JP2002051783A - 真正細菌の検出・定量法 - Google Patents
真正細菌の検出・定量法Info
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- JP2002051783A JP2002051783A JP2000241500A JP2000241500A JP2002051783A JP 2002051783 A JP2002051783 A JP 2002051783A JP 2000241500 A JP2000241500 A JP 2000241500A JP 2000241500 A JP2000241500 A JP 2000241500A JP 2002051783 A JP2002051783 A JP 2002051783A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 真正細菌に属する全ての菌種を迅速に検出・
定量する方法の提供。 【解決手段】 各種真正細菌群の中の特異的な種のみを
検出・定量する方法であって、以下のステップ：（１）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６Ｓ
ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のナンバリングにおい
て、真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
のセンス側から数えて１０４番目から１２６番目の配列
又はその相補的配列を含むオリゴヌクレオチドに蛍光色
素を付加したプローブと、上記プローブの上流側及び下
流側に存在する変動領域の配列に基づき設計したプライ
マーとを用いたポリメラーゼチェインリアクション；及
び（２）変化したプローブの蛍光波長における蛍光強度
の測定；を含む前記方法。
定量する方法の提供。 【解決手段】 各種真正細菌群の中の特異的な種のみを
検出・定量する方法であって、以下のステップ：（１）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６Ｓ
ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のナンバリングにおい
て、真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
のセンス側から数えて１０４番目から１２６番目の配列
又はその相補的配列を含むオリゴヌクレオチドに蛍光色
素を付加したプローブと、上記プローブの上流側及び下
流側に存在する変動領域の配列に基づき設計したプライ
マーとを用いたポリメラーゼチェインリアクション；及
び（２）変化したプローブの蛍光波長における蛍光強度
の測定；を含む前記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、ポリメラーゼチ
ェインリアクション（以下、ＰＣＲと略す）による各種
真正細菌を検出・定量する方法、及び当該方法に用いる
プローブに関する。各種の微生物の検出・定量は、医学
の領域をはじめ他の分野において行なわれている。結核
や敗血症などの感染症を引き起こす細菌の検出・定量は
特に重要である。本発明は、感染症を引き起こす細菌類
を含む各種真正細菌の検出・定量のためのプローブ、及
び当該プローブを用いた検出・定量方法に関するもので
ある。
ェインリアクション（以下、ＰＣＲと略す）による各種
真正細菌を検出・定量する方法、及び当該方法に用いる
プローブに関する。各種の微生物の検出・定量は、医学
の領域をはじめ他の分野において行なわれている。結核
や敗血症などの感染症を引き起こす細菌の検出・定量は
特に重要である。本発明は、感染症を引き起こす細菌類
を含む各種真正細菌の検出・定量のためのプローブ、及
び当該プローブを用いた検出・定量方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】細菌類の検出・同定には、一般に、選択
培地による分離や増殖培地による増殖、顕微鏡観察や免
疫学的な反応性を利用した方法など様々なものが用いら
れている。これらの検出・同定方法の操作は多大な時間
と熟練を必要とする。化学的な性状をもとに菌種を特定
するキットの開発により熟練の必要性は低下したが、培
養に時間を要する問題は未だ解決されていない。
培地による分離や増殖培地による増殖、顕微鏡観察や免
疫学的な反応性を利用した方法など様々なものが用いら
れている。これらの検出・同定方法の操作は多大な時間
と熟練を必要とする。化学的な性状をもとに菌種を特定
するキットの開発により熟練の必要性は低下したが、培
養に時間を要する問題は未だ解決されていない。
【０００３】近年、各種細菌の遺伝子を標的として当該
菌を検出・同定する技術が開発された。かかる技術によ
り、菌の検出・同定において大幅な時間短縮が可能とな
っている。このような遺伝子の例は、特許第２５５２７
８７号や特公平５−７８３１９号、特開平８−２９７
号、特開平１０−１９１９８２中に記載されている１６
Ｓリボソーマル遺伝子（以下、１６ＳｒＲＮＡ配列と略
す）や、特許第２５４００２３号中に記載されている、
菌に特異的な熱ショック蛋白質である。
菌を検出・同定する技術が開発された。かかる技術によ
り、菌の検出・同定において大幅な時間短縮が可能とな
っている。このような遺伝子の例は、特許第２５５２７
８７号や特公平５−７８３１９号、特開平８−２９７
号、特開平１０−１９１９８２中に記載されている１６
Ｓリボソーマル遺伝子（以下、１６ＳｒＲＮＡ配列と略
す）や、特許第２５４００２３号中に記載されている、
菌に特異的な熱ショック蛋白質である。
【０００４】特許第２５４００２３号は、マイコバクテ
リウム属を検出するプライマーを提供しているが、その
種類も多く、また定量解析ができない。特許第２５５２
７８７号では、マイコバクテリウム属細菌に特異的なプ
ライマーを用いて増幅断片を調製し、制限酵素処理と、
プローブのハイブリダイズとの併用により結核菌群のみ
を検出する方法である。この方法は、結核菌群の検出を
可能にするが、定量性がなく、不十分な情報しか提供で
きない。特開平１０−１９１９８２号は、レジオネラ菌
に特異的なプローブ（塩基配列８７１−８９０、大腸菌
１６ＳｒＲＮＡ配列のナンバリング）により、レジオネ
ラ菌を検出する方法を開示している。この方法ではレジ
オネラ菌をハイブリダイゼーションにより検出すること
ができるが、バックグランドの影響を受けやすいため感
度が低い。特開平８−２９７号は、真正細菌に特徴的な
核酸標的配列をＰＣＲや鎖置換増幅（ＳＤＡ）で検出す
るためのオリゴヌクレオチドプライマーを開示している
が、この方法では、種特異的な検出をおこなうことはで
きない。以上のように、特定の菌や真正細菌などを検出
する様々な技術が確立されてきているものの、これらの
技術のいずれも、特定の菌を迅速に定量することはでき
ない。さらに、特定の菌を定量する際に、菌特異的なプ
ローブを用いることもあるが、このような菌特異的プロ
ーブは、その特異性の故に汎用性がないため、多種の菌
を定量するためには多種のプローブが必要になるという
問題がある。
リウム属を検出するプライマーを提供しているが、その
種類も多く、また定量解析ができない。特許第２５５２
７８７号では、マイコバクテリウム属細菌に特異的なプ
ライマーを用いて増幅断片を調製し、制限酵素処理と、
プローブのハイブリダイズとの併用により結核菌群のみ
を検出する方法である。この方法は、結核菌群の検出を
可能にするが、定量性がなく、不十分な情報しか提供で
きない。特開平１０−１９１９８２号は、レジオネラ菌
に特異的なプローブ（塩基配列８７１−８９０、大腸菌
１６ＳｒＲＮＡ配列のナンバリング）により、レジオネ
ラ菌を検出する方法を開示している。この方法ではレジ
オネラ菌をハイブリダイゼーションにより検出すること
ができるが、バックグランドの影響を受けやすいため感
度が低い。特開平８−２９７号は、真正細菌に特徴的な
核酸標的配列をＰＣＲや鎖置換増幅（ＳＤＡ）で検出す
るためのオリゴヌクレオチドプライマーを開示している
が、この方法では、種特異的な検出をおこなうことはで
きない。以上のように、特定の菌や真正細菌などを検出
する様々な技術が確立されてきているものの、これらの
技術のいずれも、特定の菌を迅速に定量することはでき
ない。さらに、特定の菌を定量する際に、菌特異的なプ
ローブを用いることもあるが、このような菌特異的プロ
ーブは、その特異性の故に汎用性がないため、多種の菌
を定量するためには多種のプローブが必要になるという
問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本願発明の課題は、真
正細菌に属する全ての菌種を迅速に検出・定量する技術
を確立することであり、特に、それに基づき菌種特異的
プライマーを設計することができる変動領域に挟まれ
た、菌種間で比較的保存性の高い領域内で、当該菌種間
で汎用性の高いプローブを設計することである。そし
て、菌種毎に特異的なプライマーと本願発明に係る汎用
性の高いプローブを用いて定量的ＰＣＲをおこなうこと
により特定の菌の検出・定量を迅速におこなうことも、
本発明の課題である。
正細菌に属する全ての菌種を迅速に検出・定量する技術
を確立することであり、特に、それに基づき菌種特異的
プライマーを設計することができる変動領域に挟まれ
た、菌種間で比較的保存性の高い領域内で、当該菌種間
で汎用性の高いプローブを設計することである。そし
て、菌種毎に特異的なプライマーと本願発明に係る汎用
性の高いプローブを用いて定量的ＰＣＲをおこなうこと
により特定の菌の検出・定量を迅速におこなうことも、
本発明の課題である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明は、各種真正細
菌群の中の特異的な種のみを検出・定量する方法であっ
て、以下のステップ：（１）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮ
Ａ配列のナンバリングにおいて、真正細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ配列のセンス側から数えて１０
４番目から１２６番目の配列又はその相補的配列を含む
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を付加したプローブと、
上記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の
配列に基づき設計したプライマーとを用いたポリメラー
ゼチェインリアクション；及び（２）変化したプローブ
の蛍光波長における蛍光強度の測定；を含む前記方法を
提供する。
菌群の中の特異的な種のみを検出・定量する方法であっ
て、以下のステップ：（１）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮ
Ａ配列のナンバリングにおいて、真正細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡをコードするＤＮＡ配列のセンス側から数えて１０
４番目から１２６番目の配列又はその相補的配列を含む
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を付加したプローブと、
上記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の
配列に基づき設計したプライマーとを用いたポリメラー
ゼチェインリアクション；及び（２）変化したプローブ
の蛍光波長における蛍光強度の測定；を含む前記方法を
提供する。
【０００７】本願発明の１の態様においては、前記の特
異的な種が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフ
ィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、及
びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレ
オチドが配列番号１に記載の配列を含む、前記方法が提
供される。また、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチ
ド、及び前記方法に用いられる、前記オリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ試薬も提供される。
異的な種が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフ
ィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、及
びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレ
オチドが配列番号１に記載の配列を含む、前記方法が提
供される。また、配列番号１に記載のオリゴヌクレオチ
ド、及び前記方法に用いられる、前記オリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ試薬も提供される。
【０００８】配列番号１に示す配列を含むプローブは、
バチルス属やスタフィロコッカス属の細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
により、バチルス属およびスタフィロコッカス属の全菌
種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出・定
量することができる：バチルス・アルカロフィラス（Ba
cillus alcalophilus)、バチルス・アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliquefaciens) 、バチルス・バ
