CN113493846B - 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法 - Google Patents

柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明提供的检测试剂盒包括一条正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，一条反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，一条特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，可用于快速高效完成柑桔黄龙病菌检测，检测灵敏度可达到10copies/μL，特异性非常好，与柑桔黄龙病菌以外的菌株均无交叉反应，操作更简便快速，无需电泳检测，避免核酸扩增产物开盖污染的风险，适宜于柑桔黄龙病菌的快速检测。

Description

柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法
本发明要求以申请日为2020年06月18日，申请号为2020105604821，名称为“柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法”的发明专利申请为优先权。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌分子荧光RAA 检测引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术
柑桔黄龙病是一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和枳属等柑桔类植株。由菌种苗远距离传播，田间主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。
引起柑桔黄龙病毒的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄龙病韧皮杆菌Candidatus Liberibacter africanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter americanus和分布于亚洲及北美洲的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus。
柑桔黄龙病的检测方法，自1919年柑桔黄龙病在华南地区被发现以来，有效的诊断技术逐渐成了柑农以及科研工作者高度关注的话题。柑桔黄龙病毒检测技术也经历了漫长的探索过程，到目前为止，该病原的检测方法有很多，主要包括传统检测法、分子生物学检测法等。田间诊断法作为传统的诊断法，曾是检测黄龙病毒的唯一方法，凭借着简单易行、无需任何专业设备等优势在黄龙病毒检测中占有一定的地位，该方法仅需对待检柑橘的叶面及果实特征、传播情况等多方面的情况进行综合考虑，及可以做出诊断结果。但由于黄龙病本身的复杂性等特点，使其容易与其他症状相混淆，误判率高。通常被作为黄龙病的初步诊断技术，不适于黄龙病毒准确诊断。
柑桔黄龙病的分子检测方法目前以荧光PCR法为主，该方法无需开盖，避免了核酸检测过程中的污染风险，而且其检测灵敏度和特异性都要优于其他方法。但该方法需要与专业的实时荧光PCR仪配合使用，使得检测仪器成本很高，而且对实验操作人员有较高的要求。荧光RAA法是一种重组酶介导的核酸链扩增技术，相比荧光PCR技术，荧光RAA 法无需模板的热变性、温度的循环，更适合在有大量样品的非实验室进行检测，更适合现场检测。
急需找到可用于检测柑桔黄龙病的高灵敏度、高特异性、检测速度更快的荧光RAA检测方法，使柑桔黄龙病能够实现更便捷、更精准的现场检测。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种针对柑桔黄龙病菌进行高灵敏度和高特异性的荧光RAA检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，所述特异性荧光探针的序列中间标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团以及四氢呋喃，3’端标记有C3 Spacer。
进一步地，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、 Dabcy1或Tamra中的一种。
进一步地，所述特异性荧光探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基因为BHQ1。
进一步地，所述柑桔黄龙病菌RAA检测的靶基因质粒序列如SEQ ID NO.8所示。
另一方面，本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组。
进一步地，所述检测试剂盒还包括RAA反应混合液、柑桔黄龙病菌核酸阳性参考品和ddH2O。
进一步地，所述柑桔黄龙病菌核酸阳性参考品为柑桔黄龙病菌Las基因部分序列的阳性质粒。
进一步地，所述含有柑桔黄龙病菌Las基因的阳性质粒的部分序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述RAA反应混合液包括120ng/μL SSB蛋白、100ng/μL recA重组酶蛋白、 40ng/μL Rad51、30ng/μL BsμDNA聚合酶、1mmol/L dNTP、400nmol/L引物混合液、100nmol/L探针混合液、280mmol/L MgAC、20％PEG。
再一方面，本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测方法，包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如上所述的检测试剂盒进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光扩增曲线分析待测样本，确定待测样本中是否存在柑桔黄龙病菌。
具体如下：提取待测样品的DNA，以待测样品的DNA为模板，在柑桔黄龙病菌的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA反应混合液存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述柑桔黄龙病菌正向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述柑桔黄龙病菌反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，探针的序列中间标记有FAM荧光报告基团、BHQ1荧光淬灭基团以及四氢呋喃(THF)，3’端标记有C3 Spacer。
进一步地，所述实时荧光RAA反应程序为：39℃，1min；39℃，30s(采集荧光)，共计40个循环。
进一步地，时荧光RAA反应结束后，可利用实时荧光仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。
进一步地，当待测样本FAM通道有明显的扩增曲线且CT值≤39，判断为柑桔黄龙病菌阳性结果；当待测样本无明显扩增曲线且CT值＞39，判断为柑桔黄龙病菌阴性结果。
作为本发明的第四方面，本发明提供了一组引物探针组在用于制备柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测试剂盒或用于检测柑桔黄龙病菌中的用途，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其中，所述特异性荧光探针的序列中间标记有FAM荧光报告基团、BHQ1荧光淬灭基团以及四氢呋喃(THF)，3’端标记有C3 Spacer。
本发明的有益效果为：
(1)快速高效：只需20min即可完成检测，时间为荧光PCR的1/5左右；
(2)高特异性：本发明与柑桔黄龙病菌以外的菌株均无交叉反应；
(3)高灵敏度：检测灵敏度可达到10copies/μL；
(4)鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，避免核酸扩增产物开盖污染的风险。
附图说明
图1为实施例1中涉及的3对引物RAA扩增曲线图
图2为实施例4中的RAA检测方法对柑桔黄龙病的灵敏度实验图，从左到右依次为103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL的阳性标准品的扩增结果
图3为实施例5中的RAA检测方法对柑桔黄龙病的特异性实验图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。在本发明中，若无特别指明，实施例中采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。
实施例1：柑桔黄龙病菌分子的荧光RAA检测引物探针组的设计
本研究参考GenBank上已公布的柑桔黄龙病菌核酸序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，分别选择该菌基因组中特异性高、较为保守的片段作为目的基因。大量实验表明，不同的引物对RAA扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本研究针对目的基因片段初步设计了3条上游引物、3条下游引物和1条探针(引物序列如表1所示)，分别为Las-1、Las-2、Las-3，引物探针序列可和柑桔黄龙病菌基因组的相应序列特异性结合。其中，上述引物扩增目的片段的大小分别为160bp、168bp、128bp。分别将设计的引物探针用阳性质粒进行引物探针筛选，引物探针的扩增曲线如图1所示。
