CN105400778B - 同时检测10种致病性弧菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒和一种同时检测10种致病性弧菌的方法。本发明试剂盒包括通用引物、荧光探针和根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针。同时检测10种致病性弧菌的方法包括以待测样本提取的可疑菌的DNA为模板，利用本发明试剂盒采用荧光探针熔解曲线法依次进行杂交连接反应、荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理。本发明试剂盒和检测方法能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌，从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率。
Description
技术领域
本发明属于卫生防预病毒检测技术领域，具体的涉及一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒及基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的方法。
背景技术
弧菌科(Vibrionaceae)是一群氧化酶阳性，具有端极鞭毛，菌体短小、直或微弯的革兰阴性杆菌。分为弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、发光杆菌属和射光杆菌属等五个属。弧菌属分布广泛，水中居多，约37种。在众多弧菌之中，致病性差异较大，与人类健康密切相关且能够致病的弧菌主要包括：霍乱弧菌、创伤弧菌、河弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、气单胞菌和类志贺邻单胞菌。
霍乱是一种急性腹泻疾病，能在数小时内造成腹泻脱水甚至死亡，是我国《传染病防治法》规定的甲类传染病之一。属于国际检疫传染病。自1871年以来，已经发生过7次世界性霍乱大流行。霍乱弧菌(V.cholera)是人类霍乱的病原体，在霍乱弧菌的200多个血清群中，仅O1群和O139群霍乱弧菌能引起暴发发流行。而其它的血清群只是引起胃肠炎等一般腹泻。霍乱弧菌的致病物质涉及染色体上的多个基因，霍乱肠毒素则是霍乱弧菌最重要的毒力因子，也是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素。根据中国疾控中心发布的《2013年度全国法定传染病报告发病、死亡统计表》显示，2012年霍乱发病数为75例，死亡0例，2013年霍乱发病数53例，死亡1例。创伤弧菌又称海洋弧菌，临床中最常见的是胃肠炎、伤口感染以及原发性败血症。创伤弧菌的感染多发于欧洲、美洲和亚洲的沿海城市，在国内常见于浙江省等沿海省份有败血症的病例报告。河弧菌可以通过污染的海产品导致人类的流行性腹泻，引起散发或爆发病例，是仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌。副溶血弧菌的感染多发于食用生的或未煮熟的受污染的海产品所致，以及伤口暴露于海水之中，根据美国疾控中心统计，自1997-1998年共计345例感染，其中59％为表现为胃肠炎，34％为伤口感染，5％为败血症，2％为其他症状。同时，副溶血弧菌也是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。溶藻弧菌是海产品和食物中检出率较高的优势菌种，能够引起急性胃肠炎、伤口感染和败血症。作为一种腹泻相关的重要病原菌正日益受到重视。拟态弧菌，革兰氏阴性弧菌，与不典型的霍乱弧菌关系密切，其形态学、DNA序列及性质与霍乱弧菌相似。不仅可以导致水产动物腹泻病，而且可以通过水体及水产品感染人类，在我国福建、北京、江苏、上海及浙江有发病报道，多为散发或暴发。气单胞菌和类志贺邻单胞菌近年来逐渐受到重视的两种致病弧菌，多经未煮熟的海产品传播，在我国浙江宁波、温州地区有报道两种致病菌的腹泻病例和食物中毒情况。
目前，针对致病性弧菌鉴定的标准方法是利用3％的氯化钠碱性蛋白冻水增菌8-16h，再使用弧菌选择性平板硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfatecitrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)分离单菌落，然后，进行生化鉴定和血清学分型。最后确定具体的哪一种致病菌，耗时长，一般需要5-7天才能确定结果。若出现生化特性非特异的菌株，则很难通过生化鉴定区分相似菌株。ELIS是免疫学检测中应用最为广泛的一种方法，而分子生物学则以PCR方法为主要代表，各类弧菌检测的试剂盒都已投入市场，在致病性弧菌的检测中也被大量采用。此外，RAPD、AFLP和DNA指纹图谱技术也被用于致病性弧菌的检测，然而，上述方法往往只能一次筛查1-2种的致病菌，若要快速检测一系列的可疑致病菌，则需多次实验，工作量偏大，检测时间长。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能同时检测10种致病性弧菌的试剂盒及利用本发明试剂盒采用荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的方法，旨在解决现有检测致病性弧菌方法存在的同时检测致病性弧菌数量少，效率低，周期长的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括通用引物、荧光探针和根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针；其中，
所述通用引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述荧光探针包括荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5；且所述荧光探针FAM的序列为SEQ ID NO：3所示，所述荧光探针ROX的序列为SEQ ID NO：4所示，所述荧光探针Cy5的序列为SEQ ID NO：5所示；
