CN109468395A - 一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用，引物，包括上游引物，其序列为SEQ ID NO.1：GGGAGCAAACACGATAGATACCCT，下游引物，其序列为SEQ ID NO.2：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC；其能够检测口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆支原体和禽滑液支原体，灵敏度高，抗干扰能力强。

Description

一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
支原体是一类缺乏细胞壁的原核微生物，在自然界分布十分广泛。支原体个体微小，可透过一般滤膜(0.22-0.45μm)，在细胞培养过程中极易受到支原体污染，细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是世界性问题。国内外研究表明，目前已知的20多种细胞污染支原体中，95％的支原体污染由以下支原体导致：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆支原体。支原体感染发生后能改变细胞的DNA/RNA及蛋白表达，但不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。目前已有多种方法从细胞培养物中检测这些支原体，包括DNA荧光染色法、支原体培养法、电镜和聚合酶链反应(PCR)等。目前国内动物生物制品企业对支原体检测均采用培养法，该方法能很准确地检测出最常导致细胞污染的支原体活菌及其它多种支原体但所需时间长，一个检测周期3-5周，且灵敏度差。
目前来说，检测肺炎支原体的试剂盒较多，比如申请号为201110167591.8的专利公开了一种检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒，其包括SEQ ID NO.1所示的序列，该序列由下述引物扩增获得，MpP1-FP:5’-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，MpP1-RP:5’-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’。其用于检测肺炎支原体的p1基因保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物和探针，具有较强的特异性，利用该引物和探针进行肺炎支原体的荧光定量PCR检测方法进一步简化肺炎支原体的检测的程序、缩短检测周期，用于检测国内的分离肺炎支原体株，可作为检测临床标本的手段，提高肺炎支原体检测的阳性率。但是不同的来源支原体的检测灵敏度和抗干扰能力是不同的，对于生长于猪的支原体来说，其生长环境比较恶劣，如果用一般的pcr检测方法，经常会由于其他物质的干扰，出现假阴假阳的问题。
申请号为201210296912.9的专利公开了一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，包括引物1：P37-F5′-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3′，引物2：P37-R5′-TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3′，分子信标探针：5’-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3’，其只能用于检测猪鼻支原体，不能检测其他支原体，局限性较大，虽然不能支原体具有不同的保守序列，但是从所有的支原体发保守序列中找到对所有支原体都起作用，具有同样灵敏度和抗干扰能力的引物，是比较困难的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用，其能够检测口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆支原体和禽滑液支原体，灵敏度高，抗干扰能力强。
本发明的内容包括检测支原体的引物，其包括：
上游引物，其序列为SEQ ID NO.1：GGGAGCAAACACGATAGATACCCT，
下游引物，其序列为SEQ ID NO.2：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC。
优选的，所述上游引物和下游引物的浓度分别为0.1～10pmoL/μL，更优选为10pmoL/μL。
本发明还提供一种检测支原体的试剂盒，包括所述引物，还包括缓冲液、dNTP、Taq酶和双蒸水。所述Taq酶的浓度优选为2.5U/μL。
本发明提供一种检测支原体的检测方法，包括PCR反应程序，其步骤为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min；反应结束。
本发明还提供一种引物或者试剂盒在同时检测口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆支原体和禽滑液支原体上的应用。
本发明针对支原体16S rRNA保守区设计一对特异性引物，扩增目的基因片段大小270bp，引物序列为：上游引物(5’-3’)GGGAGCAAACACGATAGATACCCT；下游引物(5’-3’)TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC。
本发明采用25μL PCR反应体系进行扩增，反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
PCR反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min；反应结束后，PCR产物置4℃备用。
PCR扩增结束后，取2μL PCR扩增产物与4μL6×Loading Buffer混合后，加入1％琼脂糖凝胶中，100V电泳40min，用紫外检测仪观察，并用凝胶成像系统照像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的检测方法克服了常规培养法检测技术耗时长，须3－5周才能判断结果、抗污染能力差和有些支原体不能在培养基上生长等问题，检测快速高效，仅需4h就可得到检测结果。