ジウス（Bacillus badius)、バチルス・カルドリティカ
ス（Bacillus caldolyticus)、バチルス・セレウス（Ba
cillus cereus)、バチルス・コーニイ（Bacillus cohni
i)、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus)、バチル
ス・インソリタス（Bacillus insolitus) 、バチルス・
カウストフィラス（Bacillus kaustophilus)、バチルス
・レンタス（Bacillus lentus)、バチスル・リケニフオ
ルミス（Bacillus licheniformis) 、
バチルス属やスタフィロコッカス属の細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
により、バチルス属およびスタフィロコッカス属の全菌
種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出・定
量することができる：バチルス・アルカロフィラス（Ba
cillus alcalophilus)、バチルス・アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliquefaciens) 、バチルス・バ
ジウス（Bacillus badius)、バチルス・カルドリティカ
ス（Bacillus caldolyticus)、バチルス・セレウス（Ba
cillus cereus)、バチルス・コーニイ（Bacillus cohni
i)、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus)、バチル
ス・インソリタス（Bacillus insolitus) 、バチルス・
カウストフィラス（Bacillus kaustophilus)、バチルス
・レンタス（Bacillus lentus)、バチスル・リケニフオ
ルミス（Bacillus licheniformis) 、
【０００９】バチルス・メガテリウム（Bacillus megat
erium)、バチルス・メチノリカス（Bacillus methenoli
cus)、バチルス・パリダス（Bacillus pallidus)、バチ
ルス・ポピリエ（Bacillus popilliae) 、バチルス・プ
ミラス（Bacillus pumilus) 、バチルス・スミチイ（Ba
cillus smithii) 、バチルス・ステアロサーモフィラス
（Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サブチリ
ス（Bacillus subtilis)、バチルス・サーモアミロボラ
ンス（Bacillus thermoamylovorans) 、バチルス・サー
モデントリフィカンス（Bacillus thermodenitrifican
s) 、バチルス・サーモグルコシダシウス（Bacillus th
ermoglucosidasius) 、バチルス・サーモレオボランス
（Bacillus thermoleovorans) 、バチルス・ベデリ（Ba
cillus vedderi) 、カロラマター・ファービダス（Calo
ramator fervidus) 、
erium)、バチルス・メチノリカス（Bacillus methenoli
cus)、バチルス・パリダス（Bacillus pallidus)、バチ
ルス・ポピリエ（Bacillus popilliae) 、バチルス・プ
ミラス（Bacillus pumilus) 、バチルス・スミチイ（Ba
cillus smithii) 、バチルス・ステアロサーモフィラス
（Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サブチリ
ス（Bacillus subtilis)、バチルス・サーモアミロボラ
ンス（Bacillus thermoamylovorans) 、バチルス・サー
モデントリフィカンス（Bacillus thermodenitrifican
s) 、バチルス・サーモグルコシダシウス（Bacillus th
ermoglucosidasius) 、バチルス・サーモレオボランス
（Bacillus thermoleovorans) 、バチルス・ベデリ（Ba
cillus vedderi) 、カロラマター・ファービダス（Calo
ramator fervidus) 、
【００１０】クロストリジウム・ファービダス（Clostr
idium fervidus) 、クルシア・ギブソニイ（Kurthia gi
bsonii) 、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus
brevis) 、サッカロコッカス・サーモフィラス（Saccha
rococcus thermophilus)、サルシナ・ベントリキュリ
（Sarcina ventriculi) 、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・
エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis) 、及
びスタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hom
inis) 。
idium fervidus) 、クルシア・ギブソニイ（Kurthia gi
bsonii) 、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus
brevis) 、サッカロコッカス・サーモフィラス（Saccha
rococcus thermophilus)、サルシナ・ベントリキュリ
（Sarcina ventriculi) 、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・
エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis) 、及
びスタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hom
inis) 。
【００１１】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオ
リゴヌクレオチドが配列番号２に記載の配列を含む、前
記方法が提供される。また、配列番号２に記載のオリゴ
ヌクレオチド及び前記方法に用いられる前記オリゴヌク
レオチドを含むプローブ試薬も提供される。
異的な種が、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属、及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオ
リゴヌクレオチドが配列番号２に記載の配列を含む、前
記方法が提供される。また、配列番号２に記載のオリゴ
ヌクレオチド及び前記方法に用いられる前記オリゴヌク
レオチドを含むプローブ試薬も提供される。
【００１２】配列番号２に示す配列を含むプローブは、
ブレビバチルス属やパエニバチルス属などの細菌の１６
ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記
プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列
に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、
変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定す
ることにより、ブレビバチルス属やパエニバチルス属の
全菌種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出
・定量することができる：ブレビバチルス・アグリ（Br
evibacillus agri) 、ブレビバチルス・ボルステレンシ
ス（Brevibacillus borstelensis) 、ブレビバチルス・
ブレビス（Brevibacillus brevis) 、ブレビバチルス・
セントロスポラス（Brevibacillus centrosporus) 、ブ
レビバチルス・コシネンシス（Brevibacillus choshine
nsis) 、ブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillu
s formosus) 、ブレビバチルス・ラチロスポラス（Brev
ibacillus laterosporus) 、ブレビバチルス・パラブレ
ビス（Brevibacillus parabrevis) 、
ブレビバチルス属やパエニバチルス属などの細菌の１６
ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記
プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列
に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、
変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定す
ることにより、ブレビバチルス属やパエニバチルス属の
全菌種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出
・定量することができる：ブレビバチルス・アグリ（Br
evibacillus agri) 、ブレビバチルス・ボルステレンシ
ス（Brevibacillus borstelensis) 、ブレビバチルス・
ブレビス（Brevibacillus brevis) 、ブレビバチルス・
セントロスポラス（Brevibacillus centrosporus) 、ブ
レビバチルス・コシネンシス（Brevibacillus choshine
nsis) 、ブレビバチルス・フォルモサス（Brevibacillu
s formosus) 、ブレビバチルス・ラチロスポラス（Brev
ibacillus laterosporus) 、ブレビバチルス・パラブレ
ビス（Brevibacillus parabrevis) 、
【００１３】ブレビバチルス・レウスゼリ（Brevibacil
lus reuszeri) 、ブレビバチルス・サーモルバー（Brev
ibacillus thermoruber)、パエニバチルス・アヒベンシ
ス（Paenibacillus ahibensis)、パエニバチルス・アル
ベイ（Paenibacillus alvei)、パエニバチルス・アミロ
リティカス（Paenibacillus amylolyticus) 、パエニバ
チルス・アピアリウス（Paenibacillus apiarius) 、パ
エニバチルス・アゾトフィクサンス（Paenibacillus az
otofixans)、パエニバチルス・コンドロイチナス（Paen
ibacillus chondroitinus)、パエニバチルス・カードラ
ノリティカス（Paenibacillus curdlanolyticus)、パエ
ニバチルス・デエラム（Paenibacillus durum)、パエニ
バチルス・グルカノリティカス（Paenibacillus glucan
olyticus) 、パエニバチルス・イリノイセンシス（Paen
ibacillus illinoisensis)、パエニバチルス・コベンシ
ス（Paenibacillus kobensis) 、パエニバチルス・ラル
バエ（Paenibacillus larvae) 、パエニバチルス・マセ
ランス（Paenibacillus macerans) 、パエニバチルス・
マクアリエンシス（Paenibacillus macquariensis)、パ
エニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli) 、パエ
ニバチルス・ペオリエ（Paenibacillus peoriae)、パエ
ニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa) 、
パエニバチルス・チアミノリティカス（Paenibacillus
thiaminolyticus)、及びパエニバチルス・バリダス（Pa
enibacillus validus)。
lus reuszeri) 、ブレビバチルス・サーモルバー（Brev
ibacillus thermoruber)、パエニバチルス・アヒベンシ
ス（Paenibacillus ahibensis)、パエニバチルス・アル
ベイ（Paenibacillus alvei)、パエニバチルス・アミロ
リティカス（Paenibacillus amylolyticus) 、パエニバ
チルス・アピアリウス（Paenibacillus apiarius) 、パ
エニバチルス・アゾトフィクサンス（Paenibacillus az
otofixans)、パエニバチルス・コンドロイチナス（Paen
ibacillus chondroitinus)、パエニバチルス・カードラ
ノリティカス（Paenibacillus curdlanolyticus)、パエ
ニバチルス・デエラム（Paenibacillus durum)、パエニ
バチルス・グルカノリティカス（Paenibacillus glucan
olyticus) 、パエニバチルス・イリノイセンシス（Paen
ibacillus illinoisensis)、パエニバチルス・コベンシ
ス（Paenibacillus kobensis) 、パエニバチルス・ラル
バエ（Paenibacillus larvae) 、パエニバチルス・マセ
