CN106520923B - 同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法。所述同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，包括一对通用引物、一条荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针。所述同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，以待测样本提取的可疑菌的DNA为模板，采用多重连接探针扩增技术和荧光探针熔解曲线技术相结合进行检测，通过溶解曲线分析处理待测样品中金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的情况。

Description

同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是最主要的食源性致病菌之一，在自然界中广泛存在。由于金黄色葡萄球菌对多种理化因素具有较强抵抗力(耐热)，易于污染肉制品乳制品，因此在世界各国，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件占了很大比例。食品受金黄色葡萄球菌污染后，不仅容易导致腐败变质，而且部分菌株会产生肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)。肠毒素是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子，是一种分子量低(约26-29kDa)且热稳定性高(100℃煮沸30min不被破坏)的毒素蛋白质，能抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用。误食污染肠毒素的食物后，肠毒素在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。根据抗原性，SE分为约20个血清型，其中SE-A、SE-B、SE-C、SE-D和SE-E是最为常见的血清型(约95％金黄色葡萄球菌食物中毒事件是由SEA～SEE引起的)，尤以SE-A，SE-D最为显著，随后陆续发现的肠毒素包括SE(G-U)。A型的毒力最强，引起食物中毒最多的，而C型又可分为C1、C2和C3亚型。
目前检测SE的方法按照检测原理不同，分为动物实验、免疫血清学方法、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术、高效液相色谱(HPLC)等。用于金黄色葡萄球菌检测的传统方法主要采用细菌分离培养及生化鉴别，该方法耗时长，一般需3～5d，且检测灵敏度较低。免疫学检测方法如ELISA，该法操作简单，灵敏度较高；但一些试剂盒特异性较低，易出现假阳性。PCR技术具有快速、灵敏等特点，已广泛应用于致病菌的检测，但多采用凝胶电泳法检测PCR产物，步骤繁琐，易造成污染。荧光PCR技术由于灵敏度高、特异性强的特点越来越受到重视，从技术原理来看，荧光PCR借助荧光染料或荧光探针实现对把基因检测，目前最为常见的是Taqman探针，市售的荧光PCR仪器主要包括4个(FAM、ROX、HEX、Cy5)荧光通道，而要实现在一个反应管内检测5种肠毒素至少需要8条荧光探针(含双色标记)，极大的增加了检测成本，同时，肠毒素基因序列富含AT碱基，序列Tm值偏低，设计难度大，容易引起非特异扩增，造成假阳性结果，目前，对金黄色葡萄球菌肠毒素检测仍以单色荧光PCR为主。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，旨在解决现有技术在一个反应管内检测5种肠毒素检测成本大、探针设计难度高、容易造成假阳性结果的问题。
本发明是这样实现的，一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，包括一对通用引物、一条荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针；其中，
所述通用引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述荧光探针为ROX荧光探针，序列为SEQ ID NO：3所示；
所述根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针如下：
金黄色葡萄球菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
A型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
B型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
C型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
D型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
E型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示。
以及，一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，包括以下步骤：
设计通用引物、荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针，比检测其杂交熔点温度，制备上述的试剂盒；
提取待测样本所含可疑菌的DNA；
以所述DNA作为模板，使用所述杂交连接探针识别并与待测的目的基因进行杂交连接反应，杂交连接酶催化与所述模板互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，获得一条完整的单链杂交连接产物，将待测目的基因序列中的信息转移到所述杂交连接产物中；
通过一对通用引物和一条荧光探针进行荧光PCR扩增所述杂交连接产物，同时进行熔解曲线分析，由低到高的变化过程中出不同的Tm值，完成熔解曲线分析，通过产物溶解峰的温度和形状差异，判断是否含有金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素，其中，所述荧光探针与金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素中的多种匹配程度不同的靶序列杂交，形成稳定性不同的双链杂交体。
