CN107354224A - 一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法 - Google Patents

一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法 Download PDF

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杨毅
孔君
陈乃中
朱水芳
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Abstract

本发明公开了一种用于快速检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法。本发明所提供的用于检测柑桔黄龙病菌的引物对，为如下a)或b)：a)由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；b)由将序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的且与a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明所提供的探针自5’端到3’端如下：序列3‑(dT‑荧光基团)‑四氢呋喃残基‑(dT‑淬灭基团)‑序列4；在所述探针的3'端进行修饰。本发明整个检测过程在1小时内，其快速、特异性和灵敏的特点可以满足野外和林场柑桔属样品的快速初检以及细菌DNA的快速鉴定。

Description

一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法
技术领域
本发明属于农业和植物检疫技术领域，涉及一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法。
背景技术
柑桔黄龙病(Citrus Huanghongbing,HLB)，又称黄梢病、黄枯病、青果病，最先于1919年华南地区报道，由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌(Candidatusliberobacter asiaticum,Las)引起，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害，该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区。感染果实的典型症状是着色异常、果小、畸形。染病沙糖橘等宽皮柑橘的果实常表现为果蒂和果肩周围先褪绿转色，其它部位仍然为青绿色，且因蜡质形成受阻而无光泽。果农称之为“红鼻子果”或“红肩果”。染病甜橙树的果实常表现为青果，病果的果汁味酸、淡。染病早期，叶片常显现为斑驳型黄化，待病菌散播到全树后，新梢抽生的叶片一般为均匀黄化。病根表皮易脱离、腐烂。黄龙病菌优先定殖在根中且分布较为均匀，这也是为什么仅仅砍除病枝并不能有效控制黄龙病的原因所在。该病70年代在广东爆发流行，80年代传入闽南、福州一带，对柑桔造成极大危害，管理差、抛荒的柑桔园发生较重，如任其蔓延，将对柑桔产业造成死树毁园的致命打击。柑橘类植物感染黄龙病菌后并不立即显症，存在潜伏期。潜伏期的长短视品种、树龄、健康状况、种植环境等而异，但相比其它病原体，黄龙病菌的潜伏期较长。而且目前在柑橘属中无基因抗性资源，一旦树木被感染，就无法控制。使用不含黄龙病的种苗和控制传播介质木虱种群是防止黄龙病传播的重要措施。因此早期检测，快速鉴定和剔除感染的树木和带病枝条是最重要的防控措施。
为了开发一种能在常温下，并可以在野外快速检测黄龙病菌的方法，我们采用磁珠法提取柑桔黄龙病菌DNA，利用重组酶介导等温扩增技术(recombinase polymeraseamplification，RPA)，在37℃-42℃之间，无需变性，即可在便携式荧光检测仪上进行扩增和检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法。
第一，本发明提供了一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物对，具体为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
第二，本发明提供了一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合，由前文所述的引物对和单链探针组成；
所述单链探针自5’端到3’端结构如下所示：
区段A-(dT-荧光基团)-四氢呋喃残基-(dT-淬灭基团)-区段B；
在所述单链探针的3'端进行修饰；
所述区段A如序列表中序列3所示；
所述区段B如序列表中序列4所示。
在本发明的一个实施例中，所述荧光基团具体为FAM；所述淬灭基团具体为BHQ1。
所述“在所述单链探针的3'端进行修饰”可为在所述单链探针的3’端采用C3-spacer或磷酸盐或生物素-PEG或胺进行修饰。
第三，本发明提供了一种用于野外快速检测柑桔黄龙病菌的重组酶介导等温扩增技术。
第四，本发明提供了一种用于检测柑桔黄龙病菌的重组酶介导等温扩增试剂盒。所述试剂盒含有前文所述的引物对或所述的引物探针组合或所述的试剂。
其中，所述试剂盒中含有阳性质粒。所述阳性质粒具体可为含有序列表中序列5所示DNA片段的重组质粒。
第五，前文所述引物对或所述引物探针组合或所述试剂或所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)检测或辅助检测柑桔黄龙病菌；
(2)制备用于检测或辅助检测柑桔黄龙病菌的产品；
(3)检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌；
(4)制备用于检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌的产品；
(5)检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌；
(6)制备用于检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌的产品。
