CN105779625B - 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法。本发明突破了普通PCR方法的限制，可实时定量样品中细菌含量，灵敏度高，最低检测极限达到每个反应5个拷贝数；特异性强，可特异性识别猪链球菌和猪链球菌2型，对其他细菌无反应；重复性好，重复检测的变异系数小于1.19%；而且临床诊断效果明显，非常适合大量临床样品的检测和猪链球菌的常规疫情监测，具有极高的应用价值。

Description

一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量 PCR引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于核酸检测领域，涉及一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒及方法。
背景技术
猪链球菌是造成生猪养殖业重大经济损失的主要病原之一，全球几乎100%规模化猪场均有猪链球菌存在，可通过呼吸道相互传播，主要引起败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等症状。同时猪链球菌也是一种人兽共患病病原，人可通过接触带菌猪或猪肉产品感染，引起败血症、脑膜炎，甚至休克样综合症导致死亡。尽管50年来人感染猪链球菌大多为职业性接触性的散发病例，比如养殖户、兽医、屠夫、食品加工者等；但最近几年的人感染猪链球菌病例的数量不断增加，并趋向于常规人群，在中国就有过两次猪链球菌2型的区域大流行，严重威胁公共卫生安全，所以对猪链球菌的监测至关重要。
猪链球菌为革兰氏阳性球菌，是猪身上的正常寄生菌，主要定植在猪的上呼吸道中，尤其是在扁桃体和鼻腔，也可定植于生殖器和消化道内。根据荚膜多糖的抗原性，将猪链球菌分为35个血清型（1～34型及1/2型），多数参考菌株是从病猪上分离得到的，而14型是来源于人，17、18、19和21型来源于健康猪，20和30型来源于病牛，33型来源病羔羊。猪链球菌致病性的划分现在还比较模糊，不过现有研究表明1、2、1/2、7、9、14型是猪群中的主要致病血清型，2、14型为人群中的主要致病血清型。调查显示不管是对人还是猪，2型都是最为主要的致病菌，其致病力是最高的，并且是北美、南美、欧洲、亚洲、澳大利亚等地区流行率最高的血清型，占全球人和猪病例数的74.7%和27.9%，所以猪链球菌2型是疫情监控和病原鉴定的首要检测对象。
目前细菌分离培养与血清学分型结合仍然是诊断猪链球菌的金标准，但此方法无法检测出无荚膜菌株和自凝菌株，并且耗时，灵敏度低，操作要求高，不利于推广和疫情监测。为弥补这些的不足，研究者建立了多种猪链球菌的基因分型方法，在基因水平上实现对猪链球菌的鉴定与分型，并提高了检测的准确性和灵敏度。包括针对型特异性的cps基因序列设计分型PCR，这部分研究大多集中在主要致病菌上，但最近刘志杰和Anusak Kerdsin针对33个血清型CPS基因设计了多个多重PCR，建立全套的基因分型方法，实现了对33个血清型的特异性检测；当然现使用最多基因分型方法的还是Samantha J. King建立的针对猪链球菌多个保守基因的MLTS方法，此方法主要检测cpn60，dpr，recA，aroA，thrA，gki，mutS等7个保守基因，根据这7个基因的基因型进行编码确定猪链球菌的血清型（ST），这一方法广泛用于猪链球菌的分子流行病学调查，并建立有MLTS数据库，可方便了解猪链球菌的全球流行和分布情况。不过这两个基因分型方法都比较费时费钱，而且交叉污染的风险大，只能针对少量样品，不适合疫情监测和初步筛查过程中的大量样品的检测。
与常规PCR相比，TaqMan荧光定量PCR具有以下优点：第一，为封闭反应，无需对PCR产物进行后续处理，进一步缩短检测时间并降低了交叉污染的风险；第二，增加荧光探针后，检测的灵敏度和特异性进一步提高；第三，整个扩增过程可实时检测，结果直观，有利于大量样品同时检测；第四，定量采用对数期扩增数据，非终点定量，结果更为可靠。目前研究者建立了多个猪链球菌荧光PCR方法，包括高志强针对猪链球菌16S RNA设计的通用型荧光PCR方法，高志强及孙洋针对cps2J基因设计的猪链球菌2型的荧光PCR方法，不过这些方法都为单荧光PCR，无法实现单管内同时检测猪链球菌和猪链球菌2型，增加了疫情监测的工作量和成本。
发明内容
本发明目的在于提供一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和探针。
本发明的另一目的在于提供一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：
引物GDH-F：5’-GAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC-3’（SEQ ID NO：1），
引物GDH-R：5’-CCATGGAACACGGAAGCTG-3’ （SEQ ID NO：2），
引物CPS2J-F：5’-GATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT-3’ （SEQ ID NO：4），
引物CPS2J-R：5’-CCATTTGGTAACCGGAAAAGTT-3’ （SEQ ID NO：5）。
一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR探针，探针的核苷酸序列如下所示：
