JP4242244B2 - 有胞子好気性細菌の判定に用いられるオリゴヌクレオチド、これを用いた有胞子好気性細菌の判定方法および判定キット - Google Patents
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Description
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでいるものであり、具体的には、上記特異的な塩基配列が、配列番号1ないし6に示される塩基配列の何れかを上記特異的な塩基配列として含むオリゴヌクレオチドである。
(a)次に示す塩基配列(配列番号1)を有し、24塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(a):(5') d−ACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGG (3')
(b)次に示す塩基配列(配列番号2)を有し、24塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(b):(5') d−ACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGG (3')
(c)次に示す塩基配列(配列番号3)を有し、22塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(c):(5') d−TTGAGTTTCAGTCTTGCGAGCG (3')
(d)次に示す塩基配列(配列番号4)を有し、22塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(d):(5') d−TTGAGTTTCAGTCTTGCGACCG (3')
(e)次に示す塩基配列(配列番号5)を有し、22塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(e):(5') d−TTGAGTTTCACTCTTGCGAGCG (3')
(f)次に示す塩基配列(配列番号6)を有し、22塩基からなる。
オリゴヌクレオチド(f):(5') d−TTGAGTTTCACTCTTGCGACCG (3')
本発明にかかるオリゴヌクレオチドとしては、上記(a)〜(f)に限定されるものではなく、配列番号1〜6の何れかに示される塩基配列を有するもの以外に、これら塩基配列の相補的配列を有するものであってもよい。また、本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、配列番号1〜6の何れかに示される塩基配列やこれらの相補的配列以外に付加的な塩基配列を含んでいてもよい。さらには、本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、配列番号1〜6の何れかに示される塩基配列やこれらの相補的配列中に、1〜3程度の範囲内の塩基が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されるように改変されたものであってもよい。
1.長さ(サイズ)は20〜25塩基が適当である。
2.G+C(グアニン+シトシン)含量は50%前後が好ましい。
3.プライマー間の相補性については、ダイマー形成を防ぐために、3’末端が相補的なプライマーを避ける。
4.プライマー内には、二次構造を形成することを避けるため、自己相補配列を含まないようにする。
5.2種のプライマーはなるべくTm値の近いものを選択する。
本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定方法は、(1)で説明した上記オリゴヌクレオチド(a)〜(f)をプライマーとして用いてPCR反応を行うことにより、特定のDNA断片を増幅させ、それを指標として判定する方法である。
本発明で判定対象となる有胞子好気性細菌とは、具体的には、バチルス(Bacillus)属とそのその近縁の細菌であれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、バチルス属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属、ゲオバチルス(Geobacillus)属、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属、ブレビバチルス(Brevibacillus)属、アンピバチルス(Amphibacillus)属、ビルジバチルス(Virgibacillus)属、ハロバチルス(Halobacillus)属、グラチリバチリス(Gracillibacillus)属、サリバチルス(Salibacillus)属、マリニバチルス(Marinibacillus)属、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)属等の細菌を挙げることができる。上記有胞子好気性細菌は、これら有胞子好気性細菌は芽胞を形成するという特徴を有している。
PCR工程は、判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてPCR反応を行う工程であって、このとき、プライマーとして本発明にかかるオリゴヌクレオチド、例えば上記オリゴヌクレオチドを用いる。
DNA断片増幅確認工程は、上記PCR工程で得られたPCR産物中に、増幅された特定のDNA断片があるか否かを判定する工程であれば特に限定されるものではない。本発明にかかる判定方法では、上記特定のDNA断片の増幅を指標として、判定の対象となる被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定することができる。
本発明にかかる判定方法においては、上記PCR工程およびDNA断片増幅確認工程が含まれていればよいが、さらに他の工程、例えば検体調製工程が含まれていてもよい。
本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定キットは、(2)で説明した上記有胞子好気性細菌の判定方法を行うための判定キットであればよい。具体的には、PCR反応に使用されるプライマーとして、有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な、配列番号1〜6の何れかの塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを、少なくとも含んでいる構成であればよく、好ましくは、上述した各工程を実施するための試薬類等を含んでいる構成を挙げることができる。
本発明にかかるオリゴヌクレオチド並びにこれを用いた判定方法、および判定キットの用途は特に限定されるものではなく、有胞子好気性細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、微生物による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定する場合に好適に用いられる。
バチルス属(Bacillus属)およびその近縁の有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な遺伝子配列を検索し設計したプライマーを用いてPCRを行い、有胞子好気性細菌とそれ以外の細菌を検出できるか否かを評価した。
バチルス属(Bacillus属)、パネニバチルス属(Paenibacillus属)、アネウリニバチルス属(Aneurinibacillus属)、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus属)、およびバチルス属(Bacillus属)細菌と比較的遺伝子配列の類似している芽胞非形成の細菌を用いた。検体として用いた細菌については、表1に示した。これら各菌株に最適な培養条件で培養した菌株から、ゲノムDNAをGenomic DNA Purification Kit(Edge Biosystems社製)を用い、添付のプロトコールに従って調製した。
