CN102268478A - 检测空肠弯曲菌的引物、探针及方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR引物和探针以及使用其进行定量检测的方法，引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。本发明还提供了检测空肠弯曲菌的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

检测空肠弯曲菌的引物、探针及方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测空肠弯曲菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行空肠弯曲菌检测的方法和试剂盒。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌，是导致人类腹泻的主要病原之一。空肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于空肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可导致格林-巴利综合症，给人类带来严重的疾病负担。国内外对空肠弯曲菌的监测都非常关注。

细菌的分离培养及生化鉴定是目前常用的检测空肠弯曲菌感染的方法。由于空肠弯曲菌属于微需氧细菌，生长需要特定的气体环境，体外培养对培养基的营养条件要求较高，培养条件要求苛刻，且成本较高，常规的生化鉴定空肠弯曲菌比较繁琐，须具备较好的技术与经验，加上由于区分菌株的生化鉴定结果的一致性不好，可能会造成分离菌株的错误鉴定，造成目前对腹泻患者以及食品污染检测过程中的空肠弯曲菌检测灵敏度低，检出率不高，检出时间慢的缺点。

近年来随着分子生物学的发展，国内外已先后开展了一些针对空肠弯曲菌的基因检测研究，通过对样品中病原的特异核苷酸(DNA)序列的检测可以确定特异病原的感染，针对的靶基因主要包括16SrDNA、23SrDNA等。荧光定量PCR的方法通过检测标本中空肠弯曲菌特异的DNA序列，能大大提高了检测的灵敏度和特异度，同时根据特异DNA序列片段的拷贝数能够确定样品中空肠弯曲菌污染的量，确诊空肠弯曲菌的感染以及确定样品中的污染数量。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测空肠弯曲菌的特异性引物和探针；

本发明的另一个目的在于提供检测空肠弯曲菌的荧光定量PCR方法及其试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先对NCBI已公布的所有空肠弯曲菌，用BLASTn与Vector NTI Suite 6.0软件对所有测序菌种特异基因的DNA序列进行比对，筛选出空肠弯曲菌基因的特异序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，本发明提供用于特异性扩征上述特异序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

上游引物：CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG，

下游引物：GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG。

探针序列为：

FAM-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-BHQ1。

本发明提供一种空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μl反应体系时，其优选配置为：

本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性4min，1个循环；95℃变性10s，55～65℃退火30s，40个循环。

本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性4min，1个循环；95℃变性10s，59℃退火30s，40个循环。

本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值＜35.0时样品结果为阳性；

Ct值≥40.0的样品结果为阴性；

Ct值在35.0～40.0之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明提供了一种用于空肠弯曲菌检测的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。

本发明试剂盒的引物序列为：

上游引物：CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG，

下游引物：GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG。

探针序列为，FAM-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-BHQ1。

本发明提供的试剂盒，还可进一步包括DNA裂解液，荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为空肠弯曲菌基因组DNA。

本发明提供了用于检测空肠弯曲菌的特异性引物和探针，建立了检测空肠弯曲菌的荧光定量PCR方法，该方法具有很高的检测灵敏度，当Ct＝35时可以检测到4.26CFU的空肠弯曲菌；该方法还具有100％的特异性，其重复性好，批内可重复性变异系数为0.1％～1.4％之间，批间可重复性变异系数为1.7％，可作为检测临床标本的手段，提高空肠弯曲菌检测的阳性率，操作简单，大大缩短检测周期。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对照，该试剂盒的推广应用将有助于及时准确地判断环境中、饮用水和食品中空肠弯曲菌的污染及污染程度，为防治和监测空肠弯曲菌病提供技术支持。

附图说明

图1为空肠弯曲菌荧光定量PCR灵敏度评价，其中图1a为空肠弯曲菌模板1×10⁵～1×10⁰CFU扩增曲线；图1b为1×10⁵～1×10⁰CFU浓度对数与Ct值的线性回归图；

图2为空肠弯曲菌荧光定量PCR特异度评价；

图3为空肠弯曲菌荧光定量PCR重复性评价，其中图3a为NCTC11168三次重复检测回归曲线，R₁ ²＝0.993，R₂ ²＝0.994，R₃ ²＝0.991；图3b为ATCC33560三次稀释检测回归曲线，R₁ ²＝0.990，R₂ ²＝0.997，R₃ ²＝0.991；图3c为ICDC07001、ATCC81116及ATCC49349三株菌检测回归曲线，回归系数均数＝-3.7797，Sd＝0.064，CV＝1.7％，R²(ATCC 81116)＝1.000，R²(ATCC 49349)＝0.998，R²(ICDC07001)＝0.999；

