JP2004290171A - 微生物の分子生物学的同定技術 - Google Patents
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Abstract
【課題】微生物を菌種レベルで迅速に識別・同定する技術を開発する。また、その技術により環境微生物の検出・同定を試みる。
【解決手段】ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成技術を用いることにより、微生物を菌種レベルで迅速に識別・同定する。また、その原理をＤＮＡマイクロアレイに応用することにより、環境微生物の検出・同定を行う。ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成を用いることにより、また、ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成技術をＤＮＡマイクロアレイに応用することにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。
【選択図】 なし
【解決手段】ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成技術を用いることにより、微生物を菌種レベルで迅速に識別・同定する。また、その原理をＤＮＡマイクロアレイに応用することにより、環境微生物の検出・同定を行う。ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成を用いることにより、また、ＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成技術をＤＮＡマイクロアレイに応用することにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の検出、同定、ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成技術、ＤＮＡマクロアレイ技術、ＤＮＡマイクロアレイ技術の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌を中心とする微生物の分類・同定は、従来細胞形態、生理・生化学的性状、化学分類学的性状等の表現型の情報に加え、核酸分子情報に基づいて行われている。属以上の高次分類群の分類・識別には小サブユニットｒＲＮＡ（あるいはその遺伝子である小サブユニットｒＤＮＡ）の塩基配列の比較が有効であるが、菌種レベルでの識別・同定にはこの分子技法の適用は解像度の低さのため困難である。また、単一の性状によって、あるいは表現型の組み合わせによって菌種を同定することも困難である。
【０００３】
菌種識別の唯一の技術として現在、異なる菌株間のゲノムＤＮＡの交雑形成率（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）が用いられている。国際細菌分類委員会は７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率を示す菌株の集団を遺伝的な同一種として認めることを推奨しており（例えば、非特許文献１参照）、この基準は現在も踏襲されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３７、１９８７年、Ｐ．４６３−４６４
【０００５】
ゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法においてはいくつかの技術的欠点がある。本法では比較的大量のきれいなＤＮＡ試料が必要であり、そのため菌体培養、細胞からのＤＮＡの抽出、精製、被検体およびプローブ試料作成などに労力や時間を要する。また、交雑試験の再現性が低い、きょう雑物の混入により結果が左右されやすい、などの欠点がある。また、本法は培養できる純粋菌株間の試験を前提としており、複合微生物系である環境試料には適用しにくい。また、ＤＮＡが得られにくい試料の場合も適用が難しい。
【０００６】
ゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ相同性に替わる菌種同定のための分子技法として例えばｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を比較する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２８６７９号公報
【０００８】
しかし、塩基配列を決定する方法では、ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法と同様に時間がかかるのみならず、菌種により増幅プライマーの検討が必要という欠点は改善されない。また、環境中の複数の微生物に対しての同定には適用困難である。
【０００９】
ｒＲＮＡ遺伝子オペロン中に存在するＩＴＳ領域（図１）は変化に富む塩基配列を含むことから、真正細菌検出のためのプローブ開発について有効性が示唆され（例えば、非特許文献２参照）、現在その塩基配列の情報が微生物の識別に使われている。ここに、ＩＴＳとは、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（リボソームＲＮＡスペーサー）の略称である（本明細書では、このように略して用いる）。
【００１０】
【非特許文献２】
Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １、１９９１年、Ｐ．５１−５６
【００１１】
ＩＴＳ領域に由来する菌種に特異的な配列のオリゴプローブを用いた真正細菌分類群の検出、単離および区別する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、特異的な配列のオリゴプローブを用いるこの方法は、プローブの設計に菌種の配列情報が必要である。また、菌種の識別は定性反応である。
【００１２】
【特許文献２】
特表平１０−５０１９７６号公報
【００１３】
ユニバーサルプライマーを用いた多コピーＩＴＳ領域全てを含めた交雑形成に関する報告はこれまでになく、そのＩＴＳ交雑形成率がゲノムＤＮＡの交雑形成率と比較して菌種識別に有効かどうか具体的知見はない。またＩＴＳ交雑形成率に対する定量評価（相対的強度）に関する報告はこれまでにない。
【００１４】
ＤＮＡマイクロアレイ法によるＩＴＳ交雑形成技術はこれまで報告されていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上述の従来知見と技術の背景下に、本発明はＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法に替わり得る定量性と解像度を有し、かつ特定の塩基配列情報を必要としない微生物菌種の分子生物学的識別・検出技術を開発し、従来より迅速、簡便、かつ正確に菌種の同定を行うことを目的とする。さらに、本発明の目的は、この技術をＤＮＡマイクロアレイと組み合わせることにより、多数の菌種を同時に効率的に同定することを可能にする環境微生物診断法としての新技術を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記目的を達成すべく、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の代表的菌種を微生物保存機関より取り寄せ、また、新たにこれらの細菌を自然環境中から分離し、合計１，５００株を対象としてＩＴＳ領域の解析を行った。