探针GDH-P：5’-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA -3’ （SEQ ID NO：3），
探针CPS2J-P：5’-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA -3’ （SEQ ID NO：6），
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
进一步的，上述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针GDH-P和CPS2J-P2的5’端标记的荧光基团不相同。
一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，上述试剂盒还含有上述所述的探针。
一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病菌DNA；
2）以提取的DNA和阳性标准品DNA为模板，用权利要求1所述的引物对GDH-F、GDH-R、CPS2J-F和CPS2J-R，及权利要求2或3所述探针GDH-P和CPS2J-P2进行双重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号。；
3）根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的猪链球菌和猪链球菌2型中的目标基因进行定性和定量分析；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2）中的双重荧光定量PCR扩增反应体系为：
2×Premix Ex Taq buffer 12.5μl
10 μM引物GDH-F 0.5μl
10 μM引物GDH-R 0.5μl
5 μM探针GDH-P 1μl
10 μM引物CPS2J-F 0.5μl
10 μM引物CPS2J-R 0.5μl
5 μM探针CPS2J-P 1μl
模板DNA 1μl
ROX Reference Dye(50×) 0.25μl
无RNA酶水 补至25μl。
进一步的，步骤2）中双重荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。
进一步的，步骤3）中所述结果分析的具体过程为：
1）定性分析：出现探针GDH-P 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌通用型阳性，扩增出现探针CPS2J-P 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌2型阳性；未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪链球菌通用型和2型，为阴性；
2）定量分析：根据阳性标准品的标准曲线，将待测样品猪链球菌通用型或2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌通用型或2型的基因拷贝数。
本发明的有益效果是：
1）本发明突破了普通PCR方法的限制，可实时定量样品中细菌含量，灵敏度高、特异性强，重复性好。并突破了单荧光PCR检测的限制，可实现同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型，进一步减少了实验时间和成本，可根据构建的标准品DNA进行定量检测；非常适合大量临床样品的检测和疫情监控，为诊断和防控猪链球菌病提供技术支持。
2）本发明可实现同一反应中同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型，缩短了检测时间和成本；
3）本发明灵敏度高，最低检测极限达到每个反应5个拷贝数；
4）本发明特异性强，可特异性识别猪链球菌和猪链球菌2型，对其他细菌无反应；
5）本发明重复性好，检测结果稳定，重复检测的变异系数小于1.19%。
6）临床诊断效果明显，本发明PCR与普通PCR的Kappa值达0.8和0757，一致性极高；非常适合大量临床样品的检测和猪链球菌的常规疫情监测，具有极高的应用价值。
附图说明
图1是引物和探针浓度组合的扩增曲线图；A图为猪链球菌通用型的扩增曲线，B图为猪链球菌2型的扩增曲线；引物探针组合内字母A、B、C表示探针浓度100 nM、150 nM、200nM，数字1、2、3表示引物浓度200 nM、300 nM、400 nM，NC为阴性对照；
图2是阳性质粒标准品DNA的扩增曲线图和标准曲线图；A图为猪链球菌通用型阳性标准品的扩增曲线图和标准曲线图，B图为猪链球菌2型阳性标准品的扩增曲线图和标准曲线图；横坐标为标准品拷贝数的Log10值，纵坐标为检测CT值；标准品拷贝数分别为10倍稀释的 4×108 ~ 4×101copies/ul 8个梯度；
图3是本发明双重荧光PCR对低浓度质粒标准品的扩增曲线图，A图为猪链球菌通用型阳性标准品的检测结果，B图为猪链球菌2型阳性标准品的检测结果；低浓度质粒标准品的拷贝数浓度为40、20、10、5、2.5 copies/ul；
图4是本发明双重荧光PCR重复检测结果的误差限图，A图为猪链球菌通用型阳性标准品的检测结果，B图为猪链球菌2型阳性标准品的检测结果；图右上角的表格为重复检测的组内和组间变异系数；
