JP3423597B2 - 細菌の同定方法 - Google Patents
細菌の同定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌同定のための
オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
に関し、詳しくは細菌の１６Ｓ−リボソームＲＮＡ（以
下、１６Ｓ−ｒＲＮＡと略すことがある。）をコードす
る遺伝子の５’上流域に特異的な塩基配列およびそれを
用いて特定の細菌を迅速、かつ正確に同定する方法に関
する。
オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた細菌の同定方法
に関し、詳しくは細菌の１６Ｓ−リボソームＲＮＡ（以
下、１６Ｓ−ｒＲＮＡと略すことがある。）をコードす
る遺伝子の５’上流域に特異的な塩基配列およびそれを
用いて特定の細菌を迅速、かつ正確に同定する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】細菌は古くから人間と密接な関係があ
り、食品工業、医薬品工業などの様々な分野で幅広く研
究の対象として注目されている。これらの細菌の中に
は、人間に対して有用なものが多く存在するが、人間に
疾患等を引き起こす原因菌（例えばセレウス菌、ボツリ
ヌス菌、コレラ菌、大腸菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ
球菌、赤痢菌など）も自然界に存在し、該原因菌による
疾患等の予防や治療に関する研究は現在でも精力的に行
われている。このような背景のもとで、細菌がいかなる
種類に属しているかを同定することは、疾患や食品の変
敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明などに大きく寄
与するものである。
り、食品工業、医薬品工業などの様々な分野で幅広く研
究の対象として注目されている。これらの細菌の中に
は、人間に対して有用なものが多く存在するが、人間に
疾患等を引き起こす原因菌（例えばセレウス菌、ボツリ
ヌス菌、コレラ菌、大腸菌、サルモネラ菌、黄色ブドウ
球菌、赤痢菌など）も自然界に存在し、該原因菌による
疾患等の予防や治療に関する研究は現在でも精力的に行
われている。このような背景のもとで、細菌がいかなる
種類に属しているかを同定することは、疾患や食品の変
敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明などに大きく寄
与するものである。
【０００３】細菌の同定は、古くは肉眼または顕微鏡で
形態を観察することや培養所見で行われてきたが、その
後染色法が開発され、グラム陽性、グラム陰性またはそ
のいずれにも属さないグラム不定の３形態に大別される
ようになった。さらに、細菌学や生化学などの進歩で細
菌の生理・生化学的性質により細分化されることとな
り、これらの性状による区分は細菌の分類に大きく貢献
した。また、機器分析の技術向上に伴い菌体脂肪酸、細
胞壁の主要構成アミノ酸、キノン系、ＤＮＡの塩基組成
等が明らかにされ、より正確な細菌の同定、分類が可能
になった。さらに近年、分子生物学の急速な進歩によ
り、細菌の遺伝子の相同性は容易に検査できるようにな
り、細菌の同定、分類に必要不可欠なデータとされてい
る。
形態を観察することや培養所見で行われてきたが、その
後染色法が開発され、グラム陽性、グラム陰性またはそ
のいずれにも属さないグラム不定の３形態に大別される
ようになった。さらに、細菌学や生化学などの進歩で細
菌の生理・生化学的性質により細分化されることとな
り、これらの性状による区分は細菌の分類に大きく貢献
した。また、機器分析の技術向上に伴い菌体脂肪酸、細
胞壁の主要構成アミノ酸、キノン系、ＤＮＡの塩基組成
等が明らかにされ、より正確な細菌の同定、分類が可能
になった。さらに近年、分子生物学の急速な進歩によ
り、細菌の遺伝子の相同性は容易に検査できるようにな
り、細菌の同定、分類に必要不可欠なデータとされてい
る。
【０００４】一般的に、食品分野において細菌を同定す
る場合、Bergy's manual of systematic bacteriology
に従って被検菌となる細菌の形態観察および生理・生化
学的性質によって分類される。しかしながら、これらの
作業は非常に煩雑で判定に熟練と技量を要し、かつ日数
も多くかかるため、迅速に結果が要求される場合には不
向きである。そのため、最近では簡易キットも多く発売
され汎用化されているものの、同定可能な菌種の範囲が
狭く、かつ人為的または菌株による誤差が多い等の問題
があり、広範囲な細菌の同定に応用するには多くの課題
が残されている。また、菌体脂肪酸、細胞壁の主要構成
アミノ酸、キノン系などの化学分類的手法も多数報告さ
れているが、菌種間の相違が顕著でないため、これらは
補足または追加的なデータにとどまり、細菌の同定に大
きく貢献するには至っていないのが現状である。
る場合、Bergy's manual of systematic bacteriology
に従って被検菌となる細菌の形態観察および生理・生化
学的性質によって分類される。しかしながら、これらの
作業は非常に煩雑で判定に熟練と技量を要し、かつ日数
も多くかかるため、迅速に結果が要求される場合には不
向きである。そのため、最近では簡易キットも多く発売
され汎用化されているものの、同定可能な菌種の範囲が
狭く、かつ人為的または菌株による誤差が多い等の問題
があり、広範囲な細菌の同定に応用するには多くの課題
が残されている。また、菌体脂肪酸、細胞壁の主要構成
アミノ酸、キノン系などの化学分類的手法も多数報告さ
れているが、菌種間の相違が顕著でないため、これらは
補足または追加的なデータにとどまり、細菌の同定に大
きく貢献するには至っていないのが現状である。
【０００５】一方、近年の遺伝子工学技術の急速な進歩
に伴い、細菌の同定においても遺伝子解析などの技術
が、上記した従来の手法に付加されるようになってき
た。芽胞を形成する細菌への応用例としては、極めて性
質の類似しているバチラス・セレウス（Bacillus cere
us) とバチラス・シュリンジエンシス（Bacillus thurin
giensis)との鑑別に、後者の持つクリスタル毒素遺伝子
をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により増幅さ
せ、両菌を区別する方法〔日本食品微生物学会雑誌、11
巻、４号、第223 〜225 頁(1995)、北大農邦文紀要、19
巻、７号、第529 〜563 頁(1996)〕が挙げられる。ま
た、同様に芽胞を形成するウエルシュ菌(Clostridium
perfringens)の毒素であるエンテロトキシン（ＣＰＥ）
をコードする遺伝子に着目し、ＰＣＲ法やＲＦＬＰ法(R
andom Amplified Polymorphic DNA)により、迅速に食品
素材から検出・同定する方法もある（日本食品微生物学
会雑誌、第14巻、１号、第35〜42頁(1997)。さらに、２
３Ｓ−リボソームＲＮＡ（以下、リボソームＲＮＡをｒ
ＲＮＡと略すことがある。）を標的としたプローブを用
いたハイブリダイゼーション法によりバチラス属細菌を
分類する方法〔J. Dairy Res., 61, 4, p.529-535 (199
4)〕などが報告されている。
に伴い、細菌の同定においても遺伝子解析などの技術
が、上記した従来の手法に付加されるようになってき
