CN110079621A - 用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒 - Google Patents
用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子学生物检测领域，更具体的，涉及分枝杆菌鉴定领域。本发明提供了一种寡核苷酸组合，包括检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸，以及检测胞内分枝杆菌的寡核苷酸，可选地还包括选自其余三组中的至少一组，其可特异性地检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，并鉴定至具体种/亚种，同时还实现一个通道同时检测两种分枝杆菌，扩大了荧光PCR检测分枝杆菌的数量；本发明还提供了包含该寡核苷酸组合的试剂盒以及用于鉴定分枝杆菌的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子学生物检测领域，更具体的，属于分枝杆菌鉴定领域。
背景技术
分枝杆菌(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的，有时有分枝或出现丝状体的菌。分枝杆菌种类较多，主要包括结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)，和非结核分枝杆菌。
结核分枝杆菌(M.tuberculosis，TB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。
非结核分枝杆菌(none—tuberculous Mycobacteria，NTM)，也曾称为非典型分枝杆菌(Mycobacteria other than tuberculosis，MOTT)。随着医务工作者对相关疾病认识的提高、菌种鉴定技术的进步以及免疫缺陷性疾病和免疫抑制剂使用增多等因素，临床观察到的与NTM相关的疾病呈明显增多趋势。临床对NTM感染疾病诊断和治疗需求的增加促使对临床实验室检验能力要求的不断提升。NTM在肺器官上的感染症状与TB类似。NTM在环境中普遍存在，以土壤和水中最为常见，水源性NTM与人类感染的关系最为密切。随着鉴定技术的进步，已报道的分枝杆菌菌种数量越来越多，目前已超过170种。临床最常见的有临床价值包括脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌以及蟾蜍分枝杆菌等。
目前，常见的分枝杆菌的鉴定方法有三种：生化试验、初步菌种鉴定方法和具体菌种鉴定方法。其中，生化试验虽然曾经是经典方法，但由于操作复杂、耗时而结果不准确，因此已不常使用。初步菌种鉴定方法仅能鉴别MTBC和NTM，具体菌种鉴定方法虽然能够鉴别至种水平，但鉴定的菌种很少，且准确性和灵敏度不高。
荧光定量PCR是一种对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的检测方法；结合相应的软件可以对产物进行分析，具有反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰的特点。目前已有使用荧光定量PCR鉴定分枝杆菌的报道，例如，中国发明专利(公开号：CN101413031A)公开了一种采用荧光PCR鉴定分枝杆菌的方法以及试剂盒，所述试剂盒包括引物1、2、3、4和探针1、2，能够将结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌区分开。然而，该试剂盒或方法不能将分枝杆菌鉴定到具体种，且无法同时对多个分枝杆菌菌种/亚种进行检测，除此之外也并未对灵敏度以及准确度进行验证。
因此，存在对同时鉴定多个分枝杆菌种/亚种的高灵敏度试剂的强烈需求。
发明内容
有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种寡核苷酸组合，包括：
第一组：检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:5、6和19所示，以及检测胞内分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:11、12、23和27所示，可选地还包括选自以下组中的至少一组：
第二组：检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2和17所示，以及检测脓肿分枝脓肿亚种的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:7、8、21和25所示；
第三组：检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:3、4和18所示，以及检测结核分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:9、10、22和26所示；
第四组：检测脓肿分枝马赛亚种的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:13、14、24和28所示。进一步地，所述寡核苷酸组合包括如以上组中的至少两组、至少三组或四组。
进一步地，所述寡核苷酸组合的第四组中还包括检测内标的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:15、16和20所示。所述内标能够与上述寡核苷酸组合联用并互不影响，其用于判断本次检测是否有效，进一步确保所述寡核苷酸组合的检测准确性。
其中，SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6以及SEQ ID NO:15和16用作TaqMan探针法中的引物对，SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19以及SEQ IDNO:20用作TaqMan探针法中的探针。
其中，SEQ ID NO:7和8、SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12以及SEQ ID NO:13和14用作熔解曲线法中的引物对，SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:24是用作熔解曲线法中的荧光扩增引物对中的P1，SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27和SEQ ID NO:28是用作熔解曲线法中的荧光扩增引物对中的P2。
进一步地，上述寡核苷酸组合的荧光报告基团互不相同并互不干涉，并且可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。
进一步地，上述寡核苷酸组合中的第一组的荧光报告基团为ROX、第二组为FAM、第三组为HEX或VIC，以及第四组为CY5。
进一步地，荧光扩增引物对P1和P2还可以具有C3间臂的结构，荧光扩增引物对P2还可以具有[BHQ1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(荧光基团)]或[BHQ2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(荧光基团)]的结构。
