KR101670934B1 - 클로스트리디움 보툴리눔의 독소형 탐지용 프라이머 세트, 이를 포함하는 탐지용 조성물 및 탐지키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 독소 단백질C의 경쇄영역 코딩 유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 보툴리눔 독소형 C/D 및 C 탐지용 조성물, 및 탐지용 키트 에 관한 것으로, 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소형 C/D 와 C의 독소 단백질의 N 말단을 코딩하는 유전자에 공통적으로 결합하는 프라이머 세트 및 비 특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 보툴리눔에 대한 민감도가 개선되어 시료를 대상으로 하여 더 낮은 검출한계를 보임으로서 증균과정 없이 수행할 수 있기에 신속한 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소형 C/D와 C탐지용 프라이머 세트, 올리고뉴클레오티드, 및 이를 포함한 탐지용 조성물, 탐지용 키트 및 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 혐기성 세균으로, 이 박테리아가 생산하는 보툴리눔 독소는 동물의 이완성 마비를 일으킨다. 클로스트리디움 보툴리눔의 외독소(exotoxin)에 의해서 신경근접합부나 자율신경 시냅스에서 아세틸콜린의 시냅스 전 방출이 차단되어 보툴리눔 독소증(보툴리즘)을 일으킨다.
클로스트리디움 보툴리눔은 생성하는 신경독의 항원 특이성에 근거하여 A, B, C, D, E, F 및 G형으로 구분되며, 그 물질대사 및 혈청학적 근거로 4개 그룹으로 분류된다. 그룹 I은 강력한 단백질 분해능을 지닌 균주로 구성되었으며 단백질 분해형 A, B, F가 여기에 해당된다. 그룹 II는 단백질 분해능이 없는 균주로 구성되며 E형 모두와 B와 F 중 분해능이 없는 균주로 구성되어 있다. 그룹 III은 독소형 C 및 D를 포함하며, 그룹 IV는 주로 토양으로부터 분리되며 보툴리즘에 대해 보고된 바는 없다.
독소형 C/D와 C는 생화학적 그룹 III에 해당한다. 이 그룹의 특징은 독소의 유전자가 박테리오파지(bacteriophage)에 의해 전달되며 세균에서 플라스미드(plasmid)의 형태로 존재하게 된다는 점이다. 독소형 C/D와 C에 기인한 보툴리즘은 가축의 이완성 마비를 일으키며, 조류를 비롯한 가축에서 감염 시 높은 폐사율을 보이고 있다. 2004년부터 2008년 동안 5건의 야생조류에서의 보툴리즘이 발생하여 많은 폐사가 있었고, 2012년부터 토종닭, 꿩, 오리, 거위, 메추리 등에서 발병하여 높은 폐사율을 보이며 농가에 큰 피해를 보이고 있다.
원인균은 아포(spore) 생성이 가능해 오염 시 제거가 어렵다는 점과 맹장에서 균이 배양되어 분변으로 배출된다는 특성 때문에 이환축의 빠른 도태만이 현재까지 피해를 줄일 수 있는 최선에 방법이다. 클로스트리디움 보툴리눔은 아포 형태로 있을 시 70도가 넘는 온도와 과산화수소, 포르말린, 승홍수(이염화수은 수용액), 하이포아염소산 등을 원료로 한 소독제를 제외한 나머지 소독제에서 내성을 보인다.
클로스트리디움 보툴리눔을 분석하는 방법으로서, 현재 국제수역사무국(OIE)에서 권장하고 있는 방법은 마우스 중화 검사(mouse neutralization test)이며, 이는 탐지의 민감도가 낮을 뿐만 아니라 신속한 탐지를 통한 대응책 마련이 어렵다는 단점이 있다. 이에, 유럽에서는 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; real-time PCR)을 이용하여 민감도가 높은 탐지법을 개발하였으나, 비싼 소모품과 장비를 이용해야 한다는 점과 순수하게 정제된 DNA를 이용해야 한다는 점이 단점으로 꼽히고 있다.
상기와 같은 문제를 해결하고 높은 민감도, 짧은 탐지 시간 및 낮은 비용으로 클로스트리디움 보툴리눔의 탐지 및 독소형 구분이 가능한 방법이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 클로스트리디움 보툴리눔의 독소단백질 C의 경쇄영역을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 또는 프라이머 세트를 제공하는 것이다. 상기 독소단백질 C의 경쇄영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔는 독소형 C 또는 독소형 C/D이다.