图5是以常规PCR为参考的双重荧光定量PCR检测结果的ROC曲线，A图和B图分别为猪链球菌通用型、猪链球菌2型的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型的双重荧光定量PCR引物及探针
本发明根据猪链球菌通用型和猪链球菌2型的核酸序列，设计用于同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型的双重荧光定量PCR引物和探针；本发明通过对所设计的引物和探针进行大量的筛选，筛选出一组灵敏性高和特异性强的引物和探针序列，其序列如下：
引物GDH-F：5’-GAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC-3’（SEQ ID NO：1），
引物GDH-R：5’-CCATGGAACACGGAAGCTG-3’ （SEQ ID NO：2），
探针GDH-P：5’-FAM-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-TAMRA-3’ （SEQ ID NO：3），
引物CPS2J-F：5’-GATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT-3’ （SEQ ID NO：4），
引物CPS2J-R：5’-CCATTTGGTAACCGGAAAAGTT-3’ （SEQ ID NO：5），
探针CPS2J-P：5’-HEX-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-TAMRA-3’ （SEQ ID NO：6）。
实施例2 优化双重荧光定量PCR反应条件的优化
实验使用ABI 7500荧光定量PCR系统进行扩增和分析，以Premix Ex Taq™(Probe qPCR)作为反应缓冲液。首先在公司推荐的反应体系下进行退火温度的优化，设置6个退火温度，分别为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，反应条件为95℃/5min进行预变性及启动Taq酶，然后95℃/15s变性，50-60℃退火延伸30s并收集荧光，共40个循环。经过同一样品在6个不同退火温度下的结果对比，发现56℃下的结果稍好于其他退火温度，即56℃为双重荧光定量PCR的最佳退火温度。
在确定退火温度后则对引物和探针反应浓度进行优化，设计3×3矩阵表（如表1示）分9个组，包括3个引物浓度（200 nM、300 nM、400 nM）和3个探针浓度（100 nM、150 nM、200 nM）。反应使用25 μl反应体系，包括12.5 μl Premix Ex Taq buffer(2×)，0.5μl-1μl的引物（10 μM）和探针（5 μM），1 ul的猪链球菌2型基因组DNA样品，0.25μl ROX ReferenceDye(50×)，无RNA酶水补至25 μl。在不同引物探针浓度组合下两个靶基因的扩增曲线如图1所示，A图为猪链球菌通用型的扩增曲线，B图为猪链球菌2型的扩增曲线；引物探针组合内字母A、B、C表示探针浓度100 nM、150 nM、200 nM，数字1、2、3表示引物浓度200 nM、300 nM、400 nM，NC为阴性对照。从图1和表1中可以看出C组的扩增曲线比其他两组具有更好的斜率和CT值，而C1组又稍好于C2和C3组，即最优引物及探针浓度组合为引物200 nM和探针200nM。
表1. 引物及探针浓度的矩阵分组
实施例3 阳性标准品制备、双色荧光定量PCR扩增及标准曲线绘制
1）标准样品的制备
为绘制双重荧光PCR的标准曲线，我们分别提取阳性猪链球菌通用型和猪链球菌2型基因组DNA作为PCR模板，用以下设计的引物对进行扩增，构建阳性标准品DNA，引物序列为：
GDH-SF：5’-GGAATTCCATATGTCAAATGCC-3’（ SEQ ID NO：7），
GDH-SR：5’-CCATGGAACACGGAAGCTG-3’ （SEQ ID NO：8），
该引物对扩增产物长度为214 bp；
CPS2J-SF：5’- AGGAATTCCATATGGAAAAAGTCAGCATTATTG -3’（SEQ ID NO：9），
CPS2J-SR：5’-CCGCTCGAGTTAATCATTATTTTTTTCTTCCC-3’ （SEQ ID NO：10），
该引物对扩增产物长度为1019 bp。
所得扩增产物经1%琼脂糖电泳分离后用凝胶回收试剂盒回收，与pMD-18T载体连接后转入DH5α感受态（Takara，中国）培养过夜，然后使用质粒提取试剂盒纯化PMD-18T-GDH和PMD-18T-CPS2J质粒，经NanoDrop ND-2000C核酸检测仪测得质粒的OD260nm值，换算成质粒原始拷贝数，然后用标准品稀释液分别将两种质粒标准品稀释为4×108~4×101copies/μl 8个10倍稀释的梯度浓度，备用。
2）阳性标准样品的双色荧光定量PCR
在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行扩增，每个梯度3个复孔；
其中，PCR反应体系为：
2×Premix Ex Taq buffer 12.5μl
10 μM引物GDH-F 0.5μl
10 μM引物GDH-R 0.5μl
5 μM探针GDH-P 1μl
10 μM引物CPS2J-F 0.5μl
