CN117004774A - 超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒 - Google Patents

超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，用于灵敏地检测牛结节性皮肤病病毒。首先基于RoomTemp Sample Lysis Kit在室温下快速裂解样品，释放核酸，无需核酸提取纯化直接用于qPCR。方法集核酸提取、扩增和检测于一体。这大大简化了样品处理，节省了成本和时间。超快速qPCR在15分50秒内实现40个循环，检出限低至2.5×103copies·μL‑1。为了进一步提高灵敏度，CRISPR/Cas12a系统被介导用于快速灵敏地检测LSDV。检出限低至2×101copies·μL‑1。此外，横向流动试纸条结合CRISPR/Cas12a实现了视觉检测，为工作人员提供了极大的方便。因此超快速PCR结合CRISPR/Cas12a实现了对LSDV的超快速、灵敏、特异检测，具有重要的实际应用价值。

Description

超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物病毒检测领域，具体涉及一种Ultra-fast qPCR和CRISPR/Cas12a系统以及横向流动试纸条技术的检测方法。
背景技术
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是医学诊断、病毒细菌检测、环境监测、食品安全等方面的主要方法。然而，PCR通常需要一个多小时来扩增纯化的核酸。酶的三步扩增速度和PCR装置的变温速率导致PCR时间较长。然而，对于一种便于现场检测的稳定和温度变化快的超快速PCR装置，尚缺乏系统的分析研究。近年来，为了克服加热效率低和便携性差的问题，开发了一些小型化PCR系统，即微流控芯片的芯片实验室技术。仪器的进步加速了超快速PCR的发展。Byounghee Kim开发了一种超快速定量聚合酶链反应(PCR)，用于特异性检测慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)。1.0×108分子通过SYBR Green在4min和17s内检测到，通过EvaGreen1.0×102分子可以在11min和16s内检测到。对两个转基因马铃薯事件(SPS-Y9和EH92-527-1)建立了超快速PCR(UF-PCR)系统。它可以检测到低至0.5％的转基因掺入。采用超快速PCR技术快速检测加工食品中荞麦过敏原DNA。该方法的检出限为小麦中荞麦的0.001％。利用特异、灵敏的超快速PCR方法可以快速、准确地鉴定商品食品中的6种昆虫，检出限为1pg。以上证明了超快速PCR在食品、病毒、病原体和疾病的检测中有着广泛的应用。虽然扩增阶段所需的时间较少，但这些方法仍然需要耗时且昂贵的核酸提取。这对超快速PCR的应用是非常不利的。此外，为了快速得到结果，采用SYBR green和evgreen等荧光染料输出信号。它们的特异性较低，因为它们无法避免引物二聚体和非特异性扩增的假阳性。因此需要引入更特异的方法。
CRISPR/Cas12a系统是在细菌免疫系统中发现的，已广泛应用于核酸检测、蛋白质检测和小分子检测。当CRISPR/Cas12a与互补DNA结合时，可激活crRNA的顺式切割和反式切割活性。其中，顺式切割活性切割互补DNA，而反式切割活性切割任意单链DNA。研究表明其反裂解活性可达17s-1。因此，CRISPR/Cas12a系统不仅对依赖的crRNA具有高特异性，而且对依赖于其横切活性的crRNA具有高敏感性。先前的研究发现，与单独的扩增技术相比，CRISPR/Cas12a的参与可以将灵敏度提高高达100倍。这为检测低丰度样品提供了一种灵敏的方法。
引起牛结节性皮肤病的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)发病率高，传染性强，给畜牧业带来了巨大的经济损失。LSDV与山羊痘病毒(GTPV)和羊痘病毒(SPPV)同属牛痘病毒，同源性高达97％。很难把他们区分开来。LSDV损害皮毛，导致产奶量急剧下降。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health)将其归类为须报告的动物流行性出血热，中国将其归类为2类动物疫病。然而，目前还没有有效的治疗方法，因此LSDV的识别和监测、对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。
发明内容
