FR2844522A1 - Procede et sequences nucleotidiques pour la detection et l'identification de microorganismes dans un melange complexe - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé pour la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit procédé comprenant une étape d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles spécifiques et exclusives. La présente invention a en outre pour objets des couples d'amorces pour amplification spécifiques et exclusifs, utiles à la mise en oeuvre dudit procédé, ainsi que des sondes nucléotidiques pour l'amplification en temps réel ou la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques et exclusives des bactéries contenues dans un mélange complexe. L'invention concerne enfin des outils de biologie moléculaire, à savoir un kit d'analyse et des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe.

Description

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PROCEDE ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION
ET L'IDENTIFICATION DE MICROORGANISMES DANS UN MELANGE
COMPLEXE
La présente invention relève du domaine de l'analyse de la contamination d'échantillons d'origine agro-alimentaire ou issus de l'environnement par exemple.

Dans le contexte de l'invention, I' analyse de tels échantillons s'entend de la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des microorganismes qu'ils contiennent.

En d'autres termes, l'invention s'inscrit dans le cadre de l'amélioration des procédures et l'élaboration de moyens efficaces aux fins de la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des microorganismes contenus dans des échantillons complexes. Ainsi, l'invention vise à fournir une méthode mettant en #uvre des techniques de biologie moléculaire, ainsi que des outils connexes,- adaptés à la détermination qualitative et/ou quantitative du contenu bactérien de mélanges complexes, notamment d'échantillons alimentaires.

Un mélange complexe désigne, au sens de la présente invention, toute composition contenant notamment des cellules de bactéries, ladite composition pouvant être de nature hétérogène, tel un échantillon alimentaire brut, non modifié par dessiccation par exemple, qui rassemble plusieurs constituants différents dont certains se trouvent à l'état liquide et d'autres solide, ou de nature plus homogène, telle une culture bactérienne.

La présente invention concerne un procédé pour la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit procédé comprenant une étape d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles.

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L'invention a en outre pour objets des couples d'amorces pour amplification utiles à la mise en oeuvre dudit procédé, ainsi que des sondes nucléotidiques pour la détection et, le cas échéant, la quantification de séquences d'acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe. Dans le cadre de l'invention, les sondes nucléotidiques peuvent être associées à des couples d'amorces pour amplification, aux fins de l'amplification en temps réel de séquences d'acides nucléiques cibles. Les sondes nucléotidiques peuvent également être utilisées pour la détection de séquences cibles selon des techniques d'hybridation ADN-ADN.

La présente invention concerne enfin des outils de biologie moléculaire, à savoir un kit d'analyse et des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe.

Les bactéries ou microorganismes procaryotes sont remarquables pour l'hétérogénéité de leurs caractéristiques, en particulier en termes de forme (bacilles, coques...); habitat (sol, eau, hôtes vivants...) ; structure des enveloppes cellulaires (éventuelle présence d'une paroi, composition de ladite paroi, éventuelle présence d'une membrane externe) ; régime saprophyte, commensal ou parasite ; spectre d'hôtes dans le cas des commensaux et parasites ; profil de pathogénicité et éventuels caractères de résistance aux antibiotiques caractéristiques de certains parasites ; aptitude à transférer des séquences d'acides nucléiques au sein de l'espèce, du genre, voire vers des espèces appartenant à d'autres genres bactériens... Le plus souvent, ces propriétés présentent une spécificité au niveau du genre ou de l'espèce bactérienne. Cependant, elles peuvent également être soumises à une extrême variabilité entre souches d'une même espèce du fait de facteurs environnementaux et conditions de stress différents orientant lesdites souches vers des voies d'évolution adaptative distinctes. Au vu d'un tel niveau d'hétérogénéité des propriétés des bactéries, l'on mesure aisément les difficultés posées par le typage et l'identification clairs et formels desdites bactéries lorsqu'elles sont

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contenues dans des échantillons complexes parmi d'autres composants cellulaires.

Pourtant, il n'en demeure pas moins qu'une telle identification intéresse nombre d'activités. A ce titre, elle représente un défi aux enjeux considérables.

Dans le domaine médical, il est de première nécessité de disposer de procédures et moyens d'identification des bactéries optimaux en termes de fiabilité et pouvoir discriminant, ceci eu égard aux problèmes de santé publique générés par les infections bactériennes, notamment les infections par des bactéries multirésistantes aux antibiotiques, parfois très difficiles à enrayer. Aussi l'identification précise des bactéries jusqu'au niveau de l'espèce a-t-elle pour objectif de répondre à plusieurs attentes, non seulement du public mais également du personnel médical. Pour ce dernier, il s'agit en particulier de pouvoir : (i) diagnostiquer avec exactitude les pathologies des patients ; (ii) anticiper en matière de traitements, lesquels sont dès lors plus ciblés et mieux adaptés aux pathologies en cause , (iii) prévenir et, le cas échéant, faire face à d'éventuelles rechutes ou récidives ; et (iv) approfondir les connaissances épidémiologiques relatives aux microorganismes pathogènes, notamment via la caractérisation des facteurs favorables au développement des infections.

Dans le domaine de la veille sanitaire, il convient de s'assurer de la qualité et l'innocuité des aliments disponibles sur le marché, en particulier afin d'écarter tout risque potentiel d'épidémie par contamination de masse.

A cet égard, les consommateurs se sentent concernés par les questions relatives aux propriétés nutritionnelles des aliments, leurs saveurs, leur caractère inoffensif, et parfois même leurs éventuelles vertus prophylactiques ou thérapeutiques, avec le concept récent des alimentsmédicaments , dits alicaments . La tendance actuelle du public vise à exiger une parfaite transparence tout au long de la chaîne alimentaire, c'est-à-dire tant au niveau de la production des matières premières ou produits finis et la fabrication des produits intermédiaires, qu'au niveau de

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l'acheminement desdits matières premières ou produits finis et intermédiaires vers leur site de vente, et qu'au niveau de leur commercialisation ou leur utilisation dans le cadre de la préparation de produits plus complexes, tels les plats cuisinés. C'est pourquoi des normes de sécurité et qualité ont été édictées à l'attention des producteurs, fabricants, transporteurs, distributeurs et restaurateurs, normes dont le nonrespect est sanctionné par des autorités spécialisées compétentes en matière de veille sanitaire, parmi lesquelles les experts vétérinaires et la Direction Générale de la Consommation, la Concurrence et la Répression des Fraudes. Ainsi, des contrôles sont effectués, de manière régulière ou sporadique, ponctuelle ou à plus grande échelle, afin de couvrir l'ensemble de la chaîne alimentaire, de la production jusqu'à la vente au particulier. A ce titre, il est fondamental de garantir qualité et fiabilité du contrôle microbiologique des aliments, s'agissant en particulier de la détermination du niveau zéro de contamination par des bactéries pathogènes pour l'homme et/ou les animaux.

Aux fins de la détection et l'identification des 'bactéries, l'on a longtemps fait appel à des procédés basés sur des réactions biochimiques permettant de mettre en évidence in vitro les caractéristiques phénotypiques et métaboliques propres aux souches testées. Cependant, ces méthodes conventionnelles montrent souvent une capacité limitée à identifier les bactéries jusqu'au niveau de l'espèce, en ce qu'elles reposent sur le résultat de réactions souvent aléatoires de métabolisation éventuellement fermentaire de diverses sources de nutriments, par exemple des sources de carbone et d'azote. En effet, l'identification phénotypique consiste à combiner et croiser les réponses des bactéries à une pluralité de tests biochimiques. En conséquence, lorsque certaines espèces ne répondent pas à un ou plusieurs desdits tests - ce qui est le cas de certaines espèces bactériennes qui, bien que pathogènes, sont rarement isolées en milieu hospitalier notamment - l'analyse devient hasardeuse et dépourvue d'objectivité. Aussi, pour en améliorer la

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spécificité et l'acuité, des tests complémentaires s'imposent, requérant alors temps, efforts et moyens parfois coûteux. En définitive, de tels procédés se révèlent longs et compliqués à mettre en #uvre, le résultat n'étant généralement obtenu qu'après 24 à 48 heures, et aléatoires en termes de spécificité et fiabilité. Certes, des systèmes commerciaux d'identification phénotypique, tels les galeries miniaturisées d'utilisation manuelle de la gamme API (bioMérieux, France) ou les cartes destinées à être ensemencées, incubées et lues au moyen d'un automate (VITEK#, bioMérieux, France), restent néanmoins utilisés en clinique et dans l'industrie. Cependant, les analyses en cause concernent des espèces bactériennes couramment isolées et faciles à cultiver. De plus, elles ne sont pas effectuées pour répondre à une urgence étant donné que les temps d'incubation requis par de tels systèmes atteignent souvent 24 heures.

Dans le but de développer des procédures conduisant à une discrimination rapide et correcte des bactéries, des approches alternatives aux traditionnels tests physiologiques ont été proposées. @
Certaines de ces approches demeurent dans le domaine de la caractérisation phénotypique, par exemple les méthodes fondées sur des réactions avec des anticorps ou le typage bactériophagique en fonction du profil des récepteurs bactériens. Cependant, de telles méthodes sont d'une reproductibilité discutable eu égard à la variabilité d'expression des caractéristiques phénotypiques en question, telle l'expression des facteurs de virulence et des antigènes, sporadique car influencée dans une très large mesure par l'environnement et le stress.

Quant aux autres procédures, elles ont été élaborées aux fins d'une discrimination non plus d'ordre phénotypique mais génotypique, c'est-à-dire au niveau des séquences d'acides nucléiques elles-mêmes et de leur organisation. Elles font à cet égard intervenir des techniques de biologie moléculaire (Gurtler et Mayall. 2001. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51 (Pt 1) : 3-16).

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En particulier, les méthodes de typage génétique revêtent un intérêt certain lorsque l'analyse concerne des pathogènes dont la manipulation est difficile et non-reproductible, du fait notamment d'une faible vitesse et d'une versatilité de croissance, ainsi que de l'absence de pré-requis spécifiques en termes de conditions de culture. De telles circonstances rendent les tests métaboliques tout à fait inappropriés (Versalovic et al. 1993. Arch.

Pathol. Lab. Med. 117 : 1088-1098).