본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 독소 단백질 유전자 중합효소연쇄반응의 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 상기 프라이머 세트의 핵산서열과 일부 상보적인 핵산서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 탐지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 독소 단백질 유전자의 탐지방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 클로스트리디움 보툴리눔의 유전적 탐지법에 관해 연구하던 중 보툴리눔 독소형 C/D와 C의 독소 유전자의 N 말단 쪽에 공통으로 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 민감도가 개선되어 증균과정 없이도 진단이 가능하며 외부환경에 의한 오염을 차단하며, 클로스트리디움 보툴리눔의 검출률을 유의하게 증가시켜 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 중합효소연쇄반응을 수행함에 있어서 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 경우 중합효소연쇄반응 중에 발생하는 비특이반응을 억제하는바 더욱 바람직하며, 또한 상기 중합반응은 네스티드-PCR, 예컨대 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested PCR)이 바람직하다.
본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 독소 단백질 C의 경쇄영역의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응용 프라이머 또는 프라이머 세트를 제공한다. 상기 독소단백질 C의 경쇄영역을 코딩하는 유전자를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔는 독소형 C 또는 독소형 C/D이다.
구체적으로, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 핵산서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하며, 예를 들면 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 프라이머 세트, 또는 서열번호 3 및 4로 표시되는 핵산서열로 구성된 프라이머 세트일 수 있다. 상기 프라이머는 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 독소 단백질의 N말단에 위치하는 경쇄영역을 코딩하는 유전자 에 결합하는 것이 바람직하다. 상기 중합반응은 네스티드-PCR, 예컨대 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응이 바람직하며, 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 아웃터-프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 핵산서열로 구성된 이너-프라이머 세트를 포함할 수 있다.
| 프라이머 명칭 | 염기서열(5’ → 3’) | 증폭크기(bp) |
| BCSTNP out F | AGCTAATGAGCCTGAAAAAGCCTTTCGCAT(서열번호 1) | 424 |
| BCSTNP out R | AGCACCAAATCCTTCTTGTGCCGCAAA(서열번호 2) | |
| BCSTNP in F | CTCGAGTTACAAGCCC(서열번호 3) | 256 |
| BCSTNP in R | ACCCAGTTGTTACCTT(서열번호 4) |
본 발명에서 "프라이머(primer)"란 적절한 완충용액 중의 적정한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs) 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적정 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다.
상기 프라이머의 길이는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하는 온도와 밀접한 관계를 가지는데 일반적으로 길이가 길어질수록 온도는 높아지게 된다. 사용 목적에 따라 달라질 수는 있으나 보통 15 내지 40 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
C/D 독소유전자와 C 독소유전자의 각각 424 염기크기의 증폭산물을 얻을 수 있는 1차 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트로서, 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 프라이머 세트를 제작한다. 상기 1차 중합효소연쇄반응용 프라이머의 경우, 어닐링 온도가 68 내지 74℃이며, 바람직하게는 72℃의 온도에서 각 증폭대상 유전자와 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, C/D 독소유전자와 C 독소유전자의 각각 256 염기크기의 증폭산물을 얻을 수 있는 2차 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 제작하고, 상기 2차 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트의 경우 50 내지 60℃, 또는 52 내지 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였으며, 예를 들어 58℃에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있다.
C/D 독소유전자와 C 독소유전자를 특이적으로 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트의 위치를 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다. 보툴리누스 신경 독소(BoNT)는, 분자량 약 100 kDa의 중쇄(H사슬) 도메인 및 분자량 약 50 kDa의 경쇄(Light chain) 도메인으로 구성된다. 중쇄 도메인은 C말단 중쇄(Hc) 및 N말단 중쇄(Hn)룰 포함한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 프라이머세트는 C형 독소 단백질와 C/D 독소 단백질의 경쇄(light chain)에 결합하여 독소 유전자 특이적 증폭산물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C의 독소 단백질 N 말단을 코딩하는 유전자에 결합하는 프라이머 세트를 이용하여 독소 유전자를 증폭하는 경우에, 프라이머 세트가 독소유전자에 비특이적으로 결합하는 것을 방지할 필요가 있어, 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 세트를 제공한다.
상기 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트는 아웃터-프라이머의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 각각 상보적으로 결합할 수 있으며, 적어도 일 말단에 위치하는 2개 또는 3개의 염기는 아웃터-프라이머의 핵산서열의 염기와 비상보적인 서열을 포함한다. 구체적으로, 올리고뉴클레오티드 세트는 상기 아웃터-프라이머 세트 중 서열번호 1의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와, 상기 아웃 프라이머 세트 중 서열번호 2의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트일 수 있다.
