CN109266772A - 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量pcr的检测方法 - Google Patents
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Abstract
柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括针对柑橘黄龙病原菌亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，一对基于植物细胞色素氧化酶的阳性对照引物及1条特异探针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中下属的病原菌检测技术领域，具体涉及柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法。
背景技术
柑橘产业作为我国千亿元级别的大产业，已经成为我国农民收入的重要来源之一。在我国，栽培柑橘的省(区、市)有20多个，主要集中在湖南、江西、四川、福建、浙江、广西、湖北、广东和重庆9个省 (区、市)，常年产量占全国的95％以上。
柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘最为严重的病害，是由一种韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter)所引起的，该种病原菌目前尚未有能够在培养基内进行培养的报道。柑橘黄龙病病原菌主要有三个种，分别为黄龙病菌亚洲种 (Ca.L.asiaticus)，黄龙病菌非洲种(Ca.L.africanus)和黄龙病菌美洲种(Ca.L.americanus)。黄龙病病原菌主要通过柑橘木虱、嫁接苗木以及菟丝子传播。携带病原菌的柑橘木虱可同时传播亚洲种和美洲种两个种的柑橘黄龙病病原菌。柑橘黄龙病可防可控但不可治，严重威胁着全球的柑橘产业。柑橘黄龙病在目前缺乏有效防控药剂和抗病品种的条件下，加强病害的早期检测，对进口的柑橘进行检疫检测，防止外来的柑橘黄龙病菌的传入对病害的防控具有重要的现实意义。
随着分子生物学研究的发展，人们对柑橘黄龙病越来越了解，一些快速、准确灵敏的分子检测方法被建立起来，已广泛应用于黄龙病病原菌的检测。
目前已建立和发展了常规PCR、巢式PCR、核酸探针检测、荧光定量 PCR、LAMP等技术来检测黄龙病病原菌，不断地提高检测的灵敏度和准确率。其中PCR技术以其灵敏、简便、特异、高效的特点，已成为实验室检测常用方法。目前的检测主要针对扩增病原菌的16SrDNA、23S rDNA、 16S-23SrRNA ITS、外膜蛋白OMP基因、β-operon基因、DNA聚合酶基因等。由于中国的柑橘黄龙病病原菌主要为黄龙病菌亚洲种，所以目前的专利显示以及市场上销售的检测产品绝大多数为检测黄龙病菌亚洲种，而在进口的柑橘中，可能会含有其他种的柑橘黄龙病菌，现有技术缺少一种方法能够区分检测黄龙病菌的不同种，因此，需要找到更有效的，能检测不同种柑橘黄龙病原菌的检测方法。
发明内容
针对目前黄龙病病原菌在柑橘(特别是带菌但尚未显症)病株中含量低且分布不均匀，并且柑橘黄龙病病原菌有三个种，而市场上常见的检测柑橘黄龙病的检测普遍为检测黄龙病原菌的亚洲种，尚没有能同时检测三种黄龙病病原菌的不足，市场需要一种对于柑橘黄龙病病原菌的检测更全面的检测方法，以评估感染的黄龙病病原菌属于哪个种。
为了解决以上技术问题，本发明提供了柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法。16S rRNA基因在细菌中普遍存在，其功能非常重要，所以在进化中非常保守，在鉴定细菌新种的时候，通过比较16S rRNA基因的序列可以得到较好的分辨率，通过VectorNTI进行柑橘黄龙病菌(Ca.L.asiaticus)，非洲种(Ca.L.africanus)和美洲种(Ca.L. americanus)的16S rRNA基因序列比对，设计出三对种间特异的引物，一条可鉴定三个种的通用探针，三对引物与一条通用探针相结合，通过荧光定量PCR的方法鉴定出柑橘黄龙病菌的三个不同种。
柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括以下步骤：
1)引物设计：根据黄龙病病原3个种间16S rRNA差异，设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan 探针，同时设计了一对基于植物细胞色素氧化酶(COX)的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针；
2)样品DNA提取：从柑橘叶片中提取DNA；
3)荧光定量PCR反应：使用TaqMan探针法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上下游引物及探针，模板DNA，在 AnalytikJena qTOWER 2.0荧光定量PCR仪上进行；
4)扩增曲线分析；
其中步骤3)中，荧光定量PCR反应体系包括：AceQ qPCR Probe Master Mix：10μL；基因特异性上游引物10μmol/L：0.4μL；基因特异性下游引物10μmol/L：0.4μl；TaqManProbe 10μmol/L：0.2μL； 10倍稀释模板DNA：1μL；无RNA酶的灭菌双蒸水：8μL；
混合好的反应体系，按照如下扩增条件进行设置：
黄龙病菌亚洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火 15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
黄龙病菌非洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火 15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
黄龙病菌美洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