Nombre de techniques de biologie moléculaire mises en #uvre pour le typage et la caractérisation des bactéries reposent sur une séparation électrophorétique des produits issus de la digestion des acides nucléiques desdites bactéries, ces produits présentant, espère-t-on, des tailles moléculaires différentes de manière à obtenir des profils de migration aussi clairs et exploitables que possible. Parmi ces techniques, l'on distingue notamment l'électrophorèse en champ pulsé (Pulse-Field Gel Electrophoresis ; PFGE), le polymorphisme de taille des fragments de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism ; RFLP) et le polymorphisme de taille des fragments issus du clivage par l'endonucléase Cleavase I (Cleavase I-Fragment Length Polymorphism ; CFLP) (Olive et Bean. 1999. J Clin. Microbiol. 37 : 1661-1669).

Malgré le temps et les efforts nécessaires aux mise au point et mise en oeuvre expérimentales, les profils de restriction ainsi générés s'avèrent souvent extrêmement complexes et ardus d'analyse et d'interprétation, requérant pour ce faire l'assistance de logiciels adaptés. Aussi les investissements imposés par la mise en #uvre de telles méthodes peuvent-ils être en définitive élevés, voire prohibitifs pour certaines structures, notamment les laboratoires et industries de petite envergure.

Plus simples et plus rapides, les réactions d'amplification, et notamment l'amplification par polymérisation en chaîne, plus communément appelée PCR (Polymerase Chain Reaction), permettent de caractériser des séquences d'acides nucléiques spécifiques d'espèces, en ciblant soit des gènes ubiquitaires tels ceux codant les ARN ribosomaux

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16S ou les D-alanine:D-alanine ligases, enzymes pivots du métabolisme de la paroi bactérienne (Evers et al. 1996. J. Mol. Evol. 42 : 706-712), soit des espaces intergéniques telle la région située entre les ADN ribosomaux 16S et 23S (Gurtler et Stanisich. 1996. Microbiology 142 (Pt 1) : 3-16).L'amplification passe par l'utilisation d'amorces nucléotidiques capables d'hybrider avec des séquences complémentaires présentes dans les molécules d'acides nucléiques servant de matrices. Il s'agit là d'une technique simple, facile à mettre en oeuvre en routine, fiable et reproductible si les outils utilisés, notamment les amorces, l'ADN polymérase et, dans le cas des amplifications thermo-dépendantes, les conditions de température, sont eux-mêmes respectivement spécifiques, fidèle et adaptées.

Dans le cadre de l'identification des bactéries, l'amplification, notamment la PCR, peut être appliquée seule ou, pour une différenciation plus fine des espèces, couplée à d'autres techniques, parmi lesquelles la détermination de la séquence des produits d'amplification, le RFLP et le polymorphisme de taille des produits d'amplification (Amplified Fragment Length Polymorphism ; AFLP) (Olive et Bean, 1999, supra). La mise en #uvre de ces dernières combinaisons de techniques, manifestement plus longue et plus lourde, n'est cependant pas nécessaire à l'établissement d'une analyse de routine.

En définitive, aux fins d'une telle analyse, qui doit être à la fois simple, rapide et efficace, la technique d'amplification peut se suffire à ellemême, pour autant que les moyens et outils utilisés répondent aux exigences de spécificité, fiabilité, reproductibilité et pouvoir discriminant évoquées supra. Une telle technique présente en outre l'avantage d'être particulièrement sensible et, en conséquence, de permettre de traiter de faibles volumes d'échantillons d'acides nucléiques.

Ainsi, compte-tenu des enjeux considérables en termes de santé et sécurité publique, il s'avère absolument nécessaire de développer des procédés de détection et identification des bactéries satisfaisant aux

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critères suivants, lesdits critères étant imposés par les exigences de mise en #uvre en routine rencontrées par les cliniciens, laboratoires de recherche et d'analyses, industries agroalimentaires et pharmaceutiques : (i) simplicité ; (ii) rapidité ; (iii) acuité ; (iv) fiabilité ; (v) reproductibilité ; (vi) performance, notamment au niveau du nombre d'échantillons susceptibles d'être traités simultanément ; (vii) coût ; et (viii) volume des installations.

La présente invention concerne donc un procédé de détection, identification et, le cas échéant, quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit procédé remplissant l'ensemble des impératifs de mise en oeuvre répertoriés ci-dessus. Ce procédé implique la réalisation d'au moins deux réactions d'amplification, simultanées mais séparées dans l'espace, d'au moins deux séquences d'acides nucléiques cibles spécifiques et exclusives d'au moins deux espèces, genres ou groupes bactériens distincts. A cet égard, ledit procédé comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples. -d'amorces pour amplification et, le cas échéant, au moins deux sondes associées, chaque couple et chaque sonde associée audit couple étant spécifiques et exclusifs d'une séquence nucléotidique cible ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles, notamment par PCR en temps réel ; et c) la détection de la présence, l'identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans le mélange complexe de départ.

Les amorces pour amplification et sondes associées objets de la présente invention ont été choisies à partir de séquences cibles issues de la littérature en application du critère suivant, dit de double spécificité, à savoir une spécificité de séquence et de taille.

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D'une part, la spécificité de séquence est telle que : (i) lesdites amorces et sondes associées pourraient être utilisées dans le cadre de réactions d'amplification de type multiplex, c'est-à-dire des réactions d'amplification multiples, simultanées et ayant lieu au sein d'un seul et même milieu réactionnel, et ce, sans risque d'obtenir des produits d'amplification secondaires non désirés, susceptibles de fausser l'analyse ; (II) elles ne sont pas hybridables entre elles, ce qui prévient l'obtention de résultats faussement négatifs ; et (iii) elles sont spécifiques de séquences nucléotidiques elles-mêmes spécifiques d'espèces ou de genres, voire de groupes bactériens.

D'autre part, la spécificité de taille des produits d'amplification générés permet d'attribuer sans ambiguïté, au moyen de méthodes analytiques conventionnelles connues de l'homme du métier, telle l'électrophorèse sur gel, chacun desdits produits à la bactérie dont il est issu.

Lesdites amorces pour amplification et sondes associées, en sus d'être spécifiques, sont également exclusives dans- les conditions d'utilisation décrites dans le cadre de la présente invention.

Cette exclusivité s'entend non seulement (i) à l'égard des espèces, genres voire groupes bactériens en présence, les amorces et sondes étant choisies de manière à éviter toute hybridation avec les acides nucléiques d'autres espèces, genres ou groupes bactériens que celui effectivement recherché, mais aussi (ii) vis-à-vis des séquences nucléotidiques de l'espèce, du genre ou du groupe cible, dans la mesure où lesdites amorces et sondes ne sont pas capables d'hybrider avec d'autres séquences que la séquence souhaitée. A ce titre, l'exclusivité des amorces pour amplification et sondes associées selon l'invention garantit l'obtention de résultats dépourvus de faux-positifs.

Les caractéristiques de spécificité et exclusivité sus-définies sont applicables non seulement aux amorces pour amplification et sondes associées, mais aussi aux séquences d'acides nucléiques cibles.

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Dans le cadre de la présente description, l'on conviendra que les termes espèces ou espèces bactériennes pourront faire référence, selon les cas, à des espèces bactériennes proprement dites et conformément à l'usage taxonomique classique, ou à des genres bactériens, niveau de classification taxonomique immédiatement supérieur à l'espèce, ou encore à des groupes bactériens, lesdits groupes représentant soit des familles bactériennes telles que classiquement répertoriées dans le domaine de la systématique microbienne et correspondant au niveau de classification situé au-dessus du genre, soit des groupes de genres ou de familles de bactéries présentant un ou plusieurs caractères phénotypiques ou physiologiques communs. Par exemple, de tels groupes bactériens peuvent rassembler les bacilles par opposition aux coques, ou les organismes mésophiles (i.e., les organismes dont la température optimale de croissance se situe entre 20 et 37 C environ) par opposition aux organismes psychrophiles ou thermophiles (i.e., les organismes dont la température optimale de croissance se situe respectivement entre 4 et 10 C environ ou entre 45 et 60 C environ), ou encore les bactéries saprophytes (i.e., les bactéries vivant dans la nature de manière indépendante) par opposition aux bactéries commensales, symbiotiques ou parasites (i.e., les bactéries vivant en association étroite avec les cellules hôtes, respectivement sans bénéfice ni désavantage pour les unes et les autres, ou tirant chacune bénéfice de cette association, ou encore dont seules les bactéries tirent bénéfice, ces dernières altérant généralement le métabolisme des cellules hôtes). L'homme du métier spécialisé en bactériologie est parfaitement à même de définir des groupes bactériens, en sus de ceux listés ci-dessus, sur la base de critères morphologiques et/ou phénotypiques et/ou physiologiques communs. Le sens à donner aux termes espèces ou espèces bactériennes ressortira clairement du contexte. En particulier, l'homme du métier pourra se référer au Tableau # infra pour savoir si les séquences nucléotidiques cibles des réactions d'amplification, et les séquences des amorces pour

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amplification et sondes associées selon l'invention, sont spécifiques et exclusives d'espèces, genres (Salmonella spp. par exemple) ou groupes bactériens (Escherichia coli, Shigella spp., Yersinia enterocolitica et Hafnia alvei par exemple).

Ainsi, un mode préféré de mise en oeuvre du procédé objet de l'invention consiste à utiliser à titre de matrice un échantillon constitué d'acides nucléiques préalablement extraits et purifiés à partir des cellules de bactéries contenues dans un mélange complexe, notamment alimentaire, à l'aide d'un automate d'extraction. Un exemple d'un tel automate a été décrit dans la demande de brevet français N 0204424 relative à un procédé d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
1) la clarification du, mélange par filtration ;
2) la rétention des microorganismes contenus dans le filtrat sur un dispositif de type cartouche de filtration ;
3) la lyse des microorganismes in situ ;
4) la récupération des acides nucléiques à partir de la cartouche de filtration ; et
5) la concentration et la purification des acides nucléiques par chromatographie d'adsorption liquide-solide, telle la chromatographie sur colonne de silice.

La demande N 0204424 concerne également un automate capable de mettre en #uvre un tel procédé d'extraction.

Selon le procédé de détection objet de la présente invention, le terme amplification est revêtu d'un sens générique, en ce qu'il fait référence à toute technique de biologie moléculaire dont le principe consiste à amplifier ou multiplier de manière exponentielle une séquence d'acide nucléique cible. L'on peut citer à titre d'exemples non limitatifs, la PCR, l'amplification par transcription (Transcription-Mediated Amplification ; TMA), l'amplification basée sur des séquences d'acides nucléiques

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(Nucleic Acid Sequence Based Amplification ; NASBA), l'auto-réplication de séquences (Self-Sustained Sequence Replication ; 3SR), l'amplification par déplacement de brin (Strand Displacement Amplification ; SDA) et la réaction de ligature en chaîne (Ligase Chain Reaction ; LCR).