本发明开发了一种超快速无需核酸提取的方法检测LSDV。基于RoomTemp样品裂解试剂盒，超快速qPCR在15min和50s内完成核酸扩增，无需核酸提取。这大大减少了测试过程，比传统的qPCR少64分钟。超快速qPCR的检出限为2.5×103copies·μL-1。为了进一步提高灵敏度，本发明介导CRISPR/Cas12a检测超快速PCR产物。检出限低至2×101copies·μL-1。因此，无需核酸提取的超快速PCR与CRISPR/Cas12a结合，节省了时间和试剂成本，提高了灵敏度和特异性。在核酸检测中具有广阔的应用前景。目前国内外尚无超快速PCR和CRISPR/Cas12a的无核酸提取步骤的LSDV检测方法。因此，建立了超快速PCR和CRISPR/Cas12a的无核酸提取步骤的LSDV检测方法，这对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。
为获得对LSDV更快速和灵敏的检测方法，本发明提供了超快速qPCR所用引物和探针，准确鉴定出LSDV。第一个目的是基于以上引物和探针构建超快速qPCR，并建立无核酸提取的直接扩增的分子并行检测方法。第二个目的是为提高灵敏度，用CRISPR/Cas12a结合超快速PCR提供更快速的、更特异的检测方法。第三个目的是为实现可视化检测，横向流动试纸条技术结合超快速PCR和CRISPR/Cas12a提供更加便携和可视化的方法。
为了实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：超快速无需核酸提取牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速qPCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示探针。
检测方法包括以下步骤：
裂解体系，样品裂解无需核酸提取：用RoomTemp Sample Lysis Kit裂解样品，样品中含有裂解缓冲液和稳定缓冲液。取2μL血液或细胞悬液加入20μL裂解缓冲液，室温孵育3min，然后加入20μL稳定缓冲液，得到靶标物，可直接用于后续检测。
超快速qPCR体系：由1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U SpeedSTAR HS DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混合物、正向引物、反向引物和探针5μM各1μL、2μL ddH2O和1.5μL靶标物组成。扩增程序为：95℃扩增1min；40个循环：95℃3s和58℃4s。扩增过程需要15min 50s。
结果判定：在40个循环中出现荧光信号为阳性；无荧光信号为阴性。
为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案是：超快速无需核酸提取牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，Fast BufferⅠ、SpeedSTAR HS DNA聚合酶、dNTP混合物，LbCas12a，Reaction缓冲液，超快速PCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物，CRISPR/Cas12a体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的crRNA、和核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的ssDNA reporter。
检测方法包括以下步骤：
取2μL血液或细胞悬液加入20μL裂解缓冲液，室温孵育3min，然后加入20μL稳定缓冲液，得到靶标物，可直接用于后续检测。
超快速PCR体系：1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U SpeedSTAR HS DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混合物、正向引物和反向引物5μM各1μL、3μLddH2O和1.5μL靶标物组成。扩增程序为:95℃扩增1min；35个循环:95℃3s和58℃4s。扩增过程需要14min。
CRISPR/Cas12a体系：1μM LbCas12a 2μL、1μM的crRNA 2μL、10×Reaction缓冲液2μL、15μM ssDNA reporter 1μL、4μL超快速PCR产物和9μL ddH2O。将混合物快速放入荧光恒温仪GS8中，37℃恒温30min。
结果判定：出现荧光信号为阳性；无荧光信号为阴性。
为了实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：在第二个技术方案的基础上还包括试纸条和LFD-ssDNA reporter。
检测方法包括以下步骤：
取2μL血液或细胞悬液加入20μL裂解缓冲液，室温孵育3min，然后加入20μL稳定缓冲液，得到靶标物，可直接用于后续检测。
超快速PCR体系：1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U SpeedSTAR HS DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混合物、正向引物和反向引物5μM各1μL、3μLddH2O和1.5μL靶标物组成。扩增程序为:95℃扩增1min；35个循环:95℃3s和58℃4s。扩增过程需要14min。