データベース(BLAST)からバチルス属(Bacillus属)とその近縁の有胞子好気性細菌(例えば、パネニバチルス属(Paenibacillus属)、アネウリニバチルス属(Aneurinibacillus属)、ゲオバチルス属(Geobacillus属)、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus属)、ブレビバチルス属(Brevibacillus属)等)、および芽胞非形成の細菌の16SリボゾームRNA遺伝子配列を抽出して、VectorNTIのAlignXという遺伝子解析ソフトを用いてアライメントを行い、有胞子好気性細菌に比較的共通している領域を選び出した。その中で、配列番号1〜6の配列を選び、それらと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、プライマーとして用いた。以下、各プライマーをそれぞれオリゴヌクレオチド(a)〜(f)と称する。
前記ゲノムDNAを鋳型として、上記オリゴヌクレオチド(a)〜(f)を用いて、表2に示したサンプルを調製してPCR反応を行った。なお、PCR反応は、Biometra社製T GRAGIENTを用いて行い、PCR条件は表3に示すとおりにした。PCR反応終了後、Agilent2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社製)に添付のプロトコールに従って分析を行い、DNAの増幅バンド、およびそのバンドのサイズを確認した。
バイオアナライザによる電気泳動の結果を図2に示した。図2中レーン1は分子量マーカー、レーン2はBacillus subtilis (IFO13719)の結果、レーン3はB. sphaericus (NBRC15095)の結果、レーン4はB. cereus (IAM12605)の結果、レーン5はB. coagulans (IAM12463)の結果、レーン6はB. megaterium (JCM2506)の結果、レーン7は、Paenibacillus validus (BUB75)の結果、レーン8はP. illinoisensis (IFO15379)の結果、レーン9はAneurinibacillus aneurinolyticus (IAM1077)の結果、レーン10は、Alicyclobacillus acidoterrestris (ATCC49025)の結果、レーン11はA.acidocaldarius (JCM5260)の結果、レーン12はStaphylococcus aureus (ATCC9144)の結果、レーン13はStaphylococcus capitis (ATCC27840)の結果、レーン14はStreptococcus salivarius (SAM0180)の結果、およびレーン15はLactobacillus delbrueckii (IAM1928)の結果をそれぞれ示した。
未同定細菌株に対して100bpのDNA断片の有無を指標にして有胞子好気性細菌か否かを判断した結果と、当該細菌の同定結果とを比較することによって、本発明にかかる有胞子好気性細菌の検出判定方法の妥当性を検討することにした。
食品の製造環境から分離された未同定細菌2株(No.1およびNo.2とする)をトリプチケースソイ寒天培地(BBL社製)にて、35℃,好気条件下で培養した。培地上の菌体を1コロニー採取し、Genomic DNA Purification Kit(Edge Biosystems社製)を用いて添付のプロトコールに従ってDNAを抽出し、これを検体とした(検体調製工程)。
前記検体液を鋳型として、前述したオリゴヌクレオチド(a)〜(f)を用いて、表2に示したサンプルを調製してPCRを行った。なお、PCRは、Biometra社製T GRAGIENTを用いて行い、PCR条件は表3に示すとおりにした。PCR終了後、Agilent2100バイオアナライザ(Agilent Technologies社製)に添付のプロトコールに従って分析を行い、DNAの増幅バンド、およびそのバンドのサイズを確認した。
電気泳動の結果を図3に示した。図3中レーン1は分子量マーカー、レーン2はNo.1の未同定細菌株の結果、およびレーン3はNo.2の未同定細菌株の結果をそれぞれ示した。
Claims (12)
- 有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでおり、
上記特異的な塩基配列が、配列番号1ないし6に示される塩基配列の何れかであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも1種に属する細菌であることを特徴とする請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてPCR反応を行うことで得られる特定のDNA断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定する有胞子好気性細菌の判定方法であって、
PCR反応に使用されるプライマーとしては、有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが少なくとも1種用いられるとともに、
上記特異的な塩基配列が、配列番号1ないし6に示される塩基配列の何れかであることを特徴とする有胞子好気性細菌の判定方法。 - 上記プライマーのうち、配列番号1または2に示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがセンスプライマーとして用いられるとともに、
配列番号3ないし6の何れかに示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがアンチセンスプライマーとして用いられることを特徴とする請求項3に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。 - 上記センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、上記特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが2種類以上用いられることを特徴とする請求項3または4に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
- 増幅される上記特定のDNA断片は、ゲル電気泳動による分離により0.1kb近傍で検出される大きさを有することを特徴とする請求項3ないし5の何れか1項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
- 上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも1種に属する細菌であることを特徴とする請求項3ないし6の何れか1項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
- 請求項3ないし7の何れか1項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法を行うための判定キット。
- 判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてPCR反応を行うことで得られる特定のDNA断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定するために用いられる判定キットであって、
PCR反応に使用されるプライマーとして、有胞子好気性細菌の16SリボゾームRNA遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含み、当該特異的な塩基配列が配列番号1ないし6に示される塩基配列の何れかであるオリゴヌクレオチドを少なくとも1種含むことを特徴とする有胞子好気性細菌の判定キット。 - さらに、ゲル電気泳動用マーカーとして用いられ、長さの異なる指標用DNA断片を複数種含むDNA断片混合物を含んでおり、
当該DNA断片混合物には、0.1kbの大きさを有する指標用DNA断片が含まれていることを特徴とする請求項9に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。 - さらに、被判定菌から核酸を調製する試薬群を含むことを特徴とする請求項9または10に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
- さらに、PCR反応に用いられる試薬群を含むことを特徴とする請求項9ないし11の何れか1項に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
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