た。芽胞を形成する細菌への応用例としては、極めて性
質の類似しているバチラス・セレウス（Bacillus cere
us) とバチラス・シュリンジエンシス（Bacillus thurin
giensis)との鑑別に、後者の持つクリスタル毒素遺伝子
をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により増幅さ
せ、両菌を区別する方法〔日本食品微生物学会雑誌、11
巻、４号、第223 〜225 頁(1995)、北大農邦文紀要、19
巻、７号、第529 〜563 頁(1996)〕が挙げられる。ま
た、同様に芽胞を形成するウエルシュ菌(Clostridium
perfringens)の毒素であるエンテロトキシン（ＣＰＥ）
をコードする遺伝子に着目し、ＰＣＲ法やＲＦＬＰ法(R
andom Amplified Polymorphic DNA)により、迅速に食品
素材から検出・同定する方法もある（日本食品微生物学
会雑誌、第14巻、１号、第35〜42頁(1997)。さらに、２
３Ｓ−リボソームＲＮＡ（以下、リボソームＲＮＡをｒ
ＲＮＡと略すことがある。）を標的としたプローブを用
いたハイブリダイゼーション法によりバチラス属細菌を
分類する方法〔J. Dairy Res., 61, 4, p.529-535 (199
4)〕などが報告されている。
【０００６】これらの手法は芽胞形成菌にとどまらず、
例えば腸内細菌であるビブリオ属細菌の鑑別〔FEMS Mic
robiol. Lett., 152, p.125-132(1997) 、Res. Microbi
ol.,145, p.151-156(1994) 〕や、グラム陽性球菌の同
定〔J. of Bcateriol., 175,7483-7487(1993)、FEMS Mi
crobiol. Lett., 151, 231-236(1997) 〕にも応用され
ている。このように、微生物の分類や同定の分野への遺
伝子工学の導入は、前記した細菌類にとどまらず普遍的
に行われるようになってきた。しかし、上記の方法は菌
種によっては特定のプライマーやプローブなどを必要と
するため、極めて限られた範囲の細菌にしか有効でな
く、ある程度の範囲に被検菌を絞り込むまでは、従来か
ら行われている生理・生化学的手法に頼らざるを得ない
のが現状である。
例えば腸内細菌であるビブリオ属細菌の鑑別〔FEMS Mic
robiol. Lett., 152, p.125-132(1997) 、Res. Microbi
ol.,145, p.151-156(1994) 〕や、グラム陽性球菌の同
定〔J. of Bcateriol., 175,7483-7487(1993)、FEMS Mi
crobiol. Lett., 151, 231-236(1997) 〕にも応用され
ている。このように、微生物の分類や同定の分野への遺
伝子工学の導入は、前記した細菌類にとどまらず普遍的
に行われるようになってきた。しかし、上記の方法は菌
種によっては特定のプライマーやプローブなどを必要と
するため、極めて限られた範囲の細菌にしか有効でな
く、ある程度の範囲に被検菌を絞り込むまでは、従来か
ら行われている生理・生化学的手法に頼らざるを得ない
のが現状である。
【０００７】一方、情報網の発達により、既に解析され
ている遺伝子情報は容易に入手することができ、これを
利用して未知の遺伝子の検索を行ったり、生物間での遺
伝子の相同性を検討する等に利用することができる。こ
のうち、細菌の遺伝子に関して最も多く解析・登録され
ているものの１つがｒＲＮＡをコードしている遺伝子で
ある。リボソームは、ウイルスなどを除く全ての生物に
存在しており、細菌の場合は３種類のＲＮＡと５２種類
のタンパク質からなる分子量 2,520,000（沈降速度７０
Ｓ）で、菌種間で微妙な違いはあるもののその大きさは
ほとんど共通している。
ている遺伝子情報は容易に入手することができ、これを
利用して未知の遺伝子の検索を行ったり、生物間での遺
伝子の相同性を検討する等に利用することができる。こ
のうち、細菌の遺伝子に関して最も多く解析・登録され
ているものの１つがｒＲＮＡをコードしている遺伝子で
ある。リボソームは、ウイルスなどを除く全ての生物に
存在しており、細菌の場合は３種類のＲＮＡと５２種類
のタンパク質からなる分子量 2,520,000（沈降速度７０
Ｓ）で、菌種間で微妙な違いはあるもののその大きさは
ほとんど共通している。
【０００８】リボソームは、５Ｓ−および２３Ｓ−ｒＲ
ＮＡと２１種のタンパク質からなる大きなサブユニット
と１６Ｓ−ｒＲＮＡと３１種のタンパク質からなる小さ
なサブユニットから構成されており、２３Ｓ−ｒＲＮＡ
は約２９００塩基、１６Ｓ−ｒＲＮＡは約１５００塩
基、５Ｓ−ｒＲＮＡは約１２０塩基でそれぞれ構成され
ている。これらの塩基配列は、細菌の種類によって相違
が見られるため、これらの情報は細菌の分類に大きく貢
献することになり、それぞれの塩基配列に基づく系統分
類が行われている。中でも、最も情報量が多く存在し、
普遍的に活用されているのが１６Ｓ−ｒＲＮＡである。
これまでは、細菌同定の最終項目として該１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡ遺伝子の全塩基配列を決定し、それまでに得られた
生理・生化学的性状やその他の化学分析とを併せて細菌
を同定するのが、細菌同定の流れとして受入れられてい
る。しかしながら、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする遺伝
子の塩基配列から細菌を同定しようとする試みは、塩基
配列を容易に決められなかったり、データベースの不足
等の理由から、まだ十分には浸透していない。さらに、
１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を用いた細菌
の系統分類は、酢酸菌について報告〔Biosci. Biotech.
Biochem., 61, 1244 〜1251 (1997) 〕があるが、その
他の細菌に関しては皆無である。
ＮＡと２１種のタンパク質からなる大きなサブユニット
と１６Ｓ−ｒＲＮＡと３１種のタンパク質からなる小さ
なサブユニットから構成されており、２３Ｓ−ｒＲＮＡ
は約２９００塩基、１６Ｓ−ｒＲＮＡは約１５００塩
基、５Ｓ−ｒＲＮＡは約１２０塩基でそれぞれ構成され
ている。これらの塩基配列は、細菌の種類によって相違
が見られるため、これらの情報は細菌の分類に大きく貢
献することになり、それぞれの塩基配列に基づく系統分
類が行われている。中でも、最も情報量が多く存在し、
普遍的に活用されているのが１６Ｓ−ｒＲＮＡである。
これまでは、細菌同定の最終項目として該１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡ遺伝子の全塩基配列を決定し、それまでに得られた
生理・生化学的性状やその他の化学分析とを併せて細菌
を同定するのが、細菌同定の流れとして受入れられてい
る。しかしながら、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする遺伝
子の塩基配列から細菌を同定しようとする試みは、塩基
配列を容易に決められなかったり、データベースの不足
等の理由から、まだ十分には浸透していない。さらに、
１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を用いた細菌
の系統分類は、酢酸菌について報告〔Biosci. Biotech.