구체적인 일예에서, 상기 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 핵산서열로 구성될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 60℃, 또는 52 내지 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였으며, 예를 들어 58℃에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있으며, 염기서열을 하기 표 2에 나타냈다.
| 명칭 | 염기서열(5’ → 3’) |
| BCSTNP anti F | CATATGCGAAAGGCTAAA(서열번호 5) |
| BCSTNP anti R | TGATTTGCGGCACAACTT(서열번호 6) |
예를 들면, nested-PCR 반응에서, 본 발명에 따른 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트는 상기 아웃터-프라이머 세트와 혼성화하여 이후 이너-프라이머 세트에 의한 2차 증폭반응에서 아웃터-프라이머 세트가 비특이적 증폭반응을 수행하는 것을 방지할 수 있으며, 또한 상기 아웃터-프라이머 세트 자체가 주형으로 작용하여 증폭이 되더라도, 올리고뉴클레오티드 세트는 아웃터-프라이머 세트와 비상보적인 염기를 포함함에 따라 증폭산물이 추가적인 PCR 반응의 프라이머로 작용할 수 없도록 한다.
본 발명에서 용어 "중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다. 상기 중합효소연쇄반응은 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일구체예에서, 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C의 독소 단백질의 N말단을 코딩하는 유전자와 결합하는 프라이머 세트, 및 비특이적 반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응을 수행할 경우, 보툴리즘에 대한 민감도가 개선되어 낮은 검출한계를 갖고, 탐지 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, 독소형 C/D와 C에 대해 특이적으로 검출할 수 있어, 조류 및 가축에서 보툴리즘의 신속탐지를 통한 질병 통제에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 핵산서열로 구성된 아웃터-프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 핵산서열로 구성된 이너-프라이머 세트; 및 상기 아웃터-프라이머 세트 중 서열번호 1의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와, 상기 아웃 프라이머 세트중 서열번호 2의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트일 수 있으며, 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드는 약 17개 염기 내지 36개 염기크기를 가질 수 있다.
예를 들면 서열번호 5 및 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C 의 탐지용 조성물, 또는 탐지용 키트를 제공한다.
상기 조성물 또는 키트는 보툴리즘 감염 개체 및 환경물질을 포함한 매개체 등에 대한 탐지가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 감염 개체는 조류, 및 포유류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상, 예를 들어, 반추류 또는 영장류에 대한 탐지가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 의 독소 유전자 증폭용 조성물 또는 키트는 선택적으로 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열안정 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, 및 4개의 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 시료 DNA를 증폭하는 단계; 및 (2) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D 및 C 탐지 방법을 제공한다.
상기 시료 DNA 증폭단계를 수행하기 전에, 먼저 시료 DNA를 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 시료 DNA는 보툴리즘 감염 개체 및 환경물질을 포함한 매개체 등에서 유래된 것일 수 있으며, 상기 감염 개체는 조류, 반추류, 및 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 대한 탐지가 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하거나 단지 배양액을 증류수에 희석시켜 끓이는 방법으로도 수행할 수 있다.
상기 증폭단계의 시료 DNA 증폭은 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄 반응(polymerae chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 프라이밍 중합효소 연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reacion; realtime PCR) 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Realtime Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)등의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 증폭단계는 상기 증폭단계는 시료 DNA 변성단계, 상기 아웃터-프라이머 세트를 이용한 1차 증폭단계; 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 반응단계; 상기 이너-프라이머 세트를 이용한 2차 증폭단계; 및 신장단계를 포함할 수 있다.
상기 증폭단계는 상기 아웃터-프라이머세트, 이너-프라이머 세트 및 올리고뉴클레오타이드 세트를 일시에 투입하거나 순차적으로 투입하여 수행할 수 있다.
구체적으로 상기 증폭단계는 하기 단계 (a) 내지 (d)단계를 포함할 수 있다.
(a) 서열번호 1 및 2의 아웃터-프라이머 세트를 이용하여, 94℃의 온도에서 15초간; 72℃에서 60초간; 처리하는 과정을 15회 사이클로 수행하는 1차 증폭단계;
(b) 본 발명에 따른 비특이적 증폭반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 58℃에서 5분간 반응시키는 올리고뉴클레오티드 반응단계;
(c) 2차 PCR 반응을 서열번호 3 및 4의 이너-프라이머 세트를 이용하여, 94℃의 온도에서 15초간; 58℃에서 90초간; 72℃에서 60초간; 처리하는 과정을 30회의 사이클로 수행하는 2차 증폭단계; 및
(d) 72℃의 온도에서 3분간 처리하는 DNA 신장단계.
상기 중합효소연쇄반응에서 온도 및 시간 조건은 본 발명의 중합효소연쇄반응 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의한 타당한 수치로 변경될 수 있다. 상기 1차 증폭단계의 어닐링(annealing) 온도는 68 내지 74℃, 예컨대 72℃이고, 2차 증폭단계의 어닐링 온도는 50 내지 60℃, 예컨대 58℃일 수 있다.