表1 Las-1、Las-2和Las-3
由图1结果可见，Las-2引物探针配对组的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高(纵坐标值)并且有明显的指数期和平台期，其它引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，相对表现较差。说明Las-2引物探针组扩增反应效率更高。
实施例2：柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测试剂盒及检测方法
本实施例提供的柑桔黄龙病菌分子的荧光RAA检测试剂盒，包括引物混合液、RAA反应混合液、柑桔黄龙病菌基因阳性参考品和ddH2O。
其中的RAA反应混合液的成分如下：120ng/μL SSB蛋白、100ng/μL recA重组酶蛋白 (SC-recA/BS-recA)、40ng/μL Rad51、30ng/μL BsμDNA聚合酶、1mmol/L dNTP、400nmol/L 引物混合液、100nmol/L探针混合液、280mmol/L MgAC、20％PEG。
所述的引物混合液中的引物探针组采用实施例1中的Las-2，所述正向引物碱基序列如 SEQ ID No.4所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID No.5所示，其中，正向引物和反向引物的摩尔配比为1:1。
特异性探针碱基序列如SEQ ID No.3所示，探针的序列中间标记有FAM荧光报告基团、BHQ1荧光淬灭基团以及四氢呋喃(THF)，3’端标记有C3 Spacer。
所述的柑桔黄龙病菌基因阳性参考品包含有柑桔黄龙病菌Las基因组保守区序列的阳性质粒，所述含有柑桔黄龙病菌Las基因的阳性质粒的部分序列如SEQ ID NO.8所示。
应用本实施例提供的试剂盒对样本中的柑桔黄龙病菌进行检测，检测步骤如下：
1、样品核酸的提取
1.1、核酸提取：采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明步骤提取待测样本基因组DNA。
2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应管，每个RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。
表2 反应体系配置表
RAA反应体系组分 体积(μL)
RAA反应干粉 1管
20％PEG 45.5
280mM MgAC 2.5
模板DNA 2
总体积 50 
3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA扩增：39℃，1min；39℃30s(荧光采集)，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。
4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定待检样本结果。
待测样本FAM通道扩增曲线呈“S”型且CT值≤39，判断为柑桔黄龙病菌阳性结果；当待测样本无明显扩增曲线且CT值＞39，判断柑桔黄龙病菌阴性结果。
实施例3：应用本发明的试剂盒进行实际样本检测
为验证本发明所述引物、探针、试剂在实际情况下能正常使用，于是模拟实际情况，使用实施例2提供的试剂盒对实际样本进行检测。实际样本由青岛农业大学动物健康检测与评价中心提供，共12份，其中4份为柑桔黄龙病菌阳性叶片样本、4份为柑桔黄龙病菌阴性样本。检测结果与已知PCR检测结果一致，符合率100％。
可见本发明具有快速、实时、灵敏、准确的检测柑桔黄龙病菌的优点。
实施例4：本发明的试剂盒灵敏度试验
提取柑桔黄龙病菌阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并分别按比例稀释到103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL 4个浓度梯度，采用实施例2 提供的试剂盒，进行灵敏度试验。
检测结果如图2所示，从左到右依次为103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、 100copies/μL的扩增结果，从中可以看出本发明的荧光RAA扩增试剂的检测灵敏度可达101copies/μL，表明本发明的荧光RAA检测试剂盒和检测方法对柑桔黄龙病菌的检测诊断具有高度的灵敏性。
实施例5：本发明的试剂盒的特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实施例2提供的试剂盒，分别对柑桔植株常见引起病害的病原体进行检测，分析本发明的试剂盒的检测特异性。
检测结果表明：仅柑桔黄龙病菌出现正常扩增，阴性对照(ddH2O)及柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus)、柑桔麻风病毒(Citrus leprosies virus)、柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus)、柑桔裂皮病类病毒(Citrus excortis viroid)、柑桔鳞皮病毒(Citrus psorosis virus)、温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus)、柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri pv.citri)、木质部难养菌(Xylella fastidiosa)、桔茎点霉(Phoma tracheiphila)样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明荧光RAA检测试剂盒能特异性扩增出柑桔黄龙病菌中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。
同时，采用实施例1提供的Las-1和Las-3的引物探针组进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好地特异区分不同的样本，特异性不是很好(具体实验数据略)。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 南宁众册生物科技有限公司
<120> 柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法
<150> 2020105604821
<151> 2020-06-18
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattagtgtt gcgcaaatta aagatcttcg g 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaatagaca attagagact gcccaacgaa 30
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtctcgtc aagattgcta tccgtgatac aattagagga atatc 45
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagatgcggg aagctggtgg aggtgtaaaa g 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaaaagcta accgaaattt taggagcaat a 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaagctggt ggaggtgtaa aagttgccaa 30
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caggactatc cgaatagaca attagagact g 31
<210> 8
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaggaaaga gcgtagaaat ttctgaatta agtaagattt tttcttcttc tggatcaatt 60
gttgttgcac attataaggg aattagtgtt gcgcaaatta aagatcttcg gaaaaagatg 120
cgggaagctg gtggaggtgt aaaagttgcc aaaaatcgtc tcgtcaagat tgctatccgt 180
gatactagta ttagaggaat atctgatctt ttcgttgggc agtctctaat tgtctattcg 240
gatagtcctg ttattgctcc taaaatttcg gttagctttt caaatgacaa taatgaattt 300
agagttcttg gtggggttgt agagaagggc gtccttaatc aagattctat caagcaaatt 360
gcttctttac ccgatcttga gg 382