Il convient de noter que l'acronyme PCR peut être utilisé dans le cadre de la présente invention pour désigner de manière spécifique la réaction de PCR, ou de manière indifférente toute réaction d'amplification telle que celles sus-citées.

Les réactions d'amplification ainsi visées peuvent être isothermes ou nécessiter l'exposition cyclique à différentes températures. Selon cette dernière configuration, l'on parle avantageusement de réaction d'amplification thermo-dépendante , bien que ce dernier terme puisse parfois être tacite, auquel cas l'homme du métier est à même de le déduire clairement et sans ambiguïté du contexte.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'amplification est effectuée aux fins d'une détection purement qualitative des bactéries contenues dans un mélange complexe.

En revanche, selon un autre mode de réalisation, l'analyse effectuée conformément au procédé objet de l'invention est quantitative, en ce qu'elle permet de déterminer la concentration initiale de la séquence cible au sein de l'échantillon d'acides nucléiques. Il est alors fait appel aux techniques d'amplification dite quantitative , cinétique ou en temps réel connues de l'homme du métier.

En particulier, ces techniques permettent de mesurer par fluorescence l'accumulation des produits au cours de la réaction d'amplification, l'intensité de la fluorescence émise étant proportionnelle à la quantité de molécules amplifiées. De nombreux systèmes de détection en temps réel des produits d'amplification PCR ont ainsi été développés, parmi lesquels l'on distingue les agents intercalants émettant un signal fluorescent lorsqu'ils sont liés à l'ADN double brin ( DNA binding dye ), les amorces fluorescentes, les sondes d'hybridation et les sondes

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d'hydrolyse (pour revue, voir Le Technoscope intitulé La PCR en temps réel , cahier N 139, dans la revue Biofutur N 219 de février 2002).

Parmi les systèmes les plus utilisés, figurent notamment les sondes d'hydrolyse de type TaqManTM (ABI, Foster City, CA, Etats-Unis). Ces sondes comptent entre 25 et 35 nucléotides environ, et portent un fluorophore au niveau de leur extrémité 5' et un absorbeur de fluorescence (ci-après quencheur ) à l'extrémité 3'. Le quencheur, placé à faible distance du fluorophore, absorbe la fluorescence émise par celui-ci et émet une fluorescence qui n'est pas détectée par l'automate PCR. A titre d'exemple, le S-TAMRA, qui ré-émet à 568 nm peut être inhibé. La Taq DNA polymérase (ci-après Taq polymérase ), de par son activité exonucléase dans le sens 5' vers 3', va dégrader la sonde hybridée à la région de la séquence cible qui lui est complémentaire. Cette dégradation est effectuée par l'enzyme de manière séquentielle, à partir de l'extrémité 5' de la sonde. C'est précisément ce processus de dégradation par hydrolyse de la sonde qui est à l'origine de la fluorescence émise, le fluorophore étant ainsi physiquement séparé du quencheur par un mécanisme impliquant directement la séquence à détecter.

Brièvement, lors de l'étape d'hybridation de la réaction PCR, les amorces pour amplification et la sonde associée reconnaissent leur séquence complémentaire. La Taq polymérase procède ensuite à l'extension des amorces dans le sens 5' vers 3' jusqu'à rencontrer la structure double brin formée par la région de la séquence cible hybridée avec la sonde. L'activité exonucléase de 5' vers 3' de l'enzyme clive alors séquentiellement la sonde à partir de son extrémité 5'. Cette hydrolyse progressive libère le fluorophore dans le milieu réactionnel, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence émise. La mesure de la fluorescence au terme de chaque étape d'extension de la réaction PCR permet de suivre l'évolution de la réaction au cours du temps et de déterminer la concentration initiale en acides nucléiques cibles dans l'échantillon de départ.

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L'on peut également citer à titre purement illustratif les balises moléculaires ( molecular beacons ), appartenant au groupe des sondes d'hybridation. Ces balises portent un fluorophore et un quencheur, respectivement situés aux extrémités 5' et 3' des sondes. Les séquences des extrémités 5' et 3' des sondes sont dessinées indépendamment de la séquence cible et sont mutuellement complémentaires, afin de former en solution une structure tige-boucle, ou structure en épingle à cheveux, dans laquelle fluorophore et quencheur sont situés en vis-à-vis. La région centrale des sondes est complémentaire d'une région interne de la séquence cible, et forme la boucle de cette structure. En présence de la séquence cible, les sondes s'hybrident à leur séquence complémentaire par leur partie centrale, ce qui provoque le déploiement de la structure repliée des sondes. Le fluorophore est alors séparé du quencheur. A la différence de la chimie TaqManTM, la fluorescence émise doit être mesurée durant l'étape d'hybridation, lorsque les sondes émettent un signal fluorescent en se liant à la région de la séquence cible qui leur est complémentaire.

Au sens de la présente invention, le terme analyse ainsi que l'expression détection de bactéries sont susceptibles de signifier à la fois détection, identification et, le cas échéant, quantification desdites bactéries. Un tel sens ressort pour l'homme du métier clairement et sans équivoque du contexte.

La présente invention concerne un procédé d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace dans la mesure où se déroulent, non pas une réaction d'amplification à l'aide d'un trio unique comprenant un couple d'amorces et une sonde associée, mais plusieurs réactions concomitantes d'amplification de plusieurs séquences cibles différentes présentes dans le même échantillon, lesdites réactions étant telles que : (i) elles mettent en jeu plusieurs trios distincts associant couples d'amorces et sondes ; (ii) à chaque couple d'amorces et sonde associée est assigné un espace réactionnel particulier ; et (iii)

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chaque réaction d'amplification est effectuée au sein d'un milieu réactionnel spécifique, contenu dans ledit espace.

Avantageusement, un tel espace est une chambre réactionnelle d'une cartouche à usage unique décrite dans la demande de brevet US n 09/981070 bénéficiant de la priorité de la demande de brevet français publiée le 1er février 2002 sous le numéro 2812306. Par exemple, une telle cartouche comprend notamment une pluralité de chambres réactionnelles, chacune contenant un couple d'amorces et une sonde associée pour l'amplification de séquences nucléotidiques cibles, auxquelles se trouve relié un réservoir d'alimentation en échantillon d'acides nucléiques servant de matrices lors des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace. Le nombre de chambres réactionnelles peut varier de 20 à 500 environ, ou de 30 à 100 environ. Par exemple, le Genedisc, commercialisé par GeneSystems (Bruz, France), comprend 36 chambres réactionnelles.

Cette cartouche est utilisable dans un dispositif de type automate pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques, ledit dispositif comprenant, outre la ou les cartouches elles-mêmes, au moins une platine de chauffage dont au moins deux zones distinctes peuvent être portées à au moins deux températures différentes et maintenues constantes, chaque température correspondant ainsi à une étape donnée d'un cycle d'amplification, à savoir l'étape de dénaturation, d'hybridation ou d'élongation, ainsi que des moyens de déplacement relatif entre la ou les cartouches et la ou les platines, ledit déplacement assurant une exposition cyclique des chambres réactionnelles d'une cartouche à la température de chacune des zones d'une platine, ce qui permet d'enchaîner automatiquement les cycles de la réaction d'amplification se déroulant à l'intérieur desdites chambres.

Au sens de l'invention, le terme plusieurs s'entend comme étant synonyme des expressions, elles-mêmes équivalentes, au moins deux et deux ou plus .

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Les acides nucléiques couvrent, selon l'acception usuelle, les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt).

Les réactions d'amplification sont applicables tant aux ADN qu'aux ARN, moyennant dans le second cas, l'introduction d'une étape préliminaire de transcription inverse, fournissant une copie de l'ARN sous la forme d'un ADNc et générant par là-même une matrice utilisable aux fins de l'amplification à l'aide des couples d'amorces nucléotidiques choisis et, le cas échéant, des sondes associées auxdits couples. En ce cas, la réaction d'amplification est connue de l'homme du métier sous l'acronyme RT-PCR (Reverse Transcription - PCR). Elle figure parmi l'ensemble des réactions regroupées, conformément à la définition supra, sous la dénomination amplification ou PCR .

D'après le vocabulaire usuel en matière de PCR, les séquences d'acides nucléiques à amplifier sont dites cibles ou matrices .

Comme précisé supra, dans le contexte particulier de la présente invention, lesdites séquences sont revêtues des propriétés de spécificité et exclusivité telles que définies supra.

Ainsi, selon le procédé objet de la présente invention, les séquences d'acides nucléiques cibles sont amplifiées à l'aide de couples d'amorces nucléotidiques spécifiques et exclusives, l'expression amorce spécifique et exclusive désignant en l'espèce toute séquence nucléotidique utile comme amorce pour amplification et capable d'hybrider en conditions strictes avec au moins 80 % des séquences d'acides nucléiques cibles. Les conditions strictes d'hybridation obéissent à la définition classique et sont connues de l'homme du métier (Sambrook et Russel. 2001. Molecular cloning : a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) Des conditions strictes d'hybridation sont, par exemple, des conditions permettant l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin, et ce, après au moins une étape de lavage.

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L'étape d'hybridation peut notamment être réalisée à environ 65 C, dans une solution comprenant du SSC 6X, du SDS 0,5 %, de la solution de Denhardt 5X et 100 g d'ADN non spécifique (par exemple de l'ADN de sperme de saumon), ou dans toute autre solution de force ionique équivalente. L'étape suivante, comprenant au moins un lavage, est par exemple effectuée à environ 65 C, dans une solution comprenant du SSC à au plus 0,2X et du SDS à au plus 0,1 %, ou dans toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions d'hybridation dépendent de la température Tm à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. S'agissant des séquences de plus de 30 bases, la température Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41x(% G+C) + 16,6xLog(concentration en cations) - 0,63x(% formamide) - (600/nombre de bases). Pour les séquences de moins de 30 bases, la température Tm est définie par la relation : Tm = 4x(nombre de G+C) + 2x(nombre de A+T).

Les conditions d'hybridation peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille des séquences, la teneur en GC et d'autres paramètres, comme indiqué notamment dans les protocoles décrits dans Sambrook et Russel (2001, supra).

Les termes et expressions amorces , amorces pour amplification et amorces nucléotidiques sont équivalents au sens de la présente invention. Il est entendu que les amorces ainsi désignées sont nécessairement spécifiques et exclusives, même si tel n'est pas toujours explicitement précisé dans le texte.