상기 아웃터-프라이머 세트와 올리고뉴클레오티드 세트의 사용 몰비는 1: 1.5 내지 10일 수 있으며, 예를 들면 1:2, 1:4 또는 1:8일 수 있으며, 아웃터-프라이머 세트(outter-primer)의 사용량에 비해서 올리고뉴클레오티드 세트의 사용량이 더 많은 것이 바람직하다. 본 발명의 일예에서, 상기 증폭단계에서 서열번호 1 및 2 의 핵산서열로 구성된 아웃터-프라이머 세트은 31.25 nM의 농도, 상기 서열번호 3 및 4로 표시되는 이너-프라이머 세트(inner-primer)는 250 nM의 농도, 및 상기 올리고뉴클레오티드 쌍은 250 nM의 농도로 첨가하여 수행할 수 있다.
상기 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 탐지 방법은 민감도가 우수하여 검출한계가 낮고, 신속한 검사가 가능하며 특이도가 검증되었으며, 경제적이기에 종래 방법에 비해 현저하게 우수한 효과를 가지고 있다.
본 발명에 따른 탐지방법은, 상기 목적 증폭산물이 시료 DNA의 증폭결과 산물에 존재하는 경우 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소형 C/D 및 독소형 C로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 클로스트리디움 보툴리눔 독소형이 시료 내에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출단계는, 증폭산물을 전기영동하여 목적 증폭산물의 밴드를 확인하여 결정하거나, 탐지 가능한 표지가 결합된 증폭산물의 존재 여부를 검출하여 결정할 수도 있다. 상기 탐지 가능한 표지를 증폭산물에 결합할 수 있으며, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지 하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성 동위원소가 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다.
본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 독소 단백질의 N 말단을 코딩하는 유전자에 공통적으로 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 보툴리눔에 대한 민감도가 개선되고, 낮은 검출한계를 보이므로, 증균과정 없이 신속하게 보툴리눔을 탐지할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔(Clostidium botulinum) 그룹 III 독소의 종류 및 프라이머에 의한 유전자 증폭 부위를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 비특이적 반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 중합효소연쇄반응의 비특이반응 억제 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3은 본 발명에 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 사용 농도에 따른 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 독소형 C의 게놈 DNA 농도에 따른 검출 한계를 측정한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 독소형 C의 검출 특이도 측정 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 비특이적 반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 중합효소연쇄반응의 비특이반응 억제 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3은 본 발명에 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 사용 농도에 따른 중합효소연쇄반응의 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 독소형 C의 게놈 DNA 농도에 따른 검출 한계를 측정한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 독소형 C의 검출 특이도 측정 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 증폭용
프라이머
세트 제작
클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C의 독소 단백질 N 말단에 결합하는 프라이머 세트를 제작하기 위해서, National Center for Biotechnical Information (NCBI, GenBank)에 등록된 독소형 C/D의 균주 3종(accession number CP002411, AB745659, AB037166)과 독소형 C의 균주 3종(accession number AB745658, X72793, AB061780)의 유전자 염기서열을 참조하였다. 상기 염기서열로부터 C/D와 C의 독소 단백질의 N 말단 부분에서 6종 균주의 염기서열이 공통된 부분을 찾아서 프라이머 세트, 즉 1차 및 2차 증폭용 프라이머 세트를 제작하였으며, 이들 프라이머 서열을 하기 [표 3]에 나타내었다.
| 프라이머 명칭 | 염기서열(5’ → 3’) | 증폭크기(bp) |
| BCSTNP out F | AGCTAATGAGCCTGAAAAAGCCTTTCGCAT(서열번호 1) | 424 |
| BCSTNP out R | AGCACCAAATCCTTCTTGTGCCGCAAA(서열번호 2) | |
| BCSTNP in F | CTCGAGTTACAAGCCC(서열번호 3) | 256 |
| BCSTNP in R | ACCCAGTTGTTACCTT(서열번호 4) |
상기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, C/D 독소유전자와 C 독소유전자의 각각 424 염기크기의 핵산서열을 증폭할 수 있는 1차 증폭용 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)을 제작하였다. 상기 1차 증폭용 프라이머의 경우, 72℃의 온도에서 각 증폭대상 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였다.
또한, C/D 독소유전자와 C 독소유전자의 각각 256 염기크기의 핵산서열을 증폭할 수 있는 2차 증폭용 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 제작하였다. 상기 2차 증폭용 프라이머 세트의 경우 52 내지 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였다.
한편, C/D 독소유전자와 C 독소유전자를 특이적으로 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트의 위치를 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다. 상기 제작된 1차 및 2차 프라이머 세트는 이후 중합효소연쇄반응에서 사용하였다.
실시예
2.