ランス（Paenibacillus macerans) 、パエニバチルス・
マクアリエンシス（Paenibacillus macquariensis)、パ
エニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli) 、パエ
ニバチルス・ペオリエ（Paenibacillus peoriae)、パエ
ニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa) 、
パエニバチルス・チアミノリティカス（Paenibacillus
thiaminolyticus)、及びパエニバチルス・バリダス（Pa
enibacillus validus)。
【００１４】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属、及びその近縁属の細菌であり、かつ、前
記のオリゴヌクレオチドが配列番号３に記載の配列を含
む、前記方法が提供される。また、配列番号３に記載の
オリゴヌクレオチド及び前記方法に用いられる前記オリ
ゴヌクレオチドを含むプローブ試薬も提供される。
異的な種が、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属、及びその近縁属の細菌であり、かつ、前
記のオリゴヌクレオチドが配列番号３に記載の配列を含
む、前記方法が提供される。また、配列番号３に記載の
オリゴヌクレオチド及び前記方法に用いられる前記オリ
ゴヌクレオチドを含むプローブ試薬も提供される。
【００１５】配列番号３に示す配列を含むプローブは、
アクチノバチルス属などの細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列に
ハイブリダイズすることができ、上記プローブの上流側
及び下流側に存在する変動領域の配列に基づき設計した
プライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化したプローブ
の蛍光波長において蛍光強度を測定することにより、ア
クチノバチルス属の全菌種を、更に詳細には、例えば次
のような菌種を検出・定量することができる：アクチノ
バチルス・カプスラタス（Actinobacillus capsulatu
s)、アクチノバチルス・エクーリ（Actinobacillus equ
uli)、アクチノバチルス・ホミニス（Actinobacillus h
ominis) 、アクチノバチルス・インドリカス（Actinoba
cillus indolicus) 、アクチノバチルス・リグニエレシ
イ（Actinobacillus lignieresii) 、及びアクチノバチ
ルス・プレウロニューモニエ（Actinobacillus pleurop
neumoniae)。
アクチノバチルス属などの細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列に
ハイブリダイズすることができ、上記プローブの上流側
及び下流側に存在する変動領域の配列に基づき設計した
プライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化したプローブ
の蛍光波長において蛍光強度を測定することにより、ア
クチノバチルス属の全菌種を、更に詳細には、例えば次
のような菌種を検出・定量することができる：アクチノ
バチルス・カプスラタス（Actinobacillus capsulatu
s)、アクチノバチルス・エクーリ（Actinobacillus equ
uli)、アクチノバチルス・ホミニス（Actinobacillus h
ominis) 、アクチノバチルス・インドリカス（Actinoba
cillus indolicus) 、アクチノバチルス・リグニエレシ
イ（Actinobacillus lignieresii) 、及びアクチノバチ
ルス・プレウロニューモニエ（Actinobacillus pleurop
neumoniae)。
【００１６】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、
及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌク
レオチドが配列番号４に記載の配列を含む、前記方法が
提供される。また、配列番号４に記載のオリゴヌクレオ
チド及び前記方法に用いられる、前記オリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ試薬も提供される。
異的な種が、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、
及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌク
レオチドが配列番号４に記載の配列を含む、前記方法が
提供される。また、配列番号４に記載のオリゴヌクレオ
チド及び前記方法に用いられる、前記オリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ試薬も提供される。
【００１７】配列番号４に示す配列を含むプローブは、
ミコバクテリウム属およびコリネバクテリウム属および
アクチノマイセス属およびストレプトマイセス属および
ロドコッカス属などの放線菌およびその類縁の細菌の１
６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上
記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配
列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行な
い、変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度を測
定することで、放線菌およびその類縁の細菌の全菌種
を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出・定量
することができる：ストレプトマイセス・グリセウス
（Streptomyces griseus) 、ストレプトマイセス・サル
モニス（Streptomyces salmonis)、アクチノマイセス・
デンティコレンス（Actinomyces denticolens)、アクチ
ノマイセス・オドントリティカス（Actinomyces odonto
lyticus)、アクチノマイセス・ピオゲネス（Actinomyce
s pyogenes) 、ロイコノストック・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック・ラ
クティス（Leuconostoc lactis) 、コリネバクテリウム
・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae)、コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum) 、コリネバクテリウム・ボビス（Corynebacteriu
m bovis)、コリネバクテリウム・クッシェリ（Coryneba
cterium kutscheri)、
ミコバクテリウム属およびコリネバクテリウム属および
アクチノマイセス属およびストレプトマイセス属および
ロドコッカス属などの放線菌およびその類縁の細菌の１
６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上
記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配
列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行な
い、変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度を測
定することで、放線菌およびその類縁の細菌の全菌種
を、更に詳細には、例えば次のような菌種を検出・定量
することができる：ストレプトマイセス・グリセウス
（Streptomyces griseus) 、ストレプトマイセス・サル
モニス（Streptomyces salmonis)、アクチノマイセス・
デンティコレンス（Actinomyces denticolens)、アクチ
ノマイセス・オドントリティカス（Actinomyces odonto
lyticus)、アクチノマイセス・ピオゲネス（Actinomyce
s pyogenes) 、ロイコノストック・メセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック・ラ
クティス（Leuconostoc lactis) 、コリネバクテリウム
・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae)、コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum) 、コリネバクテリウム・ボビス（Corynebacteriu
m bovis)、コリネバクテリウム・クッシェリ（Coryneba
cterium kutscheri)、
【００１８】コリネバクテリウム・シュードチューバー
キュローシス（Corynebacterium pseudotuberculosis)
、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacteri
um glutamicum) 、コリネバクテリウム・レナール（Cor
ynebacterium renale) 、マイコバクテリウム・フラベ
ッセンス（Mycobacterium flavescens) 、マイコバクテ
リウム・アブセッサス（Mycobacterium abscessus)、マ
イコバクテリウム・アイチエンス（Mycobacterium aich
iense)、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacteriu
m avium)、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacteriu
m bovis)、マイコバクテリウム・セラタム（Mycobacter
ium celatum)、マイコバクテリウム・チェロネ（Mycoba
cterium chelonae) 、マイコバクテリウム・イントラセ
ルラー（Mycobacterium intracellulare) 、
キュローシス（Corynebacterium pseudotuberculosis)
、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacteri
um glutamicum) 、コリネバクテリウム・レナール（Cor
ynebacterium renale) 、マイコバクテリウム・フラベ
ッセンス（Mycobacterium flavescens) 、マイコバクテ
リウム・アブセッサス（Mycobacterium abscessus)、マ
イコバクテリウム・アイチエンス（Mycobacterium aich
iense)、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacteriu
m avium)、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacteriu
m bovis)、マイコバクテリウム・セラタム（Mycobacter
ium celatum)、マイコバクテリウム・チェロネ（Mycoba
cterium chelonae) 、マイコバクテリウム・イントラセ
ルラー（Mycobacterium intracellulare) 、
【００１９】マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacter
ium leprae) 、マイコバクテリウム・チューバーキュロ
ーシス（Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテ
リウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulace
um) 、マイコバクテリウム・フオルチタム（Mycobacter
ium fortitum) 、マイコバクテリウム・ツルガイ（Myco
bacterium szulgai)、マイコバクテリウム・ゴルドネ
（Mycobacterium gordonae) 、マイコバクテリウム・シ
ミエ（Mycobacterium simiae) 、及びマイコバクテリウ
ム・ノンクロマゲニカム（Mycobacterium nonchromagen
icum)。
ium leprae) 、マイコバクテリウム・チューバーキュロ
ーシス（Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテ
リウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulace
um) 、マイコバクテリウム・フオルチタム（Mycobacter
ium fortitum) 、マイコバクテリウム・ツルガイ（Myco
bacterium szulgai)、マイコバクテリウム・ゴルドネ
（Mycobacterium gordonae) 、マイコバクテリウム・シ
ミエ（Mycobacterium simiae) 、及びマイコバクテリウ
ム・ノンクロマゲニカム（Mycobacterium nonchromagen
icum)。
【００２０】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、