Biochem., 61, 1244 〜1251 (1997) 〕があるが、その
他の細菌に関しては皆無である。
【０００９】遺伝子の塩基配列の決定に際しては、従来
Maxam-Gilbert 法が行われていたが、現在ではヌクレオ
チドアナログとＤＮＡポリメラーゼとを用いたダイデオ
キシ(dideoxy) 法、蛍光ラベルしたプライマーまたはダ
イデオキシヌクレオチドを用いた塩基配列決定法、自動
ＤＮＡシーケンサーを用いる方法などが挙げられる。こ
れらの方法は、解析時間の短縮や再現性の向上などにつ
いても改善がなされており、容易、かつ短時間で目的と
する塩基配列を決定することが可能である。しかし、こ
れらの方法の中には、放射性同位元素を利用しているた
めに特殊な施設や試薬、さらには技量が要求されたり、
解析のためには高価な機器が必要であるものもある。こ
のため、専門機関を除いては、依然として細菌の分類・
同定は煩雑で時間がかかる形態や生理・生化学的手法か
らのアプローチが中心となっている。加えて、これまで
に開発されたいずれの遺伝子工学的な手法によっても、
被検菌となる菌株がどの属に属する細菌であるかといっ
た情報を、生理・生化学的手法により得ていなければ有
効に活用することができないといった問題を抱えてい
る。さらに、現在行われている１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列をもとに細菌を同定する方法は、該塩基配列
のほぼ全領域を系統分類の対象としているために複数回
のシークエンス解析が必要であり、経費や時間などの面
で従来の生理・生化学的手法に取って代わるには至って
いない。
Maxam-Gilbert 法が行われていたが、現在ではヌクレオ
チドアナログとＤＮＡポリメラーゼとを用いたダイデオ
キシ(dideoxy) 法、蛍光ラベルしたプライマーまたはダ
イデオキシヌクレオチドを用いた塩基配列決定法、自動
ＤＮＡシーケンサーを用いる方法などが挙げられる。こ
れらの方法は、解析時間の短縮や再現性の向上などにつ
いても改善がなされており、容易、かつ短時間で目的と
する塩基配列を決定することが可能である。しかし、こ
れらの方法の中には、放射性同位元素を利用しているた
めに特殊な施設や試薬、さらには技量が要求されたり、
解析のためには高価な機器が必要であるものもある。こ
のため、専門機関を除いては、依然として細菌の分類・
同定は煩雑で時間がかかる形態や生理・生化学的手法か
らのアプローチが中心となっている。加えて、これまで
に開発されたいずれの遺伝子工学的な手法によっても、
被検菌となる菌株がどの属に属する細菌であるかといっ
た情報を、生理・生化学的手法により得ていなければ有
効に活用することができないといった問題を抱えてい
る。さらに、現在行われている１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
の塩基配列をもとに細菌を同定する方法は、該塩基配列
のほぼ全領域を系統分類の対象としているために複数回
のシークエンス解析が必要であり、経費や時間などの面
で従来の生理・生化学的手法に取って代わるには至って
いない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】そのため、簡便で、誤
差も少なく、短時間に実施でき、しかも試験方法が統一
された細菌の分離、同定法の開発が望まれていた。そこ
で本発明者らは、迅速、簡便、かつ確実に特定の細菌、
例えば腸内細菌科（Enterobacteriaceae）やビブリオ科
（Vibrionaceae）に属する細菌、芽胞を形成するグラム
陽性細菌、およびグラム陽性球菌などの細菌を同定する
ために、最もデータ量の豊富な１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
に着目し、その塩基配列の相同性に基づく細菌の同定ア
プローチを試みた。すなわち、１回のシークエンス解析
で決定できる配列数（約３００塩基程度）であること、
決定した配列が属間および種間において変化に富んでい
ることを基本条件とし、前記した細菌に共通なプライマ
ー領域の検索を行ったところ、５’末端領域がこれらの
条件を満たしていることを見出した。そこで、この領域
を増幅するためのＤＮＡ断片を合成して、これら細菌に
対するプライマーとしての評価を行うため、特定の細菌
のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行ったところ、
約３００塩基からなるＤＮＡ断片が増幅されていること
が電気泳動法によって確認された。これらの増幅したＤ
ＮＡの塩基配列を決定し、コンピュータによる相同性解
析またはインターネットによる相同性検索を行ったとこ
ろ、該配列は鋳型として用いた細菌の同じ領域の塩基配
列と最も高い相同性で一致した。本発明は、かかる知見
に基づいて完成されたものである。
差も少なく、短時間に実施でき、しかも試験方法が統一
された細菌の分離、同定法の開発が望まれていた。そこ
で本発明者らは、迅速、簡便、かつ確実に特定の細菌、
例えば腸内細菌科（Enterobacteriaceae）やビブリオ科
（Vibrionaceae）に属する細菌、芽胞を形成するグラム
陽性細菌、およびグラム陽性球菌などの細菌を同定する
ために、最もデータ量の豊富な１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子
に着目し、その塩基配列の相同性に基づく細菌の同定ア
プローチを試みた。すなわち、１回のシークエンス解析
で決定できる配列数（約３００塩基程度）であること、
決定した配列が属間および種間において変化に富んでい
ることを基本条件とし、前記した細菌に共通なプライマ
ー領域の検索を行ったところ、５’末端領域がこれらの
条件を満たしていることを見出した。そこで、この領域
を増幅するためのＤＮＡ断片を合成して、これら細菌に
対するプライマーとしての評価を行うため、特定の細菌
のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行ったところ、
約３００塩基からなるＤＮＡ断片が増幅されていること
が電気泳動法によって確認された。これらの増幅したＤ
ＮＡの塩基配列を決定し、コンピュータによる相同性解
析またはインターネットによる相同性検索を行ったとこ
ろ、該配列は鋳型として用いた細菌の同じ領域の塩基配
列と最も高い相同性で一致した。本発明は、かかる知見
に基づいて完成されたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、芽胞を形成するグラム陽性細菌を同定するにあた
り、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列
表の配列番号１（ただし、配列中の最初のＹはＣまたは
Ｔ、２番目のＹはＴまたはＣ、ＲはＡまたはＧを示す。
以下同じ。）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドと配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを組み合わせてなる１対のプライマーを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リボゾー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５‘末端領域のＤＮＡを
増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常法により決
定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較し、被検菌
が最も高い相同性を有する細菌種として同定することを
特徴とする細菌の同定方法である。請求項２に記載の本
発明は、アビオトロフィア属、エロコッカス属、コプロ
コッカス属、デニコッカス属、ゲメラ属、マリノコッカ
ス属、ミクロコッカス属、ペプトコッカス属、ペプトス
トレプトコッカス属、プラノコッカス属、ルミノコッカ
ス属、サッカロコッカス属、サリニコッカス属、サルシ
ナ属、スタフィロコッカス属およびバゴコッカス属の中
から選択されたグラム陽性球菌、アレセノフォナス属、
シトロバクター属、エンテロバクター属、エルウィニア
属、エシェリヒア属、エウィンゲラ属、ハフィニア属、
クレブシエラ属、クルイベラ属、パントエア属、フォト
ラブダス属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア
属、シゲラ属およびエルシニア属の中から選択された腸
内細菌科に属する細菌もしくはエアロモナス属、フォト
バクテリウム属、プレシオモナス属およびビブリオ属の
中から選択されたビブリオ科に属する細菌を同定するに
あたり、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを組み合わせてなる１対のプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リ
ボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域のＤ
ＮＡを増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常法に
より決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較し、
被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定する
ことを特徴とする細菌の同定方法である。請求項３に記
載の本発明は、芽胞を形成するグラム陽性細菌が、アリ
シクロバチルス属、バチルス属、ブレビバチルス属、ク
ロストリディウム属、デスルフォトマクラム属、パエニ
バチルス属、スポロハロバクター属、スポロラクトバチ
ルス属、スポロサルチナ属およびシントロフォスポラ属
の中から選択されたものである請求項１記載の細菌の同
定方法である。
は、芽胞を形成するグラム陽性細菌を同定するにあた
り、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列
表の配列番号１（ただし、配列中の最初のＹはＣまたは
Ｔ、２番目のＹはＴまたはＣ、ＲはＡまたはＧを示す。
以下同じ。）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドと配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドを組み合わせてなる１対のプライマーを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リボゾー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５‘末端領域のＤＮＡを