De manière préférée, le procédé selon la présente invention conduit à la détection de bactéries pathogènes de mammifères, hommes et/ou animaux. En particulier, ledit procédé permet de détecter la présence éventuelle de plusieurs espèces bactériennes parmi les agents infectieux pathogènes suivants : Escherichia coli et/ou Shigella spp. et/ou Hafnia alvei et/ou Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Y. enterocolitica et Campylobacter jejuni. Ces espèces bactériennes

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figurent, pour l'essentiel, parmi les contaminants alimentaires les plus fréquents et les plus préoccupants eu égard à leur pathogénicité et leur résistance, voire leur multirésistance vis-à-vis des antibiotiques courants.

S'agissant de H. alvei, cette entérobactérie, bien que rare, peut néanmoins être à l'origine de l'altération de certains aliments, notamment des viandes emballées sous une atmosphère pauvre en oxygène. En outre, H. alvei est difficile à identifier par les méthodes conventionnelles et fréquemment confondue avec des Salmonelles par exemple. La présente invention permet précisément de discriminer de façon simple et rapide H. alvei de Salmonella spp..

Pour la plupart, ces bactéries sont pathogènes et provoquent des troubles gastro-intestinaux (diarrhées, vomissements... ), parfois sévères et éventuellement accompagnés de fièvres. Elles représentent à cet égard un danger particulier pour les femmes enceintes, les jeunes enfants et les personnes âgées notamment, danger qu'il convient d'écarter par des mesures au besoin drastiques, comme l'atteste le fait que ces dernières années ont vu se multiplier les campagnes de retrait d'aliments, en particulier de fromages au lait cru, dans lesquels les concentrations en Listeria monocytogenes ou Salmonella spp. dépassaient les seuils normatifs tolérés.

Afin de détecter les espèces bactériennes sus-visées, les couples d'amorces et sondes associées ci-après ont été choisis ou dessinés de manière à remplir les conditions de spécificité et d'exclusivité requises dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention et en particulier, de l'étape d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace.

Avantageusement, les séquences nucléotidiques dessinées pour E. coli permettent également d'identifier H. alvei, et par-là même de distinguer cette espèce bactérienne des Salmonelles, avec lesquelles elle est généralement confondue.

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Le cas échéant, la discrimination ultérieure entre E. coli et H. alvei peut être effectuée par détermination du type de nitrate réductase, la majorité des entérobactéries, dont E. coli, possédant une nitrate réductase du type A, alors que H. alvei possède une nitrate réductase du type B (pour la procédure à suivre aux fins de cette détermination, voir Marchai et al.

1982. ln Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimique des bactéries. Doin Editeurs, Paris, France).

Les séquences dessinées pour E. coli permettent, outre H. alvei, de détecter également Shigella spp. et Y. enterocolitica.

Cependant, la distinction entre E. coli, Shigella spp. et H. alvei d'une part, et Y. enterocolitica d'autre part, est assurée par l'utilisation des séquences nucléotidiques spécifiques et exclusives de cette dernière espèce bactérienne.

Par ailleurs, la discrimination entre E. coli, Shigella spp. et H. alvei peut être effectuée sur la base de critères biochimiques tels que celui susmentionné et, par exemple, en utilisant des tests commerciaux de type Galerie API20E (bioMérieux, supra).

Le couple d'amorces (LmHlyAf ; LmHlyAr) a été décrit par Nogva et al. (2000. Appl. Environ. Microb. 66 : 4266-4271). Les couples d'amorces (Ye86f; Ye86r), (Ec97f ; Ec97r), (Se98f ; Se98r), (Sa193f; Sa193r), (Bc84f ; Bc84r), (Cp97f ; Cp97r) et (Cju76f ; Cju76r) ont été dessinés aux fins de la présente invention d'après les séquences génomiques respectivement publiées et déposées dans GenBank par Ibrahim et al.

(1997. J. Clin. Microbiol. 35 : 1636-1638 ; N d'accès X65999), Smith et al.

(1992. J. Bacteriol. 174 : 5820-5826 ; N d'accès M84024), Bâumler et al.

(1996. Gene 183 : 207-213 ; N d'accès U62129), Shortle (1983. Gene 22 : 181-189 ; N d'accès V01281), Gilmore étal. (1989. J. Bacteriol. 171 : 744- 753 ;N d'accès M24149), Saint-Joanis étal. (1989. Mol. Gen. Genet. 219 : 453-460 ; N d'accès X17300) et Taylor et al. (1990. Mol. Cell. Probes 4 : 261-271 ; N d'accès U27272).

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Le Tableau # suivant détaille, pour chaque bactérie, les caractéristiques des couples d'amorces et sondes associées, ainsi que des produits d'amplification générés au moyen desdits couples. Dans ce Tableau, les séquences SEQ ID N 17 à 24, dont le nom porte l'extension TqFT , correspondent aux sondes associées aux couples d'amorces pour amplification, lesdites sondes étant par exemple de type TaqMan TM (supra).

Il est entendu que toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences des sondes figurant dans le Tableau I, en ce qu'elle répond aux définitions de spécificité et exclusivité de séquence données supra, est susceptible d'être utilisée, dans le cadre de la présente invention, comme sonde.

De même, il est clair que toute séquence nucléotidique présentant un niveau de similarité de 80 % au moins vis-à-vis des séquences des amorces listées dans le Tableau I, est susceptible d'être utilisée comme amorce pour amplification conformément à l'invention. L'on entend ici par niveau de similarité de 80 % au moins entre deux séquences nucléotidiques , le fait qu'elles présentent au moins 80 % de bases identiques sur toute leur longueur, lesdites bases pouvant être consécutives, en tout ou en partie seulement. Les séquences similaires ainsi envisagées peuvent être de la même longueur que les séquences figurant dans le Tableau I, ou d'une longueur différente alors comprise entre 15 et 35 bases.

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TABLEAU

Désignation des SGQ mène Taille cles Irocluits Bactérie amorces et des Séquence SEQ 11) (,ètie Produit du gène Taille des produits

<tb> sondes <SEP> N <SEP> cible <SEP> d'amplification <SEP> (pb)
<tb> LmHlyAf <SEP> 5' <SEP> CCTgCAAgTCCTAAgACgCCA <SEP> 3'
<tb>

Listeria Lisiei-ia LiiiHlyAr 5'CAC'l'gCA'FC'I'CCgl'ggl'A'I'AC lllyl L,istéi-iolysiiie 1 13 monocylogenes LmH)yAr 5'CAC-)gCATCTCCgTggTATAC3- /// Listériolysine O

<tb> Lml13TqFT <SEP> 5' <SEP> CgATTTCATCCgCgTgTTTCTTTTCg <SEP> 3' <SEP> 17
<tb> Ye86f <SEP> 5' <SEP> CAgTgATgCATTATCgACACC <SEP> 3' <SEP> 3
<tb> Yersinia
<tb> Yersinia <SEP> Ye86r <SEP> 5' <SEP> CATACTgACTTCggCTggT <SEP> 3' <SEP> 4 <SEP> Yst <SEP> enterotoxine <SEP> 86
<tb> Ye86TqFT <SEP> 5' <SEP> CAAgCAAgCTTgTgATCCTCCgC <SEP> 3' <SEP> 18
<tb>

Escherichia coli Ec97f 5' CgACC'I'gCg'l'TgCg T'AAA'TATg 3'

<tb> et/ou <SEP> Hafnia <SEP> alvei <SEP> Ec97r <SEP> 5' <SEP> CCTCggAAgAACCATggTgT <SEP> 3' <SEP> 6 <SEP> GAD <SEP> glutamate
<tb>

et/ou Sliigella spp. IJc971' q FT 5 CCgAAAAA TggTCAggCCgTTe3' 19 décarboxylase

<tb> @
<tb> et/ou <SEP> Yersinia <SEP> 19 <SEP> ND <SEP> ND
<tb> enterocolitica
<tb> Se98f <SEP> 5' <SEP> TggACCACTgATTgCCgCTA <SEP> 3' <SEP> 7
<tb> Salmonella <SEP> spp. <SEP> Se98r <SEP> 5' <SEP> gTgATTTCgTCACgCCTTTg <SEP> 3' <SEP> 8 <SEP> IroB <SEP> glucosyl- <SEP> 98
<tb> transferase
<tb> Se98TqFT <SEP> 5' <SEP> CTTCggTCATACgCCCTggCAC <SEP> 3' <SEP> 20
<tb> Sal93f <SEP> 5' <SEP> ATggACgTggCTTAgCgTAT <SEP> 3' <SEP> 9
<tb> Staphylococcus <SEP> Sa193r <SEP> 5' <SEP> TgACCTgAATCAgCgTTgTC <SEP> 3' <SEP> 10 <SEP> Nuc <SEP> nucléase <SEP> 193
<tb> Sa <SEP> 1 <SEP> 93TqFT <SEP> 5' <SEP> TCgTCAAggCTTggCTAAAgTTgC <SEP> 3' <SEP> 21
<tb>

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<tb> Bc84f <SEP> 5' <SEP> gATTggTTCgTAAgAgCAgC <SEP> I'g <SEP> 3' <SEP> 11
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> Bc84r <SEP> 5' <SEP> AACgCTTACCTgTCATTggTG <SEP> 3' <SEP> 12 <SEP> CerA <SEP> phospholipase <SEP> C <SEP> 84
<tb> Bc84TqFT <SEP> 5' <SEP> TgCAgATAAATggCgCgCTgAAg <SEP> 3' <SEP> 22
<tb> Cp97f <SEP> 5' <SEP> CTATCTTggAgAAgCTATgCAC <SEP> 3' <SEP> 13
<tb>

Cl().\:I.idiul11 Cp97r s' g^l'CI'CAAACT'TAACATg'ICCTg 3' 14 PLC toxine alpha ou 97

<tb> perfringens <SEP> phospholipase <SEP> C
<tb> Cp97TqFT <SEP> 5' <SEP> CATCCTgCTAATgTTACTgCCgTTg <SEP> 3' <SEP> 23
<tb> Cju76f <SEP> 5'CTTgCAAATCgTTCTTTggg3' <SEP> 15
<tb>

'(.l1nlyl()hacter C u76r s' TA g C gg 'rAC g ACT g TCTT gg 3' 16 ND ND 76

<tb> Cju76TqFT <SEP> 5' <SEP> TCAAACCCTAACCTCAgCTCCAgC <SEP> 3' <SEP> 24
<tb> ND, <SEP> non <SEP> déterminé.
<tb>

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Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet de la présente invention, l'étape b) relative aux amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, des séquences nucléotidiques cibles est du type thermo-dépendante, telle la PCR en temps réel. En ce cas, un cycle d'amplification comprend au moins les sous-étapes suivantes : b1) l'étape de dénaturation, au cours de laquelle l'ADN double brin est séparé en deux molécules d'ADN simple brin, est effectuée entre 94 et 95 C, de préférence à environ 94 C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence pendant 30 secondes ; b2) l'étape d'hybridation, permettant d'apparier aux acides nucléiques simple brin complémentaires, lesquels serviront de matrices dans l'étape suivante, les amorces nucléotidiques spécifiques et, le cas échéant, la sonde associée, est réalisée entre 55 et 62 C, de préférence à environ 60 C, la température de cette étape étant en tous les cas dictée par les séquences des couples d'amorces pour amplification et sondes associées (cf. la définition de la température Tm supra), pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence pendant 30 secondes ; et b3) l'étape d'élongation, conduisant à la réplication de la ou des matrices, est mise en oeuvre entre 60 C et 72 C, pendant 15 secondes à 2 minutes, de préférence pendant 30 secondes environ.

