CN114350825A - 一种用于细胞培养中检测支原体污染的pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于细胞培养中检测支原体污染的PCR试剂盒及其应用。本发明所述组合物包括以下序列：(1)用于PCR扩增支原体核酸序列的上游引物Primer‑Myc‑F：TGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTG；(2)用于PCR扩增支原体核酸序列的下游引物Primer‑Myc‑R：CGACACGAGCTGACGACAAC。所述组合物可以用于制备PCR试剂盒。本发明组合物或试剂盒可以用于支原体检测。相较于现有PCR引物扩增法，由于本发明的引物对经过优化，Primer‑BLAST显示能扩增528个产物，具有高度光谱性。

Description

一种用于细胞培养中检测支原体污染的PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于PCR技术领域，尤其是指一种用于细胞培养中检测支原体污染的PCR试剂盒及其应用。

背景技术

支原体(mycoplasma)又称霉形体，是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具有胞壁的原核微生物，能在无生命的人工培养基上生长繁殖，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小(仅有大肠杆菌的五分之一)，基因数量为480。

在细胞培养过程中，支原体污染成为世界性问题，约有30％-60％的细胞培养物存在支原体污染。造成这种情况的原因主要有以下四点：支原体体积非常小，为0.1-0.3um，一般无法通过滤器进行去除；支原体形态多变，光学显微镜下也难以观察它的形态结构；支原体生命力顽强，可在PH7.6-8.0 条件下生存，对一般抗生素不敏感；支原体污染细胞后，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可能由于传代、换液而缓解，因此容易被忽视。

国外调查发现，大约有二十多种支原体能够污染细胞，有的细胞株甚至会被两种以上的支原体同时污染。研究表明，污染细胞的支原体95％以上为以下四种：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体 (M.hyorhinis)、莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。另外，发酵支原体 (M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)及梨支原体(M.pirum)也很常见。支原体污染的来源主要包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染以及制备细胞的原始组织及器官的污染等。

支原体污染细胞后，首先会影响细胞的生长状态及形态，由于支原体的存在会导致培养基中支持细胞生长的营养物质减少，造成细胞生长缓慢甚至停止，还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变；也会影响细胞的正常代谢和功能，蛋白质、DNA、RNA合成发生障碍、破坏细胞膜完整性、影响细胞信号传递、染色体发生异常；此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。最严重的后果是有些科研实验结果是在支原体阳性的细胞中得到的，数据的真实性和可靠性大大下降，科研成果的可信度也大打折扣。

因此，细胞培养过程中的支原体检测工作非常重要。目前，常用的检测方法有传统的分离培养法、指示细胞培养法(DNA染色法)、ELISA法、PCR 法等。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要 4周时间；二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如猪鼻支原体(M.hyorhinis)。指示细胞培养法(DNA染色法) 则灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出；细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性；另外，荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。

目前，常用的检测方法有传统的分离培养法、指示细胞培养法(DNA 染色法)、ELISA法、PCR法等。PCR法为主流的支原体检测手段。支原体作为一种原核生物，其rRNA基因是由保守和多变序列间隔排列而成，以其 16SrRNA核酸序列中高度保守序列设计引物，采用PCR扩增、琼脂糖电泳的方法检测细胞中的支原体污染。

在普通PCR基础上了又发展了qPCR(荧光定量PCR)技术来检测支原体污染。qPCR是在普通PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。在qPCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

PCR法虽然比传统分离培养法检测时间大大缩短，不过已有的PCR支原体检测也存在一些问题，如引物设计不好，导致检测的灵敏度及特异性不够；而且，现在主流的检测试剂盒只能针对某一种或几种支原体，广谱性差。

而qPCR虽然可以避免普通PCR气溶胶假阳性结果的出现、提高检测灵敏度，但需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于细胞培养中检测支原体污染的PCR试剂盒及其应用。本发明具有灵敏度高、数据准确可靠、操作简单、检测快速的特点。

一种用于细胞培养中检测支原体污染的组合物，所述组合物包括以下序列：

(1)用于PCR扩增支原体核酸序列的上游引物Primer-Myc-F：TGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTG；

