CN1831141A

CN1831141A - 一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列

Info

Publication number: CN1831141A
Application number: CN 200510120894
Authority: CN
Inventors: 肖性龙; 张经纬
Original assignee: SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2025-12-15
Also published as: CN100402667C

Abstract

一种用于志贺氏菌核苷酸片段的PCR扩增引物和探针序列。引物序列包括：由上游引物SFipaHpf771序列为AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列为CCCAGAGGGAGAACCAGTC组成的引物对，以及该引物对的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：由探针SFipaHpb802序列为AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

Description

一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列。

背景技术

志贺氏菌是食品中常见的致病菌，是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁，使通透性增高，从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统，引起临床上一系列毒血症症状，如发热、神志障碍，甚至中毒性休克。其毒素破坏粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠括约肌最明显，因而发生腹痛、里急后重等症状。志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播，与其相关的食品包括色拉(土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡)、生的蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、面包制品、汉堡包和有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和26号令中明确规定志贺氏菌为必检项目。目前对该菌的检测，国标和行标多采用传统的平板培养或酶联反应(ELISA)的方法，这些方法步骤烦琐，费时费力，一般至少要耗时4-6天，且由于多种干扰因素的影响，检测结果的准确性容易降低，给食品的进出口带来了非常不利的影响。因此，建立一种更加快速、准确、操作简便的致病菌检测方法势在必行。

目前国内外应用于食源性病原菌检测的分子生物学技术，主要分为三类：普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性率和假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR方法技术成熟，也最早用于食源性病原菌的检测，但需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，而且也有一定的非特异性扩增。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高。由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性。(3)数据分析选在核酸扩增的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠。(4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰。(5)不接触有毒试剂，操作安全。(6)有利于规模化、自动化及联网管理。(7)适用范围更广，理论上可检测任何细菌的核酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列包括：

由上游引物SFipaHpf771序列为AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列为CCCCAGAGGGAGAACCAGTC组成的引物对，以及该引物对的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：由探针SfipaHpb802序列为AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。

附图说明

图1利用引物对SFipaHpf771/SfipaHpr863和探针SfipaHpb802检测志贺氏菌阳性样品的荧光PCR扩增图。

具体实施方式

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的志贺氏菌基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(志贺氏菌ipaH基因，其序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

上游引物SFipaHpf771：AAATGCGTTTCTATGGCGTGT

下游引物SFipaHpr863：CCCCAGAGGGAGAACCAGTC

探针SfipaHpb802：AGCAAATGACCTCCGCACT

2.反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：取志贺氏菌标准菌株复苏后培养48小时，取培养液1ml进行10倍梯度稀释，选取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6共6个稀释度作为系列阳性模板，分别提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物和探针进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。

2.1 引物浓度的优化在反应体系中，将志贺氏菌的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。

2.2 镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

2.3 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

2.4 dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。

2.5 探针浓度的优化在反应体系中，将志贺氏菌的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1 优化后的PCR反应体系

组分	终浓度
组分	终浓度	10×PCR反应缓冲液	1×
Mg²⁺浓度	2.5mmol/L	10×PCR反应缓冲液	1×
Mg²⁺浓度	2.5mmol/L	dNTPs(含dUTP)	0.2mmol/L
Taq酶	2U	dNTPs(含dUTP)	0.2mmol/L
Taq酶	2U	引物(上游)	0.2μmol/L
引物(下游)	0.2μmol/L	引物(上游)	0.2μmol/L
引物(下游)	0.2μmol/L	探针	0.1μmol/L
模板	2μl	探针	0.1μmol/L
模板	2μl	补水至	40μl

注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR条件选择如下：

95℃2min，1个循环；

95℃5sec，60℃40sec，40个循环。

5.检测步骤：

(1)选取引物和探针；

(2)制备待测模板，可采用酚-氯仿法提取各种来源样品中志贺氏菌的基因组DNA；

(3)反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度；

(4)选择仪器的检测通道；

(5)上机检测。

6.实施例

选取引物对SFipaHpf771/SfipaHpr863和探针SfipaHpb802，将待检的志贺氏菌培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如下：

(1)将待检的志贺氏菌增菌液(约1ml)加入1.5ml的离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清。

(2)加入DNA裂解液700ul，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟。

(3)加入等体积的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟。

(4)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5分钟。

(5)将上清液移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟。

(6)弃上清后用70％乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干。

(7)在干燥后的离心管中加入50ul DNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。在40ul荧光PCR反应体系中，加入以上提取的志贺氏菌基因组DNA 2ul，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待检培养液中含有志贺氏菌则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到1000个拷贝/ml；若待检培养液中不含有志贺氏菌则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度和特异性。