在具体的实施方案中，上述寡核苷酸组合中，检测堪萨斯分枝杆菌、检测鸟分枝杆菌、检测偶然分枝杆菌和内标的寡核苷酸适用于TaqMan探针法；检测脓肿分枝脓肿亚种、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝马赛亚种的寡核苷酸适用于熔解曲线法。
在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸组合包括第一至四组寡核苷酸组。即本发明可以在一只反应管中，通过使用全部四组的寡核苷酸组合物同时检测结核分枝杆菌(MTB)、堪萨斯分枝杆菌(MK)、鸟分枝杆菌(MA)、偶然分枝杆菌(MF)、脓肿分枝脓肿亚种(MAA)、脓肿分枝马赛亚种(MAM)、胞内分枝杆菌(MIN)等7个靶标和反应内标。从而实现高通量、快速的检测，并节省了样本消耗量。
在第二方面，本发明还提供了上述寡核苷酸组合在检测分枝杆菌中的用途。
在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的寡核苷酸组合中的任意一种。
进一步地，所述试剂盒还包括提取DNA所需试剂、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
进一步地，本发明还提供了上述试剂盒用于检测分枝杆菌的用途。
在第四方面，本发明提供了用于检测分枝杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA；
2)使用如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸组合对步骤1)获得的DNA扩增；
3)分析结果。
进一步地，所述步骤1)中的所述样品可以是痰液、培养物等。
进一步地，所述步骤3)中，采用Ct值作为堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶然分枝杆菌和内标的判定标准；并且采用熔解曲线作为脓肿分枝脓肿亚种、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝马赛亚种的判定标准，检测其在相应的Tm值的温度下，有无特征峰。
进一步的，所述步骤2)中的寡核苷酸组合的浓度由如下所示：
进一步地，所述步骤2)中还包括以下组分和浓度：
更进一步地，所述步骤2)中的寡核苷酸组合的浓度由如下所示：
进一步地，所述步骤2)中还包括以下组分和浓度：
进一步的，步骤3)中的PCR扩增程序如下所示
需指出，本发明寡核苷酸组合在设计方面与一般的荧光定量PCR法不同。第一，需要克服在单个通道同时检测两个菌种的困难，也即是基于Ct值和熔解曲线两种检测方法设计寡核苷酸的难度。可以理解，当在同一个荧光通道上检测两个靶标时，两者在荧光采集上存在一定竞争关系，其中一个靶标的扩增必然会对另一个靶点有抑制作用。第二，熔解曲线法的引物探针容易产生非特异的扩增曲线，影响另一个靶标的判断，因此对熔解曲线的引物探针的设计提出了更高要求。第三，由于待检测的菌株亲缘关系较近，在设计引物时容易出现特异性不高的问题。具体来说，亲缘关系较近的菌株，核酸序列高度同源，一方面要选取高度保守的DNA序列，另一方面还需要该序列在不同菌株中又有一定水平的差异，用于区分不同菌种。不难理解，当区分的菌种种类越多时，引物和探针的设计难度越高。
进一步地，本发明还提供了上述检测方法用于检测分枝杆菌的用途。
本发明的有益效果在于：可特异性地检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，包括结核分枝杆菌(MTB)、堪萨斯分枝杆菌(MK)、鸟分枝杆菌(MA)、偶然分枝杆菌(MF)、脓肿分枝脓肿亚种(MAA)、脓肿分枝马赛亚种(MAM)、胞内分枝杆菌(MIN)等，灵敏度和准确性高，采用荧光PCR通过Taqman探针及荧光产物杂交进行检测，检测便捷，检测速度快，临床应用范围广。
除此之外，基于酶水解Taqman探针产生荧光信号及特异性引物扩增后，产物杂交产生荧光信号两种技术原理，针对单色荧光通道中一个靶标核酸的检测采用酶水解Taqman探针，另一个靶标核酸的检测采用熔解曲线的方式，进而实现在单色荧光通道中同时进行两个靶点的检测和分析，因此，现有方法4个通道只能检测4个靶点，本发明却可以检测8个靶点，扩大了荧光PCR检测分枝杆菌的数量。
本发明解决了当前分枝杆菌培养分离无法鉴定到菌种以及培养灵敏度不够导致漏检等行业问题，提升了结核与非结核的精准快速治疗，本发明为科研及临床的疑似结核分枝杆菌检测提供了简单高效的检测方法。
附图说明
图1为FAM通道堪萨斯分枝杆菌(MK)阳性检测结果；
图2为HEX通道鸟分枝杆菌(MA)阳性检测结果；
图3为ROX通道偶然分枝杆菌(MF)阳性检测结果；
图4为CY5通道内标阳性检测结果；
图5为FAM通道脓肿分枝脓肿亚种(MAA)检测结果；
图6为HEX通道结核分枝杆菌(TB)检测结果；
图7为ROX通道胞内分枝杆菌(MIN)检测结果；
图8为CY5通道脓肿分枝马赛亚种(MAM)检测结果；
图9为所有通道中阴性样本检测结果(颜色1-颜色4代表4个通道)；
图10为FAM通道堪萨斯分枝杆菌(MK)灵敏度扩增结果；
图11为HEX通道鸟分枝杆菌(MA)灵敏度扩增结果；
图12为ROX通道偶然分枝杆菌(MF)灵敏度扩增结果；
图13为FAM通道脓肿分枝脓肿亚种(MAA)灵敏度检测结果；
图14为HEX通道结核分枝杆菌(TB)灵敏度检测结果；
图15为ROX通道胞内分枝杆菌(MIN)灵敏度检测结果；
图16为CY5通道脓肿分枝马赛亚种(MAM)灵敏度检测结果；
图17为寡核苷酸组合的特异性检测结果；
图18为对比例2中内标的检测结果；
图19为对比例2中MAA扩增曲线的检测结果；
图20为对比例2中MF熔解曲线的检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、引物及探针的设计
本发明中所提供的寡核苷酸组合包括如下列表1所示的28条引物和探针：SEQ IDNO:1-28，可特异性地检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，具体包括结核分枝杆菌(TB)、堪萨斯分枝杆菌(MK)、鸟分枝杆菌(MA)、偶然分枝杆菌(MF)、脓肿分枝脓肿亚种(MAA)、脓肿分枝马赛亚种(MAM)、胞内分枝杆菌(MIN)等。
表1
其中，F和R为扩增引物的正向和反向引物对，IC-F和IC-R为内标引物对，P为检测探针，P1和P2为荧光扩增引物对，其中，荧光扩增引物对P1和P2还具有C3间臂的结构，荧光扩增引物对MAA和TB P2还具有[BHQ1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(荧光基团)]，以及MIN和MAM P2还具有[BHQ2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(荧光基团)]的结构。
实施例2、样品DNA的提取过程
本发明检测样品为痰液。采用基于磁珠法的核酸提取/纯化试剂(货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)提取DNA，在样品处理室进行如下操作：