(2)用于PCR扩增支原体核酸序列的下游引物Primer-Myc-R：CGACACGAGCTGACGACAAC。

在本发明的一个实施例中，所述Primer-Myc-F的5'端进行荧光修饰。

在本发明的一个实施例中，所述的荧光修饰的修饰物为FAM荧光染料。

一种PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括所述的组合物。

在本发明的一个实施例中，所述PCR试剂盒还包括2×PCRMix、阴性对照、阳性对照。

在本发明的一个实施例中，所述阴性对照为无菌水。

在本发明的一个实施例中，所述阳性对照为口腔支原体基因组DNA。

在本发明的一个实施例中，所述口腔支原体基因组DNA为Minerva公司 (德国)的商品化口腔支原体基因组DNA标准品(10ng±2ng，冻干粉)。

在本发明的一个实施例中，所述2×PCR Mix包括扩增酶、缓冲液、Mg²⁺与dNTP。

本发明还提供所述PCR试剂盒在检测支原体中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述支原体为Mycoplasma pirum、Mycoplasmaarginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasnia faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma phocicerebrale、Mycoplasmaauris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma arthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gyp is、Mycoplasma subdolum、 Mycoplasma anseris、Mycoplasmacanadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasma cloacale或Mycoplasma buccale。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明相较于传统分离培养法、指示细胞培养法(DNA染色法)，本发明具有灵敏度高、数据准确可靠、操作简单、检测快速的特点。相较于现有 PCR引物扩增法，由于本发明的引物对经过优化，Primer-BLAST显示能扩增528个产物，具有高度光谱性。相较于qPCR，则具有经济适用的优势。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例1中K562细胞电泳图谱；

图2是本发明实施例1中Hep3B细胞电泳图谱；

图3是本发明实施例1中THP-1细胞电泳图谱；

图4是本发明实施例1中A20细胞电泳图谱；

图5是本发明实施例1中YAC-1细胞电泳图谱；

图6是本发明实施例2中K562-1细胞(正常株)电泳图谱；

图7是本发明实施例2中K562-2细胞(伪狂犬病毒感染株)电泳图谱；

图8是本发明实施例2中K562-3细胞(大肠杆菌感染株)电泳图谱；

图9是本发明实施例2中K562-4细胞(猪鼻支原体感染株)电泳图谱；

图10是本发明实施例2中K562-5细胞(鸡滑液支原体感染株)电泳图谱；

图11是本发明实施例1、实施例2中电泳条件。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明提供了一种用于细胞培养中检测支原体污染的组合物，所述组合物包括以下序列：

(1)用于PCR扩增支原体核酸序列的上游引物Primer-Myc-F：TGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTG；

(2)用于PCR扩增支原体核酸序列的下游引物Primer-Myc-R：CGACACGAGCTGACGACAAC。

在本发明的一个实施例中，所述Primer-Myc-F的5'端进行荧光修饰。

在本发明的一个实施例中，所述的荧光修饰的修饰物为FAM荧光染料。

一种PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括所述的组合物。

在本发明的一个实施例中，所述PCR试剂盒还包括2×PCR Mix、阴性对照、阳性对照。

在本发明的一个实施例中，所述阴性对照为无菌水。

在本发明的一个实施例中，所述阳性对照为口腔支原体基因组DNA。所述阳性对照为Minerva公司(德国)的商品化口腔支原体基因组DNA标准品 (10ng±2ng，冻干粉)。

在本发明的一个实施例中，所述2×PCR Mix包括扩增酶、缓冲液、Mg²⁺与dNTP。

本发明还提供所述PCR试剂盒在检测支原体中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述支原体为Mycoplasma pirum、 Mycoplasmaarginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、 Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasnia faucium、Mycoplasma spumans、 Mycoplasma phocicerebrale、Mycoplasmaauris、Mycoplasma alkalescens、 Mycoplasma arthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gyp is、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasmacanadense、Mycoplasma zalophi、 Mycoplasma cloacale或Mycoplasma buccale。

实施例1 PCR检测试剂盒的应用验证

本实施例对5株细胞株K562、Hep3B、THP1、A20、YAC-1的DNA 样本进行支原体检测的具体实施情况。5株细胞株均为被支原体污染，其中 K562、Hep3B、THP1为常用人源细胞株；A20、YAC-1为常用小鼠源细胞株。

1、DNA提取

应用Chelex100粗提法对四株细胞进行全基因组DNA提取。吸取细胞悬液1000μL，振荡、离心10000rpm 3min，弃上清，加200μL 5％Chelex100 悬液和3μL PK 10mg/mL，56℃水浴1h，轻微振荡后，沸水浴8min，振荡10s，离心10000rpm 3min，上清备用。DNA提取完毕，用紫外分光光度计定量，并稀释成1ng/μL。

其中，5％Chelex-100配制方法：(使用前注意充分摇匀；有效期为1个月)