まず、試験菌株からゲノムＤＮＡを抽出・精製し、これらのＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ領域のＰＣＲ増幅を行った。これらのＰＣＲ産物（ＩＴＳ−ＤＮＡ）をサブクローニングした後、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定し、同時にＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成試験を行った。異なる菌株間の塩基配列の相違度とＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率の関係を解析した結果、両者の間には高い相関関係があり、ＩＴＳ配列相同率約９０％がゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率７０％に相当することが判明した。
これらの知見の基に、ＩＴＳ−ＤＮＡを用いる交雑形成をメンブレンフィルター法により、また、マイクロプレート上で実施し、特定の交雑形成条件下で得られた交雑形成シグナルの強度から、ＩＴＳ配列交雑形成率６０〜７０％がゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率７０％に相当することが判明した。
これらの知見から、微生物の検出、同定技術、およびＤＮＡマクロアレイ技術、ＤＮＡマイクロアレイ技術への応用、環境診断法に関する本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明では、ＩＴＳ領域に相当するＤＮＡ（ＩＴＳ−ＤＮＡ）の交雑形成法を、微生物の検出、同定に用いる。これにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。このことは、ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成率とＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成率との間に高い相関があったことに起因する。ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法は現在唯一の菌種識別法として用いられているが、試験に多大な時間や労力を必要とし、また、再現性の高い結果を得るのが難しい。ゲノムＤＮＡと比較して、ＩＴＳ−ＤＮＡはＰＣＲ等により遺伝子増幅可能であり、大量の培養を必要とせず、簡便・迅速な解析が可能になるため、有利である。また、高純度のＩＴＳ−ＤＮＡを試験に用いることができるため、比較的高い再現性を持つ。さらに、ＰＣＲにユニバーサルプライマーを用いることができるため、他の遺伝子を用いるよりもさらに簡便な解析ができる点でも有利である。
【００１８】
このＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、メンブランフィルター上あるいはマイクロプレート上で行う。また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、ＤＮＡマイクロアレイ上で行う。これらの技法を用いることにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。さらに、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を、ＤＮＡマイクロアレイ上で行った場合には、多数の菌種を効率的に同定することが可能となるため、未知の環境試料中に含まれる菌種を検出・同定する場合に有利である。
【００１９】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を微生物株の同定に利用する。この場合には、属レベルで特定菌種を固定化したマイクロアレイ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）または既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、菌種レベルでの識別が可能となる。ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法と比較して迅速・簡便であるため、有利である。
【００２０】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を食材・食品・飲料中の微生物検出・同定に利用する。この場合において、食品由来の純粋菌株および食中毒菌由来のＩＴＳ−ＤＮＡを固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌株を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。食材・食品・飲料中の微生物を検出する際には、迅速かつ菌株レベルでの菌種の検出を要求される場合が多いため（例えば、食中毒菌、コンタミ菌の検出など）、同定結果からすぐに試料中に含まれる近縁菌株の性状を知ることができる点で、特に有利である。
【００２１】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を臨床・腸内細菌を含む生体中の微生物検出・同定に利用する。例えば、ヒト腸内細菌の場合において、腸管由来の純粋菌株を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。ヒトの腸管内には多くの細菌が存在しており、それらは相互関係を保ちつつ腸内フローラといわれる群集を形成している。腸内フローラはヒトが日常生活で摂取する食事や薬物など数多くの要素により変化し、腸内フローラを構成する細菌もヒトの健康に影響を及ぼすことが知られている。つまり、腸内フローラの構成を簡便・迅速にモニタリングすることが可能になれば、ヒトの健康管理に役立つと考えられる。これまで、腸内フローラの構成を把握するためには、糞便中に含まれる腸内細菌を直接培養するという方法が一般的であった。近年行われている群集解析法（例えば、ＤＧＧＥ，Ｔ−ＲＦＬＰ，ＦＩＳＨなど）と比較しても、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を利用すれば、試料中に含まれる菌株を近縁種レベルで検出でき、各菌株の相対比を見ることができる点で、特に有利である。
【００２２】
さらに、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法をその他の環境中の微生物検出・同定に利用する。この場合において、特定な菌種を標的とするマイクロアレイ（例えば、鉄酸化細菌、放線菌、光合成細菌等）または既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。また、環境中の微生物検出においては、培養が困難な菌についても検出できる点で、さらに、多数の菌種を同時に効率よく同定できる点で有利である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、好ましい実施の形態に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
微生物の中で細菌を例にとると、ゲノムＤＮＡ中にｒＲＮＡオペロンが１から数コピー存在する。ｒＲＮＡオペロンは上流より１６Ｓ、２３Ｓ、および５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の順に並び、１６Ｓ ｒＤＮＡと２３Ｓ ｒＤＮＡの間にＩＴＳ領域が存在する（図１Ａ）。ＩＴＳはＯＲＦが存在しない変化に富んだランダムな塩基配列からなるが、一部のコピーにはｔＲＮＡをコードする保存領域が１〜２存在する。このｒＲＮＡオペロン全体は同一菌種では比較的保存されているが（配列の相同性９９％以上）、異なる菌種間では十分に識別可能な塩基配列の差異（約９０％以下）を得ることができる。このｒＲＮＡオペロン全体の塩基配列の差異をＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成により検出する。