本发明提供的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，含有针对金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素设计的杂交连接探针、荧光探针和引物，使得本发明试剂盒能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素，从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率和准确性。此外，本发明同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，在保证准确性的前提下，只需要一条荧光探针和一对通用引物就能实现6个靶基因的检测。
本发明提供的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，将多重连接探针扩增技术(MLPA)和荧光探针熔解曲线技术相结合进行检测，通过溶解曲线分析可同时实现金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的高通量检测，从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率和准确性，灵敏度高。具体的，本发明先进行杂交连接反应，将靶基因的信息转移至杂交链接探针上，再进行PCR扩增检测和熔解曲线分析，由于杂交链接探针用量极低(10nM)大大减少了非特异扩增产物，能够仅使用一对通用引物和一条荧光探针就实现了6个靶基因的检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素经荧光探针熔解曲线分析处理后的曲线图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，包括一对通用引物、一条荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针；其中，
所述通用引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述荧光探针为ROX荧光探针，序列为SEQ ID NO：3所示；
所述根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针如下：
金黄色葡萄球菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
A型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
B型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
C型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
D型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
E型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示。
具体的，本发明实施例根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的特异性杂交连接探针进行杂交连接反应，进一步实现PCR扩增和溶解曲线的分析，且使得所述杂交连接探针的用量极低，大大减少了非特异扩增产物，进而能够通过一条荧光探针和一组通用引物的实现6个靶基因的检测。
进一步优选的，本发明实施例所述荧光探针ROX能够同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素基因，且其Tm值分别为，E型肠毒素：Tm值54.0±1℃，D型肠毒素：Tm值57.5±1℃，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因：Tm值62.5±1℃，C型肠毒素：Tm值66.0±1℃，B型肠毒素：Tm值70.0±1℃，A型肠毒素：Tm值74.5±1℃。优选的，所述荧光探针ROX的3’端连接有BHQ淬灭基团。选用上述荧光探针不仅可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性，可以仅通过一条荧光探针实现多个目标基因的同时检测。
本发明实施例最终设计的荧光探针和通用引物的浓度可以根据实际条件和需要而定，如探针熔解曲线体系所用荧光探针和通用引物的浓度可以是表1中所述的浓度。
表1
Figure BDA0001128670300000061
上述的5种肠毒素如下文表2或5中的A型肠毒素、B型肠毒素、C型肠毒素、D型肠毒素、E型肠毒素。所述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的特异性基因分别为：金黄色葡萄球菌是nuc，A型肠毒素是SEA、B型肠毒素是SEB、C型肠毒素是SEC、D型肠毒素是SED、E型肠毒素是SEE。所述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的各自特异性基因可以直接查阅相关文献获得。上述所述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素各自特异性基因序列如下述表2中所示。具体的，
金黄色葡萄球菌的特异性性基因序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
A型肠毒素的特异性性基因序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
B型肠毒素的特异性性基因序列为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
C型肠毒素的特异性性基因序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
D型肠毒素的特异性性基因序列为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
E型肠毒素的特异性性基因序列为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示。
表2
Figure BDA0001128670300000062
Figure BDA0001128670300000071