(1)量取100mL的去离子水置于250mL的玻璃烧杯中。

(2)称取Chelex100 5g，置于广口玻璃瓶中。

(3)将去离子水加入到广口玻璃瓶中，室温保存。

2、PCR扩增程序

PCR(在NCBI进行Primer-BLAST，可知引物对能扩增多达528个大小为190bp的扩增产物，可见本发明具有高度光谱性)。

扩增体系体积为10μL：

扩增程序：

扩增产物通过3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳。若在190bp位置出现电泳峰，结果判定为阳性，说明细胞培养物中存在支原体污染；若在190bp 位置未出现电泳峰，结果判定为阴性，说明细胞培养物中不存在支原体污染。同时加入阳性对照(口腔支原体基因组DNA)、阴性对照(无菌水)进行电泳。

3、毛细管电泳检测

3.1、将SIZ-500内标和甲酰胺按1:24比例进行混合，取10μL混合物进入到96孔板中，再分别吸取5株细胞PCR产物0.5μL进样，混合静止数分钟，离心后放入3130xl遗传分析仪进行检测。电泳条件(见图11)。

3.2、电泳完毕后，应用

ID v3.2软件进行数据分析，并生成各细胞株图谱(详见附图1-5)。

4、结果分析

通过图1-5可知，5株细胞株在190bp处均出现电泳峰，结果呈阳性，说明5株细胞均有被支原体污染的情况。

实施例2 PCR检测试剂盒的特异性验证结果

本实施例通过对检测5种细胞株DNA进行试剂盒的特异性验证。5株细胞株均为K562细胞，K562-1为正常株，未受任何污染；K562-2为被伪狂犬病毒感染株；K562-3为被大肠杆菌感染株；K562-4为被猪鼻支原体感染株；K562-5 为被鸡滑液支原体感染株。本实施例所述PCR检测试剂盒分别对以上5种K562 细胞株基因组DNA进行扩增、3130xl遗传分析仪毛细管电泳。

1、DNA提取

应用Chelex100粗提法对四株细胞进行全基因组DNA提取。吸取细胞悬液1000μL，振荡、离心10000rpm 3min，弃上清，加200μL 5％ Chelex100 悬液和3μL PK 10mg/mL，56℃水浴1h，轻微振荡后，沸水浴8min，振荡 10s，离心10000rpm 3min，上清备用。DNA提取完毕，用紫外分光光度计定量，并稀释成1ng/μL。

其中，5％Chelex-100配制方法：(使用前注意充分摇匀；有效期为1个月)

(1)量取100mL的去离子水置于250mL的玻璃烧杯中。

(2)称取Chelex100 5g，置于广口玻璃瓶中。

(3)将去离子水加入到广口玻璃瓶中，室温保存。

2、PCR扩增程序

PCR(在NCBI进行Primer-BLAST，可知引物对能扩增多达528个大小为190bp的扩增产物，可见本发明具有高度光谱性)。

扩增体系体积为10μL：

扩增程序：

扩增产物通过3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳。若在190bp位置出现电泳峰，结果判定为阳性，说明细胞培养物中存在支原体污染；若在190bp 位置未出现电泳峰，结果判定为阴性，说明细胞培养物中不存在支原体污染。同时加入阳性对照(口腔支原体基因组DNA)、阴性对照(无菌水)进行电泳。

3、毛细管电泳检测

3.1、将SIZ-500内标和甲酰胺按1:24比例进行混合，取10μL混合物进入到96孔板中，再分别吸取5株细胞PCR产物0.5μL进样，混合静止数分钟，离心后放入3130xl遗传分析仪进行检测。电泳条件(见图11)。

3.2、电泳完毕后，应用

ID v3.2软件进行数据分析，并生成各细胞株图谱(详见附图6～10)。

4、结果分析

通过图6-10可知，K562-1、K562-2、K562-3在190bp处未出现电泳峰，结果呈阴性；K562-4、K562-5在190bp处均出现电泳峰，结果呈阳性。特异性验证试验显示该PCR试剂盒显示出很好的特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于细胞培养中检测支原体污染的组合物，其特征在于，所述组合物包括以下序列：

(1)用于PCR扩增支原体核酸序列的上游引物Primer-Myc-F：TGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTG；

(2)用于PCR扩增支原体核酸序列的下游引物Primer-Myc-R：CGACACGAGCTGACGACAAC。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Primer-Myc-F的5'端进行荧光修饰。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的荧光修饰的修饰物为FAM荧光染料。

4.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的组合物。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒还包括2×PCR Mix、阴性对照、阳性对照。

6.根据权利要求5所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无菌水。

7.根据权利要求5所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为口腔支原体基因组DNA。

8.根据权利要求5所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述2×PCR Mix包括扩增酶、缓冲液、Mg²⁺与dNTP。

9.权利要求4中所述PCR试剂盒在检测支原体中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述支原体为Mycoplasma pirum、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、Mycoplasmahyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasnia faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasma auris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gyp is、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasmacloacale或Mycoplasma buccale。

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