及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌク
レオチドが配列番号５に記載の配列を含む、前記方法が
提供される。また、配列番号５に記載のオリゴヌクレオ
チド及び前記方法に用いられる前記オリゴヌクレオチド
を含むプローブ試薬も提供される。
異的な種が、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、
及びその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌク
レオチドが配列番号５に記載の配列を含む、前記方法が
提供される。また、配列番号５に記載のオリゴヌクレオ
チド及び前記方法に用いられる前記オリゴヌクレオチド
を含むプローブ試薬も提供される。
【００２１】配列番号５に示す配列を含むプローブは、
レジオネラ属の細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダ
イズすることができ、上記プローブの上流側及び下流側
に存在する変動領域の配列に基づき設計したプライマー
を用いてＰＣＲを行ない、変化したプローブの蛍光波長
において蛍光強度を測定することで、レジオネラ属の細
菌の全菌種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を
検出・定量することができる：レジオネラ・アニサ（Le
gionella anisa) 、レジオネラ・ブルネンシス（Legion
ella brunensis) 、レジオネラ・チェリイ（Legionella
cherrii) 、レジオネラ・エリスラ（Legionella eryth
ra) 、レジオネラ・フェーレイ（Legionella feeleii)
、レジオネラ・ハケリエ（Legionella hackeliae) 、
レジオネラ・ジャメスタウニエンシス（Legionella jam
estowniensis) 、レジオネラ・ジョーダニス（Legionel
la jordanis)、レジオネラ・ロングビーチェ（Legionel
la longbeachae) 、レジオネラ・オークリジェンシス
（Legionella oakridgensis)、レジオネラ・パリジエン
シス（Legionella parisiensis) 、レジオネラ・ニュー
モフィラ（Legionella pneumophila) 、
レジオネラ属の細菌の１６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダ
イズすることができ、上記プローブの上流側及び下流側
に存在する変動領域の配列に基づき設計したプライマー
を用いてＰＣＲを行ない、変化したプローブの蛍光波長
において蛍光強度を測定することで、レジオネラ属の細
菌の全菌種を、更に詳細には、例えば次のような菌種を
検出・定量することができる：レジオネラ・アニサ（Le
gionella anisa) 、レジオネラ・ブルネンシス（Legion
ella brunensis) 、レジオネラ・チェリイ（Legionella
cherrii) 、レジオネラ・エリスラ（Legionella eryth
ra) 、レジオネラ・フェーレイ（Legionella feeleii)
、レジオネラ・ハケリエ（Legionella hackeliae) 、
レジオネラ・ジャメスタウニエンシス（Legionella jam
estowniensis) 、レジオネラ・ジョーダニス（Legionel
la jordanis)、レジオネラ・ロングビーチェ（Legionel
la longbeachae) 、レジオネラ・オークリジェンシス
（Legionella oakridgensis)、レジオネラ・パリジエン
シス（Legionella parisiensis) 、レジオネラ・ニュー
モフィラ（Legionella pneumophila) 、
【００２２】レジオネラ・ルブリルセンス（Legionella
rubrilucens) 、レジオネラ・セインセレンシ（Legion
ella sainthelensi)、レジオネラ・サンチクルシス（Le
gionella santicrucis) 、レジオネラ・スピリテンシス
（Legionella spiritensis) 、レジオネラ・ステイガワ
ルチ（Legionella steigerwaltii) 、及びレジオネラ・
ワズワーチ（Legionella wadsworthii) 。
rubrilucens) 、レジオネラ・セインセレンシ（Legion
ella sainthelensi)、レジオネラ・サンチクルシス（Le
gionella santicrucis) 、レジオネラ・スピリテンシス
（Legionella spiritensis) 、レジオネラ・ステイガワ
ルチ（Legionella steigerwaltii) 、及びレジオネラ・
ワズワーチ（Legionella wadsworthii) 。
【００２３】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、敗血症の原因菌である、シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、スタフィロコッカス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びクレブシエ
ラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細菌、及び大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、並びにその近縁属
の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列
番号６に記載の配列を含む、前記方法が提供される。ま
た、配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド及び前記方
法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプローブ
試薬も提供される。
異的な種が、敗血症の原因菌である、シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、スタフィロコッカス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びクレブシエ
ラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細菌、及び大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、並びにその近縁属
の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列
番号６に記載の配列を含む、前記方法が提供される。ま
た、配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド及び前記方
法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプローブ
試薬も提供される。
【００２４】配列番号６に示す配列を含むプローブは、
敗血症の原因菌である、シュードモナス属細菌および大
腸菌、スタフィロコッカス属細菌、クレブシエラ属細菌
の１６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることがで
き、上記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領
域の配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを
行ない、変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度
を測定することで、敗血症の原因菌の各菌種を、更に詳
細には、例えば次のような菌種を検出・定量することが
できる：シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomona
s aeruginosa) 、エシェリキア・コリ（Escherichia co
li) 、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneum
oniae)、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus)、及びスタフィロコッカス・エピダーミデ
ィス（Staphylococcus epidermidis) 。
敗血症の原因菌である、シュードモナス属細菌および大
腸菌、スタフィロコッカス属細菌、クレブシエラ属細菌
の１６ＳｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることがで
き、上記プローブの上流側及び下流側に存在する変動領
域の配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを
行ない、変化したプローブの蛍光波長において蛍光強度
を測定することで、敗血症の原因菌の各菌種を、更に詳
細には、例えば次のような菌種を検出・定量することが
できる：シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomona
s aeruginosa) 、エシェリキア・コリ（Escherichia co
li) 、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneum
oniae)、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco
ccus aureus)、及びスタフィロコッカス・エピダーミデ
ィス（Staphylococcus epidermidis) 。
【００２５】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属、ブラデヒドビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）属、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、リ
ゾビウム（Ｒｈｉｚｓｏｂｉｕｍ）属などの紅色非硫黄
細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のαグループに
属する細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが
配列番号７に記載の配列を含む、前記方法が提供され
る。また、配列番号７に記載のオリゴヌクレオチド及び
前記方法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプ
ローブ試薬も提供される。
異的な種が、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属、ブラデヒドビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）属、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、リ
ゾビウム（Ｒｈｉｚｓｏｂｉｕｍ）属などの紅色非硫黄
細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のαグループに
属する細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが
配列番号７に記載の配列を含む、前記方法が提供され
る。また、配列番号７に記載のオリゴヌクレオチド及び
前記方法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプ
ローブ試薬も提供される。
【００２６】配列番号７に示す配列を含むプローブは、
紅色非硫黄細菌のαグループに属する細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
で、紅色非硫黄細菌のαグループの全菌種を、更に詳細
には、例えば次のような菌種を検出・定量することがで
きる：アセトバクター・パスツーリアナス（Acetobacte
r pasteurianus) 、アセトバクター・ハンセニイ（Acet
obacter hansenii) 、アグロバクテリウム・ルビ（Agro
bacterium rubi) 、アグロバクテリウム・チュームファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens)、アクアスピリ
ラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii)、ブラデ
ヒドビウム・エスピー（Bradyrhizobium sp)、カウロバ
クター・エスピー（Caulobacter sp) 、グルコノバクタ
ー・アサイ（Gluconobacter asaii)、及びパラコッカス
・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans) 、
及びリゾビウム・エスピー（Rhizobium sp) 。
紅色非硫黄細菌のαグループに属する細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
で、紅色非硫黄細菌のαグループの全菌種を、更に詳細
には、例えば次のような菌種を検出・定量することがで
きる：アセトバクター・パスツーリアナス（Acetobacte
r pasteurianus) 、アセトバクター・ハンセニイ（Acet
obacter hansenii) 、アグロバクテリウム・ルビ（Agro