7.本发明的优点：

(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

(2)本发明提供的引物和探针对于不含有志贺氏菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

(3)由于本发明采用志贺氏菌的内源基因ipaH作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。

(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

附录

志贺氏菌ipaH基因

atgattaaat caaccaatat acaggcaatc ggttctggta ttatgcatca aataaacaat 60

atatactcgt taactccatt tcctttacct atggaactga ctccatcttg taatgaattt 120

tatttaaaag cctggagtga atgggaaaag aacggtaccc caggcgagca acgcaatatc 180

gccttcaata ggctgaaaat atgtttacaa aatcaagagg cagaattaaa tttatctgag 240

ttagatttaa aaacattacc agatttaccg cctcagataa caacactgga aataagaaaa 300

aacctattaa cacatctccc tgatttacca ccaatgctta aggtaataca tgctcaattt 360

aatcaactgg aaagcttacc tgccttaccc gagacgttag aagagcttaa tgcgggtgat 420

aacaagataa aagaattacc atttcttcct gaaaatctaa ctcatttacg ggttcataat 480

aaccgattgc atattctgcc actattgcca ccggaactaa aattactggt agtttctgga 540

aacagattag acagcattcc cccctttcca gataagcttg aagggctggc tatggctaat 600

aattttatag aacaactacc ggaattacct tttagtatga acagggctgt gctaatgaat 660

aataatctga caacacttcc ggaaagtgtc ctgagattag ctcagaatgc cttcgtaaat 720

gttgcaggta atccactgtc tggccatacc atgcgtacac tacaacaaat aaccaccgga 780

ccagattatt ctggtcctcg aatatttttc tctatgggaa attctgccac aatttccgct 840

ccagaacact ccctggctga tgccgtgaca gcatggttcc cggaaaacaa acaatctgat 900

gtatcacaga tatggcatgc ttttgaacat gaagagcacg ccaacacctt ttccgcgttc 960

cttgaccgcc tttccgatac cgtctctgca cgcaatacct ccggattccg tgaacaggtc 1020

gctgcatggc tggaaaaact cagtgcctct gcggagcttc gacagcagtc tttcgctgtt 1080

gctgctgatg ccactgagag ctgtgaggac cgtgtcgcgc tcacatggaa caatctccgg 1140

aaaaccctcc tggtccatca ggcatcagaa ggccttttcg ataatgatac cggcgctctg 1200

ctctccctgg gcagggaaat gttccgcctc gaaattctgg aggacattgc ccgggataaa 1260

gtcagaactc tccattttgt ggatgagata gaagtctacc tggccttcca gaccatgctc 1320

gcagagaaac ttcagctctc cactgccgtg aaggaaatgc gtttctatgg cgtgtcggga 1380

gtgacagcaa atgacctccg cactgccgaa gccatggtca gaagccgtga agagaatgaa 1440

tttaaggact ggttctccct ctggggacca tggcatgctg tactgaagcg tacggaagct 1500

gaccgctggg cgcaggcaga agagcagaag tatgagatgc tggagaatga gtactctcag 1560

agggtggctg accggctgaa agcatcaggt ctgagcggtg atacggatgc ggagagggaa 1620

gccggtgcac aggtgatgcg tgagactgaa cagcagattt accgtcagtt gactgacgag 1680

gtactggccc tgcgattgtc tgaaaacggc tcaaatcata tcgcataa 1730

序列表

<110>深圳太太基因工程有限公司

<120>一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aaatgcgttt ctatggcgtg t 21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccccagaggg agaaccagtc 20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agcaaatgac ctccgcact 19

Claims

1.一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物SFipaHpf771序列为AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列为CCCCAGAGGGAGAACCAGTC组成的引物对，以及该引物对的上游引物SFipaHpf771位置向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基，下游引物SFipaHpr863位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列。

2.根据权利要求1所述的用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：上游引物SFipaHpf771序列为AAATGCGTTTCTATGGCGTGT和下游引物SFipaHpr863序列为CCCCAGAGGGAGAACCAGTC。

3.一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针序列包括：由探针SfipaHpb802序列为AGCAAATGACCTCCGCACT向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。

4.根据权利要求3所述的用于检测志贺氏菌核苷酸片段的探针序列，其特征在于所述的探针SfipaHpb802序列为AGCAAATGACCTCCGCACT。