CN111690759A

CN111690759A - 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111690759A
Application number: CN202010772043.7A
Authority: CN
Inventors: 宋震; 周常勇; 马志敏; 段玉; 许建建; 宾羽
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111690759B

Abstract

本发明公开了一种柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物，序列为：上游引物：5’‑GTTGGTGTCGTCGCTTGTATGGACTATAGT‑3’，下游引物：5’‑GCCGCGCACGGGTGCAAAAAATCTTCAACTTC‑3’。还公开了含有该特异引物的柑橘溃疡病菌RPA检测试剂盒，及一种柑橘溃疡病菌RPA检测的方法：1)提取待测样品基因组DNA；2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所用特异引物为权利要求1中所述的特异引物；3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。本发明方法具强特异性和高灵敏等特点，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单。

Description

柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物、试剂盒和方法。

背景技术

柑橘是世界也是我国最大的水果产业，柑橘溃疡病(Citrus canker)是由柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citri ssp.citri，Xcc)引起的一种破坏性极强的检疫性细菌病害。感染该菌的柑橘叶片、枝条、果实等出现溃疡病斑症状，导致落叶落果、树势衰退，严重影响柑橘产业发展。近年来，随着我国晚熟杂柑的迅猛发展，因引种繁殖材料及苗木的不规范，大大加剧了此病的传播。Xcc一般在柑橘树枝或叶形成的病斑上越冬，第二年春天在病斑上繁殖后形成初级传染源，田间多经自然风雨或潜叶蛾等传播，气孔、皮孔或伤口是其主要入口，侵染新叶成为新的病斑，形成二次传染源，再次传染到新的夏秋梢形成病斑，在新的病斑进行下次越冬，以此形成病害循环。对此病的田间防控，在疫区多采用化防与农业防治措施相结合的综防措施；在非疫区，应严格实施检验检疫，而这些措施的实施往往与溃疡病的检测密切相关。

传统溃疡病检测有症状目测法、病理组织切片法、病原菌分离培养等，后来又发展了血清学检测方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、斑点免疫结合法和A蛋白酶联法等，这些方法大多需时长，有的需用酶联检测仪，其灵敏度也有待提升。本世纪以来，发展了分子检测方法，如普通PCR、实时PCR以及LAMP等。普通PCR和实时PCR法需要PCR仪，操作实施时均耗时费力，对操作技巧、试验仪器的要求较高，限制了基层的使用；而LAMP需要复杂的探针设计和较长的反应时间。因此，研究快速简便的检测方法对柑橘溃疡病的检验检疫和繁殖无病苗木具有现实意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种新型恒温扩增技术，在25-43℃恒温条件下反应5-20min就可以扩增出检测产物。该技术具有反应快速、灵敏、特异性高等强等特点，且不需要昂贵的变温实验仪器，被认为是一种可以替代PCR的新型核酸扩增技术。RPA技术的关键在于引物的设计。目前对于柑橘溃疡病菌的RPA检测尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物，所述特异引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-GTTGGTGTCGTCGCTTGTATGGACTATAGT-3’，

下游引物：5’-GCCGCGCACGGGTGCAAAAAATCTTCAACTTC-3’。

本发明的另一方面提供一种柑橘溃疡病菌RPA检测试剂盒，含有上述的特异引物。

所述柑橘溃疡病菌RPA检测试剂盒，还含有植物总核酸提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阴性对照、阳性对照。

本发明的又一方面提供一种柑橘溃疡病菌RPA检测的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所用特异引物为权利要求1中所述的特异引物；

3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。

在上述方法中，RPA反应的反应体系包含：在反应体系中的终浓度为0.2～0.5μmol·L^-1的上\下游引物，样品基因组DNA，RPA扩增反应试剂。

优选地，所述上\下游引物在反应体系中的终浓度为0.4μmol·L^-1。

在上述方法中，RPA反应条件为：反应温度为37～42℃，反应时间为10～50分钟。

优选地，RPA反应条件为：反应温度为39℃，反应时间为30分钟。

在上述技术方案中，所述步骤3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。

进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到231或232bp的条带即表明待测样品是阳性样品。

本发明的有益效果是：首次将RPA技术应用于柑橘溃疡病菌的检测，建立了RPA快速检测体系，该检测体系与柑橘衰退病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘裂皮类病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘黄龙病菌、温州蜜柑萎缩病毒等常见柑橘病原均无交叉反应，特异性强；与已报道的Xcc普通PCR和实时PCR检测技术相比，其灵敏度是普通PCR的100倍，与实时PCR灵敏度相当；利用该体系对71个未知送检样品进行检测，RPA检测结果与PCR、实时PCR检测结果一致，表明其有良好的适用性。