Avantageusement, l'étape b) du procédé objet de l'invention comprend, outre les sous-étapes b1) à b3) susvisées, une sous-étape préliminaire bO) d'activation de la Taq polymérase à une température de 94 C environ, pendant 3 à 15 minutes, de préférence pendant 3 à 5 minutes. Cette étape bO) est facultative, mais devient requise si la Taq polymérase utilisée est une enzyme dite Hot start , telle la PlatinumTM Taq DNA Polymerase (InvitrogenTM Life Technologies, Invitrogen, Cergy Pontoise, France).

De manière générale, les sous-étapes b1) à b3) supra subissent au moins 40 cycles d'amplification.

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La présente invention a en outre pour objets des couples d'amorces pour amplification utiles à la mise en #uvre du procédé décrit ci-dessus pour la détection ae séquences d'acides nucléiques spécifiques et exclusives de bactéries contenues dans un mélange complexe.

Lesdits couples d'amorces permettent l'amplification de fragments d'acides nucléiques spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B cereus, C. perfringens et C. jejuni, et sont constitués par des séquences choisies parmi les amorces suivantes : - Ye86f (SEQ ID N 3) et Ye86r (SEQ ID N 4) pour Y. enterocolitica ; - Ec97f (SEQ ID N 5) et Ec97r (SEQ ID N 6) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; - Se98f (SEQ ID N 7) et Se98r (SEQ ID N 8) pour
Salmonella spp., ; - Sa193f (SEQ ID N 9) et Sa193r (SEQ ID N 10) pour S. aureus ; - Bc84f (SEQ ID N 11) et Bc84r (SEQ ID N 12) pour B. cereus ; - Cp97f (SEQ ID N 13) et Cp97r (SEQ ID N 14) pour C. perfringens ; et - Cju76f (SEQ ID N 15) et Cju76r (SEQ ID N 16) pour C. jejuni.

Comme indiqué précédemment, l'on considère en outre que toute séquence similaire à au moins 80 % à l'une des séquences nucléotidiques sus-visées, constitue une amorce spécifique et exclusive convenant à une utilisation dans le cadre d'un procédé de détection des espèces bactériennes simple, rapide et fiable, et en particulier dans le cadre du procédé objet de l'invention.

En outre, la présente invention a pour objets des sondes nucléotidiques pouvant être, selon les modes de réalisation, associées à

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des couples d'amorces pour amplification tels que ceux décrits ci-dessus, aux fins de l'amplification en temps réel de séquences d'acides nucléiques cibles, ou utilisées pour la détection de séquences cibles selon des techniques d'hybridation ADN-ADN.

Ainsi, selon un premier mode de réalisation des sondes objets de l'invention, celles-ci sont utilisées dans le cadre de réactions d'amplification en temps réel, conformément aux principes de la chimie TaqManTM (supra) ou des balises moléculaires évoqués précédemment et connus de l'homme du métier. En particulier, lesdites sondes sont des oligonucléotides de type TaqManTM (supra), marqués en 5' par un fluorophore, telle la 6méthylfluorescéine (FAM), et en 3' par un quencheur, telle la tétraméthylrhodamine (TAMRA), dont les séquences, spécifiques et exclusives d'espèces bactériennes, sont choisies parmi : - Lm113TqFT (SEQ ID N 17) pour L. monocytogenes ; - Ye86TqFT (SEQ.ID N 18) pour Y. enterocolitica ; - Ec97TqFT (SEQ ID N 19) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou
Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; - Se98TqFT (SEQ ID N 20) pour Salmonella spp. ; - Sa193TqFT (SEQ ID N 21) pour S. aureus ; - Bc84TqFT (SEQ ID N 22) pour B. cereus ; - Cp97TqFT (SEQ ID N 23) pour C. perfringens ; - Cju76TqFT (SEQ ID N 24) pour C. jejuni ; et - toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins
80 % avec les séquences ci-dessus.

De préférence, les sondes sus-citées sont utilisées en association avec les couples d'amorces pour amplification décrits supra.

Selon un autre mode de réalisation des sondes nucléotidiques objets de la présente invention, celles-ci sont utiles pour la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques et exclusives de bactéries contenues dans un mélange complexe. Lesdites sondes, marquées chimiquement (à froid) ou radioactivement (à chaud), permettent alors la

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mise en #uvre de procédures d'hybridation telles l'hybridation Southern, l'hybridation sur colonies et l'hybridation sur dépôts en points (Dot Biot) (Sambrook et Russel, 2001, supra). Ces techniques d'hybridation, couramment utilisées tant en laboratoire que dans l'industrie, font à ce titre partie des connaissances générales de l'homme du métier.

Ainsi, les sondes nucléotidiques objets de l'invention permettent la détection de fragments d'acides nucléiques spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B. cereus, C. perfringens et C. jejuni.

Selon un premier aspect de ce mode de réalisation, lesdites sondes sont constituées par les produits d'amplification obtenus à l'aide des couples d'amorces dont les séquences sont choisies parmi :
Ye86f (SEQ ID N 3) et Ye86r (SEQ ID N 4) pour Y. enterocolitica ; - Ec97f (SEQ ID N 5) et Ec97r (SEQ ID N 6) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; - Se98f (SEQ ID N 7) et Se98r (SEQ ID N 8) pour
Salmonella spp. ; - Sa193f (SEQ ID N 9) et Sa193r (SEQ ID N 10) pour S. aureus ; - Bc84f (SEQ ID N 11) et Bc84r (SEQ ID N 12) pour B. cereus ; - Cp97f (SEQ ID N 13) et Cp97r (SEQ ID N 14) pour C. perfringens ; et - Cju76f (SEQ ID N 15) et Cju76r (SEQ ID N 16) pour C. jejuni ; et - toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins
80 % avec les séquences ci-dessus.

Selon un autre aspect, les sondes objets de l'invention sont des oligonucléotides dont les séquences sont choisies parmi :

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Lm113TqFT (SEQ ID N 17) pourL. monocytogenes ;
Ye86TqFT (SEQ ID N 18) pour Y. enterocolitica ;
Ec97TqFT (SEQ ID N 19) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou
Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ;
Se98TqFT (SEQ ID N 20) pour Salmonella spp. ;
Sa193TqFT (SEQ ID N 21) pour S. aureus ;
Bc84TqFT (SEQ ID N 22) pour B. cereus ;
Cp97TqFT (SEQ ID N 23) pour C. perfringens ;
Cju76TqFT (SEQ ID N 24) pour C. jejuni ; et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins
80 % avec les séquences ci-dessus.

Il est entendu que, pour la mise en oeuvre de cet aspect de l'invention, les séquences SEQ ID N 17 à 24, utiles pour la détection d'espèces bactériennes par des techniques d'hybridation ADN-ADN, sont dépourvues des marquages au moyen d'un fluorophore en 5' et d'un quencheur en 3', caractéristiques des systèmes TaqManTM (supra) ou des balises moléculaires, tels que décrits supra.

La présente invention concerne enfin des outils de biologie moléculaire, kit d'analyse et micro-réseaux ou puces à acides nucléiques, pour la détection de bactéries contenues dans un mélange complexe.

Ainsi, la présente invention vise un kit ou système pour la détection des acides nucléiques d'au moins deux espèces bactériennes différentes contenues dans un mélange complexe. Ledit kit permet notamment de mettre en #uvre le procédé selon l'invention, en ce qu'il fournit des couples d'amorces utilisables lors de l'étape d'amplifications multiples dudit procédé. Ainsi, ce kit comprend : - au moins deux couples d'amorces dont les séquences sont choisies dans le groupe constitué par SEQ ID N 1 à SEQ ID N 16 du Tableau I, et toute séquence similaire à 80 % au moins à ces dernières, pour l'amplification de fragments spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y.

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enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens et C. jejuni ; - et/ou au moins deux sondes nucléotidiques, respectivement marquées en 5' et en 3' par un fluorophore et un quencheur, sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N 17 à SEQ ID N 24 du Tableau I, et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières ; - et/ou au moins deux sondes nucléotidiques choisies dans le groupe comprenant les sondes de séquences SEQ ID N 17 à 24 (Tableau I, supra), dépourvues des marquages par un fluorophore en 5' et un quencheur en 3', les produits d'amplification obtenus à l'aide des couples d'amorces de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 16 (Tableau I, supra), et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières, pour la détection de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens et C. jejuni.

L'invention porte enfin sur des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection d'au moins deux espèces bactériennes différentes contenues dans un mélange complexe.

Selon un premier mode de réalisation, un micro-réseau conforme à la présente invention est utile aux fins de la mise en oeuvre de réactions d'amplification multiples, simultanées mais séparées dans l'espace. Ledit micro-réseau comprend alors : - au moins deux couples d'amorces dont les séquences sont choisies dans le groupe constitué par SEQ ID N 1 à SEQ ID N 16 du Tableau I, et toute séquence similaire à 80 % au moins à ces dernières, pour l'amplification de fragments spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens et C. jejuni ;

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- et, le cas échéant, au moins deux sondes nucléotidiques, respectivement marquées en 5' et en 3' par un fluorophore et un quencheur, sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N 17 à SEQ ID N 24 du Tableau I, et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières.