【００２５】
ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成の方法の一例として図１Ｂを用いて説明する。１６Ｓ ｒＤＮＡおよび２３Ｓ ｒＤＮＡは保存性の高い塩基配列を含むため、それぞれの３’末端および５’末端の保存領域を標的とするＰＣＲプライマーを用いて、菌体から抽出・精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ−ＤＮＡをＰＣＲ増幅する（図１Ｂの１．）。増幅にはＰＣＲ以外の技法を用いてもよい。増幅したＩＴＳ−ＤＮＡは、電気泳動、スピンカラム法あるいは他の手段を用いて精製する（図１Ｂの２．）。精製した標的ＩＴＳ−ＤＮＡ試料の一定量をメンブレンフィルターあるいはマイクロプレートにブロッティングし、固定する（図１Ｂの３．）。別途ＩＴＳ−ＤＮＡを蛍光標識、化学発光標識あるいはその他の方法で標識したプローブを作成する。標的ＩＴＳ−ＤＮＡ試料を固定したメンブレンフィルターあるいはマイクロプレートと標識プローブの間でハイブリダイゼーションを行う（図１Ｂの４．）。交雑したＤＮＡのスポットを蛍光法、化学発光、その他の定法で検出する。
【００２６】
ＩＴＳ−ＤＮＡのＰＣＲ増幅条件として、ＰＣＲ 反応液の組成と反応条件をそれぞれ表１と表２に示す。プライマーセットはＩＴＳ−ＤＮＡを含む配列をＰＣＲ増幅するもの、または、ＩＴＳ−ＤＮＡ一部のみをＰＣＲ増幅するものであってもよい。１５４１ｆ（配列番号：１）とＬＳ２３ｒ（配列番号：２）を例に挙げて示す。ＩＴＳ−ＤＮＡをＰＣＲ増幅できる他のプライマーセットを用いてもよい。ＰＣＲ 反応後、増幅産物の２μｌ を１．５ ％アガロースゲル電気泳動で確認する。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
（配列番号：１）
配列の長さ：１９
配列の型：ＲＮＡ
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
起源
生物名：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
配列
ｇｇｃｔｇｇａｔｃａ ｃｃｔｃｃｔｔ
【００３０】
（配列番号：２）
配列の長さ：１７
配列の型：ＲＮＡ
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
起源
生物名：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
配列
ｔｇｃｃｃａａｇｇｃ ａｔｃｃａｃｃ
【００３１】
ＰＣＲ 増幅産物の精製はＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）（注：ＱＩＡ ｑｕｉｃｋは登録商標）を用いて行った。精製増幅産物は１．５ ％アガロースゲル電気泳動に供され、エチジウムブロマイド染色により、増幅が確認された。
【００３２】
メンブレンフィルターを用いてハイブリダイゼーションを行う場合の例を、以下に示す。
【００３３】
メンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ＋， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ２０２０Ｂ）へのＩＴＳ−ＤＮＡの固定は、以下の条件下で行う。
（１） 適当なサイズにカットしたメンブレンフィルターを蒸留水中に沈めて濡らした後、２×ＳＳＣ中に１０分以上沈めて処理、デシケーターで１日乾燥させる。
（２） ０．２μＭ ＩＴＳ−ＤＮＡ １０μｌを用意し、１００℃、５分間熱変性させる。
（３） 変性ＤＮＡを氷上で急冷し、スポットの直前にＩＴＳ−ＤＮＡに０．５倍量の２０×ＳＳＣを加え希釈する。
（４） メンブレンフィルターをろ紙の上に置き、ピペットの先を触れさせないように注意しながら、ＩＴＳ−ＤＮＡを２μｌスポットする。
（５） メンブレンフィルターについた余分な水分をろ紙で吸い取った後、８０℃、１０分乾燥させる。
（６） ＩＴＳ−ＤＮＡは紫外線照射によりメンブレンフィルターに固定する。
【００３４】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、ＩＴＳ−ＤＮＡの標識は以下の条件下で行う。プローブの標識には、耐熱性アルカリホスファターゼ（ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８０）を用いる。その他の標識を用いてもよい。
（１） Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ μｌにキット付属の滅菌水 ４０ μｌを加えて希釈する。
（２） 標識するＩＴＳ−ＤＮＡを滅菌水で１００ ｎｇ／μｌとなるように希釈する。
（３） 標識するＩＴＳ−ＤＮＡ １０ μｌをマイクロチューブに入れ、１００℃、５分間熱変性させる。
（４） 変性ＩＴＳ−ＤＮＡを氷上で急冷し、卓上遠心機で軽く遠心する。
（５） （４）のＩＴＳ−ＤＮＡに１０ μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加する。反応は氷上で行い穏やかに混合する。
（６） ２μｌのｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを添加する。反応は氷上で行い穏やかに混合する。
（７） 希釈したＣｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ μｌ加える。完全に混合した後卓上遠心機で軽く遠心する。
（８） ３７℃で３０分間インキュベートする。
【００３５】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションは、以下の条件下で行う。
（１） ＩＴＳ−ＤＮＡを固定したメンブレンフィルターを２×ＳＳＣで均一に湿らせる。メンブレンフィルターについた余分な水分をろ紙で吸い取る。
（２） メンブレンフィルターを予めハイブリオーブンで７０℃に温めておいたハイブリダイゼーションバッファー（ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８０に付属）に添加する。
（３）マスキングのためにＰＣＲプライマーまたはＰＣＲ産物に含まれるＩＴＳを除いたｒＤＮＡ部分のＰＣＲ増幅物をハイブリダイゼーションバッファーに添加し７０℃で３０分、プレハイブリダイゼーションする。
（４） プレハイブリダイゼーションで用いたバッファーに標識したＩＴＳ−ＤＮＡを全て加える（このときにバッファーを少量とり、マイクロチューブ内で混ぜる）。
（５） ７０℃で２時間、インキュベートする（溶液が蒸発しないよう注意する）。
（６） メンブレンフィルターを予め温めておいた１次洗浄バッファーに浸し５０℃、１０分間穏やかに振とうして洗浄する。２回繰り返す。
（７） 新しい容器に２５０ ｍｌの２次洗浄バッファーを入れ、メンブレンフィルターを浸し常温で５分間洗浄する。２回繰り返す。
【００３６】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、シグナルの検出は以下の条件下で行う。検出は化学発光（ＣＤＰ Ｓｔａｒ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８２）で行う。
（１） メンブレンフィルターから余分な２次洗浄バッファーを取り除き、サランラップにブロットされている面を上にして置く。
（２） メンブレンフィルターにＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを８００μｌ添加し、５分間放置する。