本发明实施例根据上述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的如上述表2所述的特异性性基因序列而分别设计的杂交连接探针如下文表5中所示的SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：27。
上述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的杂交连接探针序列能够有效识别并杂交待测目的基因，而且在杂交连接酶催化与待测模板DNA互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，以能获得一条完整的单链杂交连接产物。
进一步的，本发明实施例所述试剂盒中，为了检测时杂交连接反应和荧光探针溶解曲线检测的进行，还会用到其他试剂。因此，为了本发明实施例试剂盒使用的方便，在一实施例中，本发明实施例试剂盒还包括杂交连接酶缓冲液、杂交连接酶，或进一步的包括ddH2O。且该杂交连接酶缓冲液(Ligase buffer)、杂交连接酶(Ligase)与上述序列为SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物以及去离子水构成杂交连接反应试剂体系，如表3所示。其中，表3中的模板DNA为待测目标菌提取的DNA。
表3
Figure BDA0001128670300000072
在另一实施例中，本发明实施例试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶和ddH2O。且该PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和rTaq酶与上述序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的通用引物和上述所示荧光探针以及去离子水构成荧光探针溶解曲线检测试剂体系，如表4所示。其中，表4中的模板为按照上述表3中的杂交连接反应体系反应所得的杂交连接反应产物。
表4
由上所述，本发明实施例试剂盒含有针对金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异基因设计的杂交连接探针、荧光探针和引物，使得本发明实施例试剂盒能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素，从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率。
本发明实施例提供的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，含有针对金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素设计的杂交连接探针、荧光探针和引物，使得本发明试剂盒能够在多重连接探针扩增技术的基础上，采用实时荧光PCR熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素，从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率和准确性。此外，本发明实施例同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，在保证准确性的前提下，只需要一条荧光探针和一对通用引物就能实现6个靶基因的检测。
对应的，基于上文所述的基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒的基础上，本发明实施例还提供了一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，包括以下步骤：
S01.设计通用引物、荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针，比检测其杂交熔点温度，制备上述的试剂盒；
S02.提取待测样本所含可疑菌的DNA；
S03.以所述DNA作为模板，使用所述杂交连接探针识别并与待测的目的基因进行杂交连接反应，杂交连接酶催化与所述模板互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，获得一条完整的单链杂交连接产物，将待测目的基因序列中的信息转移到所述杂交连接产物中；
S04.通过一对通用引物和一条荧光探针进行荧光PCR扩增所述杂交连接产物，同时进行熔解曲线分析，由低到高的变化过程中出不同的Tm值，完成熔解曲线分析，通过产物溶解峰的温度和形状差异，判断是否含有金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素，其中，所述荧光探针与金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素中的多种匹配程度不同的靶序列杂交，形成稳定性不同的双链杂交体。
具体地，上述步骤S01中，所述通用引物和杂交连接探针基于金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计。经过发明人的反复研究、对比，获得不与待测基因系列相似、不与引物序列互补杂交的特异性荧光探针。本发明实施例所述荧光探针ROX能够同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素基因，且其Tm值分别为，E型肠毒素：Tm值54.0±1℃，D型肠毒素：Tm值57.5±1℃，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因：Tm值62.5±1℃，C型肠毒素：Tm值66.0±1℃，B型肠毒素：Tm值70.0±1℃，A型肠毒素：Tm值74.5±1℃。优选的，所述荧光探针ROX的3’端连接有BHQ淬灭基团。
上述步骤S02中待测样本可以是食用原料、食品，还可以设计公共卫生安全的使用物品等。也即是说，该步骤S02中测样本RNA提取的来源还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断为目标的来源。当然，也可以是脱离人体物，如粪便等。提取待测样本所含可疑菌的DNA方式可以按照本领域DNA常规提取方式，如下文实施例1中核算DNA的提取方法。