Selon un autre mode de réalisation, un micro-réseau objet de l'invention peut servir à la détection d'au moins deux espèces bactériennes parmi Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens et C. jejuni, lesdites espèces étant contenues dans un mélange complexe, et la détection étant effectuée par des techniques d'hybridation ADN-ADN. En ce cas, le micro-réseau comprend au moins deux sondes nucléotidiques choisies parmi : les séquences SEQ ID N 17 à 24 (Tableau I, supra), dépourvues du fluorophore en 5' et du quencheur en 3', et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins
80 % avec ces dernières ; et les produits d'amplification obtenus à l'aide des couples d'amorces de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 16 (Tableau I, supra) et toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci.

Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention.

Figure 1: courbes d'amplification obtenues avec l'ADN de L. monocytogenes en utilisant les amorces LmHlyAF (SEQ ID n 1) et LmHlyAR (SEQ ID n 2) ainsi que la sonde Lm113TqFT (SEQ ID n 17) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : *, 5.105 ; , ,5.104; ,5.103; 5.102 ; et , 5 copies par réaction.

RFU : unité de fluorescence relative.

Figure 2 : courbes d'amplification de l'ADN de L. monocytogenes obtenues par détection multiparamétrique en PCR rotative.

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Figure 3: courbes obtenues par amplification de l'ADN de Salmonella spp. à l'aide des amorces Se98f (SEQ ID n 7) et Se98r (SEQ ID n 8) en présence de la sonde Se98TqFT (SEQ ID n 20) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : ,5.105; 5.104; 5.103 ; , , 5.102; 50;et 5 copies par réaction.

Figure 4 : électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.

Pistes 1 et 2 : fragments obtenus par amplification de l'ADN de Salmonella spp. à l'aide des amorces Se98f (SEQ ID n 7) et Se98r (SEQ ID n 8), respectivement à partir de 5.105 et 5 copies d'équivalents génomique.

Piste 3 : témoin négatif de PCR (les 5 l d'ADN ont été remplacés par 5 l d'eau).

Piste Mq : marqueur de poids moléculaire (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen, supra)
Figure 5 : courbes obtenues par amplification de l'ADN de E. coli en utilisant les amorces Ec97f (SEQ ID n 5) et Ec97r (SEQ ID n 6) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : , 5.106; , 5.105; 5.103 ; , 50 ; et . , 5 copies par réaction.

Figure 6: courbes d'amplification de l'ADN de Y. enterocolitica obtenues à l'aide des amorces Ye86f (SEQ ID n 3) et Ye86r (SEQ ID n 4) associées à la sonde Ye86TqFT (SEQ ID n 18) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : , 5.106 ; , 5.105 ; 5.104 ; , ,5.103; 5.102; #, 50 ;et , 5 copies par réaction.

Figure 7 : courbes d'amplification de l'ADN de B. cereus en utilisant les amorces Bc84f (SEQ ID n 11) et Bc84r (SEQ ID n 12) ainsi que la sonde Bc84TqFT (SEQ ID n 22) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : ,5.106; , 5.105; ,5.104; ,5.103 ;
5.102 ; et , 50 copies par réaction.

Figure 8 : électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.

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Pistes 1 et 2: fragments issus de l'amplification de l'ADN de B. cereus à l'aide des amorces Bc84f (SEQ ID n 11) et Bc84r (SEQ ID n 12), respectivement à partir de 5.106 et 50 copies d'équivalents génomique.

Piste 3 : témoin négatif de PCR (les 5 l d'ADN ont été remplacés par 5 l d'eau) ; la bande qui apparaît correspond à des dimères d'amorces.

Piste Mq : marqueur de poids moléculaire (Low DNA Mass Ladder, supra).

Figure 9 : courbes d'amplification de l'ADN de B. cereus obtenues par détection multiparamétrique en PCR rotative.

Figure 10: courbes obtenues par amplification de l'ADN de C. perfringens en utilisant les amorces Cp97f (SEQ ID n 13) et Cp97r (SEQ ID n 14) ainsi que la sonde associée Cp97TqFT (SEQ ID n 23) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : , 5.106; ,5.105; #, 5.104 ; 5.103; . 5.102 ; , 50 ; et , 5 copies par réaction.

Figure 11 : courbes d'amplification de l'ADN de C. jejuni obtenues à l'aide des amorces Cju76f (SEQ ID n 15) et Cju76r (SEQ ID n 16) associées à la sonde Cju76TqFT (SEQ ID n 24) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : , 5.105 ; , 5.104 ; , 5.103 ; , 5.102 ; 50 ; et , 5 copies par réaction.

Figure 12 : courbes d'amplification de l'ADN de S. aureus obtenues à l'aide des amorces Sa193f (SEQ ID n 9) et Sa193r (SEQ ID n 10) ainsi que la sonde Sa193TqFT (SEQ ID n 21) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de: 5.106; , 5.105; , 5.104; , 5.10 3 ; 5.102 ; et 50 copies par réaction.

La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, vise à illustrer l'invention, sans en limiter la portée.

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PARTIE EXPERIMENTALE
1- Conditions de mise en #uvre des réactions PCR :
1-1- Mélange réactionnel :
Dans un volume final compris entre environ 5 et 15 l, et de préférence égal à environ 10 l, les réactifs classiques des réactions PCR ont été ajoutés Selon les conditions de mise en oeuvre, il s'est parfois avéré utile de rajouter du Tween20, notamment afin d'éliminer les inhibiteurs résiduels de la Taq DNA polymérase éventuellement présents dans le mélange réactionnel.

Le Tableau Il ci-dessous indique les concentrations finales des différents constituants du mix réactionnel, lequel correspond, dans le cadre de la présente invention, au mélange réactionnel avant addition de l'échantillon d'acides nucléiques.

TABLEAU Il
Constituant Concentration finale
Amorces et sondes associées entre 0,1 et 0,5 pmole/L de chaque, de préférence 0,25 mole/L de chaque
Tampon de PCR 10X 1X MgCI2 entre environ 2 et 5 mmole/L, de préférence environ 4 mmole/L
Mélange dNTP au moins 200 mole/L de chaque Tween20 entre 0 et 0,01 %
Taq DNA polymérase entre environ 0,5 et 0,75 unités
Selon un mode particulier de mise en #uvre de l'invention, les réactions PCR ont été effectuées dans les conditions suivantes.

Le tampon de PCR 10X, par exemple le Qiagen PCR Buffer 10X (Qiagen, Courtaboeuf, France), avait pour composition la formule suivante :
Tris-HCI, KCI, (NH4)2SO4 et MgCl2, et un pH égal à 8,7 (mesuré à 20 C).

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Le mélange dNTP était constitué de 10 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP (Sigma-Aldrich, Lyon, France).

Le mélange réactionnel pour une réaction d'amplification avait la composition suivante :
5 l de mix réactionnel, soit :
1 l de Qiagen PCR Buffer 10X
1 l de MgCl2 à 25 mM
0,2 l de mélange dNTP
0,75 unités de Taq DNA polymérase (Qiagen, supra) eau ultra pure qsp. 5 l et 5 l d'échantillon d'acides nucléiques, soit un volume final de 10 l.

I-2- Echantillons d'acides nucléiques : 1-2-1- Extraction d'ADN génomique à partir d'une culture pure ;
Aux fins de la lyse chimique des cellules bactériennes, 500 l d'une culture bactérienne pure ont été mélangés à 500 l d'une solution de TENS 2X - Chelex-100 15 % (Tris-HCI 100 mM pH 8,0 ; EDTA 40 mM pH 8,0 ; NaCI 200 mM ; 2 % et Chelex-100 15 %) ou à 500 l d'une solution de Chelex-100 à 25 % dans l'eau.

Ce mélange a été incubé entre 60 et 100 C, pendant 10 à 20 minutes.

Le cas échéant, ce mélange a subi un deuxième traitement de lyse cellulaire, par voie mécanique.

Ce traitement mécanique, consistant en l'ultrasonication des cellules bactériennes et/ou des résidus issus de la lyse chimique, a été appliqué au mélange subséquemment à la lyse chimique, dans les mêmes conditions de tampon et température que celle-ci.

Dans certains cas, la lyse par traitement mécanique pouvait être appliquée alternativement à la lyse chimique.

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De manière facultative, le lysat a été purifié et concentré à l'aide du système Nucleospin Plant L (Macherey Nagel, Düren, Allemagne).

En ce cas, les acides nucléiques ont été mélangés volume à volume avec un tampon de liaison ( C4 ) et de l'éthanol absolu. Ce mélange a été vigoureusement agité pendant 30 secondes, puis déposé sur une colonne de silice.

La colonne a été lavée successivement avec 1 et 2 ml des tampons CQW et C5 , respectivement, avant d'être séchée pendant 10 minutes par centrifugation à 5500 x g, à température ambiante.

Afin d'éluer l'ADN fixé sur la silice, 200 l de tampon CE préchauffé à 70 C ont été incubés 5 minutes sur la colonne.

Alternativement, si le lysat n'était pas purifié, 200 L étaient prélevés et stockés dans la glace en vue de l'analyse par PCR.

1-2-2- Extraction d'acides nucléiques à partir d'une matrice alimentaire :
25 g de matrice alimentaire ont été dilués dans 225 ml d'EPT [eau peptonée tamponnée (Biokar, Beauvais, France) ] ou de Fraser (Biokar), respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. ou Listeria monocytogenes.

Le mélange a été homogénéisé à l'aide d'un stomacher pendant 3 minutes.

Les milieux ainsi obtenus ont été incubés 18 h à 37 C et 24 h à 30 C, respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. et en L, monocytogenes.

Entre 1 et 10 ml de broyat alimentaire ont été prélevés et centrifugés 5 minutes à 500 x g afin d'éliminer les gros débris, i.e., les particules de matrice alimentaire de grande taille.

Le surnageant a été récupéré puis centrifugé 3 minutes à 16 000 x g.

300 l de tampon TENS 2X - Chelex-100 15% ou de solution aqueuse de Chelex-100 à 25% ont été ajoutés au culot bactérien.

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Ce mélange a été incubé entre 60 et 100 C aux fins de la lyse chimique (voir paragraphe 1-2-1- supra).

Comme décrit ci-dessus, le mélange pouvait, de manière alternative ou subséquente à la lyse chimique, être traité mécaniquement.

De manière facultative, le lysat a été purifié et concentré à l'aide du système Nucleospin Plant L (voir paragraphe 1-2-1- supra).

Alternativement, si le lysat n'était pas purifié, 200 l étaient prélevés et stockés dans la glace en vue de l'analyse par PCR.

