CN104004827A - 志贺氏菌荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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刘钦松
郭涛
杜志楠
郭宝柱
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Abstract

本发明涉及一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，包括DNA提取液、PCR反应液、Taq酶和UNG酶混合液、志贺氏菌阳性对照、阴性对照；其特征引物序列为：F Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT R Sequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT探针：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCCModification：5’6-FAM，3’BHQ1；采用此试剂盒对被测样品中志贺氏菌进行检测，灵敏度高，稳定性好，方便快捷。

Description

志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明提供了一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，属于生物科学领域。 
背景技术
实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用。由于实时荧光定量PCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到的优势。 
发明内容
一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，包含标准阳性模板、阳性对照品、阴性对照品、TaqDNA聚合酶和UNG酶混合液、荧光聚合酶链式反应液，其目的在于克服了现有技术的不足。 
本发明通过以下技术方案实现上述目的： 
根据志贺氏菌保守序列设计特异的引物和探针，当样品中含有志贺氏菌时，前增菌后提取的志贺氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中志贺氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被Taq酶水解，把探针上的荧光基团和淬灭基团分开，从而通过荧光增量来实时判断志贺氏菌的存在。 
1、根据志贺氏菌管家基因设计引物和探针。 
引物： 
F Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT Tm55.02 
R Sequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT Tm55.75 
探针：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC 
Modification：5’6-FAM，3’BHQ1 
2、志贺氏菌增菌液DNA的制备(水煮法)。 
a将志贺氏菌于肉汤营养培养基平板上划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养24小时； 
b挑取单菌落于营养肉汤液体培养基中，37℃震荡培养8小时； 
c加入终浓度为0.5％的甲醛溶液置于37℃恒温培养箱中灭活24小时。 
d将灭活的菌液置于离心机中10000r/min离心2min，弃上清，用双蒸水洗两次，加入适量双蒸水摇匀； 
e置于金属浴中煮沸备用。 
3、核酸扩增。 
具体实施方式：
以下通过实例更详细地对本发明的技术要点进行解释，为更好地理解本发明提供依据。 
1、灵敏度：检测的最高稀释度可达10-8～10-7，定量检测线性范围可达10-1010拷贝/ml。 
2、特异性：采用最新基因序列数据库设计，并通过系统验证，本试剂盒能够检测所有己知志贺氏菌毒株。对于其它菌株，本试剂盒检测结果为阴性。 
3、具体实施方式 
下面结合具体实例对本技术发明做进一步说明。 
实施例1 
检测试剂盒的性能评估 
检测方法灵敏度评估 
通过对市面上购买来的40份食品样品采用细胞培养、常规PCR、荧光定量PCR3种方法检测同时进行比较验证，结果荧光定量PCR法对LM的检出率为1215％，高于常规PCR的1010％和细菌培养分离的510％。如采用传统的细菌培养法进行细菌分离，虽然是一种经典方法，但全过程至少需要4～7d，通常检出限为1000cfu/ml，而采用本方法，检出限为10cfu/ml。 
实施例2 
临床样品中志贺氏菌的荧光定量PCR检测： 
检测样本类型： 
肛拭子、粪便等。 
适用仪器： 
ABI系列荧光定量PCR仪、Roche系列荧光定量PCR仪、Qiagen Rotor Gene等荧光定量PCR仪 。

Claims (4)

1.一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液、Taq酶和UNG酶混合液、沙门氏菌阳性对照、阴性对照。其特征在于，PCR反应液中所含志贺氏菌特异性引物序列和探针，所述引物与探针如下： 
上游引物序列：Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT 
下游引物序列：RSequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT 
探针：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC Modification：5’6-FAM，3’BHQl 。
2.根据权利要求1所述的一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒PCR反应液中所含10×Buffer2.5μL/反应，Mg离子浓度为800μM，dNTP浓度为400μM，上下游引物浓度为0.2μM，探针浓度为0.3μM，Taq酶和UNG酶混合液中Taq酶浓度为50U/μL，UNG酶浓度为2U/μL。 
3.根据权利要求1所述的一种志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包含以下步骤： 
a取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；加入50ul DNA提取液，充分混匀后沸水浴5min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。 
b将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶和UNG酶混合液，按1μL/管加入酶混合液，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液20ul+1ulTaq酶。 
c加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。阴、阳性对照使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对照各4uL，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。 
d上机扩增、检测区：反应条件为50℃：2min，1个循环；95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，55℃：60sec(信号采集)，40个循环。反应体系设 为25ul。 
e检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。 
检测样本Ct值＞35.0且Ct值＜40时，需重复检测一次，如果Ct值仍＜40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否则报告阴性。样本不显示Ct值时，报告阴性。 
4.如权利要求书1所述的检测方法，其特征在于其反应体系为： 
组分       终浓度 
上游引物：0.16μM 
下游引物：0.16μM 
探针：0.24μM 
dNTP：320μM 
dUTP：320μM 
Mg：640μM 
10×Buffer：1× 
Taq酶：5U/反应 
UNG酶：0.2U/反应 
模板：4uL 
水：补至25uL 。
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