CRISPR/Cas12a体系：1μM LbCas12a 2μL、1μM的crRNA 2μL、10×Reaction缓冲液2μL、15μM LFD-ssDNA reporter 1μL、4μL超快速PCR产物和9μLddH2O，37℃反应30min。然后加入30μL ddH2O，将试纸条插入其中。室温孵育2min，观察结果
结果判定：试纸条上同时出现T线和C线或者仅有T线为阳性，只有C线则为阴性。
SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：ATCTGCTACAAGTTTTAACGAACTTA。
SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：TGAATGTGATCTCATATCCTTATTG。
SEQ ID NO.3的核苷酸序列为：
FAM-TAAAAAAAGAAAAAAAAAAAGGC-BHQ1。
SEQ ID NO.4的核苷酸序列为：
AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAAAAAAAGAAAAAAAAAAAG。
SEQ ID NO.5的核苷酸序列为：
FAM-TATTATT-BHQ1
本发明的优点包括：(1)、基于超快速qPCR的分子并行检测方法在15min50s内完成了40个循环，比起传统的qPCR，极大地缩短了时间；(2)、分子并行检测方法实现了无核酸提取和纯化，省略了繁琐复杂的步骤和昂贵的提取纯化试剂；(3)、高灵敏度：超快速PCR的高效扩增结合CRISPR/Cas12a的反式切割活性的信号放大能力使得方法有高的灵敏度，时间检测限低至20copies·μL-1。高的灵敏度可以解决由于丰度低造成的假阴性现象。(4)高特异性：特异性高的引物结合CRISPR体系的crRNA保障了方法的特异性，避免由非特异性扩增带来的假阳性；(5)、鉴定简便：试纸条检测结果均可用肉眼识别；(6)、用途广：可广泛用于LSDV检测；(7)便捷：UF-150体型小且便携，并且试纸条可以实现LSDV的即时检测(POCT)。
附图说明
图1利用荧光信号(A)和LFD(B)进行LSDV检测的超快速qPCR检测结合CRISPR/Cas12a的原理；
图2引物的扩增区与探针和crRNA的靶区；
图3筛选酶及检测仪器用于超快速qPCR；
图4超快速qPCR的条件优化。(A)退火温度优化。(B)退火时间优化。(C)引物浓度。(D)探针浓度；
图5超快速qPCR的性能。超快速qPCR(A)和常规qPCR的操作步骤(B)。(C)、(D)、(E)不同浓度样品经过不同循环后的结果。(F)不同浓度样品的常规qPCR结果；
图6超快速qPCR的选择性分析(A)和重复性；
图7CRISPR/Cas12a系统的条件优化。(A)Cas12a的浓度。(B)crRNA的浓度。(C)荧光中ssDNA报告基因的浓度。(D)LFD试验中ssDNA报告探针的浓度；
图8CRISPR/Cas12a超快速PCR检测LSDV的性能。琼脂糖凝胶电泳结合超快速PCR(A)和常规PCR(B)检测不同浓度LSDV的结果。CRISPR/Cas12a系统与超快速PCR(C)和常规PCR(D)结合的LSDV荧光光谱。紫外灯下CRISPR/Cas12a系统与超快速PCR(E)和常规PCR(F)结合的图像。1～7个样品为2×104、1×104、2×103、1×103、2×102、1×102、2×101copies·μL-1,8为对照组；
图9利用CRISPR/Cas12a对LSDV检测进行LFD的性能(A)和选择性分析(B)。CRISPR/Cas12a结合超快速PCR方法的选择性分析(C)和重复性(D)；
图10(A)超快速PCR结合CRISPR/Cas12a检测真实样品的热图。(B)实际样品在紫外光下的荧光。(C)实际样品的LFD测定结果；
图11采用SN/T-5197-2019标准方法对40个样品进行检测。
具体实施方式
本发明的原理是：快速、灵敏地检测LSDV对预防和控制疫情具有重要意义。在此，本发明建立了一种无需核酸提取的超快速PCR方法。如图1(A)所示，样品可以通过RoomTempSample Lysis kit直接用于超快速PCR，该试剂盒包含裂解缓冲液和稳定缓冲液。样品在室温裂解后，有许多物质抑制PCR或qPCR。稳定缓冲液中含有保护蛋白和稳定因子，可以消除裂解样品中抑制剂对下游qPCR和PCR反应的抑制作用。保证了裂解后的DNA溶液能长期稳定保存。因此，基于RoomTemp Sample Lysis kit该方法减少了提取和纯化核酸的繁琐步骤，大大减少了检测时间、人力成本和材料成本。在图2中，LSDV在VARV B22R基因上增加了36-38bp，而同一属的GTPV和SPPV则没有。基于这一差异，探针被设计，探针和引物的核苷酸序列见表1。使用超快速PCR仪UF-150可在15min和50s内完成40个循环并收集荧光信号，在14min内完成35个循环。这比传统的qPCR缩短了四分之三的时间。这要归功于UF-150的快速加热和冷却速度以及超薄芯片，这使得加热更加均匀。