bacterium rubi) 、アグロバクテリウム・チュームファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens)、アクアスピリ
ラム・イテルソニ（Aquaspirillum itersonii)、ブラデ
ヒドビウム・エスピー（Bradyrhizobium sp)、カウロバ
クター・エスピー（Caulobacter sp) 、グルコノバクタ
ー・アサイ（Gluconobacter asaii)、及びパラコッカス
・デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans) 、
及びリゾビウム・エスピー（Rhizobium sp) 。
【００２７】本願発明の他の態様においては、前記の特
異的な種が、アルカリジーン（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属、ボルデトラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、スフ
ァエロティルス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ）属、スピ
リラム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属などの紅色非硫黄細菌
（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβグループに属す
る細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列
番号８に記載の配列を含む、前記方法が提供される。ま
た、配列番号８に記載のオリゴヌクレオチド及び前記方
法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプローブ
試薬も提供される。
異的な種が、アルカリジーン（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属、ボルデトラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、スフ
ァエロティルス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ）属、スピ
リラム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属などの紅色非硫黄細菌
（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβグループに属す
る細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列
番号８に記載の配列を含む、前記方法が提供される。ま
た、配列番号８に記載のオリゴヌクレオチド及び前記方
法に用いられる前記オリゴヌクレオチドを含むプローブ
試薬も提供される。
【００２８】配列番号８に示す配列を含むプローブは、
紅色非硫黄細菌のβグループに属する細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
で、紅色非硫黄細菌のβグループの各菌種を、更に詳細
には、例えば次のような菌種を検出・定量することがで
きる：アルカリジーン・デニトリフィカンス（Alcalige
nes denitrificans)、アルカリジーン・ファエカリス
（Alcaligenes faecalis) 、アルカリジーン・エスピー
（Alcaligenes sp) 、ボルデトラ・アビウム（Bordetel
la avium) 、ボルデトラ・ブロンキセプティカ（Bordet
ella bronchiseptica)、ボルデトラ・パラペルタシス
（Bordetella parapertussis) 、スピリラム・ボルタン
ス（Spirillum volutans) 、スファエロティルス・ナタ
ンス（Sphaerotilus natans)、ステレラ・ワズワーセン
シス（Sutterella wadsworthensis)、及びタイロレラ・
エクイジェニタリス（Taylorella equigenitalis) 。
紅色非硫黄細菌のβグループに属する細菌の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列にハイブリダイズすることができ、上記プロー
ブの上流側及び下流側に存在する変動領域の配列に基づ
き設計したプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変化し
たプローブの蛍光波長において蛍光強度を測定すること
で、紅色非硫黄細菌のβグループの各菌種を、更に詳細
には、例えば次のような菌種を検出・定量することがで
きる：アルカリジーン・デニトリフィカンス（Alcalige
nes denitrificans)、アルカリジーン・ファエカリス
（Alcaligenes faecalis) 、アルカリジーン・エスピー
（Alcaligenes sp) 、ボルデトラ・アビウム（Bordetel
la avium) 、ボルデトラ・ブロンキセプティカ（Bordet
ella bronchiseptica)、ボルデトラ・パラペルタシス
（Bordetella parapertussis) 、スピリラム・ボルタン
ス（Spirillum volutans) 、スファエロティルス・ナタ
ンス（Sphaerotilus natans)、ステレラ・ワズワーセン
シス（Sutterella wadsworthensis)、及びタイロレラ・
エクイジェニタリス（Taylorella equigenitalis) 。
【００２９】本願発明に係るプローブとしては、（株）
ＰＥバイオシステムズジャパンで合成可能なＴａｑＭａ
ｎプローブが好ましい。ＴａｑＭａｎプローブには、
５’側にレポーター色素と３’側にクエンチャー色素が
付いている。ハイブリダイズしていない状態では、レポ
ーター色素により吸収した光のエネルギーはクエンチャ
ー色素により蛍光として放出される。上記プローブがＤ
ＮＡにハイブリダイズした状態でＰＣＲが進むと、ＤＮ
Ａポリメラーゼの持つエキソヌクレアーゼ活性によりプ
ローブが分解し、レポーター色素からクエンチャー色素
へエネルギーが伝わらなくなり、レポーター色素が蛍光
を発するようになる。このようにハイブリダイゼーショ
ンにより、蛍光波長が変化するため、変化した蛍光波長
をモニタリングすることで、上記プローブとハイブリダ
イズするＤＮＡ、さらには上記ＤＮＡを含む菌の定量が
可能になる。
ＰＥバイオシステムズジャパンで合成可能なＴａｑＭａ
ｎプローブが好ましい。ＴａｑＭａｎプローブには、
５’側にレポーター色素と３’側にクエンチャー色素が
付いている。ハイブリダイズしていない状態では、レポ
ーター色素により吸収した光のエネルギーはクエンチャ
ー色素により蛍光として放出される。上記プローブがＤ
ＮＡにハイブリダイズした状態でＰＣＲが進むと、ＤＮ
Ａポリメラーゼの持つエキソヌクレアーゼ活性によりプ
ローブが分解し、レポーター色素からクエンチャー色素
へエネルギーが伝わらなくなり、レポーター色素が蛍光
を発するようになる。このようにハイブリダイゼーショ
ンにより、蛍光波長が変化するため、変化した蛍光波長
をモニタリングすることで、上記プローブとハイブリダ
イズするＤＮＡ、さらには上記ＤＮＡを含む菌の定量が
可能になる。
【００３０】また、本願発明に係るプローブとしては、
配列番号１〜８に示す配列をもつオリゴヌクレオチドが
望ましいが、その配列の一部を欠いたり、又は配列の上
流側又は下流側にヌクレオチドをいくつか追加したプロ
ーブであることができる。プローブの熱変性温度（以
下、Ｔｍ値と略す）は特に規定するものではないが、通
常プライマーのＴｍよりも約４℃以上高くする必要があ
る。好ましくは、プライマーのＴｍよりも約４℃から約
１０℃高いＴｍ値をもつプローブを使用することができ
る。また、ＴａｑＭａｎプローブを作製する際は、プロ
ーブの５’末端をＧ以外のヌクレオチドにする必要があ
る。さらに、プローブ中のＣの割合がＧの割合よりも高
くすることが望ましい。さらにまた、プローブの長さは
３０mer 以下であることが望ましい。
配列番号１〜８に示す配列をもつオリゴヌクレオチドが
望ましいが、その配列の一部を欠いたり、又は配列の上
流側又は下流側にヌクレオチドをいくつか追加したプロ
ーブであることができる。プローブの熱変性温度（以
下、Ｔｍ値と略す）は特に規定するものではないが、通
常プライマーのＴｍよりも約４℃以上高くする必要があ
る。好ましくは、プライマーのＴｍよりも約４℃から約
１０℃高いＴｍ値をもつプローブを使用することができ
る。また、ＴａｑＭａｎプローブを作製する際は、プロ
ーブの５’末端をＧ以外のヌクレオチドにする必要があ
る。さらに、プローブ中のＣの割合がＧの割合よりも高
くすることが望ましい。さらにまた、プローブの長さは
３０mer 以下であることが望ましい。
【００３１】本プローブを用いて菌を検出・定量する際
に設計するプライマーは、センス側を１番目から１０４
番目（大腸菌１６ＳｒＲＮＡ配列のナンバリング）の
間、好ましくは６９番目から１０４番目の間で、アンチ
センス側を１２８番目から２５０番目の間、好ましくは
１６２番目から２２６番目の間で設計されることができ
る。上述のように、プライマーのＴｍ値は、プローブの
Ｔｍ値よりも約４℃以上低くすること、好ましくは約４
℃から約１０℃低いＴｍ値にすることが好ましい。ま
た、高次構造を形成しないようにプライマーを設計する
こと、また、プライマーダイマーの形成を防止するため
に、プライマーの３’末端同士が相補的な配列にならな
いようにすることが好ましい。
に設計するプライマーは、センス側を１番目から１０４
番目（大腸菌１６ＳｒＲＮＡ配列のナンバリング）の
間、好ましくは６９番目から１０４番目の間で、アンチ
センス側を１２８番目から２５０番目の間、好ましくは
１６２番目から２２６番目の間で設計されることができ
る。上述のように、プライマーのＴｍ値は、プローブの
Ｔｍ値よりも約４℃以上低くすること、好ましくは約４
℃から約１０℃低いＴｍ値にすることが好ましい。ま
た、高次構造を形成しないようにプライマーを設計する
こと、また、プライマーダイマーの形成を防止するため
に、プライマーの３’末端同士が相補的な配列にならな
いようにすることが好ましい。
【００３２】
【実施例】以下の実施例において本願発明をさらに詳し
く説明するが、本願発明の範囲はこれらに限定されるも
のではない。
く説明するが、本願発明の範囲はこれらに限定されるも
のではない。
【００３３】実施例１ 乾燥重量１kgのドッグフードに５００ｇのおが屑と５０
ｇの牛糞堆肥を混ぜ、含水率が６０％になるように水を
補給した。その試料を有機性廃棄物分解装置内に投入
し、 １．２Ｌ／min ・ＤＭの条件で通気してドッグフー
ドを分解処理した。処理容器の壁温が試料温度よりも常
に１℃低くなるように温度制御し、 分解により生じた発
酵熱を利用するようにした。ドッグフードの分解処理過
程で、 ＣＯ 2 の発生速度に３つのピークがあった。１つ
目のピークは１３時間後、２つ目のピークは１７時間
後、３つ目のピークは24時間後であった。そこで、各ピ
ーク時にサンプリングし、各サンプルの菌叢について、
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（以下、 ＤＧＧＥと略
す）により解析した。この結果、以下の菌群が優先的に
働いていることが分かった：バチルス・サブチリス（Ba
cillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス（Baci
llus licheniformis) 、バチルス・サーモデニトリフィ
カンス（Bacillus thermodenitrificans) 、バチルス
（Bacillus）Ａ１０株、バチルス（Bacillus）Ａ１４
株、及びバチルス（Bacillus）Ｓ１株。バチルス（Baci
llus）Ａ１０株は、バチルス・サーモデニトリフィカン
ス（Bacillus thermodenitrificans) やバチルス・カル
ドキシルオリティキュ（Bacillus caldoxylolyticu) に
近縁な種、バチルス（Bacillus）Ａ１４株は、バチルス
・ハロジュランス（Bacillus halodurans)ヤバチルス・
サーモクロアカエ（Bacillus thermocloacae) に近縁な
種、バチルス（Bacillus）Ｓ１株は、バチルス・サーモ
スファエリカス（Bacillus thermosphaericus)に近縁な
種と考えられた。
ｇの牛糞堆肥を混ぜ、含水率が６０％になるように水を
補給した。その試料を有機性廃棄物分解装置内に投入
し、 １．２Ｌ／min ・ＤＭの条件で通気してドッグフー
ドを分解処理した。処理容器の壁温が試料温度よりも常
に１℃低くなるように温度制御し、 分解により生じた発
酵熱を利用するようにした。ドッグフードの分解処理過
程で、 ＣＯ 2 の発生速度に３つのピークがあった。１つ
目のピークは１３時間後、２つ目のピークは１７時間
後、３つ目のピークは24時間後であった。そこで、各ピ
ーク時にサンプリングし、各サンプルの菌叢について、
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（以下、 ＤＧＧＥと略
す）により解析した。この結果、以下の菌群が優先的に
働いていることが分かった：バチルス・サブチリス（Ba
cillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス（Baci
llus licheniformis) 、バチルス・サーモデニトリフィ
カンス（Bacillus thermodenitrificans) 、バチルス