増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常法により決
定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較し、被検菌
が最も高い相同性を有する細菌種として同定することを
特徴とする細菌の同定方法である。請求項２に記載の本
発明は、アビオトロフィア属、エロコッカス属、コプロ
コッカス属、デニコッカス属、ゲメラ属、マリノコッカ
ス属、ミクロコッカス属、ペプトコッカス属、ペプトス
トレプトコッカス属、プラノコッカス属、ルミノコッカ
ス属、サッカロコッカス属、サリニコッカス属、サルシ
ナ属、スタフィロコッカス属およびバゴコッカス属の中
から選択されたグラム陽性球菌、アレセノフォナス属、
シトロバクター属、エンテロバクター属、エルウィニア
属、エシェリヒア属、エウィンゲラ属、ハフィニア属、
クレブシエラ属、クルイベラ属、パントエア属、フォト
ラブダス属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア
属、シゲラ属およびエルシニア属の中から選択された腸
内細菌科に属する細菌もしくはエアロモナス属、フォト
バクテリウム属、プレシオモナス属およびビブリオ属の
中から選択されたビブリオ科に属する細菌を同定するに
あたり、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、
配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを組み合わせてなる１対のプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ−リ
ボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域のＤ
ＮＡを増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常法に
より決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較し、
被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定する
ことを特徴とする細菌の同定方法である。請求項３に記
載の本発明は、芽胞を形成するグラム陽性細菌が、アリ
シクロバチルス属、バチルス属、ブレビバチルス属、ク
ロストリディウム属、デスルフォトマクラム属、パエニ
バチルス属、スポロハロバクター属、スポロラクトバチ
ルス属、スポロサルチナ属およびシントロフォスポラ属
の中から選択されたものである請求項１記載の細菌の同
定方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳しく説明す
る。本発明の方法により被検菌の同定対象とされる細菌
は、既に１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が解析さ
れ、データベース等に登録されているものである。この
ような細菌の具体例としては、第１表に示した４４種の
腸内細菌科に属する細菌、第２表に示した４２種のビブ
リオ科に属する細菌、第３表に示した１４８種の芽胞を
形成するグラム陽性細菌および第４表に示した５６種の
グラム陽性球菌等が挙げられる。
る。本発明の方法により被検菌の同定対象とされる細菌
は、既に１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が解析さ
れ、データベース等に登録されているものである。この
ような細菌の具体例としては、第１表に示した４４種の
腸内細菌科に属する細菌、第２表に示した４２種のビブ
リオ科に属する細菌、第３表に示した１４８種の芽胞を
形成するグラム陽性細菌および第４表に示した５６種の
グラム陽性球菌等が挙げられる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】
【表４】
【００１７】
【表５】
【００１８】ところで、１６Ｓ−ｒＲＮＡをコードする
遺伝子は細菌の科間または属間では相違が多いけれど
も、同種内では比較的よく保存されていることが知られ
ており、このような塩基配列の相同または相違により細
菌は系統分類されている。しかし、従来は１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡのほぼ全領域（約１．５ｋｂｐ）のみを系統分類の
対象として利用しており、該遺伝子の部分領域により細
菌を系統分類する試みは殆ど行われていない。細菌全種
に共通となるプライマーとしての条件を満たす領域は見
出すことができないが、本発明者らの研究の結果、上記
の第１〜４表に示した菌種の範囲においては、共通とな
るプライマーとしての条件を満たすような非常に類似し
た配列を見出すことができた。
遺伝子は細菌の科間または属間では相違が多いけれど
も、同種内では比較的よく保存されていることが知られ
ており、このような塩基配列の相同または相違により細
菌は系統分類されている。しかし、従来は１６Ｓ−ｒＲ
ＮＡのほぼ全領域（約１．５ｋｂｐ）のみを系統分類の
対象として利用しており、該遺伝子の部分領域により細
菌を系統分類する試みは殆ど行われていない。細菌全種
に共通となるプライマーとしての条件を満たす領域は見
出すことができないが、本発明者らの研究の結果、上記
の第１〜４表に示した菌種の範囲においては、共通とな
るプライマーとしての条件を満たすような非常に類似し
た配列を見出すことができた。
【００１９】配列表の配列番号１および２に示した合成
オリゴヌクレオチドは、上記した細菌の１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列を検索し、細菌の属間および種間に
おいて変化に富んでいる５’末端領域の約３００塩基程
度の配列を増幅することが可能な領域をコードするよう
に設計されたものである。被検菌より抽出したゲノムＤ
ＮＡを鋳型として、該配列番号１と配列番号２のオリゴ
ヌクレオチドの組み合わせからなる１対のプライマーを
用いてＰＣＲ法を行って得られた増幅産物は、１回のシ
ークエンス解析により塩基配列を決定することが可能で
ある。これらのプライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて
合成することができ、そのままもしくはＨＰＬＣ等で適
宜精製して使用することができる。
オリゴヌクレオチドは、上記した細菌の１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａ遺伝子の塩基配列を検索し、細菌の属間および種間に
おいて変化に富んでいる５’末端領域の約３００塩基程
度の配列を増幅することが可能な領域をコードするよう
に設計されたものである。被検菌より抽出したゲノムＤ
ＮＡを鋳型として、該配列番号１と配列番号２のオリゴ
ヌクレオチドの組み合わせからなる１対のプライマーを
用いてＰＣＲ法を行って得られた増幅産物は、１回のシ
ークエンス解析により塩基配列を決定することが可能で
ある。これらのプライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて
合成することができ、そのままもしくはＨＰＬＣ等で適
宜精製して使用することができる。
【００２０】本発明のプライマーは、前記したように、
細菌全種に完全に共通となる塩基配列を持つものではな
いが、第１〜４表に示した菌種の範囲においては共通な
プライマーとしての諸条件を満たす非常に類似した配列
である。つまり、菌種によってはプライマー配列のうち
の幾つかの塩基が異なるものも存在するが、そのような
菌種についても本発明のプライマーを用いて所期の配列
を増幅することができる。例えば、配列番号１（ただし
最初のＹはＣ、２番目のＹはＴ、ＲはＧ）に関して、該
プライマー配列と一部が一致しない場合について第５表
（２塩基以上の不一致がプライマー配列上に存在する菌
種およびそのオリゴヌクレオチド配列）に示す。表中、
＊は欠損を示す。
細菌全種に完全に共通となる塩基配列を持つものではな
いが、第１〜４表に示した菌種の範囲においては共通な
プライマーとしての諸条件を満たす非常に類似した配列
である。つまり、菌種によってはプライマー配列のうち
の幾つかの塩基が異なるものも存在するが、そのような
菌種についても本発明のプライマーを用いて所期の配列
を増幅することができる。例えば、配列番号１（ただし
最初のＹはＣ、２番目のＹはＴ、ＲはＧ）に関して、該
プライマー配列と一部が一致しない場合について第５表
（２塩基以上の不一致がプライマー配列上に存在する菌
種およびそのオリゴヌクレオチド配列）に示す。表中、
＊は欠損を示す。
【００２１】
【表６】
【００２２】配列番号１（ただし最初のＹはＣ、２番目
のＹはＴ、ＲはＧ）と全く同じ配列である細菌種は２９
０種中１３２種、１塩基の不一致がある菌種は１０２
種、２塩基の不一致がある菌種は４３種、３塩基以上の
不一致を持つ菌種は１３種である（第５表）。また、配
列番号２と全く同じ配列である細菌種は２９０種中２７
７種、１塩基の不一致がある菌種は１１種、２塩基の不
一致がある菌種は２種である。
のＹはＴ、ＲはＧ）と全く同じ配列である細菌種は２９
０種中１３２種、１塩基の不一致がある菌種は１０２
種、２塩基の不一致がある菌種は４３種、３塩基以上の
不一致を持つ菌種は１３種である（第５表）。また、配
列番号２と全く同じ配列である細菌種は２９０種中２７
７種、１塩基の不一致がある菌種は１１種、２塩基の不
一致がある菌種は２種である。
【００２３】次に、本発明による細菌の同定方法につい
て説明する。まず、被検菌より常法に従ってゲノムＤＮ
Ａを抽出する。これを鋳型として上記の１対のプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行い、該細菌の１６Ｓ−リボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域の約３００
塩基を増幅する。ＰＣＲ法については、パーキンエルマ
ー社や宝酒造社などから市販されているタックＤＮＡポ
リメラーゼを含む遺伝子増幅キットおよび自動遺伝子増
幅装置を用いて行うことができる。反応は常法により行
えばよいが、好ましい反応条件の１例は、変性９５℃で
０．５分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反
応７２℃で２分間の合成反応のサイクルを３０サイクル
行う方法である。
て説明する。まず、被検菌より常法に従ってゲノムＤＮ
Ａを抽出する。これを鋳型として上記の１対のプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行い、該細菌の１６Ｓ−リボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域の約３００