为了提高方法的灵敏度，介导了CRISPR/Cas12a。图1(B)中，CRISPR/Cas12a通过PAM位点和crRNA识别扩增产物。crRNA设计用于36-38bp区域，其核苷酸序列见表1。Cas12a的反式切割活性被激活以切割附近的ssDNA报告探针。在ssDNA报告探针的两端修饰荧光团FAM和猝灭剂BHQ1。探针被Cas12a剪切后，FAM远离BHQ1，产生大量荧光。因此，CRISPR/Cas12a不仅通过PAM位点和crRNA提高了方法的特异性，而且通过反式切割活性提高了方法的敏感性。在紫外灯下可以清楚地看到荧光信号。此外，通过介导横向流动试纸条(LFD)实现可视化检测，极大方便了工作人员。探针两端修饰用生物素和FAM。在LFD上，Au-anti-FAM、链亲和素和Au-anti-FAM分别附着在吸收垫、C线和T线上。因此，完整的探针被捕获在C线上。而被Cas12a剪切的带有FAM探针被截获在T线上。所以当目标出现时，LFD上会出现两条线；当靶标不存在时，LFD只在C线上有条带。
表1
实施例1，超快速PCR酶及仪器的筛选
为了筛选出最有效的超快速PCR酶，在超快速PCR程序下验证了三种常用的酶。在图3中，对相同浓度的样品扩增SpeedSTAR HS DNA聚合酶(HS)、2×Ex Taq(Probe qPCR)MIX(Taq)和Premix Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye(V2)。显然，在不同的扩增工具下，HS的条带都是最亮的，说明HS在超快速PCR程序下的扩增效率最高。其他酶的扩增效率均低于HS。因此，将HS作为后续检测的最佳扩增酶。此外，超快速PCR的反应时间还取决于装置上升和冷却的速度。ABI Pro Flex TM PCR扩增器的最大温度变化率为6℃/s,32个循环需要29min和52s。ABI 7500快速荧光定量PCR仪最大温度变化率为5.5℃/s,32个循环22min。480Ⅱ最大温度变化率为4.4℃/s，冷却速率为2.2℃/s,32次循环耗时27min。虽然它们的反应时间比传统PCR短得多，但还不够。我们采用便携式UF-150快速荧光定量PCR仪，加热速度为8℃/s，冷却速度为8℃/s，超薄芯片使温度更加均匀稳定。可在12分56秒内完成32个循环。与传统PCR相比，速度提高了20倍，反应时间大大缩短。因此选择UF-150快速荧光定量PCR仪进行随后的研究。然而，利用UF-150进行扩增时，只有HS产生了显著的条带，其他的都没有。造成这种现象的原因可能是仪器上升和冷却过快，酶的效率下降。因此采用HS和UF-150进行后续超快速PCR。
实施例2，超快速qPCR条件优化
采用两步法进行超快速qPCR。首先，通过琼脂糖凝胶电泳研究了温度对PCR扩增率的影响。如图4(A)所示，当温度达到58℃时，条带亮度达到最大值。随着温度的升高，由于引物与靶物的组合太不稳定，产物越来越少。因此58℃为最佳温度。并对退火时间进行了优化。在图4(B)中，产品的亮度从1s增加到4s,5s的产品与4s的产物的条带亮度相同。这表明，4s足以HS酶产生足够的产物。因此，4s是最优退火和延伸时间。此外，引物的浓度影响产物的数量。图4(C)显示，当引物长度大于5μM时，也会产生类似的结果。为节省成本，引物浓度选择5μM为最佳。同时，探针的浓度影响超快速qPCR的效果。图4(D)显示，当浓度达到5μM时，荧光强度达到最大。因此，最佳探针浓度为5μM。
实施例3，超快速qPCR的性能
超快速qPCR依赖于带有超薄芯片的UF-150。在图5(A)中，使用RoomTemp SampleLysis kit处理后的样品直接添加到芯片上。该芯片可同时检测10个样品，包括上样孔和通气孔。UF-150可在15分钟50秒内完成40个循环的信号采集。而传统方法需要提取纯化试剂盒、水浴锅和离心机完成核酸提取，再使用qPCR进行检测。如图5(B)所示，整个过程耗时80分钟，非常耗时。因此，超快速qPCR具有更大的应用潜力。如图5(C)所示，随着浓度的降低，荧光强度逐渐降低。该方法在15min和50s内完成40个循环，可以检测到的最低浓度为2.5×103copies·μL-1。图5(D)展示UF-150在14min内完成35个循环时，具有明显信号的最低浓度为2.5×104copies·μL-1。图5(E)显示UF-150在12min12秒完成30个周期时，该方法可以检测到中的最低浓度是2.5×105copies·μL-1。在图5(F)中，常规qPCR在60min和50s内检测到5×102copies·μL-1。超快速qPCR的实际检出限是传统qPCR的5倍。原因有在RoomTemp样品裂解试剂盒快速裂解样品时，核酸未全部释放，导致信号低；此外，UF-150具有快速上升和冷却的能力，这不利于温度稳定，导致扩增酶的效率较低。虽然它的灵敏度不如传统方法，但它非常快速方便。它适合随时随地检测。
实施例4、超快速qPCR方法的选择性和重复性分析