（３） 余分なバッファーをろ紙で吸い取り、メンブレンフィルターを気泡がないようにサランラップでくるみ、ブロット面が上になるようにフィルムカセットにセットする。暗室でフィルムを２時間、露光する。
【００３７】
本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成は、メンブレンフィルターあるいはマイクロプレートを用いたＤＮＡマクロアレイ法による純粋培養菌株の菌種レベルの同定に適用できる以外に、多種の微生物が含まれるサンプルからの近縁種の検出を目的としたＤＮＡマイクロアレイにも展開できる（図１Ｃ）。
【００３８】
中空糸配列体ＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う場合の例を、以下に示す。
【００３９】
ＤＮＡマイクロアレイへのＩＴＳ−ＤＮＡの固定は、以下の条件下で行う。ＩＴＳ−ＤＮＡの片鎖を中空糸に固定し、ＩＴＳ−ＤＮＡの濃度を３段階（例として、０．０６、０．０４、０．０２μＭ）とし３点スポットする。スポットの固定には他の方法を用いてもよい。
【００４０】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、ＩＴＳ−ＤＮＡの標識はＰＣＲ反応液中に蛍光色素Ｃｙ５を標識したＰＣＲプライマー（ただし、ＤＮＡマイクロアレイに固定したＩＴＳ−ＤＮＡの逆鎖とする）を加えることにより行う。他の標識法を用いてもよい。
【００４１】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションは、以下の条件下で行う。
（１） ＤＮＡマイクロアレイを滅菌水中で６５℃、６時間浸漬させる。
（２）ハイブリダイゼーション溶液 ２０×ＳＳＣ ２５μｌ、２％ ＳＤＣ １０μｌ、滅菌水１５μｌを作製し、３７℃で保温する。
（３） 標識した１００ ｎｇ／μｌ ＩＴＳ−ＤＮＡ ５０μｌを９４℃で２分間熱変性し、氷上で１分間急冷する。
（４） ＤＮＡマイクロアレイをハイブリチャンバーにセットし調整した溶液１００μｌを入れ６５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行う。
（５） 予め遠沈管に入れて５０℃で保温しておいた０．０５×ＳＳＣ １０ ｍｌ中にＤＮＡマイクロアレイを入れ５０℃、４０分間静置することで洗浄する。
（６） 予め遠沈管に入れて５０℃で保温しておいた新しい０．０５×ＳＳＣ １０ ｍｌ中にＤＮＡマイクロアレイを入れ５０℃、２０分間静置することで洗浄する。
（７）４℃で５分間静置する。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションを行う場合、蛍光読み取り装置により検出を行う。
【００４３】
ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成を利用したＤＮＡマクロアレイ法およびＤＮＡマイクロアレイ法は純粋菌株の簡易・迅速同定の他、様々な環境中の微生物の菌種検出、同定に使うことができる。対象とする環境試料は水、土壌、大気、下水、廃水処理系などの他、食品、人・動物試料（糞便、唾液、その他）、臨床材料などが挙げられる。
【００４４】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに詳述する。
【００４５】
【実施例】
（実施例１）
光合成細菌であるＲｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ属の菌株を用いてメンブレンフィルターによるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成試験およびゲノムＤＮＡ交雑形成試験を行い比較した。図２にＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率とゲノムＤＮＡ交雑形成率との関係を示す。両者はＹ＝Ｘという１次関数の強い相関が示された。この結果はゲノムＤＮＡ交雑形成率の７０％がＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率の約７０％に相当することを示している。
【００４６】
（実施例２）
糞便試料からＤＮＡを抽出し、抽出ＤＮＡから増幅・標識したＩＴＳ−ＤＮＡを用いて基準株の腸内細菌のＩＴＳ−ＤＮＡを固定したＤＮＡマイクロアレイと交雑形成を行い、腸内細菌の種レベルでの検出を行った。図３に糞便試料ＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイとの交雑形成で得られた腸内細菌の検出画像を示す。この結果は様々な試料中の微生物の菌種検出、同定にＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイが有効であることを示している。
【００４７】
【発明の効果】
請求項１記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、ゲノムＤＮＡと比較して、ＩＴＳ−ＤＮＡはＰＣＲ等により遺伝子増幅可能であり、大量の培養を必要とせず、簡便・迅速な解析が可能になる点で有利である。また、高純度のＩＴＳ−ＤＮＡを試験に用いることができるため、比較的高い再現性を持つ点で有利である。さらに、ＰＣＲにユニバーサルプライマーを用いることができるため、他の遺伝子を用いるよりもさらに簡便な解析ができる点でも有利である。
【００４８】
請求項２または３記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。
【００４９】
請求項４記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、多数の菌種を効率的に同定することが可能となるため、未知の環境試料中に含まれる菌種を検出・同定する場合に有利である。
【００５０】
請求項５記載の発明によれば、属レベルで特定菌種を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法と比較して迅速・簡便である点で有利である。
【００５１】
請求項６記載の発明によれば、食材・食品・飲料由来の純粋菌株および食中毒菌由来のＩＴＳ−ＤＮＡを固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌株を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、同定結果からすぐに試料中に含まれる近縁菌株の性状を知ることができるから、特に有利である。
【００５２】
請求項７記載の発明によれば、臨床・腸内細菌を含む生体由来の純粋菌株を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、近年行われている群集解析法と比較しても、試料中に含まれる菌株を近縁種レベルで検出でき、各菌株の相対比を見ることができる点で特に有利である。
【００５３】
請求項８記載の発明によれば、特定な菌種を標的とするマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、環境中の微生物検出においては、培養が困難な菌についても検出できる点で、さらに、多数の菌種を同時に効率よく同定できる点で有利である。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成技術の一例を示す概略図である。
【図２】本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率とゲノムＤＮＡ交雑形成率との関係を示すグラフである。