塩基を増幅する。ＰＣＲ法については、パーキンエルマ
ー社や宝酒造社などから市販されているタックＤＮＡポ
リメラーゼを含む遺伝子増幅キットおよび自動遺伝子増
幅装置を用いて行うことができる。反応は常法により行
えばよいが、好ましい反応条件の１例は、変性９５℃で
０．５分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反
応７２℃で２分間の合成反応のサイクルを３０サイクル
行う方法である。
【００２４】続いて、上記で得たＰＣＲ増幅産物の塩基
配列を決定するため、目的とするＰＣＲ増幅産物を検出
する。検出方法としては、アガロースゲル電気泳動また
はポリアクリルアミド電気泳動、スポット法またはサザ
ンブロット法などの常法が挙げられる。なお、スポット
法およびサザンブロット法において、該ＰＣＲ増幅産物
を検出するためのプローブＤＮＡは、増幅した塩基配列
領域内で適宜選択すればよい。ＰＣＲ増幅産物の塩基配
列を決定する方法としては、特に限定されないが、ＰＣ
Ｒ増幅産物をパーキンエルマー社やファルマシア社など
から市販されている塩基配列決定キットを用いた自動Ｄ
ＮＡシーケンサーによって決定する方法や、ＰＣＲ増幅
産物をＭ１３ファージベクターにクローニングしファー
ジＤＮＡを調製した後にサンガー法により決定する方法
などが挙げられる。
配列を決定するため、目的とするＰＣＲ増幅産物を検出
する。検出方法としては、アガロースゲル電気泳動また
はポリアクリルアミド電気泳動、スポット法またはサザ
ンブロット法などの常法が挙げられる。なお、スポット
法およびサザンブロット法において、該ＰＣＲ増幅産物
を検出するためのプローブＤＮＡは、増幅した塩基配列
領域内で適宜選択すればよい。ＰＣＲ増幅産物の塩基配
列を決定する方法としては、特に限定されないが、ＰＣ
Ｒ増幅産物をパーキンエルマー社やファルマシア社など
から市販されている塩基配列決定キットを用いた自動Ｄ
ＮＡシーケンサーによって決定する方法や、ＰＣＲ増幅
産物をＭ１３ファージベクターにクローニングしファー
ジＤＮＡを調製した後にサンガー法により決定する方法
などが挙げられる。
【００２５】このようにして決定した１６Ｓ−ｒＲＮＡ
遺伝子の５’末端領域の約３００塩基の塩基配列を、既
知のデータベース等に登録されている塩基配列との相同
性を比較することによって、被検菌の同定を行う。具体
的には、該塩基配列をGene Works（帝人システムテクノ
ロジー社）やＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）などか
ら市販されている遺伝子解析ソフトを使用して解析する
ことができ、インターネットを用いてＤＤＢＪ（日本Ｄ
ＮＡデータバンク）などのシステムにより、決定したこ
れら細菌の塩基配列の相同性検索を行う。また、本発明
の方法により細菌の同定を行うにあたり、細菌群の１６
Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端領域を増幅させるための
プライマー対を細菌同定キットとしておくことにより、
これら細菌の検出・同定を迅速、かつ簡便に実施するこ
とができる。なお、その際に用いる試薬は溶液状、粉末
状などいずれの形態をとってもよい。さらに、未知の細
菌についても、本発明の方法に従い、１対のプライマー
を使用してＰＣＲ法により増幅し、その塩基配列を決定
することにより、該細菌を同定することができる。
遺伝子の５’末端領域の約３００塩基の塩基配列を、既
知のデータベース等に登録されている塩基配列との相同
性を比較することによって、被検菌の同定を行う。具体
的には、該塩基配列をGene Works（帝人システムテクノ
ロジー社）やＤＮＡＳＩＳシステム（宝酒造社）などか
ら市販されている遺伝子解析ソフトを使用して解析する
ことができ、インターネットを用いてＤＤＢＪ（日本Ｄ
ＮＡデータバンク）などのシステムにより、決定したこ
れら細菌の塩基配列の相同性検索を行う。また、本発明
の方法により細菌の同定を行うにあたり、細菌群の１６
Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端領域を増幅させるための
プライマー対を細菌同定キットとしておくことにより、
これら細菌の検出・同定を迅速、かつ簡便に実施するこ
とができる。なお、その際に用いる試薬は溶液状、粉末
状などいずれの形態をとってもよい。さらに、未知の細
菌についても、本発明の方法に従い、１対のプライマー
を使用してＰＣＲ法により増幅し、その塩基配列を決定
することにより、該細菌を同定することができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例
１ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 （１）被検菌のゲノムＤＮＡの調製 芽胞形成グラム陽性細菌を被検菌として、該細菌をそれ
ぞれの至適条件下で培養した。例えば、偏性嫌気菌は嫌
気培養したり、微生物保存機関から入手した菌株につい
ては、該機関の推奨する条件を採用した。培養条件につ
いては、通常ブレインハートインフュージョン寒天培地
を用いて３５℃で２４時間培養した。なお、以下におい
て、ゲノムＤＮＡの調製は、すべてInstaGene Matrix(B
IO-RAD社製) を用いて行った。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例
１ 芽胞形成グラム陽性菌の同定 （１）被検菌のゲノムＤＮＡの調製 芽胞形成グラム陽性細菌を被検菌として、該細菌をそれ
ぞれの至適条件下で培養した。例えば、偏性嫌気菌は嫌
気培養したり、微生物保存機関から入手した菌株につい
ては、該機関の推奨する条件を採用した。培養条件につ
いては、通常ブレインハートインフュージョン寒天培地
を用いて３５℃で２４時間培養した。なお、以下におい
て、ゲノムＤＮＡの調製は、すべてInstaGene Matrix(B
IO-RAD社製) を用いて行った。
【００２７】（２）ＰＣＲ法
（１）において得たゲノムＤＮＡ０．１μｇを鋳型と
し、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社
製）を用いてＰＣＲ法を行った。プライマーは、配列番
号１（ただし最初のＹはＣ、２番目のＹはＴ、ＲはＧ）
および配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用し
た。このプライマーは、すべてオリゴサービスつくば研
究所に合成委託した。なお、ＰＣＲ法の反応液は、ゲノ
ムＤＮＡ０．１μｇを含む溶液を０．２ｍｌのエッペン
チューブにとり、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー
（100mM トリス−HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgC
l２)、８μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各２．５ｍＭ）、０．５μｌの５
ユニット／μｌのタックＤＮＡポリメラーゼ、各５μｌ
のプライマー、これに滅菌水を加えて１００μｌの溶液
とした。
し、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社
製）を用いてＰＣＲ法を行った。プライマーは、配列番
号１（ただし最初のＹはＣ、２番目のＹはＴ、ＲはＧ）
および配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドを使用し
た。このプライマーは、すべてオリゴサービスつくば研
究所に合成委託した。なお、ＰＣＲ法の反応液は、ゲノ
ムＤＮＡ０．１μｇを含む溶液を０．２ｍｌのエッペン
チューブにとり、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー
（100mM トリス−HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgC
l２)、８μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各２．５ｍＭ）、０．５μｌの５
ユニット／μｌのタックＤＮＡポリメラーゼ、各５μｌ
のプライマー、これに滅菌水を加えて１００μｌの溶液
とした。
【００２８】ＰＣＲの反応条件は、変性９５℃で０．５
分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反応７２
℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行った。
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液１０μｌを試
料として、１％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社製）ゲル電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して増幅さ
れた約３００塩基のＤＮＡを確認した。
分間、アニーリング５０℃で０．５分間、伸長反応７２
℃で２分間の合成反応サイクルを３０サイクル行った。
反応終了後、ＰＣＲ増幅産物を含む反応液１０μｌを試
料として、１％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ社製）ゲル電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して増幅さ
れた約３００塩基のＤＮＡを確認した。
【００２９】（３）ＰＣＲ増幅産物の塩基配列の決定
上記の（２）によって得られた増幅産物反応液９０μｌ
に、２０％ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ 6000(ｗ／ｖ）,
2.5Ｍ NaCl)を６７μｌ加えてよく撹拌した後、氷上に
て１時間放置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、再
度同じ条件で遠心分離した後、風乾した。こうして得た
ＰＣＲ増幅産物を、滅菌蒸留水に５０μｇ／μｌとなる
ように溶解させた。続いて、該ＰＣＲ増幅産物溶液６μ
ｌを試料として用い、ダイターミネーターサイクルシー
クエンスキット（パーキンエルマー社製）により目的と
する領域の塩基配列を決定した。その結果、２７５塩基
の配列が決定された。
に、２０％ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ 6000(ｗ／ｖ）,
2.5Ｍ NaCl)を６７μｌ加えてよく撹拌した後、氷上に
て１時間放置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、再
度同じ条件で遠心分離した後、風乾した。こうして得た