图4为荧光定量PCR检测不同量细菌掺入粪便标本中的结果；

图5为倍比稀释的粪便标本在选择性培养基上培养结果，其中图5a为10¹CFU开始有空肠弯曲菌生长，图5b为10²CFU细菌生长，图5c为10³CFU，图5d为10⁴CFU，图5e为10⁵CFU；

图6为掺入菌量分别为10⁰～10⁵的10μl菌液打点计数结果；

图7为荧光定量PCR检测临床粪便标本的结果；

图8为荧光定量PCR验证空肠弯曲菌标准质粒结果，其中图8a为空肠弯曲菌模板7.536×10^-1～7.536×10⁵CFU扩增曲线；图8b为7.536×10^-1～7.536×10⁵CFU浓度对数与Ct值的线性回归图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1空肠弯曲菌特异DNA序列的确定

本发明对NCBI已公布的所有空肠弯曲菌，用BLASTn与VectorNTI Suite 6.0软件对所有测序菌种特异基因的DNA序列进行比对，筛选出空肠弯曲菌基因的特异序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2空肠弯曲菌特异性引物和探针的设计

本发明经反复筛选和验证，得到一对用于检测空肠弯曲菌的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的TaqMan探针，由上海辉睿生物公司合成。该探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ。

本发明得到的引物序列为：

上游引物：CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG，Tm：58℃，

下游引物：GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG，Tm：59℃，

本发明得到的探针序列为：

FAM-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-BHQ1，Tm：65℃。

实施例3检测空肠弯曲菌的荧光定量PCR检测方法的建立

(1)real-time PCR实验参数的优化

参照Invirogen推荐荧光定量PCR 25μL体系：2×PCRUDG12.5μL，mg²⁺3.5mM，PCR nucleotide MIX(含dNTP)4mM，上、下游引物终浓度为0.4μM，探针终浓度为0.2μM，DNA模板2μL。优化一个条件，固定其余条件。根据Ct值和荧光信号的强弱来判断优化条件，把最佳的条件组合起来作为最终的优化体系。

退火温度从55℃～65℃之间进行优化；引物按终浓度从0.08μM～0.62μM之间进行优化；探针的浓度从0.08μM～0.36μM之间进行优化；mg²⁺浓度在1.5～5mM之间进行优化；dNTPs浓度在2～5.8mM之间进行优化。最终确定的空肠弯曲菌荧光定量PCR反应体系见表1：

表1空肠弯曲菌荧光定量PCR反应体系

(2)循环条件

同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

实施例4空肠弯曲菌荧光定量PCR检测方法的特性评价

1、灵敏度评价，灵敏度即real-time PCR的最低检测限。

①根据弯曲菌1OD≈3×10⁷CFU/mL，提取约2.64×10⁸CFU的空肠弯曲菌。

②将2.64×10⁸CFU稀释至1×10^-1CFU/2μL～1×10⁵CFU/2μL，备用。

③用优化了的real-time PCR方法检测这7个稀释度的空肠弯曲菌DNA做荧光定量PCR检测确定灵敏度，图1a。

由图可见空肠弯曲菌DNA模板在1×10⁰CFU～1×10⁵CFU都有曲线扩增，空肠弯曲菌DNA浓度的lg值与Ct值的关系可以用如下的函数式表达：y＝-3.993x+37.51，系数R²＝0.998，图1b。

根据2007年我国颁布的《SN1870-2007食品中致病菌检测方法》中阳性结果的判定标准为：Ct≥40.0样品结果为阴性，Ct＜35.0样品结果为阳性，Ct＞35.0而＜40.0重复该样本。其中空肠弯曲菌的最低检测限为500CFU/mL。当Ct＝35时本研究建立的荧光定量PCR方法可以检测到4.26CFU的空肠弯曲菌。

五种空肠弯曲菌NCTC11168、ATCC81116、ATCC33560、ATCC49349、ICDCCJ07001，其中ATCC，NCTC系列菌株来自美国国家典型菌种保藏中心，购自北京中原公司；ETEC 10407、EAEC042、EIEC 44825标准株购于卫生部药品生物制品检定所；伤寒沙门氏菌CT18来自加拿大遗传中心，购自北京中原公司；ICDC系列为本科室保存菌株。

2、特异度评价，又称真阴性率评价，即实际上不是空肠弯曲菌，而按照该检测方法的标准被正确地判为非空肠弯曲菌的百分比。用优化了的real-time PCR检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠粘附性大肠杆菌(EAEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)、伤寒、甲副伤寒、鼠伤寒、霍乱、痢疾杆菌、肠炎沙门菌、小肠耶尔森氏菌O:3型、副溶血弧菌、肠球菌、单增李斯特菌，上述菌种编号或来源见表2。空肠弯曲菌ATCC33560为阳性对照，结果除阳性对照扩展外，其余检测均为阴性，见图2。