【図３】糞便試料ＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイとの交雑形成で得られた腸内細菌の検出画像を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の検出、同定、ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成技術、ＤＮＡマクロアレイ技術、ＤＮＡマイクロアレイ技術の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌を中心とする微生物の分類・同定は、従来細胞形態、生理・生化学的性状、化学分類学的性状等の表現型の情報に加え、核酸分子情報に基づいて行われている。属以上の高次分類群の分類・識別には小サブユニットｒＲＮＡ（あるいはその遺伝子である小サブユニットｒＤＮＡ）の塩基配列の比較が有効であるが、菌種レベルでの識別・同定にはこの分子技法の適用は解像度の低さのため困難である。また、単一の性状によって、あるいは表現型の組み合わせによって菌種を同定することも困難である。
【０００３】
菌種識別の唯一の技術として現在、異なる菌株間のゲノムＤＮＡの交雑形成率（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）が用いられている。国際細菌分類委員会は７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率を示す菌株の集団を遺伝的な同一種として認めることを推奨しており（例えば、非特許文献１参照）、この基準は現在も踏襲されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３７、１９８７年、Ｐ．４６３−４６４
【０００５】
ゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法においてはいくつかの技術的欠点がある。本法では比較的大量のきれいなＤＮＡ試料が必要であり、そのため菌体培養、細胞からのＤＮＡの抽出、精製、被検体およびプローブ試料作成などに労力や時間を要する。また、交雑試験の再現性が低い、きょう雑物の混入により結果が左右されやすい、などの欠点がある。また、本法は培養できる純粋菌株間の試験を前提としており、複合微生物系である環境試料には適用しにくい。また、ＤＮＡが得られにくい試料の場合も適用が難しい。
【０００６】
ゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ相同性に替わる菌種同定のための分子技法として例えばｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列を比較する方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２８６７９号公報
【０００８】
しかし、塩基配列を決定する方法では、ＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法と同様に時間がかかるのみならず、菌種により増幅プライマーの検討が必要という欠点は改善されない。また、環境中の複数の微生物に対しての同定には適用困難である。
【０００９】
ｒＲＮＡ遺伝子オペロン中に存在するＩＴＳ領域（図１）は変化に富む塩基配列を含むことから、真正細菌検出のためのプローブ開発について有効性が示唆され（例えば、非特許文献２参照）、現在その塩基配列の情報が微生物の識別に使われている。ここに、ＩＴＳとは、ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（リボソームＲＮＡスペーサー）の略称である（本明細書では、このように略して用いる）。
【００１０】
【非特許文献２】
Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ． ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １、１９９１年、Ｐ．５１−５６
【００１１】
ＩＴＳ領域に由来する菌種に特異的な配列のオリゴプローブを用いた真正細菌分類群の検出、単離および区別する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、特異的な配列のオリゴプローブを用いるこの方法は、プローブの設計に菌種の配列情報が必要である。また、菌種の識別は定性反応である。
【００１２】
【特許文献２】
特表平１０−５０１９７６号公報
【００１３】
ユニバーサルプライマーを用いた多コピーＩＴＳ領域全てを含めた交雑形成に関する報告はこれまでになく、そのＩＴＳ交雑形成率がゲノムＤＮＡの交雑形成率と比較して菌種識別に有効かどうか具体的知見はない。またＩＴＳ交雑形成率に対する定量評価（相対的強度）に関する報告はこれまでにない。
【００１４】
ＤＮＡマイクロアレイ法によるＩＴＳ交雑形成技術はこれまで報告されていない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上述の従来知見と技術の背景下に、本発明はＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成法に替わり得る定量性と解像度を有し、かつ特定の塩基配列情報を必要としない微生物菌種の分子生物学的識別・検出技術を開発し、従来より迅速、簡便、かつ正確に菌種の同定を行うことを目的とする。さらに、本発明の目的は、この技術をＤＮＡマイクロアレイと組み合わせることにより、多数の菌種を同時に効率的に同定することを可能にする環境微生物診断法としての新技術を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記目的を達成すべく、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の代表的菌種を微生物保存機関より取り寄せ、また、新たにこれらの細菌を自然環境中から分離し、合計１，５００株を対象としてＩＴＳ領域の解析を行った。
まず、試験菌株からゲノムＤＮＡを抽出・精製し、これらのＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ領域のＰＣＲ増幅を行った。これらのＰＣＲ産物（ＩＴＳ−ＤＮＡ）をサブクローニングした後、ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定し、同時にＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成試験を行った。異なる菌株間の塩基配列の相違度とＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率の関係を解析した結果、両者の間には高い相関関係があり、ＩＴＳ配列相同率約９０％がゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率７０％に相当することが判明した。
これらの知見の基に、ＩＴＳ−ＤＮＡを用いる交雑形成をメンブレンフィルター法により、また、マイクロプレート上で実施し、特定の交雑形成条件下で得られた交雑形成シグナルの強度から、ＩＴＳ配列交雑形成率６０〜７０％がゲノムＤＮＡ−ＤＮＡ交雑形成率７０％に相当することが判明した。