阳性对照COX基因：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火 15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
步骤1)所述的设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，是一套用于检测鉴定柑橘黄龙病亚洲种、非洲种、美洲种的引物及TaqMan探针，保证3种病原菌的引物都是特异检测该种病原菌，且不受其他柑橘类常见病原体或内生菌的影响：
黄龙病菌亚洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBasia F：5’-CCTTACCAGCCCTTGACATGTATA-3’，
HLBasia R：5’-CAGCCATGCAGCACCTGTGTA-3’；
黄龙病菌非洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBafrica F：5’-CTTACCAGCCCTTGACATATGTT-3’，
HLBafrica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTATGAAA-3’；
黄龙病菌美洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBamerica F：5’-TTACCAGCCCTTGACATGGTG-3’，
HLBamerica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTGTGTG-3’；
通用TaqMan探针序列为：
HLBprobe：5’-FAM-GACGATATCAGAGATG-BHQ1-3’；
步骤1)所述的一对基于植物细胞色素氧化酶(COX)的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针，是一对用于评估DNA提取物的质量的柑橘内源基因COX(细胞色素氧化酶)引物及TaqMan探针：
COX基因基因特异性上游引物的序列：
COX f：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’，
COX基因基因特异性下游引物的序列：
COX r：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’，
COX基因TaqMan探针序列：
COX probe：5’-VIC-ATCCAGATGCTTACGCTGG-BHQ1-3’。
步骤2)所述的样品DNA提取，是提取柑橘样品的DNA，用消毒剪刀剪取柑橘叶片中脉，放入研磨仪中研磨成粉末状，DNA提取流程按照植物基因组提取试剂盒操作方法，得到高质量的基因组DNA。
步骤4)中，染料的选择为：黄龙病菌亚洲种、非洲种及美洲种的检测均选择FAM，柑橘COX基因的检测选择VIC。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明根据黄龙病菌3个种间16SrDNA的差异，设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，可区分不同种的黄龙病病原菌，同时设计了1对柑橘细胞色素氧化酶(COX) 基因的对照引物及1条特异TaqMan探针用于评估DNA的质量以保证结果的准确性，本发明所使用的引物有别于其他的检测技术。
2、本发明采用探针法对黄龙病的三个不同种的病原菌的16S rRNA基因进行分析，引物设计并筛选，优化了反应体系，建立一种使用三对不同引物，一条通用探针进行黄龙病三种病原菌鉴定的荧光定量PCR检测方法。同时，本发明也采用了柑橘的内源COX基因作为对照，设计了一对引物和一条探针，可以在进行黄龙病检测的同时，对柑橘自身基因进行检测，作为评估实验是否成功的一个评判标准，减少了因为PCR反应不成功，造成假阴性的结果出现的可能性。
3、本发明可以同时鉴定柑橘黄龙病原菌的三个不同种，目前国内尚未有同时分辨三种柑橘黄龙病原菌的专利报道。本发明的建立，可以防止只检测亚洲种而漏检非洲种或者美洲种，造成新的物种侵入的可能性，为保护我国的柑橘产业健康发展提供有力的技术保障。
附图说明
图1为样品A经柑橘黄龙病菌亚洲种检测引物HLBasia扩增的扩增曲线。
图2为柑橘黄龙病菌非洲种感染样品经柑橘黄龙病菌非洲种检测引物 HLBafrica扩增的扩增曲线，用于检验HLBafrica引物的检测有效性。
图3为柑橘黄龙病菌美洲种感染样品经柑橘黄龙病菌美洲种检测引物HLBamerica扩增的扩增曲线，用于检验HLBamerica引物的检测有效性。
图4为样品A经柑橘COX基因扩增的扩增曲线。
图5为样品A经柑橘黄龙病菌非洲种检测引物HLBafrica扩增的扩增曲线。
图6为样品A经柑橘黄龙病菌美洲种检测引物HLBamerica扩增的扩增曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例：
柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，包括以下步骤：
(1)引物的设计与合成
利用引物设计软件Primer5进行引物设计，并用人工合成的方法合成如下引物：
黄龙病菌亚洲种的特异性上游引物：
HLBasia F：5’-CCTTACCAGCCCTTGACATGTATA-3’，
黄龙病菌亚洲种的特异性下游引物：
HLBasia R：5’-CAGCCATGCAGCACCTGTGTA-3’；
黄龙病菌非洲种的特异性上游引物：
HLBafrica F：5’-CTTACCAGCCCTTGACATATGTT-3’，
黄龙病菌非洲种的特异性下游引物：
HLBafrica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTATGAAA-3’；
黄龙病菌美洲种的特异性上游引物：
HLBamerica F：5’-TTACCAGCCCTTGACATGGTG-3’，
黄龙病菌美洲种的特异性下游引物：
HLBamerica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTGTGTG-3’；