비특이반응
억제용 올리고뉴클레오티드 세트 제작
실시예 1에서 제작된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄 반응을 수행하였으며, 생성된 반응 산물에 대한 전기영동을 수행하였다. 그 결과 1차 증폭단계의 프라이머가 2차 증폭단계에 영향을 주어 비특이적 밴드가 생성되는 것을 확인하였다. 비특이반응은 다중 진단에서 특이도를 현저히 낮추는 문제가 있으므로, 비특이반응을 제하기 위해 1차 증폭단계에서 이용되는 프라이머 세트와 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트를 제작하였다.
본 발명의 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드는 BCSTNP out F와 BCSTNP out R의 염기와 상보적으로 결합할 수 있게 만들었고 그 중, 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3'말단에 위치하는 2 내지 3개의 염기는 BCSTNP out F와 BCSTNP out R과 결합이 불가하게 제조하였다. 그 외 염기는 증폭용 프라이머 세트 2의 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 구조이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였으며, 염기서열을 하기 [표 4]에 나타냈다.
| 명칭 | 염기서열(5’ → 3’) |
| BCSTNP anti F | CATATGCGAAAGGCTAAA(서열번호 5) |
| BCSTNP anti R | TGATTTGCGGCACAACTT(서열번호 6) |
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드는 18개의 염기로 이루어지며, 5' 또는 3' 말단에 위치하는 3개의 염기는 증폭 유전자 염기서열과 동일한 염기서열을 가지며, 그 외 염기는 증폭용 프라이머 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 구조이다. 상기 올리고 뉴클레오티드는 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작되었다. 상기 제작된 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응에서 사용하였다.
실시예
3.
분리균주를
이용한
클로스트리디움
보툴리눔 독소형 C/D와 C 탐지
본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 탐지를 위해 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응에 적합하게 설계하고, PCR 프라이머 및 비특이적 반응억제용 올리고뉴클레오티드의 최적 농도를 특정하기 위하여, 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D의 국내 분리주(accession number KVCC-1400025 한국수의유전자원은행)를 시료로 사용하였다.
제조사의 메뉴얼에 따라 게놈 DNA 추출 키트(QIAamp DNA mini kit; QIAGEN)를 사용하여, 상기 균주로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트 및 상기 실시예 2에서 제작된 올리고뉴클레오티드 세트 및 I star taq DNA 중합효소(intron), 염화마그네슘(MgCl2), PCR 완충용액, 증류수와 함께 PCR 튜브에 첨가한 다음, 96℃의 온도에서 2분간 DNA를 변성시킨 후, 94℃의 온도에서 15초간, 72℃에서 60초간 처리하는 과정을 15회 사이클로 수행하여 1차 증폭 과정을 진행하였다. 그 후, 58℃에서 5분간 반응시킨 후, 94℃의 온도에서 15초간, 58℃에서 90초간, 72℃ 60초간 처리하는 과정을 30회의 사이클로 수행하는 2차 증폭과정을 진행하였다. 마지막으로 72℃의 온도에서 3분간 처리하여 최종 DNA 신장단계를 수행하였으며, DNA 신장과정은 PCR 증폭기(Eppendorf Mastercycler gradient; Eppendorf)에서 수행되었다.
상기 PCR, 증폭산물을 전기영동하여 결과를 도 2(Lane 1)에 나타냈다. 이의 과정을 하기 [표 5]에 정리하여 나타내었다.
| 과정 | 온도(℃) | 시간(초) | 사이클 |
| 사전 DNA 변성단계 | 96 | 120 | |
| 1차 증폭단계 | 94 | 15 | 15 |
| 72 | 60 | ||
| 올리고뉴클레오티드 반응단계 | 58 | 300 | |
| 2차 증폭 단계 | 94 | 15 | 40 |
| 58 | 90 | ||
| 72 | 60 | ||
| 최종 DNA 신장단계 | 72 | 60 |
비교예
1
상기 실시예 2에서 제작된 비특이적 반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 같은 방법으로 수행하였으며, 증폭산물을 전기영동하여 결과를 도 2(Lane 2)에 나타냈다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 상기 1차 및 2차 프라이머 세트는 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응에서 서로 상이한 위치에서 반응함을 확인하였다. 구체적으로, 비교예에서는 1차 증폭단계의 프라이머가 2차 증폭단계에 영향을 주어 비특이적 밴드가 생성되는 것을 확인하였다 (Lane 2). 반면에, 실시예 3에서는 상기 올리코뉴클레오티드가 1차 증폭단계의 프라이머가 2차 증폭단계에 영향을 주는 것을 저해하여 비특이적 밴드가 생성되지 않는 것을 확인하였다 (Lane 1).