RPA技术最大的优点在于恒温反应，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单。有报道表明不利用任何仪器设备，仅靠人体体温即能完成RPA反应(Crannell Z A et al.，2014)，这大大增强了该技术在基层的推广使用。本研究建立的柑橘溃疡病菌RPA检测方法在兼具强特异性和高灵敏等特点的同时，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，尤其适合在基层或者实验条件不足的实验室进行柑橘溃疡病菌的快速检测，对柑橘溃疡病的检验检疫和繁殖无病苗木具有现实意义。

附图说明

图1是柑橘不同病原侵染样品的(RT-)PCR检测结果，其中，M：DNA maker；1：Xanthomonas citri ssp.citri；2：Candidatus Liberibacter asiaticus，；3：Citrusyellow vein clearing virus；4：Citrus leaf blotch virus；5：Citrus tatter leafvirus；6：Citrus exocortis viroid；7：Citrus psorosis virus；8：Satsuma dwarfvirus；9：Citrus tristeza virus。

图2是柑橘溃疡病菌RPA引物筛选结果，其中，M：DNA maker；1、4：柑橘溃疡病菌阳性样品；2、5：柑橘溃疡病菌阴性样品；3、6：ddH₂O。

图3是柑橘溃疡病菌RPA扩增产物的序列比对结果。

图4是柑橘溃疡病菌RPA检测体系的建立实验结果，其中，M：DNA maker，图A:引物浓度筛选；图B：反应温度筛选；图C：反应时间筛选。

图5是Xcc的RPA检测体系的特异性检测结果，其中，M：DNA maker；1：Xanthomonascitri ssp.citri；2：Candidatus Liberibacter asiaticus，；3：Citrus yellow veinclearingvirus；4：Citrus leaf blotch virus；5：Citrus tatter leaf virus；6：Citrusexocortis viroid；7：Citrus psorosis virus；8：Satsuma dwarf virus；9：Citrustristeza virus；10：ddH₂O；11：正对照。

图6是RPA、普通PCR和实时PCR检测柑橘溃疡病菌的灵敏度检测结果，M：DNAmaker，10^-1～10^-7：稀释倍数；图A：RPA；图B：普通PCR；图C：实时PCR。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂及仪器

样品材料：感染了柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas)、柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)、柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)、柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)、柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosisvirus，CPV)、温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus，SDV)和柑橘衰退病毒(Citrustristeza virus，CTV)的阳性柑橘样品及健康对照材料，均由西南大学柑桔研究所国家柑桔苗木脱毒中心提供。送检样品来自于重庆万州、丰都等地。

主要试剂与仪器：

RPA试剂盒为英国TwistDx Inc公司产品，货号(S003ZC)，包含Rehydrationbuffer、醋酸镁。

2×Taq PCR Master Mix为Novoprotein Scientific Inc.(近岸蛋白质科技有限公司)产品，货号(E005-02)。

qPCR Master Mix为普洛麦格(Promega)公司产品，货号(A6001)。

Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒：品牌BIOER，货号(BSC13S1B)。

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号(DP441-H)。

PCR仪(Bio-metra Tgradient)、水平电泳槽(Sub-cell GT wide Mini，BioRad)。

1.2 样品核酸制备

感染了CYVCV、CTV、CLBV、CEVD、CTLV、CPV、SDV阳性样品，使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，进行反转录制备cDNA。感染了柑橘黄龙病菌、柑橘溃疡病菌阳性样品使用Biospin全能型植物基因组DNA提取试剂盒提取总核酸。用(RT-)PCR进行检测，将阳性样品核酸保存于-20℃冰箱备用。

1.3 RPA引物设计和筛选

根据已报道的柑橘溃疡病菌基因组序列(GenBank登录号：CP011827.1；CP013664.1)选取序列保守区，通过Primer Premier 5软件分别设计了2对引物：CA1-F/R、CA2-F/R(表1)。按照RPA试剂盒说明书的反应体系(总体积：50μL)，在含固体反应物的反应管中依次加入上下游引物(10μmol·L^-1)各2.5μL，Rehydration buffer 29.5μL，ddH₂O 11μL、总核酸2μL，充分混匀，再加入280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL，充分振荡混匀，瞬时离心10s，置于39℃金属浴上反应20min。RPA反应结束后，向反应物中加入等体积氯仿溶液50μL，轻轻涡旋混匀，10000rpm离心2min，吸取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，选出最佳引物。

