DE69833853T2

DE69833853T2 - Nukleinsäuren zur erkennung von aspergillus spezien

Info

Publication number: DE69833853T2
Application number: DE69833853T
Authority: DE
Inventors: J. Christine Decatur MORRISON; Errol Chamblee REISS; Liliana Aidorevich; Soo Jong CHOI
Original assignee: Us Gov Sec Dis & Prev; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Current assignee: Us Gov Sec Dis & Prev; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1998-05-01
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2018-05-02
Also published as: WO1998050584A2; CA2288965A1; JP2001525665A; CA2288965C; AU733810B2; DE69833853D1; ATE320506T1; US20030129600A1; US7052836B2; WO1998050584A3; JP2010042005A; AU7366098A; JP4425354B2; CA2658320C; CA2658320A1; US6372430B1; EP0979312A2; EP0979312B1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der diagnostischen Mikrobiologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Arten-spezifische Detektion von Aspergillus-Arten.
Hintergrund der Erfindung
In den letzten Jahren haben Chemotherapie gegen hämatologische Malignitäten und hochdosierte Kortikosteroidbehandlung von Organtransplantatempfängern zusammen mit der Verbreitung von AIDS die Anzahl von immungeschwächten Patienten erhöht (1, 12, 14, 43). Saprophytische Fadenpilze, wie beispielsweise Aspergillus, Rhizopus- und Mucor-Arten, die in der Umgebung gefunden werden, und die als von niedriger Virulenz betrachtet wurden, sind jetzt für eine steigende Anzahl von Infektionen in immungeschwächten Wirten verantwortlich (17, 20, 43). Zusätzlich sind diese Infektionen bei immungeschwächten Patienten oft stark und schnell tödlich (7, 11, 12, 20, 44). Die Morbidität und Mortalität sind extrem hoch; z. B. hat Aspergillose eine Mortalitätsrate von ungefähr 90% (8, 11).
Um die Sache zu verkomplizieren, ist die Diagnose schwierig, und Symptome sind oft unspezifisch (18, 27, 29, 42, 44). Antikörper-gestützte Tests können aufgrund der unterdrückten oder variierenden Immunantworten von immungeschwächten Patienten unzuverlässig sein (2, 9, 18, 46). Antigendetektionstests, welche bis heute entwickelt wurden, haben die gewünschte Sensitivität nicht erreicht (2, 9, 38). Radiographischer Nachweis kann unspezifisch und ergebnislos sein (5, 29, 36), obwohl mit der Einführung von Computertomographie ein gewisser Fortschritt in der Diagnose gemacht wurde (40). Eine definitive Diagnose erfordert jedoch immer noch eine positive Blut- oder Gewebekultur oder eine histopathologische Bestätigung (3, 21). Eine zusätzliche Komplikation ist, dass invasive Prozeduren, die notwendig sind, um Biopsiematerialien zu erhalten, bei thrombozytopenischen Patientenpopulationen (37, 41) nicht zu empfehlen sind (37, 41).
Selbst wenn Kulturen von Blut, Lungen- oder Rhinozerebralgewebe positiv sind, kann eine morphologische und biologische Identifikation von Fadenpilzen einige Tage erfordern, bis adäquates Wachstum und Sporenbildung erfolgen, was eine zielgerichtete medikamentöse Therapie verzögert. Einige atypische Isolate mögen niemals Sporen bilden, was die Identifikation noch schwieriger macht (23). Wenn Histopathologie an Gewebebiopsiesektionen durchgeführt wird, machen morphologische Ähnlichkeiten von verschiedenen Fadenpilzen im Gewebe eine Differenzierung schwierig (16). Färben von histopathologischen Gewebesektionen mit fluoreszenten Antikörpern ist nicht spezifisch, solange kreuzreaktive Epitope nicht heraus absorbiert werden, die die resultierenden Antikörperreaktionen schwach machen können (14, 19). Die therapeutische Möglichkeiten variieren (7, 41, 44), was einen Test zum schnellen und spezifischen Identifizieren von Fadenpilzen für die Implementation von passend zielgerichteten Therapien dringend nötig macht. Frühe und genaue Diagnose und Behandlung können die Morbidität reduzieren und die Chancen für das Patientenüberleben erhöhen (6, 27, 39). Weiterhin wäre die Identifikation von Fadenpilzen mindestens auf Artenniveau epidemiologisch nützlich (24, 31, 43, 47).