따라서, 비특이적 반응은 다중 탐지에서 특이도를 현저히 낮추는 문제가 있으나, 상기 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여, 탐지 특이도를 향상시킬 수 있었다.
실시예
4. 다양한 농도의
프라이머
및 올리고뉴클레오티드 사용실험
중합효소연쇄반응 시 첨가하는 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 농도를 최적하기 위하여 하기 [표 6]와 같이 각각의 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 농도와 비율을 조절하여 상기 [표 5]의 방법으로 PCR을 수행하고, 생성된 반응 산물에 대한 전기영동을 수행하여 결과를 도 3에 나타내었다.
| 농도비 | 위치 | 프라이머 셋트 1 | 올리고뉴클레오티드 | 프라이머 셋트 2 |
| 1:2:2 | Lane 1 | 250nM | 500nM | 500nM |
| Lane 2 | 125nM | 250nM | 250nM | |
| Lane 3 | 62.5nM | 125nM | 125nM | |
| Lane 4 | 31.25nM | 62.5nM | 62.5nM | |
| 1:4:4 | Lane 5 | 125nM | 500nM | 500nM |
| Lane 6 | 62.5nM | 250nM | 250nM | |
| Lane 7 | 31.25nM | 125nM | 125nM | |
| Lane 8 | 15.625nM | 62.5nM | 62.5nM | |
| 1:8:8 | Lane 9 | 62.5nM | 500nM | 500nM |
| Lane 10 | 31.25nM | 250nM | 250nM | |
| Lane 11 | 15.625nM | 125nM | 125nM | |
| Lane 12 | 7.8125nM | 62.5nM | 62.5nM |
도 3에서 확인할 수 있듯이, Lane 10의 결과가 가장 진하였고 비특이도 밴드로 의심되는 밴드가 확인되지 않아, Lane 10의 농도를 최적농도로 결정하였고 이를 하기 [표 7]에 나타내다.
| 프라이머 명칭 | 최종농도(nM) |
| BCSTNP out F (서열번호 1) | 31.25 |
| BCSTNP out R (서열번호 2) | 31.25 |
| BCSTNP in F (서열번호 3) | 250 |
| BCSTNP in R (서열번호 4) | 250 |
| BCSTNP anti F (서열번호 5) | 250 |
| BCSTNP anti R (서열번호 6) | 250 |
실시예
5: 검출한계 및 검출률 평가
실시예
5-1: 균주 게놈
DNA
시료를 이용한 평가
실시예 3에 따른 중합효소 연쇄반응의 동일한 조건에 따라, 실시예 1에 프라이머 세트와 실시예 2에 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 5에서 결정한 [표 7]의 농도로 사용하여, 상기 시료 DNA 농도에 따른 검출농도를 평가하였다.
구체적으로, 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D의 국내 분리주(등록번호 제KVCC-1400025)의 게놈 DNA를 시료로 사용하였다. 게놈 DNA 추출 키트(QIAamp DNA mini kit; QIAGEN)를 제조사의 메뉴얼에 따라 사용하여 추출한 게놈 DNA를 증류수를 이용하여 10배씩 계단 희석한 후 각각을 주형으로 사용하였으며, 구체적으로 Lane 1은 Negative control, Lane 2는 1100 pg/ul, Lane 3은 110 pg/ul, Lane 4는 11 pg/ul, Lane 5는 1.1 pg/ul, Lane 6은 1100 fg/ul, 및 Lane 7은 110 fg/ul의 농도로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다 (M: 100 bp ladder). 증폭산물을 전기영동하여 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 1100pg/㎕ 부터 1.1pg/㎕까지 증폭산물에 의한 기대 밴드가 관찰되었으므로, 검출가능 최저농도가 1.1pg/㎕이라는 것을 측정하였다.
실시예
5-2: 균주
아포
접종 맹장내용물 시료를 이용한 평가
클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 독소유전자 탐지법을 이용한 아포 접종 맹장내용물에서 검출한계 측정은 실시예 5-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다.
균주 아포 접종 맹장내용물에 대해 검출 농도를 평가하고자, 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D의 국내 분리주(등록번호 제KVCC-1400025)의 아포를 증류수에 10배씩 계단 희석하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C가 없음이 증명된 토종닭의 분변 200mg에 접종한 후 (a) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 증균과정 없이 맹장 내용물에서 분변용 게놈 DNA를 추출한 시료, (b) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체 배지에 접종하여 1일간 증균하고 게놈 DNA를 추출한 시료, (c) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체 배지에 접종하여 3일간 증균하고 게놈 DNA를 추출한 시료, (d) 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체 배지에 접종하여 3일간 증균하고 13,000rpm으로 원심 분리해서 얻은 침전물을 증류수에 희석한 후 끓여서 얻은 게놈 DNA 시료를 포함한 총 4 가지 시료를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 후 전기영동을 통해서 증폭 산물에 의한 기대 밴드가 보이는 가장 낮은 농도 같을 이용하여 검출한계를 측정하였다. 그 결과를 [표 8]에 나타내었다.