所述根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针如下：
溶藻弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示；
拟态弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示；
河弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示；
创伤弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示；
霍乱弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示；
O1群霍乱弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示；
O139群霍乱弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示；
副溶血弧菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51所示所示；
气单胞菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示；
类志贺邻单胞菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55所示；
拟南芥的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示。
以及，一种同时检测10种致病性弧菌的方法，包括如下步骤：
提取待测样本所含可疑菌的DNA；所述待测样本为公共卫生产品的样本；
以所述DNA为模板DNA，利用本发明试剂盒采用荧光探针熔解曲线法依次进行杂交连接反应、荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理。
与现有技术相比，本发明试剂盒含有针对致病性弧菌特异基因设计的交易连接探针、荧光探针和引物，使得本发明试剂盒能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌，从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率。
上述本发明同时检测10种致病性弧菌的方法采用上述本发明基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒，在多重连接探针扩增技术的基础上采用实时荧光PCR熔解曲线法实现快速、简便和高通量的对10种致病性弧菌同时检测，从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率，灵敏度高。
附图说明
图1是本发明实施例对10种致病性弧菌经荧光探针熔解曲线分析处理后的曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种效率高、周期短且能同时对10种致病性弧菌进行检测的试剂盒。在一实施例中，本发明实施例试剂盒包括通用引物、荧光探针和根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针。其中，
在一实施例中，上述荧光探针包括如下表1中所示的荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5。该荧光探针中的FAM、ROX和Cy5为标记荧光基团，其分别连接在各荧光探针的5’，在一优选实施例中，连接在该各荧光探针3’的淬灭基团选用BHQ，在一具体实施例中，该BHQ可以选用BHQ1和BHQ2。
在一优选实施例中，该荧光探针FAM的序列为SEQ ID NO：3所示，所述荧光探针ROX的序列为SEQ ID NO：4所示，所述荧光探针Cy5的序列为SEQ ID NO：5所示。
选用上述荧光探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性，并实现同时检测多个目标基因。最终设计的各荧光探针浓度可以根据实际条件和需要而定，如荧光探针浓度可以是表1中所述的浓度。
表1 探针熔解曲线体系所用引物和探针序列
上述的10种致病性弧菌为如下文表2或5中的溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、气单胞菌、类志贺邻单胞菌和拟南芥。那么该10种致病性弧菌的特异特异性基因分别为：溶藻弧菌是Collagenase，拟态弧菌是vvh、河弧菌是ToxR、创伤弧菌是vvh、霍乱弧菌是HlyA和CTX、O1群霍乱弧菌是RfbE、O139群霍乱弧菌是WbfR、副溶血弧菌是ToxR和Tdh、气单胞菌是16S rRNA、类志贺邻单胞菌是23S rRNA，拟南芥是SUC2。该10种致病性弧菌的各自特异性基因可以直接查阅相关文献获得。上述该10种致病性弧菌各自特异性基因序列如下述表2中所示。
在一实施例中，基于上述10种致病性弧菌各自的特异性性基因序列分别如下：
溶藻弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
拟态弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
河弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
创伤弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
霍乱弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17所示；
O1群霍乱弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
O139群霍乱弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