第六，本发明提供了如下(A)或(B)所示方法：
(A)一种检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)采用磁珠法提取试剂盒从待测植物样本中提取基因组DNA作为模板，采用前文所述的引物探针组合或含有所述引物探针组合的所述试剂或所述试剂盒进行重组酶介导等温扩增；
(a2)根据进行所述重组酶介导等温扩增过程中荧光信号的产生情况确定所述待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌。
具体可按照如下方法确定所述待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌：如果在20分钟内有荧光信号升起，则所述待测植物样本携带或候选携带柑桔黄龙病菌；若在20分钟内无荧光信号升起，则所述待测植物样本中不携带或候选不携带柑桔黄龙病菌。
(B)一种检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌的方法，包括如下步骤：
(b1)从待测细菌中提取基因组作为模板，采用前文所述的引物探针组合或含有所述引物探针组合的所述试剂或所述试剂盒进行重组酶介导等温扩增；
(b2)根据进行所述重组酶介导等温扩增过程中荧光信号的产生情况确定所述待测细菌是否为柑桔黄龙病菌。
具体可按照如下方法确定所述待测细菌是否为柑桔黄龙病菌：如果在20分钟内有荧光信号升起，则所述待测细菌为或候选为柑桔黄龙病菌；若在20分钟内无荧光信号升起，则所述待测细菌不为或候选不为柑桔黄龙病菌。
在上述方法中，所述待测植物样本可为柑桔属植物样本。所述待测细菌可为柑桔黄龙病菌(如柑桔黄龙病菌亚洲种)、竹柏扁枝植原体、番木瓜小叶植原体。
以上任一所述重组酶介导等温扩增的反应体系具体可为：再水化缓冲液29.5μL，上下游引物各2.1μL，探针0.6μL，DNA模板(0.05-20ng)，去离子水补至47.5μL，混匀后加至含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp exo反应管中，充分溶解，加入醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL，再加入一粒磁珠。
反应体系中，上下游引物和探针均以工作液形式加至反应体系中，上下游引物和探针在工作液中的浓度均为10μmol/L。
反应体系中，所述再水化缓冲液、冻干酶粉和TwistAmp exo反应管均来自于exo试剂盒。
所述exo试剂盒为TwistDx公司，货号为TAEX002KIT的产品。
以上任一所述重组酶介导等温扩增的操作方法具体可为：39℃反应30分钟。
以上任一所述重组酶介导等温扩增具体可采用TwistDX T8等温扩增仪(TwistDX,英国)或其它可控温在37-42℃范围内的荧光检测仪进行。
所述磁珠具体可为TwistDX T8等温扩增仪自带的磁珠。
本发明提供了一种用于快速检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法，试验结果表明，采用本发明的引物探针及检测方法对来自中国南方的柑桔黄龙病菌亚洲种进行检测，在10分钟内能得到阳性扩增，而对竹柏扁枝植原体和番木瓜小叶植原体等可能共生或引起相似症状的植原体细菌没有明显的荧光信号增加。整个检测过程在1小时内，其快速、特异性和灵敏的特点可以满足野外和林场柑桔属样品的快速初检以及细菌DNA的快速鉴定。
附图说明
图1为RPA引物筛选。
图2为特异性实验结果。
图3为灵敏度实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
exo试剂盒：TwistDx公司，货号：TAEX002KIT。
实施例1、鉴定柑桔黄龙病菌的RPA引物及探针的设计与合成
根据柑桔黄龙病菌亚洲种16S ITS区序列，采用引物设计软件设计了多组理论可行的RPA引物(包括三个上游引物和三个下游引物)，如表1所示。
表1 RPA候选引物及探针序列(5’-3’)
将表1中上游引物和引物组成不同组合(F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2R3)进行效果验证、灵敏度分析和特异性分析(具体操作方法参见实施例2-4)，结果如图1所示，其中F2/R1具有最好的灵敏度和扩增效率。用F2/R1检测柑桔黄龙病菌亚洲种为阳性结果，检测柑桔叶绿素DNA、竹柏扁枝植原体和番木瓜小叶植原体DNA不产生阳性结果，满足特异性要求。
经过综合分析，筛选出一对用于鉴定柑桔黄龙病菌的最佳RPA引物，如下所示：
引物F：5'-CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG-3'(序列1)；
引物R：5'-CGACAGCCATGCAGCACCTGTGTAAAGGTCTCCG-3'(序列2)。
进一步设计了用于鉴定柑桔黄龙病菌的exo探针，如下所示：
探针P：ACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)ATATCAGAGATGG-C3Spacer
其中，THF代表四氢呋喃残基，有时称为“dSpacer”。
实际应用中，exo探针的3'末端的C3-spacer，也可替换为磷酸盐、生物素-TEG或胺等修饰基团。
实施例2、RPA检测方法的建立
1、采用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技DP342)提取待测柑桔属植物叶脉的总DNA，具体操作如下：