실시예
5-3: 임상시료를 이용한 평가
클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 독소유전자 탐지법을 이용한 실제 임상 시료(맹장내용물)에서의 검출률 측정은 실시예 5-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다.
실제임상시료의 검출률 측정을 위해 보툴리즘이 걸린 조류의 맹장 8개에서 맹장 내용물을 200mg씩 사용하여 실시예 5-1과 같은 방법으로 중합효소 연쇄반응을 수행하고 그 결과를 측정하였다. 구체적으로, 시료는 (a) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 증균과정 없이 맹장 내용물에서 분변용 게놈 DNA를 추출한 시료, (b) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체배지에 접종하여 1일간 증균하고 게놈 DNA를 추출한 시료, (c) 게놈 DNA 추출 키트를 이용하여 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체 배지에 접종하여 3일간 증균하고 게놈 DNA를 추출한 시료, (d) 맹장 내용물에서 얻어진 균주를 액체 배지에 접종하여 3일간 증균하고 13,000rpm으로 원심 분리해서 얻은 침전물을 증류수에 희석한 후 끓여서 얻은 게놈 DNA 시료를 포함한 총 4 가지 시료를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 결과를 [표 8]에 나타내었다.
| 시료 | 검출최저농도(개) | 검출률 |
| (a) | 4.3*106 | 7/8 |
| (b) | 43 | 8/8 |
| (c) | 4.3 | 8/8 |
| (d) | 4.3*103 | 8/8 |
[표 8]에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 보툴리눔에 대한 민감도를 개선시켜 1일 증균액의 경우 검출한계는 43개의 아포, 임상 시료 8개중 8개에서 양성(8/8), 3일 증균액의 경우 검출한계는 4.3개의 아포, 임상시료 8개중 8개에서 양성(8/8)을 보임으로서 유럽에서 사용하는 탐지법 보다 뛰어난 검출한계를 보임으로서 이를 대체 하여 사용할 수 있음을 확인하였다.
유럽에서 사용하는 탐지법의 경우 1일 증균액에서 1000 mg을 접종하였을 때 50개의 아포를 검출한계로 가졌으나 본 발명의 경우에는 200 mg을 이용하여 더 낮은 검출 한계를 보였다.
또한 증균을 과정 없이 맹장 내용물에서 수행한 경우 검출한계는 4.3*106개의 아포, 임상 시료 8개중 7개에서 양성(7/8)을 보임으로서 신속 탐지법으로 이용할 수 있다.
또한 3일 증균액을 물에 희석시켜 끓이는 방법으로 간단하게 DNA를 추출한 경우(시료(d))에도 검출한계는 4300개의 아포, 임상시료 중 8개 중 8개에서 양성(8/8)을 보여 본 탐지법을 편리하고 경제적인 탐지법으로 이용할 수 있다는 점을 보여 주었다.
실시예
6: 검출 특이도 조사
본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C 독소유전자 탐지법의 특이도를 확인하기 위하여, [표 9]에 나타낸 19종의 균주를 사용하였다.
| 균종 | 독소형 | 등록번호 | lane |
| negative control | 1 | ||
| Clostiridium botulinum | A | CVI 61884 | 2 |
| B | QIA 1-031-CBB-CO-044 | 3 | |
| C | CVI CKIII-u | 4 | |
| D | CVI 16878 | 5 | |
| C/D | BKT 15925 | 6 | |
| Clostiridium difficile | ATCC 9689 | 7 | |
| Clostiridium perfringens | A | KVCC BA1100001 | 8 |
| B | KVCC BA1100002 | 9 | |
| C | KVCC BA1100003 | 10 | |
| D | KVCC BA1100004 | 11 | |
| E | KVCC BA1100005 | 12 | |
| Bacillus subtilis | ATCC 6633 | 13 | |
| Bacillus cereus | ATCC 11778 | 14 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC 29212 | 15 | |
| Salmonella enteritidis | ATCC 13076 | 16 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC 14028 | 17 | |
| E. coli | ATCC 25922 | 18 | |
| Campylobacter jejuni | ATCC 33560 | 19 | |
| Campylobacter coli | ATCC 43484 | 20 | |
M: 100 bps
상기 [표 9]에서 클로스트리디움 속 균주 및 바실러스 속 균주는 아포 형성능이 있으면 나머지 균주는 아포형성능이 없다. 상기 "CVI"란 네델란드 중앙수의연구소(Central Veterinary Institute)를; "QIA"란 농림축산검역본부를; "BKT"란 스웨덴 국립수의연구소(Swedish National Veterinary Institute)를; "ATCC"는 미국 유전자원은행(American Type Culture Collection)을; "KVCC"는 한국 수의유전자원은행(Korea Veterinary Culture Collection)을; 말한다.