用LSDV、GTPV、SPPV、RPV、PCV、PRRSV和FMDV等不同的病毒采用超快速qPCR方法验证了该方法的选择性。图6(A)显示，只有LSDV出现了显著信号，其他病毒的信号与对照组相同。这表明引物和探针对LSDV具有较高的选择性。
为了验证超快速qPCR的重复性，由不同的实验人员进行了5次实验。荧光光谱在图6(B)中几乎重叠。结果表明，不提取核酸的超快速qPCR检测LSDV是可靠的。
实施例5、CRISPR/Cas12a系统的条件优化
作为信号输出，Cas12a、crRNA和ssDNA报告探针的浓度对CRISPR/Cas12a系统的有效性有显著影响。图7(A)显示，随着Cas12a浓度的增加，荧光强度迅速上升。当浓度达到1μM时，荧光强度达到峰值。结果表明，Cas12a的最佳浓度为1μM。图7(B)显示当crRNA浓度达到1μM时，荧光强度达到最大值。因此，crRNA的最佳浓度为1μM。图7(C)当ssDNA报告探针浓度达到15μM时，荧光强度达到最大值，因此选择15μM作为ssDNA报告基因的最佳浓度。此外，在LFD检测中，LFD-ssDNA报告基探针的浓度会影响条带的亮度。它的浓度过大会产生背景信号，而浓度过小又会导致信号饱和。如图7(D)所示，当浓度达到15μM时，在Test line(T线)上出现了明显的线条。当浓度为20μM时，其亮度与15μM相近，因此15μM为LFD实验的最佳浓度。
实施例6、基于超快速PCR和CRISPR/Cas12a的方法的性能
为了进一步验证超快速PCR是否在追求速度的过程中失去了灵敏度，用琼脂糖凝胶电泳分别结合超快速PCR和常规PCR检测不同浓度的核酸。在图8(A)和(B)中，条带的亮度随着浓度的降低而不断降低。当浓度低至2×102copies·μL-1时，无明显条带，与对照组相似。因此，超快速PCR与传统PCR结合琼脂糖凝胶电泳法的实际检出限为2×103copies·μL-1。超快速PCR的检出限与常规PCR相同。虽然它们都可以检测到低至2×103copies·μL-1的核酸，但超快速PCR产生的产物比传统PCR少，特别是对于低浓度的样品。这与超快速qPCR的原因相同。综上所述，超快速PCR可以在不降低灵敏度的情况下大大缩短检测时间。为了进一步提高灵敏度，CRISPR/Cas12a系统被介导对LSDV检测。在最优条件下，利用超快速PCR与CRISPR/Cas12a偶联检测不同浓度的2×104、1×104、2×103、1×103、2×102、1×102、2×101copies·μL-1核酸(各浓度分别对应图8(C)-(F)中的数字1-7，8为对照组)。在图8(C)中，荧光强度随着浓度的降低而降低。2×101copies·μL-1的荧光信号与对照组有显著差异。因此，结合CRISPR/Cas12a的超快速PCR实际检出限低至2×101copies·μL-1。图8(E)紫外线灯也得到了同样的结果。CRISPR/Cas12a比琼脂糖凝胶电泳的灵敏度高100倍。它的检测限低于标准qPCR 25倍。CRISPR/Cas12a的反式切割活性提高了方法的灵敏度，简化了操作。采用常规PCR方法对不同浓度的样品进行检测。在图8(D)和(F)中，也得到了相同的趋势。荧光强度随浓度的降低而降低。其实际检出限低至2×101copies·μL-1。这与超快速PCR的灵敏度相同。综上所述，超快速PCR结合CRISPR/Cas12a达到了加速反应而不失灵敏度的目的。更重要的是，该方法不需要核酸提取和纯化，进一步节省了时间和试剂成本。此外，利用LFD结合CRISPR/Cas12a检测超快速PCR产物。如图9(A)所示，浓度为2×102～2×106copies·μL-1的样品在T线上都有明显的条带，而浓度为1×102copies·μL-1的样品与对照组结果相同。因此，LFD的实际检出限低至2×102copies·μL-1。基于LFD的超快速方法可以在短时间内完成信号输出，实现视觉检测。
实施例7、基于超快速PCR和CRISPR/Cas12a的方法的选择性和重复性
以7种病毒为实验对象，探讨基于CRISPR/Cas12a与超快速PCR联用的方法的选择性。在图9(C)中可以清楚地看到，只有LSDV表现出高荧光，而其他病毒则没有。结果表明，采用超快速PCR技术的CRISPR/Cas12a具有高选择性，且不与其他病毒交叉。这得益于引物的选择性以及CRISPR/Cas12a基于PAM位点和crRNA的高选择性。进一步探讨了LFD法的选择性。在图9(B)中，只有LSDV在T线上有明显的条带，这验证了基于CRISPR/Cas12a的LFD检测对LSDV具有高选择性。
方法的重复性是该方法的一个重要参数。为了验证CRISPR/Cas12a与超快速PCR联用的可重复性，由不同的实验人员进行了5次实验。在图9(D)中，荧光光谱几乎重叠。结果表明，该方法对LSDV检测是可靠的。
实施例8、实际样本检测