副溶血弧菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
气单胞菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示；
类志贺邻单胞菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示；
拟南芥的特异性性基因序列为SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示。
表2 10种致病性弧菌的特异性性基因及其序列
那么根据上述10种致病性弧菌的如上述表2所述的特异性性基因序列而分别设计的杂交连接探针如下文表5中所示的SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：57。
上述各致病性弧菌的杂交连接探针序列能够有效识别并杂交待测目的基因，而且在连接酶催化与待测模板DNA互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，以能获得一条完整的单链杂交连接产物。另外，上述各致病性弧菌的杂交连接探针序列可以在Genebank中下载相关序列，利用Primer Premier 5.0，Tm utility v1.3，DNAfolding等软件设计而成。最终设计的各致病性弧菌的杂交连接探针序列浓度可以根据实际条件和需要而定。
另外，利用上述各实施例基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒对可疑致病性弧菌进行检测时，还会用到相应的试剂。如杂交连接反应的试剂体系和荧光探针溶解曲线检测试剂体系。因此，为了本发明实施例试剂盒使用的方便，在一实施例中，本发明实施例试剂盒还包括杂交连接酶缓冲液、杂交连接酶，或进一步的包括去离子水。且该杂交连接酶缓冲液、杂交连接酶与上述序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物以及去离子水构成杂交连接反应试剂体系，如表3所示。其中，表3中的模板DNA为待测目标菌提取的DNA。
表3 杂交连接反应体系
在另一实施例中，本发明实施例试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和rTaq酶，或进一步的包括去离子水。且该PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和rTaq酶与上述序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物和上述所示荧光探针以及去离子水构成荧光探针溶解曲线检测试剂体系，如表4所示。其中，表4中的模板为按照上述表3中的杂交连接反应体系反应所得的杂交连接反应产物。
表4 荧光探针熔解曲线检测体系
由上所述，本发明实施例试剂盒含有针对10种致病性弧菌特异基因设计的交易连接探针、荧光探针和引物，使得本发明实施例试剂盒能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌，从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率。
相应地，基于上文所述的基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒的基础上，本发明实施例还提供了一种能同时检测10种致病性弧菌的方法，包括如下步骤：
步骤S01：提取待测样本所含可疑菌的DNA；
步骤S02：以所述DNA为模板DNA，利用上文所述的本发明实施例基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌试剂盒，采用荧光探针熔解曲线法依次进行杂交连接反应、荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理。
具体地，上述步骤S01中待测样本可以是食用原料、食品，还可以设计公共卫生安全的使用物品等。也即是说，该步骤S01中测样本RNA提取的来源还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断为目标的来源。当然，也可以是脱离人体物，如粪便等。提取待测样本所含可疑菌的DNA方式可以按照本领域DNA常规提取方式，如下文实施例1中核算DNA的提取方法。
上述步骤S02的杂交连接反应是以步骤S01中提取的DNA为模板，在上文表3中所示杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，在该杂交反应过程中，表5中的杂交探针识别并杂交待测的目的基因，连接酶催化与模板互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，获得一条完整的单链杂交连接产物，待测目的基因序列中的信息由此被转移到杂交连接产物中。而杂交连接产物将替代目的基因序列在后续的反应中被扩增和检测。
在一实施例中，该杂交连接反应的条件为：95℃预变性5min，60℃连接80min，98℃高温变性5min。
上述步骤S02中的荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理是通过一对通用引物和一套探针实现对杂交连接产物的扩增，从而完成对目的产物的富集，然后，根据荧光检测探针可与多种匹配程度不同的靶序列杂交，形成稳定性不同的双链杂交体，由低到高的变化过程中出不同的Tm值，完成溶解曲线分析。
其中，在该步骤S02中的荧光PCR扩增处理是本步骤S02中的杂交连接反应产物为模板，在上文表4中所示荧光探针熔解曲线检测体系中进行荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理。
在一实施例中，该荧光PCR扩增处理的条件为：所述PCR扩增处理的条件为：95℃预变性3min；然后经95℃变性5s，退火58℃，15s同时采集荧光信号，延伸74℃，15s,40个循环。