取待测柑桔属植物叶脉或根皮组织约100mg，加入液氮充分碾磨。将研磨好的粉末迅速转移到预先装有400微升缓冲液GPM和5微升RNase A(10mg/ml)的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在70℃水浴10分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。12,000rpm(～13,400×g)离心4分钟，转移300微升上清至新的离心管中。加入300微升缓冲液GHB，300微升异丙醇和15微升磁珠悬浮液G，振荡混匀5分钟。将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。将离心管从磁力架上取下，加入500微升去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀30秒。将离心管放置于磁力架上静置30秒，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。加入600微升漂洗液PWB(75％乙醇/水)振荡混匀30秒。将离心管放置于磁力架上静置30秒，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。重复步骤8和9，再用75％乙醇洗涤磁珠一次。将离心管置于磁力架上，室温晾干。将离心管从磁力架上取下，加入30微升二次去离子水，振荡混匀，置于65℃孵育3分钟。将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移至一个新离心管中，置于加冰袋的保温箱中，用于后续检测。.
2、以步骤1得到的总DNA为模板，采用实施例1设计合成的引物F、引物R和探针P进行RPA反应；具体操作如下：
反应体系：取再水化缓冲液(exo试剂盒自带)29.5μL，引物F和引物R各2.1μL，探针P 0.6μL，13.2μL DNA模板，混匀后加至含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp exo反应管(exo试剂盒自带)中，充分溶解，加入醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL。
反应体系中，引物F、引物R、探针P均以工作液形式加至反应体系中，引物F、引物R和探针P在工作液中的浓度均为10μmol/L。
向反应体系中加入一粒磁珠(TwistDX T8等温扩增仪自带)，放置于便携式TwistDX T8等温扩增仪(TwistDX,英国)中，设置程序为39℃反应20-30分钟，同时记录扩增产物的荧光信号，并进行如下判断：
如果在20分钟内有荧光信号升起，则所述待测植物样本携带或候选携带柑桔黄龙病菌；若在20分钟内无荧光信号升起，则所述待测植物样本中不携带或候选不携带柑桔黄龙病菌。
实施例3、RPA检测方法的特异性
供试样本：感染了柑桔黄龙病菌亚洲种的柑桔植株；未感染柑桔黄龙病菌的柑桔植株；感染了竹柏扁枝植原体的竹柏植株；感染了番木瓜小叶植原体的番木瓜植株。
分别采用实施例2建立的检测方法对各供试样本进行RPA检测。
结果如图2所示。图2中，曲线1-3分别是三株柑桔黄龙病菌感染的柑桔植株提取的叶脉DNA做模板扩增得到的RPA实时荧光曲线。曲线4是未感染的柑桔叶DNA，曲线5是竹柏扁枝植原体感染的叶片DNA，曲线6是番木瓜小叶植原体感染的叶片DNA。
结果表明，只有感染了柑桔黄龙病菌的植株叶脉DNA样本(曲线1，2，3)检测时在20分钟内有荧光信号升起，而其它植原体感染植株(曲线4，5，6)的DNA样本检测时在20分钟内均没有荧光信号升起。
上述结果表明，本发明的方法具有较高的特异性。
实施例4、RPA检测方法的灵敏度
1、将柑桔黄龙病菌亚洲种的16S核糖体RNA扩增后，构建到pUC57载体(金斯瑞公司产品，货号为SD1176)上，得到标准品质粒，命名为pUC57-HLB-16S。
标准品质粒pUC57-HLB-16S的结构描述为：在pUC57载体的酶切位点XbaI和EcoRV之间装入序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质粒。
2、把2ng/μL步骤1得到的DNA溶液用水10倍梯度稀释，得到各稀释液；
3、取步骤2到的各稀释液作为模板，分别采用实施例2建立的RPA检测方法进行检测。
由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2ng；
反应体系2中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2×10-1ng；
反应体系3中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2×10-2ng；
反应体系4中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2×10-3ng；
反应体系5中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2×10-4ng；
反应体系6中，柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)初始含量为：2×10-5ng。
结果如图3所示。图3中，1-6依次对应反应体系1-6。结果表明，本发明建立的PRA检测方法可成功检测到2×10-4ng柑桔黄龙病菌亚洲种16S RNA载体DNA(即标准品质粒pUC57-HLB-16S)模板，约为4.71×104拷贝数。
上述结果表明，本发明的方法具有较高的灵敏度。
<110> 中国检验检疫科学研究院；中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
<120> 一种用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合及检测方法
<130> GNCLN171583
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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gagaggtgag tggaattccg agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg aggaacaccg 600
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ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg ggctgggcta cacacgtgct acaatggtgg 1140
ttacaatggg ttgcgaagtc gcga 1164