PKR-gestützte Verfahren zur Detektion, die als schnelle, sensitive Mittel zum Diagnostizieren von Infektionen vielversprechend sind, sind bei der Identifikation von DNS von Candida-Arten (13, 15, 30) und einigen anderen Pilzen, insbesondere Aspergillus-Arten (31. 33. 45) verwendet worden. Jedoch sind die meisten dieser Tests nur gattungs-spezifisch (28, 38) oder darauf gerichtet, nur Gene in einfacher Kopie (Single-Kopie Gene) zu detektieren (4, 35). Andere haben Sonden entwickelt, um in mehreren Kopien vorliegende Gene (Multi-Kopie Gene) zu detektieren, um so die Testsensitivität zur erhöhen (31, 33), aber dadurch haben sie Testspezifizität verloren, weil sie hochgradig konservierte Gene verwendet haben, die eine oder wenige Arten detektieren, die aber auch von Kreuzreaktivitäten mit humaner, Pilz- oder sogar Virus-DNA geplagt werden (25, 31, 33).
Weitere Beispiele für PKR-gestützte Verfahren zur Detektion umfassen das Typisieren von Pneumozystes carinii-Stämmen mit Typen-spezifischen Oligonukleotidsonden, die von den Nukleotidsequenzen interner transkribierter Spacer von rRNS-Genen abgeleitet werden, wie von Lu et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33 (11): 2973–2977 beschrieben wurde, und die Nukleinsäuresondentestmethoden zum Detektieren von Candida-Zell-DNS in Blut, wie in der US 5,426,027 beschrieben ist.
Gastrell et al. (1997) Electrophoresis 18: 1567–1569 beschreiben die Untersuchung ribosomaler DNS-Sequenzen interner transkribierter Spacer (ITS) bei den Gattungen Alternaria, Aspergillus, Clastoporium und Penicillium, um Regionen zu identifizieren, die für die Entwicklung von Gattungs- und Artenspezifischen Oligonukleotidsonden geeignet sind.
Deshalb ist es ein Ziel der Erfindung, verbesserte Materialien und Verfahren zum Detektieren und Differenzieren von Aspergillus-Arten in klinischen und Laborumgebungen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuren zum Detektieren von Aspergillus-Arten. Einzigartige internen transkribierten Spacer 2-codierende Regionen erlauben die Entwicklung von Sonden, die für fünf unterschiedliche Aspergillus-Arten, A. flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus und A. nidulans spezifisch sind. Die Erfindung stellt dadurch Verfahren für die Arten-spezifische Detektion und Diagnose von Aspergillus-Infektion bei einem Subjekt bereit.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellte ein einfaches, schnelles und nützliches Verfahren zum Differenzieren von Fadenpilzarten voneinander und von anderen medizinisch wichtigen Pilzen bereit. Diese Erfindung ermöglicht ein schnelles, einfaches und nützliches Verfahren zum Isolieren von Pilz-DNS von Wirtsproben und zum Anwenden der Arten- und Gattungs-spezifischen Sonden für die Diagnose einer Krankheit. Letztlich können diese Sonden für in situ-Hybridisierungs- oder in situ-PKR-Diagnostiken verwendet werden, so dass die Morphologie von Wirtsgewebe und Mirkroorganismen intakt bleibt.
Die Erfindung stellte Nukleinsäuren mit Spezifizität für fünf Aspergillu-Arten bereit. Diese Nukleinsäuren stammen von der internen transkribierten Spacer 2 ("ITS2")-Region von ribosomaler Deoxyribonukleinsäure (rDNS) von dem Genom der vorgenannten Fadenpilze. Diese ITS2-Region ist zwischen der 5.8S-rDNS-Region und der 28S-rDNS-Region angeordnet.