10 μM引物CPS2J-R 0.5μl
5 μM探针CPS2J-P 1μl
模板DNA 1μl
ROX Reference Dye(50×) 0.25μl
无RNA酶水 补至25μl。
其中2×Premix Ex Taq buffer为PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、Ex Taq酶混合液
PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。
3）绘制标准曲线及结果分析
根据上述双色荧光定量PCR的结果绘制标准曲线，计算相关系数和扩增效率。
结果如图2所示，其中A图为猪链球菌通用型阳性标准品的扩增曲线图和标准曲线图，B图为猪链球菌2型阳性标准品的扩增曲线图和标准曲线图，横坐标为标准品拷贝数的Log10值，纵坐标为检测CT值；阳性标准品拷贝数分别为10倍稀释的 4×108 ~ 4×101 copies/μl 8个梯度浓度；从中可以看出，在最优双重荧光PCR条件下分别对质粒阳性标准品PMD-18T-GDH和PMD-18T-CPS2J的检测，均只单独出现FAM和HEX荧光曲线，即相互之间不存在非特异扩增。8个浓度梯度的CT值与对应的拷贝数的Log10值呈现线性关系，且线性范围极宽；猪链球菌和猪链球菌2型的线性公式分别为y=-3.2911x+41.154和y=-3.3424x+41.562（y为CT值，x为原始拷贝数的Log10值），相关系数（R2）分别为0.9994和0.9993，扩增效率（Eff%）分别为101.303%和99.157%。
实施例4一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR方法
1）从样品中提取病菌DNA；
2）以提取的DNA为模板，进行双重荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
其中，PCR反应体系为：
2×Premix Ex Taq buffer 12.5μl
10 μM引物GDH-F 0.5μl
10 μM引物GDH-R 0.5μl
5 μM探针GDH-P 1μl
10 μM引物CPS2J-F 0.5μl
10 μM引物CPS2J-R 0.5μl
5 μM探针CPS2J-P 1μl
模板DNA 1μl
ROX Reference Dye(50×) 0.25μl
无RNA酶水 补至25μl。
其中2×Premix Ex Taq buffer为PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、Ex Taq酶混合液
PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。
3）结果分析：
①定性分析：出现探针GDH-P 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌通用型阳性，扩增出现探针CPS2J-P 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌2型阳性；未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪链球菌通用型和2型，为阴性；
②定性分析：根据标准品浓度的Log值（X轴）及其对应CT值（Y轴）作图，绘制标准曲线，再将待测样品猪链球菌通用型或2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌通用型或2型的基因拷贝数。
实施例5 特异性检测
用上述实施例4建立的方法对9株猪链球菌和11株阴性菌株的基因组DNA进行检测，验证方法能否在准确鉴定出猪链球菌的同时不对阴性菌产生非特异性反应；并验证猪链球菌2型的特异性引物和探针是否不对其他血清型的猪链球菌产生非特异反应。9株猪链球菌分别经标准血清和血清型特异性PCR确定，包括猪链球菌1、1/2、2、3、4、7、9、14、16型；11株阴性对照菌包括为大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、金色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎链球菌（ATCC 49619）、化脓性链球菌（ATCC 19615）、粪肠球菌(ATCC 29212)、乙型溶血性链球菌（ATCC 21059）、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、败血波氏杆菌、猪鼻支原体（CVCC361）、马链球菌兽疫亚种（CVCC 573）。
检测结果显示双重荧光PCR方法在检测9株猪链球菌基因组DNA时FAM荧光（gdh基因）均为阳性，但只有检测2和1/2型时HEX荧光（cps2J基因）才为阳性；而在对11株阴性对照菌的检测中双荧光都为阴性；表明本发明方法可特异性鉴别猪链球菌和猪链球菌2型。
实施例6 灵敏度检测
对实施例3制备的两个种质粒阳性标准品分别稀释至40、20、10、5、2.5copies/μl5个梯度浓度，然后用实施例4所述的扩增体系和条件进行检测，测定本发明方法的最低检出极限。
结果如图3所示，A图为猪链球菌通用型阳性标准品的检测结果，B图为猪链球菌2型阳性标准品的检测结果；从中可以看出，在最优反应条件下本发明方法对5 copies/ul以上模板量的扩增均能出现典型的扩增曲线，即检测极限值为5 copies/ul。