上述步骤S03的杂交连接反应是以步骤S02中提取的DNA为模板，在上文表3中所示杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，在该杂交反应过程中，表5中的杂交探针识别并杂交待测的目的基因，杂交连接酶催化与模板互补的待检位点的上下游杂交探针之间形成3’-5’磷酸二酯键，获得一条完整的单链杂交连接产物，待测目的基因序列中的信息由此被转移到杂交连接产物中。而杂交连接产物将替代目的基因序列在后续的反应中被扩增和检测。
在一实施例中，该杂交连接反应的条件为：95℃预变性5min，60℃连接80min，98℃高温变性5min。
上述步骤S04中，以步骤S03中的杂交连接反应产物为模板，在上文表4中所示荧光探针熔解曲线检测体系中进行荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理。
本发明实施例所述荧光PCR扩增处理和溶解曲线分析处理是通过一对通用引物和一个探针实现对杂交连接产物的扩增，从而完成对目的产物的富集，然后，根据荧光检测探针可与多种匹配程度不同的靶序列杂交，形成稳定性不同的双链杂交体，由低到高的变化过程中出不同的Tm值，完成溶解曲线分析。
在一实施例中，该荧光PCR扩增处理的条件为：所述PCR扩增处理的条件为：95℃预变性3min；然后经95℃变性5s，退火58℃，15s同时采集荧光信号，延伸74℃，15s,40个循环。
在另一实施例中，所述溶解曲线分析处理的条件为：95℃变性30s，40℃杂交1min，从40℃-82℃逐步升温每上升0.5℃采集一次荧光信号。
上述步骤S04中的荧光PCR扩增处理结束后，将产物进行熔解曲线分析处理，并根据产物溶解峰的温度和形状差异，确定是哪一种金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素。
在具体实施例中，经熔解曲线分析处理后的上述金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素检测结果如图1所示。本发明实施例所述荧光探针可以检测6个基因，荧光探针熔解曲线体系各个通道检测基因名称和Tm值范围如下：
ROX通道共检测6个基因，分别是E型肠毒素：Tm值54.0±1℃，D型肠毒素：Tm值57.5±1℃，nuc基因：Tm值62.5±1℃，C型肠毒素：Tm值66.0±1℃，B型肠毒素：Tm值70.0±1℃，A型肠毒素：Tm值74.5±1℃。
以上Tm值的测定是以BIORAD CFX96real time PCR仪器为准。检测结果判定时，Tm值以仪器自动判读为准，当仪器给出一个以上Tm值时，需参考阳性对照和阴性对照的峰值选择有效的Tm值，如果样品浓度较低，出现峰值较低而仪器无法判读时，通过调整基线或人工判读的方法获得Tm值。其中，阳性对照为致病金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素常用的阳性对照品，阴性对照为灭菌水。
本发明实施例提供的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测方法，将多重连接探针扩增技术(MLPA)和荧光探针熔解曲线技术相结合进行检测，通过溶解曲线分析可同时实现金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的高通量检测，从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率和准确性，灵敏度高。具体的，本发明实施例先进行杂交连接反应，将靶基因的信息转移至杂交链接探针上，再进行PCR扩增检测和熔解曲线分析，由于杂交链接探针用量极低(10nM)大大减少了非特异扩增产物，能够仅使用一对通用引物和一条荧光探针就实现了6个靶基因的检测。
现以具体的基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒和同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的方法为例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的Q ID NO：3；
3.根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针，其中，金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素、各金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因和各金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素杂交连接探针序列分别如表2中所示。
实施例2
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的Q ID NO：3；
3.根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针，其中，金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素、各自特异性基因和各自杂交连接探针序列分别如表2中所示。
4.杂交连接反应试剂体系，如上文表3中所示；
5.荧光探针熔解曲线检测试剂体系，如上文表4中所示。
实施例3
一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒。该试剂盒包括：
1.通用引物，如表1中的所述Q ID NO：1和SEQ ID NO：2；
2.荧光探针，如表1中的Q ID NO：3；
3.根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针，其中，金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素、各自特异性基因和各自杂交连接探针序列分别如表5中所示。
4.杂交连接反应试剂体系，如上文表3中所示；
5.荧光探针熔解曲线检测试剂体系，如上文表4中所示。
表5
Figure BDA0001128670300000131
实施例4
一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的方法。该方法包括如下步骤：
S11.引物和探针制备：
首先筛选出熔点温度差异明显的标签序列，根据表5中所示的金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的特异性基因序列按照多重连接反应探针设计原则设计杂交连接探针，设计完成的引物和探针均用blast比对保证其特异性，所有引物探针序列均由上海生工生物工程有限公司合成，引物和探针序列见表1和表5所示，如上文实施例3中基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒。