Claims (10)

1.用于检测柑桔黄龙病菌的引物对，为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
2.用于检测柑桔黄龙病菌的引物探针组合，由权利要求1所述的引物对和单链探针组成；
所述单链探针自5’端到3’端结构如下所示：
区段A-(dT-荧光基团)-四氢呋喃残基-(dT-淬灭基团)-区段B；
在所述单链探针的3'端进行修饰；
所述区段A如序列表中序列3所示；
所述区段B如序列表中序列4所示。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合，其特征在于：所述“在所述单链探针的3'端进行修饰”为在所述单链探针的3’端采用C3-spacer或磷酸盐或生物素-TEG或胺进行修饰。
5.用于检测柑桔黄龙病菌的重组酶介导等温扩增试剂，除了还有权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的引物探针组合外，还含有能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。
6.用于检测柑桔黄龙病菌的重组酶介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性质粒；所述阳性质粒为含有序列表中序列5所示DNA片段的重组质粒。
8.权利要求1所述的引物对或权利要求2-4中任一所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂或权利要求6或7所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)检测或辅助检测柑桔黄龙病菌；
(2)制备用于检测或辅助检测柑桔黄龙病菌的产品；
(3)检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌；
(4)制备用于检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌的产品；
(5)检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌；
(6)制备用于检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌的产品。
9.一种检测或辅助检测待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌的方法，包括如下步骤：
(a1)从待测植物样本中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求2-4中任一所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂或权利要求6或7所述的试剂盒进行重组酶介导等温扩增；
(a2)根据进行所述重组酶介导等温扩增过程中荧光信号的产生情况确定所述待测植物样本是否携带柑桔黄龙病菌。
10.一种检测或辅助检测待测细菌是否为柑桔黄龙病菌的方法，包括如下步骤：
(b1)从待测细菌中提取基因组作为模板，采用权利要求2-4中任一所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂或权利要求6或7所述的试剂盒进行重组酶介导等温扩增；
(b2)根据进行所述重组酶介导等温扩增过程中荧光信号的产生情况确定所述待测细菌是否为柑桔黄龙病菌。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266772A (zh) * 2018-11-28 2019-01-25 南宁国拓生物科技有限公司 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量pcr的检测方法
CN110205236A (zh) * 2019-06-12 2019-09-06 中国检验检疫科学研究院 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片
CN111690759A (zh) * 2020-08-04 2020-09-22 西南大学 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN111690777A (zh) * 2020-07-15 2020-09-22 西南大学 柑橘叶斑驳病毒rt-rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN112195222A (zh) * 2020-09-30 2021-01-08 北京农业信息技术研究中心 一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法
CN112391493A (zh) * 2020-12-10 2021-02-23 浙江省检验检疫科学技术研究院 柑橘黄龙病亚洲种的raa荧光检测方法、引物探针及试剂盒
CN113493846A (zh) * 2020-06-18 2021-10-12 南宁众册生物科技有限公司 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法
CN114045356A (zh) * 2022-01-12 2022-02-15 仲恺农业工程学院 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法
KR20220126103A (ko) * 2021-03-08 2022-09-15 대한민국(산림청 국립산림과학원장) 파이토플라스마 검출용 재조합 중합 효소 증폭 프라이머 및 프로브 세트