(2)本发明的检测方法灵敏度高，最低检测量为10个拷贝目的基因，重复性优，可以实现大通量样品的检测。
(3)本发明的检测方法特异性强，针对支原体16S rRNA保守区设计的一对特异性引物，可以检测出细胞培养中污染的所有种类支原体。
(3)本发明的检测方法成本低，约8元/1个样品。
(4)本发明可以大大缩短疫苗生产过程中支原体检验所需时间，选择高度保守的区域设计引物，通过PCR方法可以同时特异性检测出6种支原体，并能敏感的检测到10个拷贝数的目的基因。通过23个不同样品(细胞、血清、疫苗成品、半成品)对建立的PCR方法和传统的培养法进行比对，检测结果符合度100％。
附图说明
图1为应用本发明检测不同支原体和其他物质的电泳图。
在图中，M：Marker2000，1：精氨酸支原体，2：发酵支原体，3：口腔支原体，4：莱氏无胆甾原体，5：猪鼻支原体，6：禽滑液支原体，7：Vero，8：Marc145，9：ST，10：PK15，11：CEF，12：PHK。
图2为应用本发明检测不同拷贝基因的电泳图。
在图中，M：Marker2000，1：1000个拷贝目的基因，2：100个拷贝目的基因，3：10个拷贝目的基因。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1：PCR检测方法特异性和敏感性试验
1.支原体菌株和检测样品
支原体标准株：精氨酸支原体(ATCC 23838)、发酵支原体(ATCC 19989)、口腔支原体(ATCC 23714)、莱氏无胆甾原体(ATCC 23206)；培养法检测疫苗产品时所用阳性对照菌株(猪鼻支原体和禽滑液支原体)由湖南中岸生物药业有限公司质检室提供。疫苗半成品、成品、疫苗生产常用细胞和细胞培养用血清等用于检测的样品由中岸生物生产部提供。
2.试剂和仪器
DNA提取试剂盒、Taq DNA Polymerase和dNTP Mixture均为天根生化科技(北京)有限公司产品。紫外分析仪(ZF1)为上海康化生化仪器制造厂产品；琼脂糖水平电泳槽(DYCP-30型)为北京六一仪器厂产品；PCR扩增仪(MYCYCLER)为伯乐生命医药产品(上海)有限公司产品；凝胶成像系统为美国西蒙公司产品；pGEM-T克隆试剂盒为美国Promega公司产品。
3.支原体模版制备，按照天根生化DNA提取试剂盒说明书进行操作。
4.支原体引物
针对支原体16S rRNA保守区设计一对属特异性引物，扩增目的基因片段大小270bp，引物序列为：上游引物(5’-3’)GGGAGCAAACACGATAGATACCCT；下游引物(5’-3’)TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC。
5.PCR扩增
应用PCR扩增仪，采用25μL PCR反应体系进行扩增，反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
PCR反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min；反应结束后，PCR产物置4℃备用。
6.扩增产物检测
PCR扩增结束后，取2μL PCR扩增产物与4μL6×Loading Buffer混合后，加入1％琼脂糖凝胶中，100V电泳40min，用紫外检测仪观察，并用凝胶成像系统照像。
7.PCR检测方法特异性试验结果
应用本文建立的PCR检测方法能准确检测出支原体菌株(图1)：支原体标准株、猪鼻支原体、禽滑液支原体均扩增出270bp大小的目的基因片段，而Vero，Marc145，ST，PK15，CEF，PHK均无扩增片段。在敏感性检测中，PCR检测方法最低能检测10个拷贝数的目的基因，具有高度敏感性(图2)。
实施例2培养法和PCR方法检测结果符合度试验
对于使用PCR方法检测的样品，参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》进行支原体培养法检测，比较两种方法的检测结果符合度。
培养法检测结果和PCR检测结果见表2。可以看出，两种检测方法的检测结果一致。
表2 PCR方法和培养法两种检测结果的比较
注：“+”表示检测结果为阳性；“－”表示检测结果为阴性。
综上可见，本发明设计的一对特异性引物可以快速鉴定各种样品中支原体污染，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、重复性优，检测结果真实可靠。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 湖南中岸生物药业有限公司
<120> 一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用
<160>2
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gggagcaaacacgatagataccct 24
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tgcaccatctgtcactctgttaacctc 27

Claims (7)

1.一种检测支原体的引物，其特征是，包括
上游引物，其序列为SEQ ID NO.1：GGGAGCAAACACGATAGATACCCT，
下游引物，其序列为SEQ ID NO.2：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC。
2.如权利要求1所述的检测支原体的引物，其特征是，所述上游引物和下游引物的浓度分别为0.1～10pmoL/μL。
3.如权利要求2所述的检测支原体的引物，其特征是，所述上游引物和下游引物的浓度分别为10pmoL/μL。
4.一种检测支原体的试剂盒，其特征是，包括如权利要求1、2或3所述引物，还包括缓冲液、dNTP、Taq酶和双蒸水。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述Taq酶的浓度为2.5U/μL。
6.一种检测支原体的检测方法，其特征是，包括PCR反应程序，其步骤为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min；反应结束。
7.一种如权利要求1-3任一项所述引物或者如权利要求4-5任一项所述的试剂盒在同时检测口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、莱氏无胆支原体和禽滑液支原体上的应用。
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