本发明中Xcc的普通PCR、实时PCR、RPA检测所使用的引物及各引物序列如表1所示：

表1实验所用引物

1.4 RPA反应产物测序鉴定

为了确定RPA反应扩增产物是否为目的片段，将RPA产物经琼脂糖电泳分离后，切取目的条带，使用胶回收试剂盒纯化切胶产物，将其送往华大基因公司测序，将测序结果与参考基因序列进行比对，确定反应扩增产物是否为目的片段。

1.5 RPA体系优化

为了优化RPA反应体系，将“1.3RPA引物设计和筛选”选出的引物设置梯度浓度：0.1μmol·L^-1、0.2μmol·L^-1、0.3μmol·L^-1、0.4μmol·L^-1、0.5μmol·L^-1，既在反应体系中分别加入选出引物F/R各(10μmol·L^-1)：0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL，设定RPA反应温度为39℃，反应时间为10min，筛选最佳反应引物浓度。

在最适引物浓度下，设定反应时间为10min，设置反应梯度温度分别设定为：34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和40℃，选择最适反应温度。

再在最适引物浓度和最适温度下，设置反应时间梯度：10min、20min、30min、40min和50min，选择最适反应时间，最终确定最佳反应体系。

1.6 特异性评价

为了检测所建立的RPA检测体系是否会与其它常见柑橘病害发生交叉反应，用建立的RPA体系平行检测CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CLBV、CPV、SDV、CLas和Xcc阳性样品核酸，设置清水为阴性对照，评价所建RPA检测方法的特异性。

1.7 灵敏度评价

为了确定所建RPA检测体系的检测灵敏度，用总核酸浓度为857ng/μL的Xcc阳性样品分别进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍梯度稀释，设置模板相对浓度梯度，清水为阴性对照，用优化后的RPA、普通PCR及实时PCR进行平行检测，比较检测灵敏度。

普通PCR引物及检测体系：核酸2μL，10μml.L^-1的上下游引物canker F/R各0.3μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，ddH₂O 7.4μL。PCR反应条件：95℃2min；95℃15s，58℃15s，72℃15s，35个循环；72℃5min，12℃保存。

实时PCR体系及引物：核酸2μL，

qPCR Master Mix 10μL，10μmlL^-1Xac F/R07各0.4μL，加水补足20μL。PCR反应条件：95℃2.5min；95℃15s，60℃30s，40个循环。

1.8 田间样品检测

来自重庆丰都、万州等地的田间送检样品共71个。提取样品总核酸，分别采取RPA、普通PCR和实时PCR(qPCR)检测，检测体系同1.7，统计比较不同方法检测结果。

2 结果与分析

2.1 阳性样品的制备

使用试剂盒分别提取感染了Xcc、CLas、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CLBV、CPV、SDV的阳性样品的总核酸，进行(RT-)PCR检测，检查结果全为阳性(如图1所示)，可用于下一步实验。

2.2 RPA检测引物筛选

RPA引物筛选：以Xcc阳性样品的核酸为模板并设立健康样品和ddH₂O对照，用设计的2对引物CA1-F/R、CA2-F/R进行RPA检测。结果显示，两对引物均能在Xcc阳性样品中扩增出单一明亮目标条带，健康对照和水对照中无条带(如图2所示)。其中引物CA2-F/R条带更明亮更清晰，说明CA2-F/R检测效果更好，故选择引物CA2-F/R进行后续实验。

2.3 RPA扩增产物鉴定

将利用引物CA2-F/R获得的柑橘溃疡病菌RPA扩增产物，进行电泳并切胶回收、纯化，送测序公司测序。测序结果与参考基因序列(GenBank登录号：CP013664.1)进行比对，结果表明，所获RPA产物为231bp，与目标片段相比有一个碱基的缺失，与参考序列的同源性为99.57％(如图3所示)，说明利用引物CA2-F/R获得的RPA扩增产物为目标Xcc特异序列。