1、取适量1.5 mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入300μL DNA提取溶液1；
2、每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；
3、每管加入100μL DNA提取溶液2-mix(充分混匀后吸取)，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟；
4、瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；
5、每管加入600μL DNA提取溶液3和200μL DNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；
6、约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃；
7、每管加入50μL PCR-mix，用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱，然后将洗脱后的全部棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。
实施例3、PCR扩增过程
取如上述实施例2中制备的洗脱液5μL，按照如下表2所述的反应体系进行配制。
表2
| 组份 | 每一个反应的体积/浓度 |
| Mg<sup>2+</sup> | 2-6mM |
| dNTPs(100mM) | 0.1-0.4mM |
| Taq酶(5U/μL) | 2-10U |
| SEQ ID NO:1-16 | 100-500nM |
| SEQ ID NO:17-20 | 50-250nM |
| SEQ ID NO:21-24 | 50-250nM |
| SEQ ID NO:25-28 | 50-250nM |
| 洗脱液 | 5μL |
| PCR缓冲液 | 补至50μL |
PCR的扩增程序如下表3所示。
表3
实施例4、实验结果分析
在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，基于taq酶水解荧光探针产生荧光信号及荧光产物杂交产生荧光信号的两种技术原理，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针，另一个靶点的检测采用熔解曲线的方式，从而实现在单色的荧光通道中同时进行两个靶点检测和分析。针对所得扩增曲线，以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值小于40：阳性；Ct值大于或等于40：阴性。针对熔解曲线，以熔解曲线在Tm时有无特征峰作为阴阳性判定标准，在特定的Tm温度下，有特征峰，则为阳性；若无，则为阴性。
具体地，结果按如下进行分析：
1、目的检测信号为FAM、HEX(或VIC)及ROX，内标检测信号为CY5；
2、Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。阈值的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；
3、先分析内标在CY5通道是否检测扩增曲线，且Ct≤39，若有，表示本次检测有效，继续进行后续分析：
A、若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜39，表示堪萨斯分枝杆菌(MK)检测结果为阳性；若FAM通道检测到Tm(69.5±1.0℃)特征峰，表示脓肿分枝脓肿亚种(MAA)检测结果为阳性；
B、若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示鸟分枝杆菌(MA)检测结果为阳性；若HEX通道检测到Tm(67.0±1.0℃)特征峰，表示结核分枝杆菌(TB)为阳性；
C、若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct＜40，表示偶然分枝杆菌(MF)检测结果为阳性；若ROX通道检测到Tm(70.5±1.0℃特征峰，表示胞内分枝杆菌(MIN)检测结果为阳性；
D、若CY5通道检测到Tm(68.0±1.0℃)特征峰，表示脓肿分枝马赛亚种(MAM)检测结果为阳性；
4、若内标在CY5通道没有检测到Ct或Ct＞39，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。
从临床一共采集了24份样品，按照实施例2、3的过程进行提取和扩增，检出阳性16例，其中复合感染3例，阴性8例，各靶点测试结果如图1-9所示。为了对结果进行验证，将阳性样本和阴性样本进行Sanger测序，其测序结果与本实施例中的结果完全一致。
对比例1
实际上，在最初的研发中设计了大量的其他引物和探针。下表4中对曾设计的引物和探针进行了示例性的列举。
表4
采用实施例3和4的检测和分析方法，并将表1中的部分寡核苷酸替换为上表4中的对应寡核苷酸，最终检测效果却并不理想，出现了灵敏度不高的问题。具体替换方式和结果如下表5所示。
表5
对比例2
本对比例旨在观察：分枝杆菌检测方法的调整对其检测效果的影响。
实验方法：设计利用熔解曲线法检测MK、MA、MF和IC的寡核苷酸组合，设计利用TaqMan探针法检测MAA、MAM、MIN和MTB的寡核苷酸组合。采用实施例3和4中的方法进行检测和分析。
实验结果：整体扩增结果不太理想，熔解曲线会抑制扩增曲线，使得扩增曲线荧光值低，曲线不挺拔(如IC)(结果如图18所示)，甚至个别靶点没有扩增曲线(如MAA)(结果如图19所示)，而且部分靶点熔解曲线也被抑制，没有特征峰(如MF)(结果如图20所示)。
实施例5、灵敏度检测及分析
选取上述实施例3中检测为阳性的样品DNA，分别将其稀释至10、100、1000拷贝/μL，每个梯度取5μL作为扩增模板，按照如实施例3所述进行扩增并再进行检测，结果如图10-16所示。结果表明本发明的方法灵敏度高，检测浓度可低至10拷贝。
实施例6、特异性检测及分析
选取肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌其他病原菌的DNA为模板，采用实施例1的寡核苷酸组合，按照如实施例3所示的扩增过程对选取的DNA进行扩增，并再进行检测，结果如图17所示，采用实施例1的寡核苷酸组合并不能扩增出条带，证明实施例1的寡核苷酸组合能特异性的扩增出对应的分枝杆菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
actcaatgcc cttcgatccc ggcgaac 27
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ctagttccac ccaagatcgg aggttagcg 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
atctgccctg cactttggga taagcctgg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttctgacctg aaggctctgc gc 22