在另一实施例中，所述溶解曲线分析处理的条件为：95℃变性30s，40℃杂交1min，从40℃-82℃逐步升温每上升0.5℃采集一次荧光信号。
上述步骤S02中的荧光PCR扩增处理结束后，将产物进行熔解曲线分析处理，并根据产物溶解峰的温度和形状差异，确定是哪一种弧菌。
在具体实施例中，经熔解曲线分析处理后的上述10种致病性弧菌检测结果如图1所示，且荧光探针熔解曲线体系各个通道检测基因名称和Tm值范围如下：
FAM通道共检测4个基因，分别是内标基因SUC2：Tm值53±1℃，类志贺邻单胞菌：Tm值57.5±1℃，气单胞菌：Tm值59.5±1℃，副溶血弧菌毒力基因Tdh:Tm值62.5±1℃。
ROX通道共检测6个基因，分别是霍乱弧菌hlyA基因：Tm值52.5±1℃，河弧菌：Tm值55.5±1℃，创伤弧菌：Tm值61.5±1℃，副溶血弧菌：Tm值65.5±1℃，拟态弧菌：Tm值69.5±1℃，溶藻弧菌：Tm值72.5±1℃。
Cy5通道共检测3个基因，分别是O1群霍乱弧菌：Tm值55±1℃，O139群霍乱弧菌：Tm值62±1℃，霍乱弧菌毒素基因CTX：Tm值68.5±1℃。
以上Tm值的测定是以BIORAD CFX96 real time PCR仪器为准。检测结果判定时，Tm值以仪器自动判读为准，当仪器给出一个以上Tm值时，需参考阳性对照和阴性对照的峰值选择有效的Tm值，如果样品浓度较低，出现峰值较低而仪器无法判读时，通过调整基线或人工判读的方法获得Tm值。其中，阳性对照为致病弧菌常用的阳性对照品，阴性对照为灭菌水。
其中，关于图1的几点说明：
1针对副溶血弧菌共选择两个基因，一个是属基因，一个是毒力基因，若待测样本是副溶血弧菌但不含毒力基因则只有一个熔点峰(ROX通道：65.5±1℃)，若毒力基因阳性，则出现两个熔点峰(ROX通道：65.5±1℃，FAM通道：62.5±1℃)。
2针对霍乱弧菌则要判定：是否为霍乱弧菌，是不是具有流行意义的O1或O139群霍乱弧菌，是不是含有毒素基因，若为非O1非O139群霍乱弧菌且毒素基因阴性则有一个熔点峰(ROX通道：52.5±1℃)，反之则出现两个熔点峰(ROX通道：52.5±1℃，CY5通道：68.5±1℃)，若为O1群霍乱弧菌且毒力基因阴性则出现两个熔点峰(ROX通道：52.5±1℃，CY5通道：55±1℃)，反之则出现三个熔点峰(ROX通道：52.5±1℃，CY5通道：55±1℃，68.5±1)，若为O139群霍乱弧菌且毒力基因阴性则出现两个熔点峰(ROX通道：5℃2.5±1℃，CY5通道：62±1℃)，反之出现三个熔点峰(ROX通道：52.5±1℃，CY5通道：62±1℃，68.5±1℃)。
由上述可知，本发明实施例同时检测10种致病性弧菌的方法采用上述本发明实施例基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒，在多重连接探针扩增技术的基础上采用实时荧光PCR熔解曲线法实现快速、简便和高通量的对10种致病性弧菌同时检测，从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率，灵敏度高。
现以具体的基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒和同时检测10种致病性弧菌的方法为例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5；
3.根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针，其中，10种致病性弧菌、各弧菌特异性基因和各弧菌杂交连接探针序列分别如表2中所示。
实施例2
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5；
3.根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针，其中，10种致病性弧菌、各弧菌特异性基因和各弧菌杂交连接探针序列分别如表2中所示。
4.杂交连接反应试剂体系，如上文表3中所示；
5.荧光探针熔解曲线检测试剂体系，如上文表4中所示。
实施例3
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5；
3.根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针，其中，10种致病性弧菌、各弧菌特异性基因和各弧菌杂交连接探针序列分别如表5中所示。
4.杂交连接反应试剂体系，如上文表3中所示；
5.荧光探针熔解曲线检测试剂体系，如上文表4中所示。
表5 10种致病性弧菌杂交连接探针序列
实施例4
一种同时检测10种致病性弧菌的方法。该方法包括如下步骤：
S41.引物和探针制备：
首先筛选出熔点温度差异明显的标签序列，根据表5中所示的10种致病性弧菌的特异性基因序列按照多重连接反应探针设计原则设计杂交连接探针，设计完成的引物和探针均用blast比对保证其特异性，所有引物探针序列均由上海生工生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表1和表5所示，如上文实施例3中基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒。
S42.提取可疑菌落的核酸DNA：
采用热裂解法提取待测物中可疑菌的DNA。向1.5mlEP管中加入200μL tris-HCLEDTA(TE,pH 8.8)，从弧菌显色平板上挑选可疑菌落到EP管中，震荡混匀，于沸水浴中热裂解5min。12,000rpm离心3min,取上清液作为模板。
S43.利用上述实施例3中的基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒进行荧光探针熔接曲线反应分析：
S431.杂交链接反应：
