CN106967826A - 一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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张瑞丽
李佳
李一佳
汪鉴
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Abstract

本发明涉及一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法，属于体外诊断试剂技术领域。该试剂盒包括所述引物对、PCR试剂、阳性对照、阴性对照和PCR反应管，引物对中，上游引物Myco‑F：5’‑ggcgaatgggtgagtaacacg‑3’；下游引物Myco‑R：5’‑cggataacgcttgcgacctatg‑3’；应用本发明检测试剂盒进行检测，操作作简便，所需时间短，具有很高的灵敏性，可以在细胞开始培养前对其是否被支原体污染进行检测，避免因盲目开始细胞培养造成的经济损失，从根源上杜绝支原体进入细胞培养室，减少支原体交叉污染细胞的可能性。

Description

一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检 测方法
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法。
背景技术
支原体（mycoplasma）又称霉形体，是一种介于细菌和病毒之间的能独立生存的最小微生物之一，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小介于细菌与病毒之间，直径0.1-0.3μm，可通过滤菌器(0.22μm)，在自然界分布十分广泛。细胞培养过程中支原体污染初期，细胞常常不引起明显病变，也不导致培养液浑浊，难以凭肉眼发现，高倍镜下观察细胞无明显变化。在污染后期支原体吸附在细胞表面，破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递，消耗细胞的核苷库，引起细胞变形、细胞染色体异常等。由于支原体对多种抗生素耐药，在细胞长期培养过程中经常出现且极难消除，并且污染的传播十分迅速。尤其在干细胞实验室，处理的样本是来自不同医院的脐带和胎盘，这些样本具有极高的支原体携带风险。一旦发生支原体污染，所引起的不良后果将是毁灭性的。因此，进行支原体检测与防治十分必要。
常见的支原体检测方法有直接培养法和间接法。直接检测法是指支原体的直接培养分离法；间接法包括DNA荧光染色法、DNA杂交法、酶联免疫吸附试验法、免疫荧光试验、电镜观察、生物化学测定等；目前，最常应用的是培养法和荧光染色法。培养法所需时间长，一个检测周期28d，且灵敏度差；DNA荧光染色法因背景荧光的存在，使实验结果不准确。而其他方法由于受价格、实验条件限制，或因灵敏度低、操作复杂、费用较高等原因不利于干细胞的培养。因此，建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。PCR作为一种简便快速、特异、灵敏的支原体检测方法，已经在国内外广泛用于支原体污染的检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法，应用本发明检测试剂盒进行检测，操作作简便，所需时间短，具有很高的灵敏性，本发明试剂盒可应用于干细胞库脐带和胎盘样本制备前支原体污染的检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对：
上游引物Myco-F：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’；
下游引物Myco-R：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。
本发明还提供一种人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括上述引物对、PCR试剂、阳性对照、阴性对照和PCR反应管。
进一步，优选的是，所述PCR试剂为2×power Taq PCR MasterMix。
进一步，优选的是，所述阳性对照的制备方法是被支原体污染的细胞培养上清，经采用权利要求1所述的引物对PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳，将在400-500bp处获得清晰条带切胶回收，即得阳性对照。
进一步，优选的是，所述阳性对照的制备方法是干细胞培养过程中经分离培养法检测确认被支原体污染的细胞，用巴氏吸管或移液器吸取细胞培养上清1mL，取3μL作为待测样本，之后经采用权利要求1所述的引物对PCR扩增后，再经质量百分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在400-500bp处会获得清晰条带，将在400-500bp处获得清晰条带的这一产物切胶回收，即得阳性对照；
所述的PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
进一步，优选的是，所述阴性对照为经灭菌的双蒸水。
进一步，优选的是，所述的灭菌方法采用高温高压灭菌法。
进一步，优选的是，所述的灭菌温度为120℃，压力为103.4kPa，时间为15min。
本发明同时提供一种人脐带、胎盘保护液支原体检测方法，采用上述人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，具体如下：在不同的PCR反应管中加入阳性对照PCR反应体系、阴性对照PCR反应体系、待测样本PCR反应体系，之后分别进行PCR扩增，得到的产物分别经质量百分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分析；
当待测样本PCR反应体系得到的产物与阴性对照PCR反应体系得到的产物一样，在400-500bp处均无扩增条带，则说明待检样本未被支原体污染；