实施例7 重复性检测
使用稀释好的质粒标准品4×107~4×103 copies/ul 5个梯度进行重复检测，每个梯度3个复孔，在不同时间点进行3次检测；计算检测结果的批内和批间的变异系数，以测定双重荧光PCR的重复性。
我们将3次不同时间点对质粒标准品的重复检测结果绘制成误差限图，如图4所示，A图为猪链球菌通用型阳性标准品的检测结果，B图为猪链球菌2型阳性标准品的检测结果；从中显示5个质粒标准品检测CT值的标准差都在0.06~0.24之间，3次检测组内变异系数在0.24~1.19%之间，组间的变异系数在0.39~0.97%之间，稳定性极高。
实施例8 临床样品检测
1）样品中提取病菌DNA；用基因组DNA提取试剂盒对实验室收集的67份呼吸道疾病和关节炎的临床病料（包括鼻拭子、关节液、扁桃体、肺等）进行细菌基因组DNA提取；
2）以提取的DNA为模板，分别对样品进行荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
其中，PCR反应体系为：
2×Premix Ex Taq buffer 12.5μl
10 μM引物GDH-F 0.5μl
10 μM引物GDH-R 0.5μl
5 μM探针GDH-P 1μl
10 μM引物CPS2J-F 0.5μl
10 μM引物CPS2J-R 0.5μl
5 μM探针CPS2J-P 1μl
模板DNA 1μl
ROX Reference Dye(50×) 0.25μl
无RNA酶水 补至25μl。
其中2×Premix Ex Taq buffer为PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、Ex Taq酶混合液
PCR扩增反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。
同时用已公布的常规PCR方法（检测极限为100 copies/reaction）平行检测获得的DNA模板，作为对比。
3）结果分析
根据实验结果，使用SPSS软件分析两种PCR方法的符合率和一致性（Kappa系数）；绘制ROC曲线，判定双重荧光定量PCR用于诊断的效果；并根据检测结果和标准曲线初步计算样品中细菌的平均含量。
经过对67份临床样品进行本发明双重荧光PCR和现有常规PCR检测，结果如表2所示，本发明双重荧光PCR法总共检出53（79.1%）例猪链球菌通用型阳性样品和24（35.8%）例猪链球菌2型阳性样品；并且猪链球菌2型阳性样品的通用型检测也都为阳性，占猪链球菌阳性样品的45.3%。在与通用型和2型的现有常规PCR的对比中，本发明方法检出的5例（5例样品中拷贝数分别为53、18、73、10、66 copies/reaction）通用型阳性样品现有普通PCR检出为阴性；本发明检出的7例（7例样品中拷贝数分别为7、24、13、13、77、9、63 copies/reaction）2型阳性样品现有普通PCR检出为阴性；不过本发明方法检出为阴性的样品用现有普通PCR检测也都为阴性。
上述本发明方法检出的5例（5例样品中拷贝数为53、18、73、10、66 copies/reaction）通用型阳性样品现有普通PCR检出为阴性；本发明检出的7例（7例样品中拷贝数为7、24、13、13、77、9、63 copies/reaction）2型阳性样品现有普通PCR检出为阴性，因为这几份样品是鼻拭子，样品里面的病原含量很低，普通PCR一般很难检出阳性，该检测结果说明本发明方法可以检测更低浓度样品。）
统计分析显示本发明双重荧光PCR方法与通用型和2型普通PCR方法的符合率分别为92.5%和89.6%，kappa值分别为0.8和0.757，具有极高的一致性；以现有常规PCR结果为参考绘制ROC曲线，如图5所示，A图和B图分别为猪链球菌通用型、猪链球菌2型的ROC曲线，从中可以看出，本发明双重荧光PCR方法通用型和2型的曲线下面积分别为0.966（P<0.001）和0.985（P<0.001），表明本发明方法具有很好的诊断效果。
最后我们根据检测结果和标准曲线初步计算所检测的阳性样品中猪链球菌和猪链球菌2型的平均带菌量分别为：阳性鼻拭子为5048和329个/ml，关节液为9062和3102个/ml，扁桃体为12049和266个/μg，肺组织为4133和11个/μg。
表2 本发明双重荧光定量PCR与常规PCR对67份临床样品的检测结果.
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 韶关学院
<120> 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物、试剂盒
及方法
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagctcttct ctacacttga gcc 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccatggaaca cggaagctg 19