连接体系总体积为10μL，反应体系如上文表3示，首先用移液枪吸取1.5μL杂交连接探针混合液到八联管中，取待测样本数为n，向八联管中加入n+1份，将八联管移至模板加样区，并向管内加入样本DNA 5μL，其中一份加入5μL灭菌水作为阴性对照，整个反应在Biometra T3 PCR仪上运行，反应程序如下：98℃5min，75℃pause，75℃暂停取出，然后再加入含有Ligase即Ligase buffer的反应体系，每管内3.5μL(包括：Ligase：1μL Ligasebuffer:1μL灭菌水：1.5μL)，震荡混匀，放置在于在Biometra T3 PCR仪上，于60℃反应80min,98℃变性5min，产物作为后续PCR反应模板。
S432.PCR和熔解曲线分析：
荧光探针熔解曲线体系总体积50μL，具体见表4所示，反应程序为：95℃预变性3min；然后经95℃变性5s，退火58℃，15s同时采集荧光信号，延伸74℃，15s,40个循环，熔解曲线程序为：95℃变性30s，40℃杂交1min,从40℃-82℃逐步升温每上升0.5℃采集一次荧光信号，整个反应在BIO RAD CFX96 real timePCR仪器上运行。
Tm值的测定是以BIORAD CFX96 real time PCR仪器为准。检测结果判定时，Tm值以仪器自动判读为准，当仪器给出一个以上Tm值时，需参考阳性对照和阴性对照的峰值选择有效的Tm值，如果样品浓度较低，出现峰值较低而仪器无法判读时，通过调整基线或人工判读的方法获得Tm值。
S44.结果判读：
根据产物溶解峰的温度和形状差异，确定是哪一种弧菌。
荧光探针熔解曲线体系各个通道检测基因名称和Tm值范围如下：
FAM通道共检测4个基因，分别是内标基因SUC2：Tm值53±1℃，类志贺邻单胞菌：Tm值57.5±1℃，气单胞菌：Tm值59.5±1℃，副溶血弧菌毒力基因Tdh:Tm值62.5±1℃。
ROX通道共检测6个基因，分别是霍乱弧菌hlyA基因：Tm值52.5±1℃，河弧菌：Tm值55.5±1℃，创伤弧菌：Tm值61.5±1℃，副溶血弧菌：Tm值65.5±1℃，拟态弧菌：Tm值69.5±1℃，溶藻弧菌：Tm值72.5±1℃。
Cy5通道共检测3个基因，分别是O1群霍乱弧菌：Tm值55±1℃，O139群霍乱弧菌：Tm值62±1℃，霍乱弧菌毒素基因CTX：Tm值68.5±1℃。
因此。本实施例4利用上述实施例3提供的基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒在多重连接探针扩增技术的基础上采用实时荧光PCR熔解曲线法实现快速、简便和高通量的对10种致病性弧菌同时检测，从而有效提高了从而有效缩短了致病性弧菌的检测周期，提高了致病性弧菌的检测效率，灵敏度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测10种致病性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括通用引物、荧光探针和根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针；其中，
所述通用引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，SEQ ID NO：1的浓度为0.015μM，SEQ ID NO：2的浓度为0.4μM；
所述荧光探针包括荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5；且所述荧光探针FAM的序列为SEQ ID NO：3所示，浓度为0.16μM，所述荧光探针ROX的序列为SEQ ID NO：4所示，浓度为0.08μM，所述荧光探针Cy5的序列为SEQ ID NO：5所示，浓度为0.16μM；
所述根据10种致病性弧菌特异性基因设计的杂交连接探针如下：
溶藻弧菌的识别Collagenase基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示；
拟态弧菌的识别vvh基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所示；
河弧菌的识别ToxR基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示；
创伤弧菌的识别vvh基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示；
霍乱弧菌的识别HlyA基因和CTX基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示；
O1群霍乱弧菌的识别RfbE基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示；
O139群霍乱弧菌的识别WbfR基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示；
副溶血弧菌的识别ToxR基因和Tdh基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51所示所示；
气单胞菌的识别16S rRNA基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示；
类志贺邻单胞菌的识别23S rRNA基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：54和SEQ IDNO：55所示；
拟南芥的识别SUC2基因的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光探针FAM、荧光探针ROX和荧光探针Cy5的3’端连接有BHQ淬灭基团。
3.根据权利要求1-2任一所述的试剂盒，其特征在于：还包括杂交连接酶缓冲液、杂交连接酶，所述杂交连接酶缓冲液、杂交连接酶与所述通用引物构成杂交连接反应试剂体系。
4.根据权利要求1-2任一所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和rTaq酶，所述PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和rTaq酶与所述通用引物和所示荧光探针构成荧光探针溶解曲线检测试剂体系。
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