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589794A (zh) * 2013-11-04 2014-02-19 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法
WO2015168134A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Envirologix, Inc. Compositions and methods for detecting huanglongbing
CN105524986A (zh) * 2015-12-29 2016-04-27 江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的lamp检测方法
CN106367533A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 淮安市疾病预防控制中心 用于检测寨卡病毒的核酸、实时荧光rpa试剂盒及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589794A (zh) * 2013-11-04 2014-02-19 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种实时荧光恒温定量检测柑橘黄龙病的方法
WO2015168134A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Envirologix, Inc. Compositions and methods for detecting huanglongbing
CN105524986A (zh) * 2015-12-29 2016-04-27 江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种快速检测亚洲柑桔黄龙病菌的lamp检测方法
CN106367533A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 淮安市疾病预防控制中心 用于检测寨卡病毒的核酸、实时荧光rpa试剂盒及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILENA EULER ET AL: "Development of a Panel of Recombinase Polymerase Amplification Assays for Detection of Biothreat Agents", 《JCM》 *
RUSSELL P F ET AL: "Rapid On-site Detection of the Huanglongbing/Citrus Greening Causal Agent"Candidatus Liberibacter asiaticus" by AmplifyRP®, a Novel Rapid Isothermal Nucleic Acid Amplification Platform", 《ACTA HORTICULTURAE》 *
冯震等: "沙田柚黄龙病病因16S rDNA片段的克隆与序列分析", 《广西农业生物科学》 *
秦立得等: "重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒检测中的应用", 《中国动物检疫》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266772A (zh) * 2018-11-28 2019-01-25 南宁国拓生物科技有限公司 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量pcr的检测方法
CN110205236A (zh) * 2019-06-12 2019-09-06 中国检验检疫科学研究院 一种基于rpa技术快速检测核酸的纸微流控芯片
CN113493846A (zh) * 2020-06-18 2021-10-12 南宁众册生物科技有限公司 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法
CN111690777A (zh) * 2020-07-15 2020-09-22 西南大学 柑橘叶斑驳病毒rt-rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN111690777B (zh) * 2020-07-15 2023-06-02 西南大学 柑橘叶斑驳病毒rt-rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN111690759A (zh) * 2020-08-04 2020-09-22 西南大学 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN111690759B (zh) * 2020-08-04 2023-10-17 西南大学 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN112195222A (zh) * 2020-09-30 2021-01-08 北京农业信息技术研究中心 一种柑橘黄龙病病菌快速定量检测方法
CN112391493A (zh) * 2020-12-10 2021-02-23 浙江省检验检疫科学技术研究院 柑橘黄龙病亚洲种的raa荧光检测方法、引物探针及试剂盒
KR20220126103A (ko) * 2021-03-08 2022-09-15 대한민국(산림청 국립산림과학원장) 파이토플라스마 검출용 재조합 중합 효소 증폭 프라이머 및 프로브 세트
KR102565505B1 (ko) 2021-03-08 2023-08-14 대한민국 파이토플라스마 검출용 재조합 중합 효소 증폭 프라이머 및 프로브 세트
CN114045356A (zh) * 2022-01-12 2022-02-15 仲恺农业工程学院 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法
CN114045356B (zh) * 2022-01-12 2022-04-26 仲恺农业工程学院 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法

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