Insbesondere stellt die Erfindung Nukleinsäuren von Aspergillus flavus (SEQ IDNO: 1), Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2), Aspergillus niger (SEQ ID NO: 3), Aspergillus terreus (SEQ ID NO: 4) und Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 5) bereit. Diese Sequenzen können verwendet werden, um Aspergillus-Arten zu identifizieren und zu unterscheiden und um diese Arten von Fusarium, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Absidia corymbifera, Cunninghamella elegans, Pseudallescheria boydii (Scedosporium apiospermum) und Sporothrix schenkii zu identifizieren und unterscheiden.
Weiterhin stellt die Erfindung isolierte Nukleinsäuresonden bereit, die von den obigen Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind und die als Arten-spezifische Identifizierer von Aspergillus flavus (SEQ ID NO: 30 und 31), Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 32), Aspergillus niger (SEQ ID NO: 33), Aspergillus terreus (SEQ ID NO: 34) und Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 35) verwendet werden können. Diese Pilze können nach Polymerasekettenreaktions- oder Ligasekettenreaktionsverstärkung von Pilz-DNS und spezifischem Testen von verstärkter DNS mit DNS-Sonden detektiert werden, die z. B. mit Digoxigenin markiert sind und mit anti-Digoxigenin-Antikörpern markiert mit Meerrettichperoxidase und einem Kolorimetrischen Substrat reagiert werden. Zusätzliche Sonden, die für die jeweiligen Arten spezifisch sind, können routinemäßig von den Sequenzen abgeleitet werden, die in den SEQ ID NO: 1–5 angegeben sind. Deshalb werden die Sonden, die in den SEQ ID NO: 30–35 gezeigt sind, nur als Beispiele für die Arten-spezifischen Sonden angegeben, die von den SEQ ID NO: 1–5 abgeleitet werden können.
Mit "isoliert" ist Nukleinsäure frei von mindestens einigen der Komponenten gemeint, mit denen sie natürlicherweise zusammen auftritt. Mit "selektiv" ist eine Sequenz gemeint, die nicht in solcher Weise mit anderen Nukleinsäuren hybridisiert, dass sie eine adäquate Bestimmung einer Aspergillus-Art verhindert.
Die hybridisierende Nukleinsäure sollte wenigstens 70% Komplementärität mit dem Segment der Nukleinsäure aufweisen, an das sie hybridisiert. So wie er hier verwendet wird, um Nukleinsäuren zu beschreiben, schließt der Begriff "hybridisiert selektiv" die fallweise zufällig hybridisierenden Nukleinsäuren aus und hat so dieselbe Bedeutung wie "hybridisiert spezifisch". Die selektiv hybridisierenden Nukleinsäuren der Erfindung können mindestens 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% und 99% Komplementärität mit dem Segment der Sequenz aufweisen, an das sie hybridisieren.
Die Erfindung zieht Sequenzen, Sonden und Primer in Betracht, die selektiv mit dem komplementären oder entgegengesetzten DNS-Strang zu jenen, die hier spezifisch angegeben sind, hybridisieren. Spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäure kann bei kleineren Modifikationen oder Substitutionen bei der Nukleinsäure auftreten, solange wie die funktionelle Arten-spezifische oder Gattungs-spezfifische Hybridisierungsfähigkeit beibehalten wird. Mit "Sonde" sind Nukleinsäuresequenzen gemeint, die als Sonden oder Primer zur selektiven Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäuresequenzen zu deren Detektion oder Verstärkung verwendet werden können, wobei die Sonden in der Länge von ungefähr 5 bis 100 Nukleotide oder vorzugsweise von ungefähr 10 bis 50 Nukleotide und am meisten bevorzugt um ungefähr 18 Nukleotide variieren können. Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren bereit, die unter stringenten Bedingungen selektiv mit den Arten-spezifischen Nukleinsäuren hybridisieren und mindestens fünf Nukleotide aufweisen sollten, die komplementär zu der interessierenden Sequenz sind. Siehe allgemein, Maniatis (26).