当待测样本PCR反应体系得到的产物与阳性对照PCR反应体系得到的产物在400-500bp处出现相同的扩增条带，则说明待检样本被支原体污染；
所述的阳性对照PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、阳性对照0.2~10ng/μL 3μL；；
所述的阴性对照PCR反应体系为PCR试剂 2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、阴性对照3μL；
所述的待测样本PCR反应体系为PCR试剂 2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；所述的待测样本为内含待处理脐带或胎盘组织的人脐带保护液或人胎盘保护液；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
人脐带保护液或人胎盘保护液均为常规可以购买到的产品。
本发明所采用的PCR试剂为2×power Taq PCR MasterMix，为DNA polymerase、buffer、dNTP Mixture的2倍浓度的混合物。
所述专用引物在制备脐带、胎盘保护液中支原体检测试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的脐带、胎盘保护液中支原体检测试剂盒的检测原理如下：
根据细胞培养过程中常见支原体16~23s rRNA之间的间隔区保守序列，设计一对属特异性引物（Myco-F，Myco-R）。该引物对和常见支原体的保守序列完全配对，保证了细胞培养常见支原体检测方法的特异性。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
应用本发明提供的脐带、胎盘保护液中支原体检测试剂盒进行检测，操作作简便，所需时间短，具有很高的灵敏性。与其他细胞培养支原体检测方法相比，应用本发明提供的剂盒对脐带保护液、胎盘保护液进行检测，可以在细胞开始培养前对其是否被支原体污染进行检测，避免因盲目开始细胞培养造成的经济损失；整个检测约需1.25h，所需时间短，利于后续实验的开展；从根源上杜绝支原体进入细胞培养室，减少支原体交叉污染细胞的可能性。本发明的试剂盒可应用于干细胞库脐带和胎盘样本制备前支原体污染的检测。
由于支原体较小且细胞常常不引起明显变化，用电子显微镜检查检出率太低。直接培养法是检测支原体污染中最为直接、可靠的方法，支原体对环境的影响敏感，容易被灭活，而且分离培养操作相对繁琐，所需时间较长（3~5周），有些支原体不能在培养基培养出来（如M.hyorhinis），实验需同时培养支原体株作为阳性对照，易造成污染，灵敏度差。因此只能够对支原体污染进行定性观察。DNA荧光染色法较分离培养法缩短了检测周期（3~4d），该方法易出现假阴性和假阳性结果，假阳性主要由于细胞碎片染色被误认为是支原体，假阴性可能由于支原体污染较轻，DNA荧光染色液或指示细胞被支原体染污，DNA荧光染色灵敏度不高。一步法支原体检测试剂整个过程只需一步，检测结果颜色变化显著，极易观察。快速支原体检测试剂依据支原体特有的代谢产物进行显色反应，阳性会产生蓝绿色，代谢产物浓度越高，颜色越深。这两种进口试剂虽然比较简捷，但不能区分支原体的具体种类，长期使用成本较高。
附图说明
图1是人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的应用图；
图2是人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的灵敏度检测图；
图3是人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的特异性检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
本发明的百分号如无特殊说明，均为质量百分数。
PCR试剂：2×power Taq PCR MasterMix，北京百泰克生物技术有限公司；UltraPower TM核酸染料：北京百泰克生物技术有限公司；
乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸（acetic acid）、琼脂糖：北京全式金生物科技有限公司；
DNA maker：宝生物工程(大连)有限公司；
PCR反应管：爱思进生物技术（杭州）有限公司；
本发明待测样本的取得方式是：在样本预处理间的无菌操作台内，将装有脐带及其保护液或者装有胎盘及其保护液的采集盒子轻轻晃动后打开，用移液器从一侧吸取保护液1ml至1.5ml离心管中，即得。
实施例1 人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的制备
一、引物合成
人工合成以下引物对：
上游引物Myco-F：5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’；（SEQ ID NO.1）
下游引物Myco-R：5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’。（SEQ ID NO.2）
用超纯水配制引物并稀释至2.5μM，-20℃保存备用。
二、阳性对照制备
干细胞培养过程中经分离培养法检测确认被支原体污染的细胞，用巴氏吸管或移液器吸取细胞培养上清1mL，取3μL作为待测样本，之后经采用上述一步骤的引物对PCR扩增后，再经质量百分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在400-500bp处获得清晰条带，经切胶回收，回收产物即得阳性对照，-20℃保存备用；
所述的PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
三、阴性对照的制备
用双蒸水经120℃高温103.4kPa高压灭菌15min，分装后获得。