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaagcactcc atggcgtagg tgccggcgta cttcgtcag 39
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gattacgcga ccactttccg accgctccga ccg 33
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcaagccgtc actccccacc gcgctgctct accac 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtctgcgatc cagggatcgt cgagggcgag gtcgg 35
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agtgccatgg agtgcttc 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
taaagtggtc gcgtaatc 18
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 27
aggggagtga cggcttgc 18
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<211> 18
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<400> 28
aatccctgga tcgcagac 18
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gcccgggcgg attga 15
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cacgggccgc tcgat 15
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catcgcaccg catcttcgag aacc 24
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tggtggccaa cggcttt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcacgcacct tggacgaa 18
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tacgcgtggc gagccttcgc 20
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actgccgtga gggcttgc 18
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<212> DNA
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<400> 40
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<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
actccctgga tcgcagac 18
Claims (10)
1.一种寡核苷酸组合，包括：
第一组：检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:5、6和19所示，以及检测胞内分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:11、12、23和27所示，可选地还包括选自以下组中的至少一组：
第二组：检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2和17所示，以及检测脓肿分枝脓肿亚种的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:7、8、21和25所示；
第三组：检测鸟分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:3、4和18所示，以及检测结核分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:9、10、22和26所示；以及
第四组：检测脓肿分枝马赛亚种的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:13、14、24和28所示。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组合，其中，第四组还包括检测内标的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:15、16和20所示。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸组合，其中，所述寡核苷酸组合的荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸组合，其中，所述寡核苷酸组合中的第一组的荧光报告基团为ROX、第二组为FAM、第三组为HEX或者VIC，以及第四组为CY5。
5.权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸组合在检测分枝杆菌中的用途。
6.一种试剂盒，包括如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，进一步包括提取DNA所需试剂、Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液中的至少一种。
8.一种用于检测分枝杆菌的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的DNA；
2)使用如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸组合对步骤1)获得的DNA扩增；
3)分析结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤3)中，采用Ct值作为堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶然分枝杆菌和内标的判定标准；并且采用熔解曲线作为脓肿分枝脓肿亚种、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝马赛亚种的判定标准。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述步骤2)中的寡核苷酸组合的浓度由如下所示：
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