Claims (7)

1.一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下的用于扩增靶基因质粒序列SEQ ID NO.8的引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，所述特异性荧光探针的序列中间标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团以及四氢呋喃，3’端标记有C3 Spacer；所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RAA反应混合液、柑桔黄龙病菌核酸阳性参考品和ddH2O。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄龙病菌核酸阳性参考品为柑桔黄龙病菌Las基因部分序列的阳性质粒。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述含有柑桔黄龙病菌Las基因的阳性质粒的部分序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RAA反应混合液包括120ng/μLSSB蛋白、100ng/μL recA重组酶蛋白、40ng/μL Rad51、30ng/μL BsμDNA聚合酶、1mmol/LdNTP、400nmol/L引物混合液、100nmol/L探针混合液、280mmol/L MgAC、20％PEG。
6.一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样本的DNA，以待测样本的DNA为模板，采用如权利要求1～5任一项所述的检测试剂盒进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光扩增曲线分析待测样本，确定待测样本中是否存在柑桔黄龙病菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RAA反应程序为：39℃，1min；39℃，30s，采集荧光，共计40个循环。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690759A (zh) * 2020-08-04 2020-09-22 西南大学 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107354224A (zh) * 2017-08-31 2017-11-17 中国检验检疫科学研究院 一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法
CN112280879A (zh) * 2020-11-17 2021-01-29 广东省农业科学院植物保护研究所 一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用
CN112391493A (zh) * 2020-12-10 2021-02-23 浙江省检验检疫科学技术研究院 柑橘黄龙病亚洲种的raa荧光检测方法、引物探针及试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111690759A (zh) * 2020-08-04 2020-09-22 西南大学 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法

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