（Bacillus）Ａ１０株、バチルス（Bacillus）Ａ１４
株、及びバチルス（Bacillus）Ｓ１株。バチルス（Baci
llus）Ａ１０株は、バチルス・サーモデニトリフィカン
ス（Bacillus thermodenitrificans) やバチルス・カル
ドキシルオリティキュ（Bacillus caldoxylolyticu) に
近縁な種、バチルス（Bacillus）Ａ１４株は、バチルス
・ハロジュランス（Bacillus halodurans)ヤバチルス・
サーモクロアカエ（Bacillus thermocloacae) に近縁な
種、バチルス（Bacillus）Ｓ１株は、バチルス・サーモ
スファエリカス（Bacillus thermosphaericus)に近縁な
種と考えられた。
【００３４】上記菌の各々の１６ＳｒＲＮＡ配列のＶＩ
−Ｖ２領域を解析したところ、配列番号１に示すものと
同じ配列を共通に有していた。そこで、配列番号１の上
流側及び下流側における変動領域の配列に基づき、各菌
のプライマーセットを以下のように設計した。 バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis)（増幅鎖
長；８５bp（配列番号２１）） 5'-AGCGGACAGATGGGAGCTT-3'(配列番号９） 5'-TTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTT-3'（配列番号１０） バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s) （増幅鎖長；６９bp（配列番号２２））
−Ｖ２領域を解析したところ、配列番号１に示すものと
同じ配列を共通に有していた。そこで、配列番号１の上
流側及び下流側における変動領域の配列に基づき、各菌
のプライマーセットを以下のように設計した。 バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis)（増幅鎖
長；８５bp（配列番号２１）） 5'-AGCGGACAGATGGGAGCTT-3'(配列番号９） 5'-TTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTT-3'（配列番号１０） バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s) （増幅鎖長；６９bp（配列番号２２））
【００３５】5'-CTTGCTCCCTTAGGTCAGCG-3'（配列番号１
１） 5'-TTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTT-3'（配列番号１２） バチルスサーモデントリフィカンス（Bacillus thermod
enitrificans) （増幅鎖長；６３bp（配列番号２３）） 5'-AGCTTGCTCTTGTTTGGGTCA-3'(配列番号１３） 5'-CTTGCGGGCAGGTTGC-3'（配列番号１４）
１） 5'-TTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTT-3'（配列番号１２） バチルスサーモデントリフィカンス（Bacillus thermod
enitrificans) （増幅鎖長；６３bp（配列番号２３）） 5'-AGCTTGCTCTTGTTTGGGTCA-3'(配列番号１３） 5'-CTTGCGGGCAGGTTGC-3'（配列番号１４）
【００３６】バチルス（Bacillus）Ａ１０株（増幅鎖
長；６５bp（配列番号２４）） 5'-CTTGCTTCTGTTCGGTTAGCG--3'（配列番号１５） 5'-CCGGTCTTACGGGCAGG-3' （配列番号１６） バチルス（Bacillus）Ａ１４株（増幅鎖長；６７bp（配
列番号２５）） 5'-GCTCGCTCTCCTTTCAGTCAG-3' （配列番号１７） 5'-GCGAGTTATCCCGGTCTTACAG-3'（配列番号１８） バチルス（Bacillus）Ｓ１株（増幅鎖長；１４７bp（配
列番号２６）） 5'-GCTTGCTTTTTATGAGGTTAGC-3'( 配列番号１９） 5'-GGTAGCAGAACCACCTTTCAACA-3'(配列番号２０）
長；６５bp（配列番号２４）） 5'-CTTGCTTCTGTTCGGTTAGCG--3'（配列番号１５） 5'-CCGGTCTTACGGGCAGG-3' （配列番号１６） バチルス（Bacillus）Ａ１４株（増幅鎖長；６７bp（配
列番号２５）） 5'-GCTCGCTCTCCTTTCAGTCAG-3' （配列番号１７） 5'-GCGAGTTATCCCGGTCTTACAG-3'（配列番号１８） バチルス（Bacillus）Ｓ１株（増幅鎖長；１４７bp（配
列番号２６）） 5'-GCTTGCTTTTTATGAGGTTAGC-3'( 配列番号１９） 5'-GGTAGCAGAACCACCTTTCAACA-3'(配列番号２０）
【００３７】上記各菌のプライマーセットを用いて、生
ゴミ処理サンプルから抽出したゲノムを鋳型としてＰＣ
Ｒをおこなった。ＰＣＲにおいては、９４℃で30秒保持
する熱変性工程と、５８℃で30秒保持するプライマー結
合工程と、７２℃で１分間保持する伸長工程からなるサ
イクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ溶液の組成を以下の
表１に示す。
ゴミ処理サンプルから抽出したゲノムを鋳型としてＰＣ
Ｒをおこなった。ＰＣＲにおいては、９４℃で30秒保持
する熱変性工程と、５８℃で30秒保持するプライマー結
合工程と、７２℃で１分間保持する伸長工程からなるサ
イクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ溶液の組成を以下の
表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】ＰＣＲにより、各菌由来のＤＮＡ断片を得
ることができた。バチルス・サブチリス（Bacillus sub
tilis)のプライマーセットを用いて増幅されたＤＮＡ断
片の塩基配列を配列番号２１に、バチルス・リケニフォ
ルミス（Bacillus licheniformis) のプライマーセット
を用いて増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２
２に、バチルス・サーモデントリフィカンス（Bacillus
thermodenitrificans) のプライマーセットを用いて増
幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２３に、バチ
ルス（Bacillus）Ａ１０株のプライマーセットを用いて
増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２４に、バ
チルス（Bacillus）Ａ１４株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２５に、
バチルス（Bacillus）Ｓ１株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２６に示
す。得られた各菌由来のＤＮＡ断片を標準ＤＮＡとし、
１×１０5 コピー数／μＬ、２×１０5 コピー数／μ
Ｌ、５×１０5 コピー数／μＬ、及び１×１０6 コピー
数／μＬとなるように、各ＤＮＡ断片を希釈調製した。
ることができた。バチルス・サブチリス（Bacillus sub
tilis)のプライマーセットを用いて増幅されたＤＮＡ断
片の塩基配列を配列番号２１に、バチルス・リケニフォ
ルミス（Bacillus licheniformis) のプライマーセット
を用いて増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２
２に、バチルス・サーモデントリフィカンス（Bacillus
thermodenitrificans) のプライマーセットを用いて増
幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２３に、バチ
ルス（Bacillus）Ａ１０株のプライマーセットを用いて
増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２４に、バ
チルス（Bacillus）Ａ１４株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２５に、
バチルス（Bacillus）Ｓ１株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２６に示
す。得られた各菌由来のＤＮＡ断片を標準ＤＮＡとし、
１×１０5 コピー数／μＬ、２×１０5 コピー数／μ
Ｌ、５×１０5 コピー数／μＬ、及び１×１０6 コピー
数／μＬとなるように、各ＤＮＡ断片を希釈調製した。
【００４０】配列番号１に示す配列のＴａｑＭａｎオリ
ゴヌクレオチドプローブ（５’末端にＦａｍレポータ
を、３’末端にＴａｍａｒａクエンチャーを修飾したも
の）を作製した。プライマーを各９００μＭ、そしてＴ
ａｑＭａｎプローブを２００μＭ含む、２倍希釈したＴ
ａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅ
ｒ Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズジャパン製）を用い
て、各菌について定量的ＰＣＲをおこなった。定量的Ｐ
ＣＲにおいては、９５℃１５秒の熱変性と６０℃１分の
プライマー結合・伸長反応を４０サイクル行なった。検
出・測定器として、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００（ＰＥバ
イオシステムズジャパン製）を用いた。
ゴヌクレオチドプローブ（５’末端にＦａｍレポータ
を、３’末端にＴａｍａｒａクエンチャーを修飾したも
の）を作製した。プライマーを各９００μＭ、そしてＴ
ａｑＭａｎプローブを２００μＭ含む、２倍希釈したＴ
ａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅ
ｒ Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズジャパン製）を用い
て、各菌について定量的ＰＣＲをおこなった。定量的Ｐ
ＣＲにおいては、９５℃１５秒の熱変性と６０℃１分の
プライマー結合・伸長反応を４０サイクル行なった。検
出・測定器として、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００（ＰＥバ
イオシステムズジャパン製）を用いた。
【００４１】解析した各菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の断片
数を７で割ることで、各試料中の各菌の数を求めた。各
試料における各菌の定量データを以下の表２に示す。表
２に示した菌数は、サンプル１００mg中における値であ
る。
数を７で割ることで、各試料中の各菌の数を求めた。各
試料における各菌の定量データを以下の表２に示す。表
２に示した菌数は、サンプル１００mg中における値であ
る。
【表２】
【００４２】このように、配列番号１に示す配列のＴａ
ｑＭａｎプローブを用いることで、生ゴミ処理過程にお
いて働くバチルス属の各菌種を迅速に検出・定量するこ
とが可能となった。
ｑＭａｎプローブを用いることで、生ゴミ処理過程にお
いて働くバチルス属の各菌種を迅速に検出・定量するこ
とが可能となった。
【００４３】実施例２ デンプンを主成分とする有機性廃棄物１kgに５００ｇの
おが屑と５０ｇの牛糞堆肥を混ぜ、含水率が６０％にな
るように水を補給した。その試料を有機性廃棄物分解装
置内に投入し、１．２Ｌ／min ・ＤＭの条件で通気して
分解処理した。試料温度は５０℃に保った。分解処理開
始後、２４時間目、７２時間目、及び９６時間目の３点
でサンプリングをおこない、各試料の菌叢について、変
製剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により解析し
た。この結果、紅色非硫黄細菌のβグループに属する以
下の細菌が働いていることが分かった。アルカリジーン
（Alcaligenes ）Ｓ６株、ボルデトラ（Bordetella）Ｓ
９株。
おが屑と５０ｇの牛糞堆肥を混ぜ、含水率が６０％にな
るように水を補給した。その試料を有機性廃棄物分解装
置内に投入し、１．２Ｌ／min ・ＤＭの条件で通気して
分解処理した。試料温度は５０℃に保った。分解処理開
始後、２４時間目、７２時間目、及び９６時間目の３点
でサンプリングをおこない、各試料の菌叢について、変
製剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により解析し
た。この結果、紅色非硫黄細菌のβグループに属する以
下の細菌が働いていることが分かった。アルカリジーン
（Alcaligenes ）Ｓ６株、ボルデトラ（Bordetella）Ｓ
９株。
【００４４】上記菌の各々の１６ＳｒＲＮＡ配列のＶ１
−Ｖ２領域を解析したところ、配列番号８に示すものと
同じ配列を共通に有していた。そこで、配列番号８の上
流側及び下流側における変動領域の配列に基づき、各菌
のプライマーセットを以下のように設計した。 アルカリジーン（Alcaligenes)Ｓ６株（増幅鎖長；１４
２bp（配列番号２７）） 5'-AGCGCGAGGTAAGCTTGCT-3'(配列番号２９） 5'-TGCGATCCCCCCCTTT-3'（配列番号３０） BordetellaＳ９株（増幅鎖長；１３５bp（配列番号２
８）） 5'-TTCGGCCTGGCGGC-3'（配列番号３１） 5'-AGAGGTCCCGAAGGATCCC-3' （配列番号３２）