表2real time PCR特异度评价检测所用菌株编号或来源

3、重复性评价

3.1批内可重复性评价将NCTC11168经5次倍比稀释，将每一个浓度的DNA重复3次，其荧光定量PCR结果见表3，回归曲线见图3a，结果显示变异系数在0.1％～0.71％之间。ATCC33560五个稀释度平行连续稀释3次，其重复结果见表4，回归曲线见图3b。结果显示变异系数在0.4％～1.4％之间。

表3NCTC11168荧光定量PCR重复检测结果

表4ATCC33560荧光定量PCR重复检测结果

3.2批间可重复性评价空肠弯曲菌标准株ATCC81116、空肠弯曲菌德莱亚种ATCC49349、空肠弯曲菌格林-巴利综合征(Guillain-BarréSyndrom，GBS)中国吉林爆发株ICDCCJ07001三株菌的荧光定量PCR检测，回归曲线见表3c，结果见表5，变异系数为1.7％，说明可重复性较好。

表5ATCC81116、ATCC49349、ICDCCJ07001荧光定量PCR检测结果

实施例5检测粪便标本中的空肠弯曲菌

1方法

1.1细菌定量收集24h，37℃培养的ATCC33560悬于生理盐水中。生理盐水洗菌2遍，重新悬于5mL生理盐水中，充分混匀。

根据OD值计算弯曲菌的量，将ATCC33560从10⁰～10⁵进行6个梯度的倍比稀释。

1.2细菌掺入

1.2.1于6支EP管中分别称取粪便0.2克，分别加入10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰细菌，提取DNA做荧光定量PCR检测用。

1.2.2取1支EP管中加入10⁵ATCC33560，充分混匀。将该掺有空肠弯曲菌粪便标本进行10⁴、10³、10²、10¹、10⁰稀释，做打点计数和划线培养用。

2结果

2.1细菌定量推算ATCC33560原液的菌量为2.05×10⁶CFU/uL。

2.2细菌掺入

2.2.1荧光定量PCR检测不同量空肠弯曲菌掺入后的结果，见表6、图4。

表6荧光定量PCR检测不同量空肠弯曲菌结果

2.3培养结果

2.3.1将倍比稀释的粪便标本在选择性培养基上划线培养，图5。

2.3.2、10uL打点计数结果，见表7、图6。

表7打点计数结果

注：10⁰～10²为3个点的菌落数。

实验结果表明应用本特异的DNA序列作为靶序列，应用本特异的探针及引物序列，检测粪便中空肠弯曲菌的灵敏度不低于选择性分离培养，但是由于选择性分离培养空肠弯曲菌不仅耗时长，而且条件苛刻(微需氧三气培养箱、昂贵培养基及经验丰富的操作者)，而real time PCR的方法可以在短时间内获得特异度、灵敏度相同的结果，并且可以指导分离培养实验的进行。

实施例6临床粪便标本的检测

将12份临床粪便标本分别用传统的细菌分离培养方法和本发明的荧光定量PCR方法进行空肠弯曲菌的检测，结果见表8。

表8粪便标本分离结果与荧光定量PCR检测结果

注：y为年，m为月。

荧光定量PCR检测粪便标本中空肠弯曲菌的结果见图7。

以上结果显示利用本研究序列建立的荧光定量PCR的方法与分离培养方法相比对临床标本检测的灵敏度大于分离培养，其灵敏度、特异度分别为100％。

实施例7空肠弯曲菌标准品的制备及检测

另设计一对普通PCR引物扩增空肠弯曲菌模板，引物序列为：

F 5`-GACATACTACTTCTTTATTGCTTGC 3`

R 5`-ATAACTTCAATACTATAACTATCCGAAG 3`

普通PCR引物扩增产物大于将荧光PCR扩增片段，将其包括在内。普通PCR产物连接至T-载体转化到DH5α。本研究的目的是为本检测方法在实际应用中提供阳性标准品。空肠弯曲菌标准质粒验证，荧光定量PCR检测结果见图8a、图8b。研制出的标准品其各浓度荧光定量PCR结果见表9。

表9荧光定量PCR检测空肠弯曲菌标准品结果

Claims (9)

1.一种用于检测空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)的特异性引物，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的引物，其核苷酸序列为：

上游引物：CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG，

下游引物：GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG。

3.与权利要求1或2所述引物配合使用的荧光探针。

4.如权利要求3所述的荧光探针，其核苷酸序列为：

FAM-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-BHQ1。

5.一种空肠弯曲菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物和权利要求3或4所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

6.如权利要求5所述的空肠弯曲菌的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为：

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性4min，1个循环；95℃变性10s，59℃退火30s，40个循环。

8.含有权利要求1或2所述引物和/或权利要求3或4所述探针的试剂盒。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其还包括：DNA裂解液、荧光定量反应液、阴性模板和/或阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为空肠弯曲菌基因组DNA。

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