2.4 RPA体系优化

RPA引物浓度优化：设置选出的引物CA2-F/R(10μmol·L^-1)梯度浓度：0.1μmol·L^-1、0.2μmol·L^-1、0.3μmol·L^-1、0.4μmol·L^-1、0.5μmol·L^-1，并设定RPA反应温度为39℃，反应时间为10min。RPA结果表明，随着加入的引物体积增加，电泳条带亮度逐步增加，达到0.4μmol·L^-1时能够扩增出单一明亮条带，0.4μmol·L^-1和0.5μmol·L^-1的RPA条带亮度无明显差异(如图4A所示)，为了节约试剂，故最佳引物浓度为：0.4μmol·L^-1。既在检测体系加入引物CA2-F/R(10μmol·L^-1)各2μL。

RPA反应温度优化：在最适引物浓度下，设定反应时间为10min，设置反应梯度温度分别为：34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，结果表明，随着温度增加，电泳条带亮度增加，但随着温度的继续增加，电泳条带开始变暗，39℃时条带最明亮(如图4B所示)，故反应温度选择39℃。

RPA反应时间筛选：在最佳引物浓度和反应温度下，设置反应时间梯度：10min、20min、30min、40min和50min。检测结果表明，随反应时间增加，电泳条带亮度增加，在30min、40min和50min时，条带亮度无明显差异(如图4C所示)，故选择反应时间为30min。

综合以上结果，确定柑橘溃疡病菌的RPA的检测体系为：1.反应体系总体积50μL，其中CA2-F/R(10μmol·L^-1)各2μL，Rehydration buffer 29.5μL，ddH₂O 12μL，核酸模板2μL，280mM醋酸镁(MgOAc)2.5μL；2.反应温度:39℃；3.反应时间：30min。

2.5 特异性评价

利用所建立的柑橘溃疡病菌RPA检测体系分别对感染了Xcc、Clas、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CLBV、CPV和SDV的阳性样品核酸进行检测。电泳结果显示，只有感染了柑橘溃疡病菌的样品扩增出单一明亮条带，检测呈阳性，而感染其它柑橘病阳性样品和清水对照检测呈阴性(结果如图5所示)。这表明所建立的RPA检测体系与其他柑橘病原无交叉反应，特异性强。

2.6 灵敏度评价

为了确定所建RPA检测体系的检测灵敏度，以总核酸浓度为872ng.μL^-1的Xcc阳性样品为模板，设置10倍稀释浓度梯度：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，平行进行RPA和普通PCR及实时PCR检测。结果表明，普通PCR可检测的最小核酸相对稀释度为10^-4，实时荧光PCR和RPA可检测的最小核酸稀释度为10^-6(结果如图6所示)，可见所建RPA体系与实时PCR的检测灵敏度相同，是普通PCR检测灵敏度的100倍。

2.7 适用性评价

将71个未知田间柑橘样品提取核酸后，采用RPA、普通PCR、实时PCR三种方法同步进行检测。实验结果表明，三种方法均检测出22个阳性样品，阳性率均为31.00％。可见，所建立的柑橘溃疡病菌RPA检测方法稳定可靠，可以用于田间柑橘样品的快速检测。

序列表

<110> 西南大学

<120> 柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物、试剂盒和方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacaacacg taaaagatca ccccgacccc 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgtgctgg tcaccgtcga tcacggcatc gc 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttggtgtcg tcgcttgtat ggactatagt 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgcgcacg ggtgcaaaaa atcttcaact tc 32

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagtcgccta ccgagaaatc c 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accacggcag ggtgaagac 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttggtgtcgt cgcttgtat 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacgggtgca aaaaatct 18

Claims

1.一种柑橘溃疡病菌RPA检测的特异引物，其特征在于，所述特异引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-GTTGGTGTCGTCGCTTGTATGGACTATAGT-3’，

下游引物：5’-GCCGCGCACGGGTGCAAAAAATCTTCAACTTC-3’。

2.一种柑橘溃疡病菌RPA检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异引物。

3.如权利要求2所述的柑橘溃疡病菌RPA检测试剂盒，其特征在于，还含有植物总核酸提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阴性对照、阳性对照。

4.一种柑橘溃疡病菌RPA检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，RPA反应的反应体系包含：在反应体系中的终浓度为0.2～0.5μmol·L^-1的上\下游引物，样品基因组DNA，RPA扩增反应试剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上\下游引物在反应体系中的终浓度为0.4μmol·L^-1。

7.如权利要求4至6任一项所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：反应温度为37～42℃，反应时间为10～50分钟。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，RPA反应条件为：反应温度为39℃，反应时间为30分钟。

9.如权利要求4至8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到231或232bp的条带即表明待测样品是阳性样品。