ＰＣＲ増幅産物を、滅菌蒸留水に５０μｇ／μｌとなる
ように溶解させた。続いて、該ＰＣＲ増幅産物溶液６μ
ｌを試料として用い、ダイターミネーターサイクルシー
クエンスキット（パーキンエルマー社製）により目的と
する領域の塩基配列を決定した。その結果、２７５塩基
の配列が決定された。
【００３０】（４）被検菌の同定
（３）において決定した塩基配列から、プライマー領域
をGene Works（帝人システムテクノロジー社）を用いて
修飾し、その塩基配列について、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）により相同性を検索した。
結果を第６表に示す。表中には、被検菌の塩基配列と相
同性の高い配列を与えるものを順に５種まで記載した。
但し、相同性が８０％以下のものは記載していない。表
示したように、芽胞を形成する被検菌は１００％の相同
性を示したバチルス・ズブチリスであると同定された。
をGene Works（帝人システムテクノロジー社）を用いて
修飾し、その塩基配列について、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）により相同性を検索した。
結果を第６表に示す。表中には、被検菌の塩基配列と相
同性の高い配列を与えるものを順に５種まで記載した。
但し、相同性が８０％以下のものは記載していない。表
示したように、芽胞を形成する被検菌は１００％の相同
性を示したバチルス・ズブチリスであると同定された。
【００３１】
【表７】
【００３２】実施例２ 芽胞形成グラム陽性菌の同定
芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２６３塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は９９％の相同性を示したブレビバチルス・ブレ
ビスであると同定された。被検菌の塩基配列を配列表の
配列番号３に、データベースに登録されているブレビバ
チルス・ブレビスの塩基配列を配列番号４に示す。ま
た、被検菌の塩基配列およびデータベースに登録されて
いるブレビバチルス・ブレビスの塩基配列の比較を図１
に示した。図中、Ａは被検菌、Ｂはブレビバチルス・ブ
レビスを示している。また、該配列中において不一致の
塩基を下線で示す。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２６３塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は９９％の相同性を示したブレビバチルス・ブレ
ビスであると同定された。被検菌の塩基配列を配列表の
配列番号３に、データベースに登録されているブレビバ
チルス・ブレビスの塩基配列を配列番号４に示す。ま
た、被検菌の塩基配列およびデータベースに登録されて
いるブレビバチルス・ブレビスの塩基配列の比較を図１
に示した。図中、Ａは被検菌、Ｂはブレビバチルス・ブ
レビスを示している。また、該配列中において不一致の
塩基を下線で示す。
【００３３】実施例３ 芽胞形成グラム陽性菌の同定
芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７９塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は相同性９９％、配列中の不一致の塩基数２を示
したパエニバチルス・ポリミキサと同定された。被検菌
の塩基配列を配列表の配列番号５に、データベースに登
録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列を
配列番号６に示す。また、被検菌の塩基配列とデータベ
ースに登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩
基配列の比較を図２に示した。図中、Ａは被検菌、Ｃは
パエニバチルス・ポリミキサを示している。該配列中に
おいて不一致の塩基を下線で示す。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７９塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌は相同性９９％、配列中の不一致の塩基数２を示
したパエニバチルス・ポリミキサと同定された。被検菌
の塩基配列を配列表の配列番号５に、データベースに登
録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩基配列を
配列番号６に示す。また、被検菌の塩基配列とデータベ
ースに登録されているパエニバチルス・ポリミキサの塩
基配列の比較を図２に示した。図中、Ａは被検菌、Ｃは
パエニバチルス・ポリミキサを示している。該配列中に
おいて不一致の塩基を下線で示す。
【００３４】実施例４ 芽胞形成グラム陽性菌の同定
芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７６塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌はスポロラクトバチルス・イヌリヌスと１００％
の相同性で一致した。このため、該細菌をスポロラクト
バチルス・イヌリヌスと同定した。
細菌の同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同
じ条件で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣ
Ｒ法によって増幅した２７６塩基の配列が決定され、DD
BJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用い
て該塩基配列の相同性について検索し、芽胞を形成する
被検菌はスポロラクトバチルス・イヌリヌスと１００％
の相同性で一致した。このため、該細菌をスポロラクト
バチルス・イヌリヌスと同定した。
【００３５】実施例５ 芽胞形成グラム陽性菌の同定
芽胞形成グラム陽性菌に属する細菌を被検菌として、該
細菌の同定を行った。なお、該菌の培養を嫌気的に行っ
たこと以外は、すべて実施例１と同じ条件で行った。結
果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法によって増幅し
た２６４塩基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同
性について検索し、芽胞を形成する被検菌はクロストリ
ディウム・ラモザムと１００％の相同性で一致した。こ
のため、該細菌をクロストリディウム・ラモザムと同定
した。
細菌の同定を行った。なお、該菌の培養を嫌気的に行っ
たこと以外は、すべて実施例１と同じ条件で行った。結
果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法によって増幅し
た２６４塩基の配列が決定され、DDBJのホモロジーサー
チシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同
性について検索し、芽胞を形成する被検菌はクロストリ
ディウム・ラモザムと１００％の相同性で一致した。こ
のため、該細菌をクロストリディウム・ラモザムと同定
した。
【００３６】実施例６ 腸内細菌科に属するグラム陰性
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６９塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はエシェリヒア・コリと１００％の相同性で一致
した。このため、該細菌をエシェリヒア・コリと同定し
た。
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６９塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はエシェリヒア・コリと１００％の相同性で一致
した。このため、該細菌をエシェリヒア・コリと同定し
た。
【００３７】実施例７ 腸内細菌科に属するグラム陰性
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６８塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はクレブシエラ・ニュウモニアと１００％の相同
性で一致した。このため、該細菌をクレブシエラ・ニュ
ウモニアと同定した。
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この結果、ＰＣＲ法に
よって増幅した２６８塩基の配列が決定され、DDBJのホ
モロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩
基配列の相同性について検索し、グラム陰性桿菌である
被検菌はクレブシエラ・ニュウモニアと１００％の相同
性で一致した。このため、該細菌をクレブシエラ・ニュ
ウモニアと同定した。
【００３８】実施例８ 腸内細菌科に属するグラム陰性
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
はエンテロバクター・サカザキと１００％の相同性で一
致したため、該細菌をエンテロバクター・サカザキと同
定した。
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第６表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
はエンテロバクター・サカザキと１００％の相同性で一
致したため、該細菌をエンテロバクター・サカザキと同
定した。
【００３９】実施例９ 腸内細菌科に属するグラム陰性
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。
桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。
【００４０】
【表８】
【００４１】この被検菌について、ＰＣＲ法によって増
幅した２６９塩基の配列を決定し、DDBJのホモロジーサ
ーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相
同性について検索した結果、被検菌はセラチア・マルセ
ッセンスと相同性９９％、不一致の塩基数１を示したセ
ラチア・マルセッセンスと同定された。
幅した２６９塩基の配列を決定し、DDBJのホモロジーサ
ーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相
同性について検索した結果、被検菌はセラチア・マルセ
ッセンスと相同性９９％、不一致の塩基数１を示したセ
ラチア・マルセッセンスと同定された。
【００４２】実施例１０ 腸内細菌科に属するグラム陰
