CN101792794B

CN101792794B - 检测志贺菌的实时荧光pcr试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101792794B
Application number: CN2009100986490A
Authority: CN
Inventors: 梅玲玲; 朱敏; 张俊彦; 程苏云; 占利
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2029-05-22
Also published as: CN101792794A

Abstract

本发明提供了一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′，下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′，荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′，其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在：靶细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对志贺菌进行快速、准确、特异检测。

Description

检测志贺菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。

(二)背景技术

志贺菌(Shigella)作为侵袭性病原菌，可直接破坏肠黏膜，引起细菌性痢疾和食物中毒。全球每年有1.6亿志贺菌患者，约有110万人死亡。是我国夏、秋季常见的肠道传染病，也是传染病防制法规定的丙类传染病病原菌，属于对人类和动物健康有极大危害的一类食源性病原菌。

志贺菌目前主要通过培养法分离，生化方法鉴定，整个过程操作繁琐，耗时长，阳性率低。TaqMan-MGB探针荧光PCR方法是在荧光定量PCR技术上发展起来的一种新型实时定量体外核酸扩增检测技术，比后者具有更好的敏感性、特异性和重复性，而且时间更缩短为2～3h以内。

(三)发明内容

本发明目的是根据志贺菌ipaH基因设计引物和TaqMan探针，提供一种检测志贺菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，可实现对志贺菌快速、准确、特异检测。

本发明采用的技术方案是：

一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作志贺菌的定性检测，也可加入标准菌株标准品进行定量检测。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还包括志贺菌标准菌株(ATCC51570)的DNA标准品。以梯度浓度的志贺菌标准菌株(ATCC51570)的DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以志贺菌标准菌株(ATCC51570)浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品中志贺菌的浓度。

本发明应用新型TaqMan-MGB探针，建立的志贺菌实时PCR方法，可直接检测疑似病人、食品和环境中志贺菌，为志贺菌食物中毒事件快速诊断，为迅速采取相应措施，避免任何食品来源疾病的爆发提供科学依据。

本发明一种检测贺菌的荧光定量PCR方法，所述方法包括：

(1)按照常规方法提取待测样品DNA；通常采用热裂解法：将菌株收集于1.5mL管中，置沸水浴10min，10000rpm离心5min，吸上清至另一离心管，-40℃保存备用；

(2)以待测样品DNA为模板，与特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于定量PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团；

(3)择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，CT值小于35，则判断为阳性，即样本中存在志贺菌。

所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非靶细菌，如副溶血性弧菌、单增李氏菌、沙门菌等。进一步，所述方法同时以梯度浓度的志贺菌(ATCC51570)DNA溶液在与样DNA相同条件下进行实时荧光定量PCR扩增反应，以志贺菌(ATCC51570)浓度的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品志贺菌的浓度。

所述PCR反应体系组成及反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，步骤(3)中PCR体系终浓度组成如下：

PCR缓冲液终浓度为1×

脱氧三磷酸核苷混合物各0.1～0.5mmol/L

上、下游引物各0.2～0.4μmol/L

荧光探针 0.1～0.2μmol/L

DNA聚合酶 0.5～5U/反应

模板DNA 10～10³ng/μL

溶剂为ddH₂O。

所述PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。1×one step RT-PCR缓冲液的组成参见Takara公司的one step Prime Script RT-PCR(Perfect Real time)，Code：DRR064A。

实际使用中，通常选用将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起的Premix Type试剂(如Premix Ex Taq TM(2×)，TaKaRa，DRR039S)，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。

步骤(3)中PCR反应条件如下：95℃预变性20S，95℃变性10S，50℃退火40S，40个循环。

发明建立了利用TaqMan-MGB荧光定量PCR技术检测志贺菌的方法，并经检测模拟双盲食品污染样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得细菌的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。

随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。

本发明的有益效果主要体现在：靶细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对志贺菌进行快速、准确、特异检测。

(四)附图说明

图1为实时荧光定量PCR标准菌株检测：志贺菌实时荧光定量PCR标准菌株(ATCC51570)检测结果，从左至右分别为10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL标准品；

图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y＝-4.296×+lgX+6.190：对应的CT值；X：细菌的CFU；

图3为荧光定量PCR检测特异性结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物、荧光探针

1、材料：

Premix Ex Taq TM(2×)购自TaKaRa公司(DRR039S)；

MX3000P型定量PCR仪为美国STRATAGNE公司产品。

2、引物及探针设计与合成：

以志贺菌ipaH基因序列(注册号为DQ448042)为模板，使用PrimerExpress^TM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan-MGB引物和探针位点，从中选择最佳组合：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

均由大连宝生物工程有限公司合成。

实施例2：志贺菌荧光定量PCR法特异性评价

1、菌株检测：

用3株志贺菌标准株(痢疾志贺菌CMCC 51570、宋内志贺菌CMCC51334、福氏志贺菌ATCC 12022)、30株志贺菌分离株，以及大肠杆菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、耶尔森菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、粪产碱杆菌、莱曼氏乳酸菌、腊样芽孢杆菌、鸭沙门氏菌、奇异变形杆菌、溶血性链球菌等91株非志贺菌菌悬液，用热裂解法提取DNA，然后用检测用上下游引物及探针在美国STRATAGNE公司MX3000P型定量PCR仪上进行PCR扩增。

(1)热裂解法：将菌株收集于1.5mL管中，置沸水浴10min，10000rpm离心5min，吸上清至另一离心管，-40℃保存备用；

(2)总反应体系包括Premix Ex Taq TM(2×)(TaKaRa，DRR039S)12.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.4μL，探针(20μmol/L)0.2μL，模板DNA量为5.0μL(约100ng/μL)，用ddH₂O补足25μL。反应管置于定量PCR仪进行荧光检测；

反应条件：95℃预变性20S，95℃变性10S，50℃退火40S，40个循环。

以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测菌株荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，CT值小于35，则判断为阳性。

同时在相同条件下以不同浓度标准菌株(ATCC51570)DNA标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的志贺菌的数量。

2、样品检测结果

标准菌株(ATCC51570)DNA标准品的检测结果参见图1，标准曲线参见图2。

特异性结果显示显示3株志贺菌标准株，30株志贺菌分离株Ct值均小于35，而非志贺菌的Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>检测志贺菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

ggaaaaccct cctggtccat 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

cgccggtatc attatcgaaa a 21

<210>3

<211>14

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

aggcatcaga aggc 14

Claims

1.一种检测志贺菌(Shigella)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGAAAACCCTCCTGGTCCAT-3′

下游引物：5′-CGCCGGTATCATTATCGAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-AGGCATCAGAAGGC-MGB-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有志贺菌标准菌株的DNA标准品。