通用TaqMan探针序列为：
HLBprobe：5’-FAM-GACGATATCAGAGATG-BHQ1-3’；
阳性对照COX基因基因特异性上游引物：
COX f：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’，
阳性对照COX基因基因特异性下游引物：
COX r：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’，
阳性对照COX基因TaqMan探针序列：
COX probe：5’-VIC-ATCCAGATGCTTACGCTGG-BHQ1-3’；
(2)样品总DNA提取
实验柑橘叶片样品编号A、B、C，均采自广西武鸣县，在无菌通风橱内用消毒剪刀剪取待检的柑橘叶片中脉，加入液氮研磨成粉末，按照试剂盒《BioFastSpin Plant GenomicDNA Extraction Reagent》提取操作方法，得到高质量的基因组DNA；因为中国境内较难找到野外感染的柑橘黄龙病非洲种和美洲种病原菌感染的柑橘样品，所以黄龙病菌非洲种及黄龙病菌美洲种感染的柑橘样品DNA的获取方式为获赠，用于检测引物的特异性和有效性；
(3)荧光定量PCR反应
使用TaqMan探针法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上下游引物及探针，模板DNA，在AnalytikJena qTOWER 2.0 荧光定量PCR仪上进行；
其中步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系包括：AceQ qPCR Probe Master Mix：10μl；基因特异性上游引物10μmol/L：0.4μl；基因特异性下游引物10μmol/L：0.4μl；TaqManProbe 10μmol/L：0.2μl；10倍稀释模板DNA：1μl；无RNA酶的灭菌双蒸水：8μl。每次PCR检测设立相应的空白对照。混合好的反应体系，按照如下扩增条件进行设置：
黄龙病菌亚洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s， 72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
黄龙病菌非洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s， 72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次 72℃延伸7min；
黄龙病菌美洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s， 72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次 72℃延伸7min；
阳性对照COX基因：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火 15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
所叙步骤(3)中染料的选择为：黄龙病菌亚洲种、非洲种及美洲种的检测均选择FAM，阳性对照COX基因的检测选择VIC；
检测结束后，根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。
(4)检测结果判定
。
序列表
<110> 南宁国拓生物科技有限公司
<120> 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttaccagc ccttgacatg tata 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagccatgca gcacctgtgt a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttaccagcc cttgacatat gtt 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccatgcagc acctgtatga aa 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttaccagccc ttgacatggt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccatgcagc acctgtgtgt g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
amgacgatat cagagatgbh 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtatgccacg tcgcattcca ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccaaaactg ctaagggcat tc 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
vcatccagat gcttacgctg gbh 23
Claims (4)
1.柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)引物设计：根据黄龙病病原3个种间16S rRNA差异，设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，同时设计了一对基于植物细胞色素氧化酶的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针；
2)样品DNA提取：从柑橘叶片中提取DNA；
3)荧光定量PCR反应：使用TaqMan探针法，分别在每个反应管中加入荧光定量PCR预混合液，相应基因的上下游引物及探针，模板DNA，在AnalytikJenaqTOWER 2.0荧光定量PCR仪上进行；
4)扩增曲线分析；