I-3- Dépôts dans le Genedisc#:
Comme indiqué dans la partie descriptive, la présente invention est susceptible d'être mise en #uvre au moyen d'une cartouche à usage unique décrite dans la demande de brevet US n 09/981070 bénéficiant de la priorité de la demande de brevet français publiée le 1er février 2002 sous le numéro 2812306. Le Genedisc commercialisé par GeneSystems (Bruz, France) est un exemple d'une telle cartouche.

Cette cartouche, et en particulier le Genedisc, est utilisable dans un dispositif de type automate pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques, également décrit dans les demandes de brevet sus-citées.

Avantageusement, le Genedisc est divisé en secteurs identiques.

L'on désigne par secteur , une partie du Genedisc# constituée d'une fraction du nombre total de chambres réactionnelles portées par ledit Genedisc#, par exemple 1/3 ou 1/6 des 36 chambres, associée à un compartiment du réservoir central, ledit compartiment alimentant les chambres réactionnelles comprises dans la fraction susvisée. Par exemple, le réservoir central du Genedisc# est divisé en trois ou six compartiments en tous points identiques, chacun de ces compartiments assurant ainsi la desserte d'un tiers ou d'un sixième du nombre total de chambres réactionnelles. Le Genedisc comprend alors, selon cet exemple, trois ou six secteurs.

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Les composants suivants ont été préalablement déposés dans les chambres réactionnelles du Genedisc : les amorces et sondes associées, ainsi que le Tween20. S'agissant des amorces et sondes, chaque trio couple d'amorces et sonde associée a été déposé dans une ou plusieurs chambres réactionnelles du Genedisc. Le Tween20 a, quant à lui, été distribué dans toutes les chambres réactionnelles.

Les autres constituants cités dans le Tableau Il ci-dessus ont été déposés, avec l'échantillon d'acides nucléiques, dans le réservoir d'alimentation du Genedisc.

Pour un secteur du Genedisc, le volume de mélange réactionnel à préparer comme décrit dans le paragraphe 1-1- supra, correspondait au volume de mélange réactionnel pour une amplification (10 l) multiplié par le nombre de chambres réactionnelles incluses dans le secteur, chacune desdites chambres étant le siège d'une amplification. Par exemple, avec un Genedisc# comprenant trois secteurs, un secteur étant alors représenté par un tiers des 36 chambres, c'est-à-dire 12 chambres, le volume de mélange réactionnel à préparer pour un secteur était de 120 l.

Ainsi, pour chaque secteur du Genedisc, les 120 l de mélange réactionnel ont été déposés dans un compartiment du réservoir central. Le mélange a ensuite été desservi dans les chambres réactionnelles contenant les pré-dépôts de trios , couples d'amorces et sondes associées, et de Tween20 à des concentrations respectives de 200 nM et 0,01 % pour 10 l finals.

1-4- Mise en oeuvre de l'étape d'amplifications multiples retape b) du procédé objet de l'inventionl :
Le nombre de cycles d'amplification effectués au cours de cette étape a varié entre 40 et 45.

En fin de réaction, les secteurs du Genedisc ont été ramenés à température ambiante.

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Il- Exemples et résultats :
11-1- Analyse multiparamétrique :
Un mélange d'acides nucléiques extraits de cultures pures de L. monocytogenes et B. cereus, respectivement à 102 et 105 copies d'équivalents d'ADN génomique par l, a été ajouté au mix réactionnel, avant d'être introduit dans un compartiment du réservoir du Genedisc.

Comme indiqué dans le paragraphe 1-3 précédent, du Tween20, à une concentration finale de 0,01 %, ainsi que les couples d'amorces et sondes spécifiques de L. monocytogenes et B. cereus, à une concentration finale de 200 nM, avaient préalablement été déposés dans les chambres réactionnelles du secteur correspondant, à raison d'une répartition de 8 chambres par microorganisme à détecter, soit un total de 16 chambres réactionnelles.

La PCR rotative a permis,d'obtenir des courbes d'amplification dans le cadre des deux détections, avec des cycles seuils (cycles à partir desquels la fluorescence est significativement plus élevée que le bruit de fond ; Ct) moyens respectifs de 25,2 0. 84 cycles et 29,5 0,55 cycles pour B. cereus (Figure 11) et L. monocytogenes (Figure 3).

II-2- Comparaison de la mise en #uvre manuelle vs automatisée, à l'aide du Genedisc#:
Deux échantillons d'acides nucléiques extraits de steak haché enrichi en L. monocytogenes ont été soumis à une amplification par PCR dans un volume réactionnel final de 10 l, d'une part manuellement, par un expérimentateur, dans le iCycler# (Bio-Rad, Marne la Coquette, France), et d'autre part de manière automatisée, à l'aide du Genedisc, dans le Genedisc Cycler (GeneSystems, Bruz, France).

Les extraits d'ADN ont été dilués au 10eme avant d'être ajoutés au mélange réactionnel.

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Les Ct moyens calculés par les deux appareils étaient comparables, avec des valeurs de 26,4 1,7 et 26,2 0,2 cycles pour le iCycler, et 26,3
0,3 et 25,8 0,1 pour le Genedisc Cycler.

II-3- Amplification des acides nucléiques extraits de cultures pures par des couples d'amorces et sondes associées spécifiques d'espèces, genres ou groupes bactériens :
11-3-1- Microorganismes étudiés :
Les amplifications ont été effectuées dans un volume réactionnel final de 10 l, sur des gammes de dilution au 10ème d'échantillons d'acides nucléiques extraits de cultures pures de Listeria monocytogenes (11 souches), Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Salmonella spp. (27 sérovars), Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, . Çampylobacter coli, Campylobacter lari, Escherichia coli (4 souches), Clostridium perfringens, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus durans, Pseudômonas stutzeri, Shigella flexneri, Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia rettgeri, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes et Enterobacter cloacae (2 souches), en utilisant les couples d'amorces et sondes associées objets de la présente invention.

11-3-2- Séquences dessinées pour la détection de Listeria monocytogenes :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour la détection de L. monocytogenes ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 1). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu avec les autres espèces de Listeria, pas plus qu'avec les bactéries étudiées appartenant à d'autres genres que Listeria. Le produit d'amplification (SEQ. ID n 25 et 26 ci-dessous) a été

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purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins en utilisant les amorces LmHlyAf (SEQ ID n 1) et LmHlyAr (SEQ ID n 2). La séquence SEQ ID n 25 a été obtenue en utilisant l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n 2).

Les nucléotides situés entre les positions 72 et 92, soulignés dans la séquence SEQ ID n 25 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n 1). La séquence SEQ ID n 26 a été déterminée à l'aide de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n 1).

Les nucléotides soulignés, situés entre les positions 74 et 94 de la séquence SEQ ID n 26 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n 2). La séquence du produit d'amplification ainsi déterminée sur chaque brin et correspondant aux séquences SEQ ID n 25 et SEQ ID n 26, était identique à la séquence cible recherchée.

SEQ ID n 25 5'ATACATTGTTTTTATTGTAATCCAATCCTTGTATATACTTATCGATTT
CATGCCGCGTGTTTCTTTTCGATTGGCGTCTTAGGACTTGCAGG 3'
SEQ ID n 26 .

5'CGAAAAGAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATT
GGATTACAATATAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTG3'
11-3-3- Séquences dessinées pour la détection de Salmonella spp. :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour l'amplification d'une séquence de Salmonella spp. ont permis d'amplifier un fragment de la taille attendue, et ce, de manière spécifique, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 3). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions réalisées sur les extraits provenant des autres genres bactériens étudiés. La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse sur gel d'agarose était conforme à la taille attendue, à savoir 98 pb (Figure 4).

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11-3-4- Séquences dessinées pour la détection de Escherichia coli :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour E. coli ont permis d'amplifier un fragment d'ADN de la taille attendue pour les 4 souches d'E. coli étudiées (Figure 5), ainsi que pour Y. enterocolitica, S. flexnen et H. alvei.

11-3-5- Séquences dessinées pour la détection de Yersinia enterocolitica :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour Y. enterocolitica ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 6). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu dans le cadre des réactions réalisées sur les extraits provenant des genres bactériens étudiés autres que Yersinia. Le produit d'amplification unique a été purifié. La séquence de ce produit, correspondant à la séquence SEQ ID n 27, a été déterminée en utilisant l'amorce Ye86f (SEQ ID n 3). Les bases situées entre les positions 37 et 56, soulignées dans la séquence SEQ ID n 27 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Ye86r (SEQ ID n 4). La séquence SEQ ID n 27 ci-dessous correspondait à la séquence cible attendue.

SEQ ID n 27 :
5'TGANGTTTANCAGCAAGCTTGTGATCCTCCGTCGCCACCAGCCG
AAGTCAGTAGTGATCCAGCCGAAG 3'
11-3-6- Séquences dessinées pour la détection de Bacillus cereus :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour B. cereus ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique, avec une sensibilité de 50 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 7). La taille du produit d'amplification a été vérifiée

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par électrophorèse sur gel d'agarose et correspondait effectivement à la taille attendue, à savoir 84 pb (Figure 8). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions effectuées sur les extraits provenant d'autres genres bactériens.

11-3-7- Séquences dessinées pour la détection de Clostridium perfnngens :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour C. perfringens ont permis d'obtenir, de manière spécifique à cette espèce, des courbes d'amplification en temps réel, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction de PCR (Figure 10). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu lors des réactions réalisées sur les extraits provenant des genres bactériens étudiés autres que Clostridium. Le produit d'amplification a été purifié. Sa séquence, SEQ ID n 28, a été déterminée en utilisant l'amorce Cp97f (SEQ ID n 13). Les nucléotides soulignés dans la séquence SEQ ID n 28 ci-dessous, situés entre les positions 59 et 78, représentent l'amorce Cp97r (SEQ ID n 14). La séquence SEQ ID n 28 ci-dessous était identique à la séquence cible recherchée.

SEQ ID n 28 :
5'TATTTTGGAGTAATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTG
CCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAG 3'
11-3-8- Séquences dessinées pour la détection de
Campylobacter jejuni :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour C. jejuni ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel de manière spécifique à cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 11). Le produit d'amplification a été purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins. La séquence SEQ ID n 29 suivante : 5'

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ATTCAGCCAAACCCTAACCTCAGCTCCAGCCCAAGACAGTCGACCGCTA 3', a été obtenue à l'aide de l'amorce Cju76f (SEQ ID n 15). Les bases soulignées, situées entre les positions 31 et 49 de la séquence ci-dessus, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Cju76r (SEQ ID n 16).