상기 19종의 균주를 영양배지에 1일간 증균시킨 후, 게놈 DNA 추출 키트(QIAamp DNA mini kit; QIAGEN)를 사용하여 게놈 DNA을 추출하고, 중합효소연쇄반응 주형으로 사용하고, 실시예 1의 프라이머 세트와 실시예 2의 올리뉴클레오타이드를 사용하고 실시예 5-1과 실질적으로 동일한 방법으로 단일 튜브 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 증폭산물을 전기영동 하여 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에서 볼 수 있듯이, lane 4(독소형 C)와 lane 6(독소형 C/D)에서 기대했던 256bp 크기의 증폭산물이 보이는 것을 확인하였으며, 다른 균종에서는 256bp 크기의 증폭산물이 보이지 않음을 확인하였다. 따라서, 상기 19종의 균주 중 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C(Lane 4)와 C/D(Lane 6)에 해당하는 균주(등록번호 제CVI CKIII-u와 제BKT 15925)에서만 특이적으로 증폭되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 진단을 위한 정보 제공 방법을 이용할 경우, 클로스트리디움 보툴리눔 독소형 C/D와 C에 대한 특이도가 우수하므로, 독소형 C/D와 C에 감염된 개체에서 특이적으로 C/D와 C를 검출하는 효과가 우수함을 확인하였다.
<110> Animal and plant quarantine agency
<120> Primer set for detection of Clostridium botulinum, composition,
and kit comprising the same
<130> DPP20145978KR
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSTNP out F
<400> 1
agctaatgag cctgaaaaag cctttcgcat 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSTNP out R
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSTNP in R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSTNP anti R
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tgatttgcgg cacaactt 18
Claims (18)
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에 비상보적인 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와,
서열번호 2의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 독소 단백질 C의 경쇄영역의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응의 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트. - 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 것인, 올리고뉴클레오티드 세트.
- 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 아웃터-프라이머 세트,
서열번호 3 및 4의 핵산서열로 구성된 이너-프라이머 세트, 및
상기 아웃터-프라이머 세트 중 서열번호 1의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와, 상기 아웃 프라이머 세트 중 서열번호 2의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하며,
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소형 C/D 및 독소형 C로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 탐지용 조성물. - 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 것인, 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 시료 DNA와
완충액 DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자, 및 뉴클레오티드 트리포스페이트로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물. - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단일 튜브 이중중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR)용인 것인, 조성물.
- 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 아웃터-프라이머 세트,
서열번호 3 및 4의 핵산서열로 구성된 이너-프라이머 세트, 및
상기 아웃터-프라이머 세트 중 서열번호 1의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드와, 상기 아웃 프라이머 세트 중 서열번호 2의 핵산서열 중 연속하는 15개 내지 30개의 핵산서열에 상보적인 염기를 포함하며, 적어도 하나의 말단에는 비상보적 2개 또는 3개의 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여, 시료 DNA를 중합효소연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하며,
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소형 C/D 및 독소형 C로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 클로스트리디움 보툴리눔 독소형을 탐지하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 핵산서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드로 구성된 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 아웃터-프라이머 세트와 올리고뉴클레오티드 세트의 사용 몰비는 1: 1.5 내지 10인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 핵산서열로 구성된 프라이머 세트는 31.25 nM의 농도, 상기 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트는 250 nM의 농도, 및 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 250 nM의 농도로 첨가되는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 증폭단계는 상기 아웃터-프라이머세트, 이너-프라이머 세트 및 올리고뉴클레오타이드 세트를 일시에 투입하고 수행하는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 증폭단계는 시료 DNA 변성단계, 상기 아웃터-프라이머세트를 이용한 1차 증폭단계; 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한 반응단계; 상기 이너-프라이머 세트를 이용한 2차 증폭단계; 및 신장단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 1차 증폭단계의 어닐링(annealing) 온도는 68 내지 74℃이고, 2차 증폭단계의 어닐링 온도는 50 내지 60℃인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 시료 DNA는 감염 개체 또는 환경물질로부터 유래된 것인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 감염 개체는 조류 및 포유류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 검출단계는 전기영동 또는 증폭산물에 표지된 탐지 가능한 표지물질을 검출하는 것인, 방법.
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| US20120088680A1 (en) | 2009-09-01 | 2012-04-12 | Robison Richard A | Real-time pcr assays for rapid detection and differentiation of the clostridium botulinum toxin genes a, b, e, and f |
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Patent Citations (4)
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