S12.提取可疑菌落的核酸DNA：
采用热裂解法提取待测物中可疑菌的DNA。向1.5mlEP管中加入200μL tris-HCLEDTA(TE,pH 8.8)，从金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素显色平板上挑选可疑菌落到EP管中，震荡混匀，于沸水浴中热裂解5min。12,000rpm离心3min,取上清液作为模板。
S13.杂交链接反应：
连接体系总体积为10μL，反应体系如上文表3示，首先用移液枪吸取1.5μL杂交连接探针混合液到八联管中，取待测样本数为n，向八联管中加入n+1份，将八联管移至模板加样区，并向管内加入样本DNA 5μL，其中一份加入5μL灭菌水作为阴性对照，整个反应在Biometra T3PCR仪上运行，反应程序如下：98℃5min，75℃pause，75℃暂停取出，然后再加入含有Ligase即Ligase buffer的反应体系，每管内3.5μL(包括：Ligase：1μL Ligasebuffer:1μL灭菌水：1.5μL)，震荡混匀，放置在于在Biometra T3PCR仪上，于60℃反应80min,98℃变性5min，产物作为后续PCR反应模板。
S14.PCR和熔解曲线分析：
荧光探针熔解曲线体系总体积50μL，具体见表4所示，反应程序为：95℃预变性3min；然后经95℃变性5s，退火58℃，15s同时采集荧光信号，延伸74℃，15s,40个循环，熔解曲线程序为：95℃变性30s，40℃杂交1min,从40℃-82℃逐步升温每上升0.5℃采集一次荧光信号，整个反应在BIO RAD CFX96real time PCR仪器上运行。
Tm值的测定是以BIORAD CFX96real time PCR仪器为准。检测结果判定时，Tm值以仪器自动判读为准，当仪器给出一个以上Tm值时，需参考阳性对照和阴性对照的峰值选择有效的Tm值，如果样品浓度较低，出现峰值较低而仪器无法判读时，通过调整基线或人工判读的方法获得Tm值。
结果判读：
根据产物溶解峰的温度和形状差异，确定是哪一种金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素。
荧光探针熔解曲线体系各个通道检测基因名称和Tm值范围如下：
ROX通道共检测6个基因，分别是E型肠毒素：Tm值54.0±1℃，D型肠毒素：Tm值57.5±1℃，nuc基因：Tm值62.5±1℃，C型肠毒素：Tm值66.0±1℃，B型肠毒素：Tm值70.0±1℃，A型肠毒素：Tm值74.5±1℃。
本实施例4利用上述实施例3提供的基于荧光探针熔解曲线法同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒在多重连接探针扩增技术的基础上采用实时荧光PCR熔解曲线法实现快速、简便和高通量的对金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素同时检测，从而有效提高了从而有效缩短了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测周期，提高了金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的检测效率，灵敏度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0001128670370000011
Figure IDA0001128670370000021
Figure IDA0001128670370000031
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Claims (3)

1.一种同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，其特征在于，包括一对通用引物、一条荧光探针和根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针；其中，
所述通用引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
所述荧光探针为ROX荧光探针，序列为SEQ ID NO：3所示；所述荧光探针ROX的3’端连接有BHQ淬灭基团；
所述根据金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素特异性基因设计的杂交连接探针如下：
金黄色葡萄球菌的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
A型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；
B型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示；
C型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
D型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25所示；
E型肠毒素的杂交连接探针序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示；
所述荧光探针ROX同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素基因，其Tm值分别为，E型肠毒素：Tm值54.0±1℃，D型肠毒素：Tm值57.5±1℃，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因：Tm值62.5±1℃，C型肠毒素：Tm值66.0±1℃，B型肠毒素：Tm值70.0±1℃，A型肠毒素：Tm值74.5±1℃。
2.如权利要求1所述的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交连接酶和杂交连接酶缓冲液。
3.如权利要求1所述的同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶和ddH2O。
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