Wenn sie als Primer verwendet wird, stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die mindestens zwei Nukleinsäuren umfassen, die mit unterschiedlichen Regionen hybridisieren, um eine gewünschte Region zu verstärken. Abhängig von der Länge der Sonde oder des Primers kann die Zielregion von 70% komplementären Basen bis zu voller Komplementärität reichen und stets unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Z. B. ist zum Zweck des Diagnostizierens der Anwesenheit von Aspergillus das Maß der Komplementärität zwischen der hybridisierenden Nukleinsäure (Sonde oder Primer) und der Sequenz, an die sie hybridisiert (z. B. Aspergillus-DNS von einer Probe) mindestens ausreichend, um Hybridisierung mit einer Nukleinsäure von anderen Hefen und Fadenpilzen zu unterscheiden. Die Erfindung stellt Beispiele von Nukleinsäuren bereit, die einzigartig für jeden Fadenpilz in den aufgelisteten Sequenzen ist, so dass das Maß an Komplementärität, das erforderlich ist, um unter stringenten Bedingungen selektiv hybridisierende von nicht selektiv hybridisierenden Nukleinsäuren zu unterscheiden, für jede Nukleinsäure eindeutig bestimmt werden kann.
Zusätzlich stellt die Erfindung bereit, dass die Nukleinsäuren verwendet werden können, um die aufgelisteten Fadenpilze allgemein von anderen Fadenpilzen und Hefen, wie beispielsweise Candida- Arten, zu differenzieren. Solch eine Bestimmung ist klinisch signifikant, da sich die Therapien für diese Infektionen unterscheiden.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Verwenden der Nukleinsäuren bereit, um die Anwesenheit der aufgelisteten Fadenpilze oder von speziellen Arten derselben zu detektieren und zu identifizieren. Das Verfahren bezieht die Schritte des Erhaltens einer Probe, die verdächtig ist, Fadenpilze zu enthalten, ein. Die Probe kann aus einem Individuum, wie beispielsweise Blut, Schleim, Lungenwaschflüssigkeit, Gebärmutterschleimhaut, Gewebe usw., oder aus der Umwelt entnommen sein. Die Fadenpilzzellen können dann lysiert werden, und die DNS kann extrahiert und präzipitiert werden. Die DNS wird vorzugsweise unter Verwendung von Universalprimern verstärkt, die von den internen transkribierten Spacer-Regionen, 18S-, 5.8S- und 28S-Regionen der Fadenpilz-rDNS, abgeleitet sind. Beispiele für solche Universalprimer sind unten als ITS 1 (SEQ ID NO: 62), ITS3 (SEQ ID NO: 63) und ITS4 (SEQ ID NO: 64) gezeigt. Detektion von Fadenpilz-DNS wird durch Hybridisieren der verstärkten DNS mit einer Arten-spezifischen Sonde erreicht, die selektiv mit der DNS hybridisiert. Detektion von Hybridisierung weist auf die Anwesenheit der speziellen Gattung (für Gattungssonden) oder Art (für Artensonden) des Fadenpilzes hin.
Vorzugsweise kann die Detektion von Nukleinsäure-(z. B. Sonden- oder Primer-)-Hybridisierung durch die Verwendung von detektierbaren Einheiten erleichtert werden. Z. B. können die Arten-spezifischen oder generischen Sonden mit Digoxigenin markiert werden, und eine Sonde für alle Pilze, wie sie in der SEQ IDNO: 61 beschrieben ist, kann mit Biotin markiert werden und in einem Test mit Streptavidinbeschichteten Mikrotiterplatten verwendet werden. Andere detektierbare Einheiten umfassen z. B. radioaktive Markierung, Enzymmarkierung und fluoreszente Markierung.
Die Erfindung sieht weiterhin ein Kit in Betracht, das eine oder mehrere Arten-spezifische Sonden enthält, die für die Detektion einer bestimmten Fadenpilzart und -gattung in einer Probe verwendet werden können. Solch ein Kit kann auch die geeigneten Reagenzien zum Hybridisieren der Sonde an die Probe und zum Detektieren der gebundenen Sonde enthalten. Die Erfindung kann weiter durch die folgenden nicht limitierenden Beispiele demonstriert werden.