−Ｖ２領域を解析したところ、配列番号８に示すものと
同じ配列を共通に有していた。そこで、配列番号８の上
流側及び下流側における変動領域の配列に基づき、各菌
のプライマーセットを以下のように設計した。 アルカリジーン（Alcaligenes)Ｓ６株（増幅鎖長；１４
２bp（配列番号２７）） 5'-AGCGCGAGGTAAGCTTGCT-3'(配列番号２９） 5'-TGCGATCCCCCCCTTT-3'（配列番号３０） BordetellaＳ９株（増幅鎖長；１３５bp（配列番号２
８）） 5'-TTCGGCCTGGCGGC-3'（配列番号３１） 5'-AGAGGTCCCGAAGGATCCC-3' （配列番号３２）
【００４５】上記各菌のプライマーセットを用いて、生
ゴミ処理サンプルから抽出したゲノムを鋳型としてＰＣ
Ｒをおこなった。ＰＣＲにおいては、９４℃で３０秒保
持する熱変性工程と、５８℃で３０秒保持するプライマ
ー結合工程と、７２℃で１分間保持する伸長工程からな
るサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ溶液の組成は表
１に示したものと同じであった。
ゴミ処理サンプルから抽出したゲノムを鋳型としてＰＣ
Ｒをおこなった。ＰＣＲにおいては、９４℃で３０秒保
持する熱変性工程と、５８℃で３０秒保持するプライマ
ー結合工程と、７２℃で１分間保持する伸長工程からな
るサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ溶液の組成は表
１に示したものと同じであった。
【００４６】ＰＣＲにより、各菌由来のＤＮＡ断片を得
ることができた。アルカリジーン（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ) Ｓ６株のプライマーセットを用いて増幅されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を配列番号２７に、ボルデトラ（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ）Ｓ９株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２８に示
す。得られた各菌由来のＤＮＡ断片を標準ＤＮＡとし、
１×１０5 コピー数／μＬ、２×１０5 コピー数／μ
Ｌ、５×１０5 コピー数／μＬ、及び１×１０6コピー
数／μＬとなるように、各ＤＮＡ断片を希釈調製した。
ることができた。アルカリジーン（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ) Ｓ６株のプライマーセットを用いて増幅されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を配列番号２７に、ボルデトラ（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａ）Ｓ９株のプライマーセットを用い
て増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号２８に示
す。得られた各菌由来のＤＮＡ断片を標準ＤＮＡとし、
１×１０5 コピー数／μＬ、２×１０5 コピー数／μ
Ｌ、５×１０5 コピー数／μＬ、及び１×１０6コピー
数／μＬとなるように、各ＤＮＡ断片を希釈調製した。
【００４７】配列番号８に示す配列のＴａｑＭａｎオリ
ゴヌクレオチドプローブ（５’末端にＦａｍレポータ
を、３’末端にＴａｍａｒａクエンチャーを修飾したも
の）を作製した。プライマーを各９００μＭ、そしてＴ
ａｑＭａｎプローブを２００μＭ含む、２倍希釈したＴ
ａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅ
ｒ Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズジャパン製）を用い
て、各菌について定量的ＰＣＲをおこなった。定量的Ｐ
ＣＲにおいては、９５℃１５秒の熱変性と６０℃１分の
プライマー結合・伸長反応を４０サイクル行なった。検
出・測定器には、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００（ＰＥバイ
オシステムズジャパン製）を用いた。
ゴヌクレオチドプローブ（５’末端にＦａｍレポータ
を、３’末端にＴａｍａｒａクエンチャーを修飾したも
の）を作製した。プライマーを各９００μＭ、そしてＴ
ａｑＭａｎプローブを２００μＭ含む、２倍希釈したＴ
ａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅ
ｒ Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズジャパン製）を用い
て、各菌について定量的ＰＣＲをおこなった。定量的Ｐ
ＣＲにおいては、９５℃１５秒の熱変性と６０℃１分の
プライマー結合・伸長反応を４０サイクル行なった。検
出・測定器には、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００（ＰＥバイ
オシステムズジャパン製）を用いた。
【００４８】解析した各菌の１６ＳｒＲＮＡ配列の断片
数を７で割ることで、各試料中の各菌の数を求めた。各
試料における各菌の定量データを以下の表３に示す。表
３に示した菌数は、サンプル１００mg中における値であ
る。
数を７で割ることで、各試料中の各菌の数を求めた。各
試料における各菌の定量データを以下の表３に示す。表
３に示した菌数は、サンプル１００mg中における値であ
る。
【表３】
【００４９】このように、配列番号８に示す配列のＴａ
ｑＭａｎプローブを用いることで、有機性廃棄物処理過
程において働く紅色非硫黄細菌のβグループに属する各
菌種を迅速に検出・定量することが可能となった。
ｑＭａｎプローブを用いることで、有機性廃棄物処理過
程において働く紅色非硫黄細菌のβグループに属する各
菌種を迅速に検出・定量することが可能となった。
【００５０】
【発明の効果】本願発明は、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡを
コードするＤＮＡのセンス側から数えて、１０４番目か
ら１２６番目の配列（5'-GGCGGACGGGTGAGTAATGTCTG-3')
に相当する真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮ
Ａ配列又はその相補的配列を含むオリゴヌクレオチドに
蛍光色素を付加したプローブと、上記プローブの上流側
及び下流側に存在する変動領域の配列に基づき設計した
プライマーとを用いてＰＣＲを行ない、そして変化した
プローブの蛍光波長において蛍光強度を測定することに
より、各種真正細菌群の中の特異的な種のみを検出・定
量する方法を提供するものである。本願発明のプローブ
を用いることにより、真正細菌における全ての菌種を迅
速に検出・定量することが可能となる。また、本願発明
に係る検出・定量方法においては、真正細菌間で非特異
的なプローブを用いることにより、バチルス属やレジオ
ネラ菌、放線菌、肺血症原因菌、紅色非硫黄細菌のαグ
ループや、紅色非硫黄細菌のβグループなどの検出に際
して、共通のプローブを用いることができるため経済的
である。
コードするＤＮＡのセンス側から数えて、１０４番目か
ら１２６番目の配列（5'-GGCGGACGGGTGAGTAATGTCTG-3')
に相当する真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮ
Ａ配列又はその相補的配列を含むオリゴヌクレオチドに
蛍光色素を付加したプローブと、上記プローブの上流側
及び下流側に存在する変動領域の配列に基づき設計した
プライマーとを用いてＰＣＲを行ない、そして変化した
プローブの蛍光波長において蛍光強度を測定することに
より、各種真正細菌群の中の特異的な種のみを検出・定
量する方法を提供するものである。本願発明のプローブ
を用いることにより、真正細菌における全ての菌種を迅
速に検出・定量することが可能となる。また、本願発明
に係る検出・定量方法においては、真正細菌間で非特異
的なプローブを用いることにより、バチルス属やレジオ
ネラ菌、放線菌、肺血症原因菌、紅色非硫黄細菌のαグ
ループや、紅色非硫黄細菌のβグループなどの検出に際
して、共通のプローブを用いることができるため経済的
である。
【配列表】 <110> Denso Co., Ltd. <120> A method for identifying and quantitatively determing eubacteria <130> ND 1004228 <160> 32 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 cacgtgttac tcacccgtcc gcc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 tacgtgttac tcacccgtcc gcc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 caagcattac tcacccgtcc gcc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cacgtgttac tcacccgttc gcc 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 tacgcgttac tcamccgtyc grc 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 asryrttact cacccgtccg ccrct 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 acgygttact cacccgtcyg ccrct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 atrywttact cacccgttcg ccact 25 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 agcggacaga tgggagctt 19 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ttatcccagt cttacaggca ggtt 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttgctccct taggtcagcg 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ttatcccagt cttacaggca ggtt 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 agcttgctct tgtttgggtc a 21 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cttgcgggca ggttgc 16 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 cttgcttctg ttcggttagc g 21 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ccggtcttac gggcagg 17 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gctcgctctc ctttcagtca g 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gcgagttatc ccggtcttac ag 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gcttgctttt tatgaggtta gc 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ggtagcagaa ccacctttca aca 23 <210> 21 <211> 85 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 21 agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg 60 taacctgcct gtaagactgg gataa 85 <210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 22 cttgctccct taggtcagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga 60 ctgggataa 69 <210> 23 <211> 63 <212> DNA <213> Bacillus thermodenitrificans <400> 23 agcttgctct tgtttgggtc agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcccgc 60 aag 63 <210> 24 <211> 65 <212> DNA <213> Bacillus A10 <400> 24 cttgcttctg ttcggttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccgtaag 60 accgg 65 <210> 25 <211> 77 <212> DNA <213> Bacillus A14 <400> 25 gctcgctctc ctttcagtca gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 60 agaccgg 67 <210> 26 <211> 147 <212> DNA <213> Bacillus S1 <400> 26 gcttgctttt tatgaggtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctat 60 agaccgggat aactcgcgga aacgcgtgct aataccggat aacacagcgg agcgcatgct 120 ccggtgttga aaggtggttc tgctacc 147 <210> 27 <211> 142 <212> DNA <213> Alcaligenes S6 <400> 27 agcgcgaggt aagcttgctt accttggcgg cgagtggcga acgggtgagt aatgtatcgg 60 aacgtgccca gtagcggggg ataactactc gaaagagtgg ctaataccgc atacgcccta 120 cgggggaaag ggggggatcg ca 147 <210> 28 <211> 135 <212> DNA <213> Bordetella S9 <400> 28 ttcggcctgg cggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgcat cggaacgtgc ccagtagtgg 60 gggataacca cgcgaaagcg tggctaatac cgcatacgcc cttaggggga aaggggggga 120 tccttcggga cctct 135 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 agcgcgaggt aagcttgct 19 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 tgcgatcccc cccttt 16 <210> 31 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 ttcggcctgg cggc 14 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 agaggtcccg aaggatccc 19
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA35 CB21 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB07 FB12 GC15 2G054 AA07 AB02 AB05 BB08 CA20 CA22 CE02 EA03 GA04 GB02 4B024 AA11 AA13 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ50 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QX02
Claims (25)
- 【請求項１】 各種真正細菌群の中の特異的な種のみを
検出・定量する方法であって、以下のステップ：（１）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６Ｓ
ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列のナンバリングにおい
て、真正細菌の１６ＳｒＲＮＡをコードするＤＮＡのセ
ンス側から数えて１０４番目から１２６番目の配列又は
その相補的配列を含むオリゴヌクレオチドに蛍光色素を
付加したプローブと、上記プローブの上流側及び下流側
に存在する変動領域の配列に基づき設計したプライマー
とを用いたポリメラーゼチェインリアクション；及び
（２）変化したプローブの蛍光波長における蛍光強度の
測定；を含む前記方法。 - 【請求項２】 前記の特異的な種が、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属及びその近縁属の細菌であり、か
つ、前記のオリゴヌクレオチドが配列番号１に記載の配
列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 配列番号１に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項４】 請求項２に記載の方法に用いられる、請
求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブ試
薬。 - 【請求項５】 前記の特異的な種が、ブレビバチルス
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス
（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びその近縁属の細
菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列番号
２に記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 配列番号２に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項７】 請求項５に記載の方法に用いられる、請
求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブ試
薬。 - 【請求項８】 前記の特異的な種が、アクチノバチルス
（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びその近縁属の
細菌であり、かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列番
号３に記載の配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 配列番号３に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項１０】 請求項８に記載の方法に用いられる、
請求項９に記載のオリゴヌクレオチドを含むプローブ試
薬。 - 【請求項１１】 前記の特異的な種が、ミコバクテリウ
ム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリ
ウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノ
マイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトマイ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒ
ｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）及びその近縁属の細菌であり、
かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列番号４に記載の
配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 配列番号４に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項１３】 請求項１１に記載の方法に用いられ
る、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドを含むプロ
ーブ試薬。 - 【請求項１４】 前記の特異的な種が、レジオネラ（Ｌ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属及びその近縁属の細菌であり、
かつ、前記のオリゴヌクレオチドが配列番号５に記載の
配列を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 配列番号５に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載の方法に用いられ
る、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドを含むプロ
ーブ試薬。 - 【請求項１７】 前記の特異的な種が、敗血症の原因菌
である、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細
菌及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）並
びにその近縁属の細菌であり、かつ、前記のオリゴヌク
レオチドが配列番号６に記載の配列を含む、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１８】 配列番号６に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項１９】 請求項１７に記載の方法に用いられ
る、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドを含むプロ
ーブ試薬。 - 【請求項２０】 前記の特異的な種が、アセトバクター
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブラデヒドビウム
（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、カウロバクター
（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属、グルコノバクター（Ｇ
ｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、パラコッカス（Ｐａｒ
ａｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｓｏｂｉｕ
ｍ）属などの紅色非硫黄細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ）のαグループに属する細菌であり、かつ、前記
のオリゴヌクレオチドが配列番号７に記載の配列を含
む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】 配列番号７に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項２２】 請求項２０に記載の方法に用いられ
る、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドを含むプロ
ーブ試薬。 - 【請求項２３】 前記の特異的な種が、アルカリジーン
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ボルデトラ（Ｂｏｒｄ
ｅｔｅｌｌａ）属、スファエロティルス（Ｓｐｈａｅｒ
ｏｔｉｌｕｓ）属、スピリラム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）
属などの紅色非硫黄細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉ
ａ）のβグループに属する細菌であり、かつ、前記のオ
リゴヌクレオチドが配列番号８に記載の配列を含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】 配列番号８に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法に用いられ
る、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドを含むプロ
ーブ試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241500A JP2002051783A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 真正細菌の検出・定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241500A JP2002051783A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 真正細菌の検出・定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002051783A true JP2002051783A (ja) | 2002-02-19 |
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ID=18732679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000241500A Pending JP2002051783A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 真正細菌の検出・定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002051783A (ja) |
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-
2000
- 2000-08-09 JP JP2000241500A patent/JP2002051783A/ja active Pending
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