四、试剂盒的组装
该试剂盒由以下物质组成：步骤一合成的引物、步骤二制备的阳性对照、步骤三制备的阴性对照、PCR试剂（2×power Taq PCR MasterMix）和PCR反应管。
实施例2 人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的应用
采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、待测样本的取得
按照前述方法，取未被支原体污染的脐带保护液取三支作为A组待测样本；被支原体污染的脐带保护液取三支作为B组待测样本；未被支原体污染的胎盘保护液取三支作为C组待测样本；被支原体污染的胎盘保护液取三支作为D组待测样本。
二、PCR扩增
1.将A、B、C、D组作为待测样本，按照扩增体系往PCR反应管内加入如下试剂：
2×power Taq PCR MasterMix 5μL；
上游引物 2.5μM 1μL（2.5μM）；
下游引物 2.5μM 1μL（2.5μM）；
待测样本 3μL。
同时取阳性对照和阴性对照各3μL（阳性对照浓度为0.2~10ng/μL），试验设3个重复，按照上述扩增体系往PCR管内分别加入PCR MasterMix、上游引物、下游引物。
2.按如下反应程序设置PCR扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。
三、结果判定
PCR产物经1%（质量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分析并拍照，如图1，阳性对照对应的点样孔上方出现扩增条带（400-500bp处），阴性对照对应的点样孔上方无扩增条带。A、C组3个重复对应的点样孔上方均无扩增条带，B、D组3个重复对应的点样孔上方均出现扩增条带。3次重复试验结果一致，表明该方法重复性良好。
实施例3 人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的灵敏度检测
采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、待测样本的取得
干细胞培养过程中经分离培养法检测确认被支原体污染的细胞，用巴氏吸管或移液器吸取细胞培养上清1mL，取3μL作为待测样本，之后经采用上述一步骤的引物对PCR扩增后，再经质量百分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分析，在400-500bp处获得清晰条带，经切胶回收，回收产物。
所述的PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
测定上述胶回收产物基因组的浓度（125.9ng/μL），进行10倍梯度稀释，取以下稀释度：10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9 ng/μL，分别作检测组1、2、3、4、5、6，每组作3个重复，取阴性对照3个重复。
二、PCR扩增
1.分别将检测组1、2、3、4、5、6及阴性对照组，按照扩增体系往PCR反应管内加入如下试剂：
2×power Taq PCR MasterMix 5μL；
上游引物 2.5μM 1μL；
下游引物 2.5μM 1μL；
待测样本 3μL。
同时取阳性对照和阴性对照各3μL（阳性对照浓度为0.2~10ng/μL），也作为待测样本，试验设3个重复，扩增体系与上述相同。
2.按如下反应程序设置PCR扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。
三、结果判定
取10μL PCR产物经1%（质量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分析并拍照，如图2，阴性对照组3个重复对应的点样孔上方均无扩增条带，检测组1、2、3、4、5三个反应对应的点样孔上方均出现扩增条带（400-500bp间），检测组6三个反应对应的点样孔上方均无扩增条带。检测结果说明，最低可检测到10-8稀释度的DNA浓度，即灵敏度为1.26 pg/mL。
实施例4 人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒的特异性检测
制备含支原体模板和不含支原体模板的保护液样本，采用实施例1制备的试剂盒对样本进行检测。
一、待测样本的取得
经确认未被支原体污染脐带保护液、胎盘保护液分别取6只，其中3只脐带保护液做检测组1，另3只脐带保护液按体积比1:1加入阳性对照，放置24h后作为检测组2；3只胎盘保护液做检测组3，另3只胎盘保护液按体积比1:1加入阳性对照，放置24h后作为检测组4。
二、PCR扩增
1.分别将检测组1、2、3、4，按照扩增体系往PCR反应管内加入如下试剂：
2×power Taq PCR MasterMix 5μL；
上游引物 2.5μM 1μL；
下游引物 2.5μM 1μL；
待测样本 3μL。
同时取阳性对照和阴性对照各3μL（阳性对照浓度为0.2~10ng/μL），也作为待测样本，试验设3个重复，扩增体系与上述相同。
2.按如下反应程序设置PCR扩增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。
三、结果判定
PCR产物经1%（质量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分析并拍照，如图3，阴性对照组组3个重复对应的点样孔上方均无扩增条带，阳性对照组组3个重复对应的点样孔上方均出现扩增条带；检测组1、3三个反应对应的点样孔上方均无扩增条带，检测组2、4三个反应对应的点样孔上方均出现扩增条带（400-500bp间）。检测结果说明在阳性对照脐带保护液、胎盘保护液中，均能检测出阳性，且条带单一，检测结果不受保护液成分影响具有特异性。
同时，本发明还对支原体污染检测方法进行比较，比较结果如表1所示。
表1支原体污染检测方法比较