Beispiele
In diesem Beispiel wurden PKR-Tests angewendet, die universelle, Pilz-spezifische Primer und ein einfaches, schnelles EIA-basiertes Format für die Amplicon-Detektion einsetzen.
Extraktion von Fadenpilz-DNS
Ein mechanisches Aufbrechverfahren wurde verwendet, um DNS von Fadenpilzarten zu erhalten, und ein enzymatisches Aufbrechverfahren, das zuvor beschrieben wurde (13), wurde verwendet, um DNS von Hefen zu erhalten. Fadenpilze wurden für 4 bis 5 Tage auf Sabouraud-Dextroseagarschrägkulturen (BBL, Abteilung von Becton Dickinson, Cockeysville, MD) bei 35°C gezogen. Zwei Schrägkulturen wurden dann durch energisches Pipetieren von 5 ml 0,01 M Kaliumphosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf die Oberfläche jeder Schrägkultur gewaschen, und die Waschlösungen wurden in 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, die 250 ml Sabouraud Dextrosebouillon (BBL) enthielten. Die Kolben wurden dann für 4 bis 5 Tage auf einem Rotationsschüttler (140 U/min) bei Raumtemperatur inkubiert. Die angewachsene Substanz wurde dann durch Vakuumfiltration durch ein steriles Whatman #1-Filterpapier geerntet, das auf einem sterilen, an eine 21 Seitenarmflasche angeschlossenen Buchner-Trichter angeordnet worden war. Die resultierende Zellmatte wurde auf dem Filtrationsapparat dreimal mit sterilem destillierten Wasser gewaschen, durch sanftes Kratzen mit einem Gummistab von dem Filterpapier entfernt und in eine sterile Petrischale gegeben, die dann mit einer Parafolie abgedichtet und bei –20°C eingefroren wurde, bis sie verwendet wurde.
Direkt vor der Verwendung wurde eine Portion der gefrorenen Zellmatte, die in der Größe einem Viertel entsprach, entfernt und in einen kalten Mörser (von 6 Zoll Durchmesser) gegeben. Flüssiger Stickstoff wurde zugegeben, um die Matte abzudecken, die dann mit einem Stößel in ein Pulver zerrieben wurde. Zusätzlicher flüssiger Stickstoff wurde nach Bedarf zugegeben, um die Matte während des Zermahlens gefroren zu halten.
DNS wurde dann unter Anwendung von Proteinase-K- und RNase-Behandlung, mehrfache Phenolextraktionen und Ethanolpräzipitation durch konventionelle Mittel aufgereinigt (26).
PKR-Verstärkung
Das Pilz-spezifische universelle Primerpaar ITS3 (5'-GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC-3') (SEQ ID NO: 63) und ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') (SEQ ID NO: 64) wurde verwendet, um einen Anteil der 5.8S-rDNS-Region, die gesamte ITS2-Region und einen Anteil der 28S-rDNS-Region für alle Arten zu verstärken, wie zuvor beschrieben wurde (13, 34). Das DNS-Sequenzieren verwendete dieses Primerpaar und das Pilz-spezifische, universelle Primerpaar ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') (SEQ ID NO: 62) und ITS4, um einen Anteil der 18S-rDNS-Region, die gesamte 5.8S-Region, die gesamten ITS1- und ITS2-Regionen und einen Anteil der 28S-rDNS-Region zu verstärken.
Ein DNS-Reagenzkit (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Japan) wurde für die PKR-Verstärkung von genomischer DNS verwendet. Die PKR wurde durchgeführt unter Verwendung von 2 μl der Testprobe in einem PKR-Reaktionsgesamtvolumen von 100 μl, das aus 10 μl 10x Ex Tag-Puffer, jeweils 2,5 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, in 8 μl, 0,2 μM von jedem Primer, und 0,6 U TaKaRa Ex Tag-DNS-Polymerase bestand.