采用RoomTemp Sample Lysis Kit处理40份血样，采用CRISPR/Cas12a结合超快速PCR检测。如图10(A)所示，1、6、7、19、20、30、31、33、35、37、38、39有明显荧光，均为阳性。而其他样本为阴性样本。图10(B)紫外灯下观察到同样的结果。此外，在图10(C)显示通过LFD分析，样品1、6、7、19、20、30、31、33、35、37、38和39在T线上有明显的条带，而其他样品中只有C线。LFD法与荧光法结果一致。此外，采用SN/T-5197-2019标准方法对样品进行检测，如图11所示，上诉样品呈阳性，其他样品呈阴性。结果一致，表明基于CRISPR/Cas12a的超快速PCR方法和LFD法具有较高的准确性和实用的样品检测潜力。

Claims (10)

1.超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速qPCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示探针。
2.根据权利要求1所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述裂解体系将血液或细胞悬液加入裂解缓冲液，然后加入稳定缓冲液，得到靶标物；
所述超快速qPCR体系包括：1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U DNA聚合酶、1.5μL 2mMdNTP混合物、正向引物、反向引物和探针5μM各1μL、2μLddH2O和1.5μL靶标物，扩增程序为：95℃扩增1min；40个循环：95℃3s和58℃4s。
3.根据权利要求2所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶选用SpeedSTAR HSDNA聚合酶。
4.根据权利要求2或3所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：结果判定为：在40个循环中出现荧光信号为阳性；无荧光信号为阴性。
5.超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速PCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物，CRISPR/Cas12a体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的crRNA、LbCas12a和ssDNA报告物。
6.根据权利要求5所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述裂解体系将血液或细胞悬液加入裂解缓冲液，然后加入稳定缓冲液，得到靶标物；
所述超快速PCR体系包括：1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U DNA聚合酶、1.5μL 2mMdNTP混合物、正向引物和反向引物5μM各1μL、3μL ddH2O和1.5μL靶标物；扩增程序为：95℃扩增1min；35个循环：95℃3s和58℃4s；
所述CRISPR/Cas12a体系包括：1μM LbCas12a 2μL、1μM的crRNA 2μL、10×Reaction缓冲液2μL、15μM ssDNA reporter 1μL、4μL超快速PCR产物和9μL ddH2O。
7.根据权利要求6所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶选用SpeedSTAR HSDNA聚合酶。
8.根据权利要求6或7所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。
9.根据权利要求5所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：还包括试纸条和LFD-ssDNA reporter；
所述裂解体系将血液或细胞悬液加入裂解缓冲液，然后加入稳定缓冲液，得到靶标物；
所述超快速PCR体系包括：1μL 10×Fast BufferⅠ、1μL 0.25U DNA聚合酶、1.5μL 2mMdNTP混合物、正向引物和反向引物5μM各1μL、3μL ddH2O和1.5μL靶标物；扩增程序为：95℃扩增1min；35个循环：95℃3s和58℃4s；
所述CRISPR/Cas12a体系包括：1μM LbCas12a 2μL、1μM的crRNA 2μL、10×Reaction缓冲液2μL、15μM LFD-ssDNA reporter 1μL、4μL超快速PCR产物和9μL ddH2O。
10.根据权利要求9所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：结果判定：试纸条上出现T线和C线或者仅有T线为阳性，只有C线则为阴性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117987601A (zh) * 2024-04-07 2024-05-07 山东农业大学 一种牛结节性皮肤病病毒的检测试剂盒及应用

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