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でエルシニア
・クリステンセニと同定された。
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でエルシニア
・クリステンセニと同定された。
【００４３】実施例１１ ビブリオ科に属するグラム陰
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でフォトバク
テリウム・フォスフォレウムと同定された。
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。その結果、
被検菌は相同性９９％、不一致の塩基数１でフォトバク
テリウム・フォスフォレウムと同定された。
【００４４】実施例１２ ビブリオ科に属するグラム陰
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。この結果、
グラム陰性桿菌である被検菌は相同性９９％、不一致の
塩基数１でビブリオ・ホリサエと同定された。
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した。この結果、
グラム陰性桿菌である被検菌は相同性９９％、不一致の
塩基数１でビブリオ・ホリサエと同定された。
【００４５】実施例１３ ビブリオ科に属するグラム陰
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でプレシオモナス・シゲロイデスと同
定された。
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でプレシオモナス・シゲロイデスと同
定された。
【００４６】実施例１４ 腸内細菌科に属するグラム陰
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。被検菌であるグラム陰
性桿菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基
の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、この被検菌は相同性９８％、不一致の塩
基数４でシトロバクター・フロインディと同定された。
被検菌の塩基配列を配列表の配列番号７に、データベー
スに登録されているシトロバクター・フロインディの塩
基配列を配列番号８に示す。また、この被検菌とデータ
ベースに登録されているシトロバクター・フロインディ
の塩基配列の比較を図３に示した。図中、Ａは被検菌、
Ｄはシトロバクター・フロインディを示している。ま
た、該配列中において不一致の塩基を下線で示す。
性桿菌の同定 グラム陰性桿菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。被検菌であるグラム陰
性桿菌について、ＰＣＲ法によって増幅した２６９塩基
の配列が決定され、DDBJのホモロジーサーチシステム
（ｂｌａｓｔｎ）を用いて該塩基配列の相同性について
検索した結果、この被検菌は相同性９８％、不一致の塩
基数４でシトロバクター・フロインディと同定された。
被検菌の塩基配列を配列表の配列番号７に、データベー
スに登録されているシトロバクター・フロインディの塩
基配列を配列番号８に示す。また、この被検菌とデータ
ベースに登録されているシトロバクター・フロインディ
の塩基配列の比較を図３に示した。図中、Ａは被検菌、
Ｄはシトロバクター・フロインディを示している。ま
た、該配列中において不一致の塩基を下線で示す。
【００４７】実施例１５ グラム陽性球菌の同定
グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列が決定さ
れ、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でデニコッカス・ラジオデュラン
と同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第７表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２５０塩基の配列が決定さ
れ、DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）
を用いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被
検菌は相同性１００％でデニコッカス・ラジオデュラン
と同定された。
【００４８】実施例１６ グラム陽性球菌の同定
グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性９９％でサッカロコッカス・サーモフィルスと
同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７１塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性９９％でサッカロコッカス・サーモフィルスと
同定された。
【００４９】
【表９】
【００５０】実施例１７ グラム陽性球菌の同定
グラム陽性球菌に属する細菌を被検菌として、該細菌の
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７６塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でスタフィロコッカス・アウレウスと
同定された。
同定を行った。なお、実験はすべて実施例１と同じ条件
で行った。結果を第８表に示す。この被検菌について、
ＰＣＲ法によって増幅した２７６塩基の配列を決定し、
DDBJのホモロジーサーチシステム（ｂｌａｓｔｎ）を用
いて該塩基配列の相同性について検索した結果、被検菌
は相同性１００％でスタフィロコッカス・アウレウスと
同定された。
【００５１】
【発明の効果】本発明により、各種の細菌を迅速、かつ
正確に同定できるプライマーが開発されたことから、特
定の細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として該プライマーを用
いたＰＣＲ法を行い、得られた増幅産物についてＤＮＡ
塩基配列を決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列との
相同性を比較することによって、該細菌を同定する方法
が提供される。この方法は、同じ細菌群においては統一
された試験方法で実施することができ、簡便な方法で細
菌を同定できる。したがって、本発明はヒトの疾患や食
品の変敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明などに大
きく寄与するものである。
正確に同定できるプライマーが開発されたことから、特
定の細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として該プライマーを用
いたＰＣＲ法を行い、得られた増幅産物についてＤＮＡ
塩基配列を決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列との
相同性を比較することによって、該細菌を同定する方法
が提供される。この方法は、同じ細菌群においては統一
された試験方法で実施することができ、簡便な方法で細
菌を同定できる。したがって、本発明はヒトの疾患や食
品の変敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明などに大
きく寄与するものである。
【００５２】
【００５３】
配列番号：１
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
GCY TAA YAC ATG CAA GTC GAR CG
【００５４】
配列番号：２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT
【００５５】
配列番号：３
配列の長さ：２６３
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：Bb. brevis
株名：B-041
配列の特徴
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：１．．２６３
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
AGGGTCTTCG GACCCTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TAGGCAACCT GCCTCTCAGA 60
CCGGGATAAC ATAGGGAAAC TTATGCTAAT ACCGGATAGG TTTTTGGATC GCATGATCCG 120
AAAAGAAAAG GCGGCTTCGG CTGTCACTGG GAGATGGGCC TGCGGCGCAT TAGCTAGTTG 180
GTGGGGTAAC GGCCTACCAA GGCGACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GACCGGACAC 240
ACTGGGACTG AGACACGGCC CAG 263
【００５６】
配列番号：４
配列の長さ：２６３
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：Bb. brevis
株名：JCM 2503
配列の特徴：
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：６３．．３２５
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
63 AGGGTCTTCG GACCCTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TAGGCAACCT GCCTCTCAGA 122
CCGGGATAAC ATAGGGAAAC TTATGCTAAT ACCGGATAGG TTTNTGGATC GCATGATCCG 182
AAAAGAAAAG GCGGCTTCGG CTGTCACTGG GAGATGGGCC TGCGGCGCAT TAGCTAGTTG 242
GTGGGGTAAC GGCCTACCAA GGCGACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GACCGGACAC 302
ACTGGGACTG AGACACGGCC CAG 325
【００５７】
配列番号：５
配列の長さ：２７９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：Pae. polymyxa
株名：B-014
配列の特徴：