Dreißig Verstärkungszyklen wurden in einem Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler (Emeryville, CA) nach der anfänglichen Denaturierung von DNS bei 95 °C für 5 min durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungsschritt bei 95 °C für 30 s, einem Anlassschritt bei 58 °C für 30 s und einem Ausweitungsschritt bei 72 °C für 1 min. Eine abschließende Ausweitung bei 72 °C für 5 min folgte dem letzten Zyklus. Nach der Verstärkung wurden die Proben bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.
Tabelle 1 Synthetische Universaloligonukleotide, die bei PKR- und Hybridisierungsanalysen verwendet wurden
DNS-Sequenzieren
Primäre DNS-Verstärkung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Eine wässrige Phase der primären PKR-Reaktion wurde unter Verwendung von QIAquick Rotationssäulen (Spin Columns) (Quiagen, Chatsworth, CA) aufgereinigt. Die DNS wurde von jeder Säule mit 50 μl Hitze-sterilisiertem Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) eluiert.
Gereinigte DNS wurde unter Verwendung eines Farbstoffterminatorzyklussequenzierkits (ABI PRISM, Perkin Elmer, Foster City, CA) markiert. Eine Mischung wurde für jeden der Primer hergestellt, so dass das Sequenzieren sowohl in der Vorwärts- als auch der Rückwärtsrichtung durchgeführt werden konnte. Das Reaktionsvolumen (20 μl) enthielt 9,5 μl Terminator Premix, 2 μl (1 ng) DNS-Matrize, 2 μl Primer (3,2 pmol) und 7,5 μl Hitze-sterilisiertes H₂O. Die Mischung wurde dann für 25 Zyklen von 96 °C für 10 s, 50 °C für 5 s, 60 °C für 4 min in einen vorgeheizten (96 °C) Perkin Elmer 9600 Thermal Cycler gegeben. Das PKR-Product wurde dann vor dem Sequenzieren unter Verwendung von CentriSep Rotationssäulen (Princeton Separations, Adelphia, NJ) aufgereinigt. Die DNS wurde dann vakuumgetrocknet, vor dem Sequenzieren unter Verwendung eines automatisierten DNS- Kapillarsequenzierers (ABI Systems, Model 373, Bethesda, MD) wieder in 6 μl Formamid-EDTA (5 μl entionisiertes Formamid plus 1 μl 50 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert und für 2 min bei 90 °C denaturiert.
Die Sequenzierresultate waren wie folgt:
Kontaminierungsschutzmaßnahmen
Schutzmaßnahmen wurden ergriffen, um mögliche Verunreinigungen von PKR-Proben zu vermeiden, indem den Richtlinien von Fujita und Kwok (13, 22) gefolgt wurde. Alle Puffer und destilliertes Wasser, die für PKR-Tests verwendet wurden, wurden autoklaviert, und frische PKR-Reagenzien wurden vor der Verwendung in Aliquots aufgeteilt. Physikalische Trennung von Laborbereichen, die verwendet wurden, um PKR-Tests zu präparieren und um PKR-Produkte zu analysieren, und die Verwendung von Aerosolresistenten Pipettenspitzen reduzierten mögliche Kreuzkontaminationen von Proben durch Aerosole. Geeignete negative Kontrollen wurden in jeden Testlauf einbezogen, einschließlich Kontrollen, die entweder den Primer oder die DNS-Matrize während der PKR-Tests weg ließen.
Agarosegelelektrophorese
Gelelektrophorese wurde in TBE-Puffer (0,1 M Tris, 0,09 M Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8,4) bei 80 V für 1 bis 2 Stunden unter Verwendung von Gelen durchgeführt, die aus 1% (Gew/Vol) Agarose (International Technologies, New Haven, CT) und 1% (Gew/Vol) NuSieve-Agar (FMC Bioproducts, Rockland, ME) zusammengesetzt waren. Die Gele wurden mit 0,5 μg Ethidiumbromid (EtBr) pro ml destilliertes H₂O für 10 min gefärbt, gefolgt von drei aufeinander folgenden Waschungen für 10 min jeweils mit destilliertem H₂O.