これらの知見から、微生物の検出、同定技術、およびＤＮＡマクロアレイ技術、ＤＮＡマイクロアレイ技術への応用、環境診断法に関する本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明では、ＩＴＳ領域に相当するＤＮＡ（ＩＴＳ−ＤＮＡ）の交雑形成法を、微生物の検出、同定に用いる。これにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。このことは、ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成率とＩＴＳ−ＤＮＡの交雑形成率との間に高い相関があったことに起因する。ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法は現在唯一の菌種識別法として用いられているが、試験に多大な時間や労力を必要とし、また、再現性の高い結果を得るのが難しい。ゲノムＤＮＡと比較して、ＩＴＳ−ＤＮＡはＰＣＲ等により遺伝子増幅可能であり、大量の培養を必要とせず、簡便・迅速な解析が可能になるため、有利である。また、高純度のＩＴＳ−ＤＮＡを試験に用いることができるため、比較的高い再現性を持つ。さらに、ＰＣＲにユニバーサルプライマーを用いることができるため、他の遺伝子を用いるよりもさらに簡便な解析ができる点でも有利である。
【００１８】
このＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、メンブランフィルター上あるいはマイクロプレート上で行う。また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、ＤＮＡマイクロアレイ上で行う。これらの技法を用いることにより、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となる。さらに、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を、ＤＮＡマイクロアレイ上で行った場合には、多数の菌種を効率的に同定することが可能となるため、未知の環境試料中に含まれる菌種を検出・同定する場合に有利である。
【００１９】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を微生物株の同定に利用する。この場合には、属レベルで特定菌種を固定化したマイクロアレイ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）または既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、菌種レベルでの識別が可能となる。ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法と比較して迅速・簡便であるため、有利である。
【００２０】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を食材・食品・飲料中の微生物検出・同定に利用する。この場合において、食品由来の純粋菌株および食中毒菌由来のＩＴＳ−ＤＮＡを固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌株を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。食材・食品・飲料中の微生物を検出する際には、迅速かつ菌株レベルでの菌種の検出を要求される場合が多いため（例えば、食中毒菌、コンタミ菌の検出など）、同定結果からすぐに試料中に含まれる近縁菌株の性状を知ることができる点で、特に有利である。
【００２１】
また、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を臨床・腸内細菌を含む生体中の微生物検出・同定に利用する。例えば、ヒト腸内細菌の場合において、腸管由来の純粋菌株を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。ヒトの腸管内には多くの細菌が存在しており、それらは相互関係を保ちつつ腸内フローラといわれる群集を形成している。腸内フローラはヒトが日常生活で摂取する食事や薬物など数多くの要素により変化し、腸内フローラを構成する細菌もヒトの健康に影響を及ぼすことが知られている。つまり、腸内フローラの構成を簡便・迅速にモニタリングすることが可能になれば、ヒトの健康管理に役立つと考えられる。これまで、腸内フローラの構成を把握するためには、糞便中に含まれる腸内細菌を直接培養するという方法が一般的であった。近年行われている群集解析法（例えば、ＤＧＧＥ，Ｔ−ＲＦＬＰ，ＦＩＳＨなど）と比較しても、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法を利用すれば、試料中に含まれる菌株を近縁種レベルで検出でき、各菌株の相対比を見ることができる点で、特に有利である。
【００２２】
さらに、前記ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑技法をその他の環境中の微生物検出・同定に利用する。この場合において、特定な菌種を標的とするマイクロアレイ（例えば、鉄酸化細菌、放線菌、光合成細菌等）または既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となる。また、環境中の微生物検出においては、培養が困難な菌についても検出できる点で、さらに、多数の菌種を同時に効率よく同定できる点で有利である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、好ましい実施の形態に基づいて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
微生物の中で細菌を例にとると、ゲノムＤＮＡ中にｒＲＮＡオペロンが１から数コピー存在する。ｒＲＮＡオペロンは上流より１６Ｓ、２３Ｓ、および５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の順に並び、１６Ｓ ｒＤＮＡと２３Ｓ ｒＤＮＡの間にＩＴＳ領域が存在する（図１Ａ）。ＩＴＳはＯＲＦが存在しない変化に富んだランダムな塩基配列からなるが、一部のコピーにはｔＲＮＡをコードする保存領域が１〜２存在する。このｒＲＮＡオペロン全体は同一菌種では比較的保存されているが（配列の相同性９９％以上）、異なる菌種間では十分に識別可能な塩基配列の差異（約９０％以下）を得ることができる。このｒＲＮＡオペロン全体の塩基配列の差異をＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成により検出する。
【００２５】
ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成の方法の一例として図１Ｂを用いて説明する。１６Ｓ ｒＤＮＡおよび２３Ｓ ｒＤＮＡは保存性の高い塩基配列を含むため、それぞれの３’末端および５’末端の保存領域を標的とするＰＣＲプライマーを用いて、菌体から抽出・精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ−ＤＮＡをＰＣＲ増幅する（図１Ｂの１．）。増幅にはＰＣＲ以外の技法を用いてもよい。増幅したＩＴＳ−ＤＮＡは、電気泳動、スピンカラム法あるいは他の手段を用いて精製する（図１Ｂの２．）。精製した標的ＩＴＳ−ＤＮＡ試料の一定量をメンブレンフィルターあるいはマイクロプレートにブロッティングし、固定する（図１Ｂの３．）。別途ＩＴＳ−ＤＮＡを蛍光標識、化学発光標識あるいはその他の方法で標識したプローブを作成する。標的ＩＴＳ−ＤＮＡ試料を固定したメンブレンフィルターあるいはマイクロプレートと標識プローブの間でハイブリダイゼーションを行う（図１Ｂの４．）。交雑したＤＮＡのスポットを蛍光法、化学発光、その他の定法で検出する。
【００２６】
ＩＴＳ−ＤＮＡのＰＣＲ増幅条件として、ＰＣＲ 反応液の組成と反応条件をそれぞれ表１と表２に示す。プライマーセットはＩＴＳ−ＤＮＡを含む配列をＰＣＲ増幅するもの、または、ＩＴＳ−ＤＮＡ一部のみをＰＣＲ増幅するものであってもよい。１５４１ｆ（配列番号：１）とＬＳ２３ｒ（配列番号：２）を例に挙げて示す。ＩＴＳ−ＤＮＡをＰＣＲ増幅できる他のプライマーセットを用いてもよい。ＰＣＲ 反応後、増幅産物の２μｌ を１．５ ％アガロースゲル電気泳動で確認する。
【００２７】