La séquence SEQ ID n 30 suivante : 5' CTGGAGCTGAGGTTAGGGTTTGGCTGAATTTAATACCCAAAGAACGATTTGC AAG 3', a été déterminée au moyen de l'amorce Cju76r (SEQ ID n 16). Les nucléotides situés entre les positions 36 et 55 et soulignés dans la séquence supra, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Cju76f (SEQ ID n 15).

Les séquences SEQ ID n 29 et 30 correspondaient à celles de la cible recherchée. Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions mises en oeuvre sur les échantillons d'acides nucléiques extraits à partir d'espèces ou de genres bactériens analysés, autres que Campylobacter.

11-3-9- Séquences dessinées pour la détection de
Staphylococcus aureus :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour S. aureus ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 50 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 12). Le produit d'amplification a été purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins.

La séquence SEQ ID n 31 suivante : 5'TTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCT TGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAA GAAAAAGTGAAGCACAAGCAAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGAC AACGCTGATTCAGGTCA 3', a été obtenue avec l'amorce Sa193f (SEQ ID n 9). Les bases soulignées, situées entre les positions 154 et 172,

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représentent la séquence complémentaire de l'amorce Sa193r (SEQ ID n 10)
La séquence SEQ ID n 32 :

5' AAATATTTAATTTCTC I I I I I I I GCTTGTGCTTCAC I I I I I CTTAAAA GTTGTTCATGTGTATTGTTAGGTTTATAAACATAAGCAACTTTAGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGCTTCGTTTACCATTTTTCCATCAGCATAAATATACGCTAAG CCACGTCCAT 3', a été déterminée en utilisant l'amorce Sa193r (SEQ ID n 10). Les nucléotides situés entre les positions 146 et 165 et soulignés dans la séquence ci-dessus représentent la séquence complémentaire de l'amorce Sa193f (SEQ ID n 9). La séquence double brin ainsi obtenue, correspondant aux séquences SEQ ID n 31 et 32 supra, s'est révélée identique à la séquence cible recherchée.

Claims (18)

1. Procédé de détection et identification de bactéries contenues dans un mélange complexe par des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples d'amorces pour amplification, chaque couple étant spécifique et exclusif d'une séquence nuciéotidique d'une espèce, d'un genre ou d'un groupe bactérien ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles ; et c) la détection de la présence et l'identification des bactéries contenues dans le mélange complexe de départ.

2. Procédé de détection, identification et quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe par des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples d'amorces pour amplification et au moins deux sondes nucléotidiques associées, chaque couple et sonde associée étant spécifique et exclusif d'une séquence nucléotidique d'une espèce, d'un genre ou d'un groupe bactérien ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles par

PCR en temps réel ; et c) la détection de la présence, l'identification et la quantification des bactéries contenues dans le mélange complexe de départ.

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3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les bactéries détectées sont des pathogènes de mammifères, en particulier de l'homme.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel au moins deux espèces, genres ou groupes bactériens sont choisis parmi Yersinia enterocolitica, Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens et Campylobacterjejuni.

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les couples d'amorces sont choisis dans le groupe de séquences suivantes :

LmHlyAf (SEQ ID N 1), LmHlyAr (SEQ ID N 2), pour l'amplification spécifique et exclusive de L. monocytogenes ;

Ye86f (SEQ ID N 3), Ye86r (SEQ ID N 4), pour l'amplification spécifique et exclusive de Y. enterocolitica ;

Ec97f (SEQ ID N 5), Ec97r (SEQ ID N 6), pour l'amplification spécifique et exclusive de E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ;

Se98f (SEQ ID N 7), Se98r (SEQ ID N 8), pour l'amplification spécifique et exclusive de Salmonella spp. ;

Sa193f (SEQ ID N 9), Sa193r (SEQ ID N 10), pour l'amplification spécifique et exclusive de S. aureus ;

Bc84f (SEQ ID N 11), Bc84r (SEQ ID N 12), pour l'amplification spécifique et exclusive de B. cereus ;

Cp97f (SEQ ID N 13), Cp97r (SEQ ID N 14), pour l'amplification spécifique et exclusive de C. perfringens ; et

Cju76f (SEQ ID N 15), Cju76r (SEQ ID N 16), pour l'amplification spécifique et exclusive de C. jejuni ; ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci.

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Cju76TqFT (SEQ ID N 24), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de C. jejuni ; ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celles-ci.

Cp97TqFT (SEQ ID N 23), pour l'amplification.en temps réel spécifique et exclusive de C. perfringens ; et

Bc84TqFT (SEQ ID N 22), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de B. cereus ;

Sa193TqFT (SEQ ID N 21), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de S. aureus ;

Se98TqFT (SEQ ID N 20), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Salmonella spp. ;

Ec97TqFT (SEQ ID N 19), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ;

Ye86TqFT (SEQ ID N 18), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Y. enterocolitica ;

Lm113TqFT (SEQ ID N 17), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de L. monocytogenes ;

6 Procédé selon la revendication 5, dans lequel les sondes associées aux couples d'amorces sont choisies dans le groupe de séquences suivantes :

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre sur un échantillon d'acides nucléiques préalablement extraits et purifiés à partir des cellules de bactéries contenues dans un mélange complexe, notamment alimentaire, à l'aide d'un automate d'extraction.

8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape b) comprend au moins les sous-étapes suivantes :

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b1) une étape de dénaturation effectuée entre 94 et 95 C, de préférence à environ 94 C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence 30 secondes ; b2) une étape d'hybridation réalisée entre 55 et 62 C, de préférence à environ 60 C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence 30 secondes ; et b3) une étape d'élongation mise en oeuvre entre 60 et 72 C, pendant 15 secondes à 2 minutes, de préférence pendant environ 30 secondes ; lesdites sous-étapes représentant un cycle d'amplification et l'étape b) comprenant au moins 40 cycles d'amplification.

9. Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre une étape préliminaire bO) d'activation de la Taq polymérase à environ 94 C pendant 3 à 15 minutes, de préférence 3 à 5 minutes.

10. Couple d'amorces pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit couple étant choisi dans le groupe constitué de :

Ye86f (SEQ ID N 3) et Ye86r (SEQ ID N 4), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Yersinia enterocolitica ;

Ec97f (SEQ ID N 5) et Ec97r (SEQ ID N 6) ; ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica ;

Se98f (SEQ ID N 7) et Se98r (SEQ ID N 8), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Salmonella spp. ;

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Cju76f (SEQ ID N 15) et Cju76r (SEQ ID N 16), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Campylobacterjejuni.

Cp97f (SEQ ID N 13) et Cp97r (SEQ ID N 14), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Clostridium perfringens ; et

Bc84f (SEQ ID N 11) et Bc84r (SEQ ID N 12), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Bacillus cereus ;

Sa193f (SEQ ID N 9) et Sa193r (SEQ ID N 10), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Staphylococcus aureus ;

11. Couple d'amorces et sonde associée pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, lesdits couple d'amorces et sonde associée étant choisis dans le groupe constitué de :

LmHlyAf (SEO ID N 1) et LmHlyAr (SEQ ID N 2), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Lm113TqFT (SEQ ID N 17) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Listeria monocytogenes ;

Ye86f (SEQ ID N 3) et Ye86r (SEQ ID N 4), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Ye86TqFT (SEQ ID N 18) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Yersinia enterocolitica ;

Ec97f (SEQ ID N 5) et Ec97r (SEQ ID N 6), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Ec97TqFT (SEQ ID N 19) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique

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Cju76f (SEQ ID N 15) et Cju76r (SEQ ID N 16), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Cju76TqFT (SEQ ID N 24) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Campylobacter jejuni.

Cp97f (SEQ ID N 13) et Cp97r (SEQ ID N 14), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Cp97TqFT (SEQ ID N 23) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Clostridium perfringens ; et

Bc84f (SEQ ID N 11) et Bc84r (SEQ ID N 12), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Bc84TqFT (SEQ ID N 22) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Bacillus cereus ;

Sa193f (SEQ ID N 9) et Sa193r (SEQ ID N 10), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Sa193TqFT (SEQ ID N 21) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Staphylococcus aureus ;

Se98f (SEQ ID N 7) et Se98r (SEQ ID N 8), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci ; et Se98TqFT (SEQ ID N 20) ou toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Salmonella spp. ;

spécifique et exclusif de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica ;

12. Sonde nucléotidique pour la mise en #uvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ladite sonde étant spécifique et exclusive d'une espèce, un genre ou un groupe bactérien comprenant

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Yersinia enterocolitica, Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia. enterocolitica, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens et Campylobacter jejuni, et correspondant à un produit d'amplification obtenu à l'aide d'un couple d'amorces de séquences choisies parmi les séquences SEQ ID N 3 à 16 et toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci.

13. Sonde nucléotidique pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ladite sonde ayant une séquence choisie parmi :

Lm113TqFT (SEQ ID N 17) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Listeria monocytogenes ;

Ye86TqFT (SEQ ID N 18) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Yersinia enterocolitica ;

Ec97TqFT (SEQ ID N 19) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica ;

Se98TqFT (SEQ ID N 20) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Salmonella spp. ;

Sa193TqFT (SEQ ID N 21) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Staphylococcus aureus ; Bc84TqFT (SEQ ID N 22) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Bacillus cereus ;

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Cju76TqFT (SEQ ID N 24) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifique et exclusive de Campylobacter jejuni.

Cp97TqFT (SEQ ID N 23) et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec celle-ci, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Clostridium perfringens ; et

14. Kit pour la détection et l'identification des acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit kit comprenant : - au moins deux couples d'amorces choisis dans un groupe comprenant les couples d'amorces selon la revendication 10 et le couple d'amorces constitué par les séquences suivantes : LmHlyAf (SEQ ID N 1) et LmHlyAr (SEQ ID N 2), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci, pour l'amplification spécifique et exclusive de L monocytogenes ; - et/ou au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 12 et/ou la revendication 13.

15. Kit pour la détection, l'identification et la quantification des acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit kit comprenant : - au moins deux couples d'amorces et sondes associées selon la revendication 11 ; - et/ou au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 12 et/ou la revendication 13.

16. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe, comprenant au moins deux couples d'amorces choisis dans un groupe comprenant les couples d'amorces selon la revendication 10 et le couple d'amorces constitué par les séquences suivantes : LmHlyAf (SEQ ID N 1)

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et LmHlyAr (SEQ ID N 2), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci, pour l'amplification spécifique et exclusive de L. monocytogenes.

17. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection, l'identification et la quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe, comprenant au moins deux couples d'amorces et sondes associées selon la revendication 11.

18. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe, ledit micro-réseau comprenant au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 12 et/ou la revendication 13.