Mikrotiterplattenenzymimmunreaktionstest für die Detektion von PKR-Produkten
Amplicons wurden unter Verwendung von Arten-spezifischen und Gattungs-Sonden markiert mit Digoxigenin und einer Sonde für alle Fadenpilze markiert mit Biotin in einem Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplattenformat detektiert (13, 34). Zehn μl PKR-Produkt wurden zu jedem 1,5 μl Eppendorf-Rohr zugegeben. Einzelstrang-DNS wurde dann durch Aufheizen der Rohre für 5 min auf 95 °C und sofortiges Abkühlen auf Eis präpariert. Zwei Zehntel eines ml Hybridisierungslösung [4x SSC (Salzlösung-Natriumcitrat-Puffer, 0,6 M NaCl, 0,06 M Trinatriumcitrat, pH 7,0), der 20 mM Hepes, 2 mM EDTA und 0,15% (Vol/Vol) Tween 20 enthielt], angereichert mit jeweils 50 ng/ml von der biotinylierten Sonde für alle Aspergillus und einer Arten-spezifischen Digoxigenin-markierten Sonde wurden zu jedem Rohr zugegeben, das denaturiertes PKR-Produkt enthielt. Die Rohre wurden durch Umdrehen durchmischt und in ein Wasserbad von 37 °C gegeben, um es den Sonden zu erlauben, sich an die PKR-Produkt-DNS anzulassen. Nach einer Stunde wurden 100 μl von jeder Probe zu doppelten Löchern einer kommerziell präparierten Streptavidin-beschichteten Mikrotiterationsplatte (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) zugegeben. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 1 h unter Schütteln inkubiert, wobei ein Mikrotitrationsplattenschüttler verwendet wurde (hergestellt für Dynatech durch CLTI, Middletown, NY). Die Platten wurden sechsmal mit 0,01 M Kaliumphosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, die 0,05% Tween 20 enthielt (PBST), gewaschen. Jedes Loch erhielt dann 100 μl Meerrettichperoxidase-konjugiertes anti-Digoxigenin-Fab-Fragment (Boehringer Mannheim) 1:1000 verdünnt in Hybridisierungspuffer. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min unter Schütteln wurde die Platte sechsmal mit PBST gewaschen. Einhundert μl einer Mischung aus einem Volumen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinperoxidasesubstrat (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersberg, MD) und einem Volumen Peroxidaselösung (Kirkegaard and Perry Laboratories) wurde zu jedem Loch zugegeben, und die Platte wurde zur Farbentwicklung für 10 min bei Raumtemperatur angeordnet. Die A_650nm von jedem Loch wurde mit einem Mikrotitrationsplattenleser (UV Max, Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA) bestimmt. Der Absorptionswert für das Leerreagenz, bei dem DNS fehlte und durch destilliertes H₂O ersetzt war, wurde von jeder Testprobe abgezogen.
Statistische Analyse
Der Studenten-t-Test wurde angewendet, um Unterschiede zwischen den Probenmittelwerten zu bestimmen. Mittelwerte sind als der Mittelwert plus oder minus der Standardabweichung von dem Mittelwert ausgedrückt. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05.
Die folgenden Sonden wurden verwendet, um jede Art zu detektieren und zu unterscheiden.
Tabelle 2 Sondensequenzen
Arten-spezifische Sonden für die ITS2-Region von rDNS für Aspergillus funigatus (SEQ ID NO: 32), A. flavus (SEQ ID NO: 31), A. niger (SEQ ID NO: 33), A. terreus (SEQ ID NO: 34) und A. nidulans (SEQ ID NO: 35) identifizierten jeweils korrekt die jeweiligen Arten (P < 0,001) und ergaben keine falsch positiven Reaktionen mit Rhizopus-, Mucor-, Fusarium-, Penicillium- oder Candid-Arten. Die A. flavus-Sonde erkannte auch A. oryzae, der zu der A. flavus-Gruppe gehört. Der Identifikationszeitraum wurde von einem Mittelwert von 5 Tagen durch konventionelle Verfahren auf 8 Stunden reduziert.