其中步骤3)中，荧光定量PCR反应体系包括：AceQ qPCR Probe Master Mix：10μL；基因特异性上游引物10μmol/L：0.4μL；基因特异性下游引物10μmol/L：0.4μl；TaqMan Probe 10μmol/L：0.2μL；10倍稀释模板DNA：1μL；无RNA酶的灭菌双蒸水：8μL；
混合好的反应体系，按照如下扩增条件进行设置：
黄龙病菌亚洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
黄龙病菌非洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
黄龙病菌美洲种：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
阳性对照COX基因：95℃预变性5min；95℃变性15s，53.4℃退火15s，72℃延伸20s，进行40个循环；在每个循环延伸阶段同步采集荧光，末次72℃延伸7min；
步骤1)所述的设计了针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，是一套用于检测鉴定柑橘黄龙病亚洲种、非洲种、美洲种的引物及TaqMan探针，保证3种病原菌的引物都是特异检测该种病原菌，且不受其他柑橘类常见病原体或内生菌的影响：
黄龙病菌亚洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBasia F：5’-CCTTACCAGCCCTTGACATGTATA-3’，
HLBasia R：5’-CAGCCATGCAGCACCTGTGTA-3’；
黄龙病菌非洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBafrica F：5’-CTTACCAGCCCTTGACATATGTT-3’，
HLBafrica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTATGAAA-3’；
黄龙病菌美洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBamerica F：5’-TTACCAGCCCTTGACATGGTG-3’，
HLBamerica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTGTGTG-3’；
通用TaqMan探针序列为：
HLBprobe：5’-FAM-GACGATATCAGAGATG-BHQ1-3’；
步骤1)所述的一对基于植物细胞色素氧化酶(COX)的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针，是一对用于评估DNA提取物的质量的柑橘内源基因COX引物及TaqMan探针：
COX基因基因特异性上游引物的序列：
COX f：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’，
COX基因基因特异性下游引物的序列：
COX r：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’，
COX基因TaqMan探针序列：
COX probe：5’-VIC-ATCCAGATGCTTACGCTGG-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于：步骤2)所述的样品DNA提取，是提取柑橘样品的DNA，用消毒剪刀剪取柑橘叶片中脉，放入研磨仪中研磨成粉末状，DNA提取流程按照植物基因组提取试剂盒操作方法，得到高质量的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于：步骤4)中，染料的选择为：黄龙病菌亚洲种、非洲种及美洲种的检测均选择FAM，柑橘COX基因的检测选择VIC。
4.一套用于柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量PCR的检测方法的引物及TaqMan探针，是一套针对亚洲种、非洲种、和美洲种的3对特异性上下游引物及1条通用TaqMan探针，保证3种病原菌的引物都是特异检测该种病原菌，且不受其他柑橘类常见病原体或内生菌的影响：
黄龙病菌亚洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBasia F：5’-CCTTACCAGCCCTTGACATGTATA-3’，
HLBasia R：5’-CAGCCATGCAGCACCTGTGTA-3’；
黄龙病菌非洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBafrica F：5’-CTTACCAGCCCTTGACATATGTT-3’，
HLBafrica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTATGAAA-3’；
黄龙病菌美洲种的特异性上下游引物分别为：
HLBamerica F：5’-TTACCAGCCCTTGACATGGTG-3’，
HLBamerica R：5’-GCCATGCAGCACCTGTGTGTG-3’；
通用TaqMan探针序列为：
HLBprobe：5’-FAM-GACGATATCAGAGATG-BHQ1-3’；
一对基于植物细胞色素氧化酶的阳性对照引物及1条特异TaqMan探针，是一对用于评估DNA提取物的质量的柑橘内源基因COX引物及TaqMan探针：
COX基因基因特异性上游引物的序列：
COX f：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’，
COX基因基因特异性下游引物的序列：
COX r：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’，
COX基因TaqMan探针序列：
COX probe：5’-VIC-ATCCAGATGCTTACGCTGG-BHQ1-3’。
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