目前，细胞培养的支原体检测最常应用的是培养法、DNA荧光染色法和PCR法。在检测价格方面，一步法支原体检测试盒价格昂贵，DNA荧光染色法和PCR法价格相当，直接培养法最便宜；在检测时限方面，直接培养法所需时间最长，DNA 荧光染色法至少需3～4d，PCR法需1.25h左右检测时间最短。在可操作性方面，直接培养法、DNA 荧光染色法需进行大量的前期工作，一步法支原体检测试盒、PCR 法操作简便易行，可操作性强；在结果判定方面，DNA荧光染色法因背景荧光的存在，使实验结果判定有一定的主观性，不准确；PCR 法结果判定简单、客观；在检测灵敏度方面，直接培养法、DNA 荧光染色法灵敏度一般，一步法支原体检测试盒较好，PCR法最灵敏。直接培养法操作繁琐、环节多、时间长，DNA荧光染色法结果判定有一定的主观性，一步法支原体检测试盒法价格较昂贵，而 PCR法检测准确、快速、简便易行，是作为细胞培养支原体污染的前期检测快速而有效的方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
<400> 1
ggcgaatggg tgagtaacac g 21
SEQ ID NO.2
cggataacgc ttgcgaccta tg 22
SEQUENCE LISTING
<110> 云南舜喜再生医学工程有限公司
<120> 一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcgaatggg tgagtaacac g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggataacgc ttgcgaccta tg 22

Claims (9)

1.一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对，其特征在于：
上游引物Myco-F：5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’；
下游引物Myco-R：5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’。
2.一种人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括如权利要求1所述的引物对、PCR试剂、阳性对照、阴性对照和PCR反应管。
3.根据权利要求2所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂为2×power Taq PCR MasterMix。
4.根据权利要求2所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的制备方法是被支原体污染的细胞培养上清，经采用权利要求1所述的引物对PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳，将在400-500bp处获得清晰条带切胶回收，即得阳性对照。
5.根据权利要求4所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的制备方法是干细胞培养过程中经分离培养法检测确认被支原体污染的细胞，用巴氏吸管或移液器吸取细胞培养上清1mL，取3μL作为待测样本，之后经采用权利要求1所述的引物对PCR扩增后，再经质量百分数为2%的琼脂糖凝胶电泳分析，将在400-500bp处获得清晰条带切胶回收，即得阳性对照；
所述的PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
6.根据权利要求2所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为经灭菌的双蒸水。
7.根据权利要求6所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述的灭菌方法采用高温高压灭菌法。
8.根据权利要求6所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：所述的灭菌温度为120℃，压力为103.4kPa，时间为15min。
9.一种人脐带、胎盘保护液支原体检测方法，采用权利要求2-8任意一项所述的人脐带、胎盘保护液支原体检测试剂盒，其特征在于：在不同的PCR反应管中加入阳性对照PCR反应体系、阴性对照PCR反应体系、待测样本PCR反应体系，之后分别进行PCR扩增，得到的产物分别经质量百分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分析；
当待测样本PCR反应体系得到的产物与阴性对照PCR反应体系得到的产物一样，在400-500bp处均无扩增条带，则说明待检样本未被支原体污染；
当待测样本PCR反应体系得到的产物与阳性对照PCR反应体系得到的产物在400-500bp处出现相同的扩增条带，则说明待检样本被支原体污染；
所述的阳性对照PCR反应体系为PCR试剂2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、阳性对照0.2~10ng/μL 3μL；
所述的阴性对照PCR反应体系为PCR试剂 2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、阴性对照3μL；
所述的待测样本PCR反应体系为PCR试剂 2×power Taq PCR MasterMix 5μL、上游引物2.5μM 1μL、下游引物2.5μM 1μL、待测样本3μL；所述的待测样本为内含待处理脐带或胎盘组织的人脐带保护液或人胎盘保护液；
所述PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，25个循环；72℃5min；16℃ ∞。
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