Tabelle 3 Aspergillus-Sonden
Arten-spezifische Sonden für die ITS2-Region von rDNS für Fusarium oxysporum, F. solani und F. moniliforme identifizierten jeweils korrekt die entsprechenden Arten (P < 0.001) und ergaben keine falsch positiven Reaktionen mit Blastomyces, Apophysomyces, Candida, Aspergillus, Mucor, Penecillium, Rhizopus, Rhizomucor, Absidia, Cunninghamella, Pseudallescheria, Sporothrix oder Neosartorya. Leere Kästchen in Tabelle 4 geben eine Sondenreaktivität von null an.
Tabelle 4 Fusarium-Sonden
Arten-spezifische Sonden für verschiedene andere Zygomyzeten sind in Tabelle 5 wiedergegeben, die die korrekte Identifikation aller Arten und keine falsch positiven Reaktionen zeigt. Die Ausnahmen sind, dass die M. circinelloides-Sonde mit der M. rouxii-DNS hybridisierte und die M, plumbeus-Sonde mit M. racemosus-DNS hybridisierte. Jedoch hybridisierte weder die M. rouxii-Sonde mit M. circinelloides-DNS, noch hybridisierte die M. racemosus-Sonde mit M. plumbeus-DNS. Deshalb kann durch einen Eliminierungsprozess jede Art korrekt identifiziert werden. Leere Kästchen in Tabelle 5 geben eine Sondenreaktivität von null an.
Tabelle 5 Zygomyzeten-Sonden
Tabelle 5 Fortsetzung
Arten-spezifische Sonden für verschiedene andere Pilze werden in Tabelle 6 wiedergegeben, die die korrekte Identifikation von allen Arten und keine falsch positiven Reaktionen zeigt. Leere Kästchen in Tabelle 6 geben eine Sondenreaktivität von null an.
Tabelle 6 Pseudallescheria- und Sporothrix-Sonden
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Claims

Isolierte Nukleinsäuresonde zum Identifizieren einer Spezies, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Aspergillus flavus (SEQ ID NO: 1), Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2) Aspergillus niger (SEQ ID NO: 3), Aspergillus terreus (SEQ ID NO: 4) und Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 5), wobei die Sonde selektiv an einen Bereich der Nukleinsäure der Sequenz ID NO: 1–5 bzw. eine dazu komplementäre Sequenz hybridisiert.
Verfahren zum Detektieren einer Spezies, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Aspergillus flavus (SEQ ID NO: 1), Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2) Aspergillus niger (SEQ ID NO: 3), Aspergillus terreus (SEQ ID NO: 4) und Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 5), in einer Probe, wobei das Verfahren das Kombinieren der Probe mit einer Nukleinsäuresonde aufweist, die in der Lage ist, selektiv mit einer Nukleinsäure der SEQ ID NO: 1–5 bzw. einer dazu komplementären Sequenz zu hybridisieren, wobei das Vorliegen der Hybridisierung die Detektion der Spezies in der Probe anzeigt.
Sonde nach Anspruch 1 zum Identifizieren oder Nachweisen von A. flavus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 30 oder 31 besteht.
Sonde nach Anspruch 1 zum Identifizieren oder Detektieren von A. fumigatus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 besteht.
Sonde nach Anspruch 1 zum Identifizieren oder Detektieren von A. niger, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 33 besteht.
Sonde nach Anspruch 1 zum Identifizieren oder Detektieren von A, terreus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 34 besteht.
Sonde nach Anspruch 1 zum Identifizieren oder Detektieren von A. nidulans, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 35 besteht.
Sonde nach Anspruch 2 zum Identifizieren oder Detektieren von A. flavus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 30 oder 31 besteht.
Sonde nach Anspruch 2 zum Identifizieren oder Detektieren von A. fumigatus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 besteht.
Sonde nach Anspruch 2 zum Identifizieren oder Detektieren von A. niger, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 33 besteht.
Sonde nach Anspruch 2 zum Identifizieren oder Detektieren von A. terreus, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 34 besteht.
Sonde nach Anspruch 2 zum Identifizieren oder Detektieren von A. nidulans, wobei die Sonde aus der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 35 besteht.