【表１】
【表２】
（配列番号：１）
配列の長さ：１９
配列の型：ＲＮＡ
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
起源
生物名：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
配列
ｇｇｃｔｇｇａｔｃａ ｃｃｔｃｃｔｔ
【００３０】
（配列番号：２）
配列の長さ：１７
配列の型：ＲＮＡ
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
起源
生物名：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
配列
ｔｇｃｃｃａａｇｇｃ ａｔｃｃａｃｃ
【００３１】
ＰＣＲ 増幅産物の精製はＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）（注：ＱＩＡ ｑｕｉｃｋは登録商標）を用いて行った。精製増幅産物は１．５ ％アガロースゲル電気泳動に供され、エチジウムブロマイド染色により、増幅が確認された。
【００３２】
メンブレンフィルターを用いてハイブリダイゼーションを行う場合の例を、以下に示す。
【００３３】
メンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ＋， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ２０２０Ｂ）へのＩＴＳ−ＤＮＡの固定は、以下の条件下で行う。
（１） 適当なサイズにカットしたメンブレンフィルターを蒸留水中に沈めて濡らした後、２×ＳＳＣ中に１０分以上沈めて処理、デシケーターで１日乾燥させる。
（２） ０．２μＭ ＩＴＳ−ＤＮＡ １０μｌを用意し、１００℃、５分間熱変性させる。
（３） 変性ＤＮＡを氷上で急冷し、スポットの直前にＩＴＳ−ＤＮＡに０．５倍量の２０×ＳＳＣを加え希釈する。
（４） メンブレンフィルターをろ紙の上に置き、ピペットの先を触れさせないように注意しながら、ＩＴＳ−ＤＮＡを２μｌスポットする。
（５） メンブレンフィルターについた余分な水分をろ紙で吸い取った後、８０℃、１０分乾燥させる。
（６） ＩＴＳ−ＤＮＡは紫外線照射によりメンブレンフィルターに固定する。
【００３４】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、ＩＴＳ−ＤＮＡの標識は以下の条件下で行う。プローブの標識には、耐熱性アルカリホスファターゼ（ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８０）を用いる。その他の標識を用いてもよい。
（１） Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ μｌにキット付属の滅菌水 ４０ μｌを加えて希釈する。
（２） 標識するＩＴＳ−ＤＮＡを滅菌水で１００ ｎｇ／μｌとなるように希釈する。
（３） 標識するＩＴＳ−ＤＮＡ １０ μｌをマイクロチューブに入れ、１００℃、５分間熱変性させる。
（４） 変性ＩＴＳ−ＤＮＡを氷上で急冷し、卓上遠心機で軽く遠心する。
（５） （４）のＩＴＳ−ＤＮＡに１０ μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加する。反応は氷上で行い穏やかに混合する。
（６） ２μｌのｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを添加する。反応は氷上で行い穏やかに混合する。
（７） 希釈したＣｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ μｌ加える。完全に混合した後卓上遠心機で軽く遠心する。
（８） ３７℃で３０分間インキュベートする。
【００３５】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションは、以下の条件下で行う。
（１） ＩＴＳ−ＤＮＡを固定したメンブレンフィルターを２×ＳＳＣで均一に湿らせる。メンブレンフィルターについた余分な水分をろ紙で吸い取る。
（２） メンブレンフィルターを予めハイブリオーブンで７０℃に温めておいたハイブリダイゼーションバッファー（ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８０に付属）に添加する。
（３）マスキングのためにＰＣＲプライマーまたはＰＣＲ産物に含まれるＩＴＳを除いたｒＤＮＡ部分のＰＣＲ増幅物をハイブリダイゼーションバッファーに添加し７０℃で３０分、プレハイブリダイゼーションする。
（４） プレハイブリダイゼーションで用いたバッファーに標識したＩＴＳ−ＤＮＡを全て加える（このときにバッファーを少量とり、マイクロチューブ内で混ぜる）。
（５） ７０℃で２時間、インキュベートする（溶液が蒸発しないよう注意する）。
（６） メンブレンフィルターを予め温めておいた１次洗浄バッファーに浸し５０℃、１０分間穏やかに振とうして洗浄する。２回繰り返す。
（７） 新しい容器に２５０ ｍｌの２次洗浄バッファーを入れ、メンブレンフィルターを浸し常温で５分間洗浄する。２回繰り返す。
【００３６】
メンブレンフィルターを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、シグナルの検出は以下の条件下で行う。検出は化学発光（ＣＤＰ Ｓｔａｒ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃａｔ＃ＲＰＮ３６８２）で行う。
（１） メンブレンフィルターから余分な２次洗浄バッファーを取り除き、サランラップにブロットされている面を上にして置く。
（２） メンブレンフィルターにＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを８００μｌ添加し、５分間放置する。
（３） 余分なバッファーをろ紙で吸い取り、メンブレンフィルターを気泡がないようにサランラップでくるみ、ブロット面が上になるようにフィルムカセットにセットする。暗室でフィルムを２時間、露光する。
【００３７】
本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成は、メンブレンフィルターあるいはマイクロプレートを用いたＤＮＡマクロアレイ法による純粋培養菌株の菌種レベルの同定に適用できる以外に、多種の微生物が含まれるサンプルからの近縁種の検出を目的としたＤＮＡマイクロアレイにも展開できる（図１Ｃ）。
【００３８】
中空糸配列体ＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う場合の例を、以下に示す。
【００３９】
ＤＮＡマイクロアレイへのＩＴＳ−ＤＮＡの固定は、以下の条件下で行う。ＩＴＳ−ＤＮＡの片鎖を中空糸に固定し、ＩＴＳ−ＤＮＡの濃度を３段階（例として、０．０６、０．０４、０．０２μＭ）とし３点スポットする。スポットの固定には他の方法を用いてもよい。
【００４０】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションを行う場合において、ＩＴＳ−ＤＮＡの標識はＰＣＲ反応液中に蛍光色素Ｃｙ５を標識したＰＣＲプライマー（ただし、ＤＮＡマイクロアレイに固定したＩＴＳ−ＤＮＡの逆鎖とする）を加えることにより行う。他の標識法を用いてもよい。
【００４１】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションは、以下の条件下で行う。
（１） ＤＮＡマイクロアレイを滅菌水中で６５℃、６時間浸漬させる。
（２）ハイブリダイゼーション溶液 ２０×ＳＳＣ ２５μｌ、２％ ＳＤＣ １０μｌ、滅菌水１５μｌを作製し、３７℃で保温する。