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgaagcaca cccagaatac atcgaagaa 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatagatgac ggttcttcag attcat 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccatttggta accggaaaag tt 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctaccatct tgctctgcgt attcca 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaattccat atgtcaaatg cc 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccatggaaca cggaagctg 19
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggaattcca tatggaaaaa gtcagcatta ttg 33
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgctcgagt taatcattat ttttttcttc cc 32

Claims (7)

1.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和探针，引物的核苷酸序列如下所示：
引物GDH-F：5’-GAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC-3’(SEQ ID NO：1)，
引物GDH-R：5’-CCATGGAACACGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO：2)，
引物CPS2J-F：5’-GATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT-3’(SEQ ID NO：4)，
引物CPS2J-R：5’-CCATTTGGTAACCGGAAAAGTT-3’(SEQ ID NO：5)；
探针的核苷酸序列如下所示：
探针GDH-P：5’-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-3’(SEQ ID NO：3)，
探针CPS2J-P：5’-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-3’(SEQ ID NO：6)，
或者为探针的核苷酸序列的核苷酸互补序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种；且探针GDH-P和CPS2J-P2的5’端标记的荧光基团不相同。
3.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1或2所述的引物和探针。
4.一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从样品中提取病菌DNA；
2)以提取的DNA和阳性标准品DNA为模板，用权利要求1所述的引物对GDH-F、GDHR、CPS2J-F和CPS2J-R，及权利要求1或2所述探针GDH-P和CPS2J-P2进行双重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；
3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的猪链球菌和猪链球菌2型中的目标基因进行定性和定量分析；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中的双重荧光定量PCR扩增反应体系为：
2×Premix Ex Taq buffer12.5μl
10μM引物GDH-F0.5μl
10μM引物GDH-R0.5μl
5μM探针GDH-P1μl
10μM引物CPS2J-F0.5μl
10μM引物CPS2J-R0.5μl
5μM探针CPS2J-P1μl
模板DNA1μl
50×ROX Reference Dye0.25μl
无RNA酶水补至25μl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中双重荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃退火30s，循环40次。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述结果分析的具体过程为：
1)定性分析：出现探针GDH-P5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌通用型阳性，扩增出现探针CPS2J-P5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明猪链球菌2型阳性；未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有猪链球菌通用型和2型，为阴性；
2)定量分析：根据阳性标准品的标准曲线，将待测样品猪链球菌通用型或2型的检测CT值代入标准曲线公式，计算样品中含有的猪链球菌通用型或2型的基因拷贝数。
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