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：１．．２７９
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
GGGTTAATTA GAAGCTTGCT TCTAACTAAC CTAGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTAGG 60
CAACCTGCCC ACAAGACAGG GATAACTACC GGAAACGGTA GCTAATACCC GATGCATCCT 120
TTTCCTGCAT GGGAGAAGGA GGAAAGGCGG AGCAATCTGT CACTTGTGGA TGGGCCTGCG 180
GCGCATTAGC TAGTTGGTGG GGTAAAGGCC TACCAAGGCG ACGATGCGTA GCCGACCTGA 240
GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAG 279
【００５８】
配列番号：６
配列の長さ：２７９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：P. polymyxa
株名：IAM 12075
配列の特徴：
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：４２．．３２０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
42 GGGTTAATTA GAAGCTTGCT TCTAACTAAC CTAGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTAGG 101
CAACCTGCCC ACAAGACTGG GATAACTACC GGAAACGGTA GCTAATACCC GATGCCTCCT 161
TTTCCTGCAT GGGAGAAGGA GGAAAGGCGG AGCAATCTGT CACTTGTGGA TGGGCCTGCG 221
GCGCATTAGC TAGTTGGTGG GGTAAAGGCC TACCAAGGCG ACGATGCGTA GCCGACCTGA 281
GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAG 320
【００５９】
配列番号：７
配列の長さ：２６９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：C. freundi
株名：C-009
配列の特徴：
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：１．．２６９
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
GTAGCACAGA GGAGCTTGCT CCTTGGGTGA CGAGTGGCGG ACGGGTGAGT AATGTCTGGG 60
AAACTGCCTG ATGGAGGGGG ATAACTACTG GAAACGGTAG CTAATACCGC ATAACGTCGC 120
AAGACCAAAG AGGGGGACCT TCGGGCCTCT TGCCATCAGA TGTGCCCAGA TGGGATTAGC 180
TAGTAGGTGG GGTAACGGCT CACCTAGGCG ACGATCCCTA GCTGGTCTGA GAGGATGACC 240
AGCCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAG 269
【００６０】
配列番号：８
配列の長さ：２６９
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｒＲＮＡ
起源
生物名：C. freundi
株名：ATCC 29935
配列の特徴：
特徴を示す記号：ｒＲＮＡ
存在位置：７０．．３３８
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
70 GTAGCACAGA GGAGCTTGCT CCTTGGGTGA CGAGTGGCGG ACGGGTGAGTA ATGTCTGGG 129
AAACTGCNTG ATGGAGGGGG ATAACTACTG GAAACGGTAG CTAATACCGCA TAACGTCGC 189
AAGACCAAAG AGGGGGACCT TCGGGCCTCT TGCCATCNNA TGTGCCCAGAT GGGATTAGC 249
TAGTAGGTGG GGTAACGGCT CACCTAGGCG ACGATCCCTA GCTGGTCTGA GAGGATGACC 309
AGCCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCNAG 338
【図１】 実施例２の被検菌の塩基配列とデータベース
に登録されているBb. brevisの塩基配列の相同性を示し
たものである。
に登録されているBb. brevisの塩基配列の相同性を示し
たものである。
【図２】 実施例３の被検菌の塩基配列とデータベース
に登録されているPa e. polymyxaの塩基配列の相同性を
示したものである。
に登録されているPa e. polymyxaの塩基配列の相同性を
示したものである。
【図３】 実施例１４の被検菌の塩基配列とデータベー
スに登録されているC. freundiの塩基配列の相同性を示
したものである。
スに登録されているC. freundiの塩基配列の相同性を示
したものである。
フロントページの続き
(72)発明者 定家 義人
静岡県三島市谷田1111番 国立遺伝学研
究所ＲＩセンター内
(56)参考文献 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．,
Ｖｏｌ．139，ｐ．1587−1594（1993)
日本醸造協会誌，Ｖｏｌ．92（３）,
ｐ．188−194（1997)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12Q 1/04
C12Q 1/68
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 芽胞を形成するグラム陽性細菌を同定す
るにあたり、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型と
し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドを組み合わせてなる１対のプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ
−リボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の５‘末端領域
のＤＮＡを増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常
法により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較
し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定
することを特徴とする細菌の同定方法。 - 【請求項２】 アビオトロフィア属、エロコッカス属、
コプロコッカス属、デニコッカス属、ゲメラ属、マリノ
コッカス属、ミクロコッカス属、ペプトコッカス属、ペ
プトストレプトコッカス属、プラノコッカス属、ルミノ
コッカス属、サッカロコッカス属、サリニコッカス属、
サルシナ属、スタフィロコッカス属およびバゴコッカス
属の中から選択されたグラム陽性球菌、アレセノフォナ
ス属、シトロバクター属、エンテロバクター属、エルウ
ィニア属、エシェリヒア属、エウィンゲラ属、ハフィニ
ア属、クレブシエラ属、クルイベラ属、パントエア属、
フォトラブダス属、プロテウス属、サルモネラ属、セラ
チア属、シゲラ属およびエルシニア属の中から選択され
た腸内細菌科に属する細菌もしくはエアロモナス属、フ
ォトバクテリウム属、プレシオモナス属およびビブリオ
属の中から選択されたビブリオ科に属する細菌を同定す
るにあたり、被検菌より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型と
し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドと配列番号２に記載の塩基配列からなる
オリゴヌクレオチドを組み合わせてなる１対のプライマ
ーを用いてポリメラーゼ連鎖反応法により細菌の１６Ｓ
−リボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の５’末端領域
のＤＮＡを増幅させ、得られた増幅産物の塩基配列を常
法により決定し、該配列を既知のＤＮＡ塩基配列と比較
し、被検菌が最も高い相同性を有する細菌種として同定
することを特徴とする細菌の同定方法。 - 【請求項３】 芽胞を形成するグラム陽性細菌が、アリ
シクロバチルス属、バチルス属、ブレビバチルス属、ク
ロストリディウム属、デスルフォトマクラム属、パエニ
バチルス属、スポロハロバクター属、スポロラクトバチ
ルス属、スポロサルチナ属およびシントロフォスポラ属
の中から選択されたものである請求項１記載の細菌の同
定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31774197A JP3423597B2 (ja) | 1997-11-05 | 1997-11-05 | 細菌の同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31774197A JP3423597B2 (ja) | 1997-11-05 | 1997-11-05 | 細菌の同定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11137259A JPH11137259A (ja) | 1999-05-25 |
| JP3423597B2 true JP3423597B2 (ja) | 2003-07-07 |
Family
ID=18091525
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31774197A Expired - Fee Related JP3423597B2 (ja) | 1997-11-05 | 1997-11-05 | 細菌の同定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3423597B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
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