（３） 標識した１００ ｎｇ／μｌ ＩＴＳ−ＤＮＡ ５０μｌを９４℃で２分間熱変性し、氷上で１分間急冷する。
（４） ＤＮＡマイクロアレイをハイブリチャンバーにセットし調整した溶液１００μｌを入れ６５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行う。
（５） 予め遠沈管に入れて５０℃で保温しておいた０．０５×ＳＳＣ １０ ｍｌ中にＤＮＡマイクロアレイを入れ５０℃、４０分間静置することで洗浄する。
（６） 予め遠沈管に入れて５０℃で保温しておいた新しい０．０５×ＳＳＣ １０ ｍｌ中にＤＮＡマイクロアレイを入れ５０℃、２０分間静置することで洗浄する。
（７）４℃で５分間静置する。
【００４２】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションを行う場合、蛍光読み取り装置により検出を行う。
【００４３】
ＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成を利用したＤＮＡマクロアレイ法およびＤＮＡマイクロアレイ法は純粋菌株の簡易・迅速同定の他、様々な環境中の微生物の菌種検出、同定に使うことができる。対象とする環境試料は水、土壌、大気、下水、廃水処理系などの他、食品、人・動物試料（糞便、唾液、その他）、臨床材料などが挙げられる。
【００４４】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに詳述する。
【００４５】
【実施例】
（実施例１）
光合成細菌であるＲｈｏｄｏｐｌａｎｅｓ属の菌株を用いてメンブレンフィルターによるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成試験およびゲノムＤＮＡ交雑形成試験を行い比較した。図２にＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率とゲノムＤＮＡ交雑形成率との関係を示す。両者はＹ＝Ｘという１次関数の強い相関が示された。この結果はゲノムＤＮＡ交雑形成率の７０％がＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率の約７０％に相当することを示している。
【００４６】
（実施例２）
糞便試料からＤＮＡを抽出し、抽出ＤＮＡから増幅・標識したＩＴＳ−ＤＮＡを用いて基準株の腸内細菌のＩＴＳ−ＤＮＡを固定したＤＮＡマイクロアレイと交雑形成を行い、腸内細菌の種レベルでの検出を行った。図３に糞便試料ＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイとの交雑形成で得られた腸内細菌の検出画像を示す。この結果は様々な試料中の微生物の菌種検出、同定にＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイが有効であることを示している。
【００４７】
【発明の効果】
請求項１記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、ゲノムＤＮＡと比較して、ＩＴＳ−ＤＮＡはＰＣＲ等により遺伝子増幅可能であり、大量の培養を必要とせず、簡便・迅速な解析が可能になる点で有利である。また、高純度のＩＴＳ−ＤＮＡを試験に用いることができるため、比較的高い再現性を持つ点で有利である。さらに、ＰＣＲにユニバーサルプライマーを用いることができるため、他の遺伝子を用いるよりもさらに簡便な解析ができる点でも有利である。
【００４８】
請求項２または３記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。
【００４９】
請求項４記載の発明によれば、菌種または近縁種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、多数の菌種を効率的に同定することが可能となるため、未知の環境試料中に含まれる菌種を検出・同定する場合に有利である。
【００５０】
請求項５記載の発明によれば、属レベルで特定菌種を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、ゲノムＤＮＡを用いた交雑形成法と比較して迅速・簡便である点で有利である。
【００５１】
請求項６記載の発明によれば、食材・食品・飲料由来の純粋菌株および食中毒菌由来のＩＴＳ−ＤＮＡを固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌株を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、同定結果からすぐに試料中に含まれる近縁菌株の性状を知ることができるから、特に有利である。
【００５２】
請求項７記載の発明によれば、臨床・腸内細菌を含む生体由来の純粋菌株を固定化したマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、近年行われている群集解析法と比較しても、試料中に含まれる菌株を近縁種レベルで検出でき、各菌株の相対比を見ることができる点で特に有利である。
【００５３】
請求項８記載の発明によれば、特定な菌種を標的とするマイクロアレイまたは既知の全菌種を固定化したマイクロアレイを用いることにより、近縁菌種レベルでの識別が可能となるという効果がある。また、環境中の微生物検出においては、培養が困難な菌についても検出できる点で、さらに、多数の菌種を同時に効率よく同定できる点で有利である。
【００５４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成技術の一例を示す概略図である。
【図２】本発明によるＩＴＳ−ＤＮＡ交雑形成率とゲノムＤＮＡ交雑形成率との関係を示すグラフである。
【図３】糞便試料ＩＴＳ−ＤＮＡを用いたＤＮＡマイクロアレイとの交雑形成で得られた腸内細菌の検出画像を示す図である。
Claims (8)
- ＩＴＳ領域に相当するＤＮＡ（ＩＴＳ−ＤＮＡ）の交雑形成法を用いることを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項１記載のＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、メンブランフィルター上で行うことを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項１記載のＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、マイクロプレート上で行うことを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項１記載のＩＴＳ−ＤＮＡ交雑を、ＤＮＡマイクロアレイ上で行うことを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項２，３，４のいずれかに記載の技術を、微生物株の同定に利用することを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項２，３，４のいずれかに記載の技術を、食材・食品・飲料中の微生物検出・同定に利用することを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項２，３，４のいずれかに記載の技術を、臨床・腸内細菌を含む生体中の微生物検出・同定に利用することを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
- 請求項２，３，４のいずれかに記載の技術を、その他の環境中の微生物検出・同定に利用することを特徴とする微生物の分子生物学的同定技術。
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