CN108893548A - 用于检测支原体的荧光定量pcr引物、检测方法及应用 - Google Patents

用于检测支原体的荧光定量pcr引物、检测方法及应用 Download PDF

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用，涉及病原体检测领域，基于现有技术无法快速、定量诊断细胞培养液中支原体的污染的问题而提出的，本发明包括用于检测支原体的荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，本发明的有益效果在于：具有灵敏度高、重复性佳及快速检测等优势，并且其污染低和成本低廉等特点，可用于科研、生产及临床实验中的细胞培养液中支原体的定量鉴定。

Description

用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及病原体检测领域，具体涉及一种用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用。
背景技术
支原体是一种无细胞壁，形态多呈不规则球状、长丝状，可通过0.22μm滤菌器，并且能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。细胞培养过程中，细胞易被支原体污染，国内外研究表明，98％以上细胞支原体污染是以下六种类型：口腔支原体(M.orale)、发酵支原体(M.Fermentans)、精氨酸支原体(M.arginini)、炎支原体(M.arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii)。
由于其微小的尺寸(～100nm)，肉眼或光学显微镜无法探测到支原体，因此，它们通常会在较长时间内不被发现。此外，由于其缺乏细胞壁，它们对许多常见的抗生素有耐药性，如青霉素和链霉素。数以百计的支原体可以同时附着在一个真核细胞上，最终通过与细胞膜融合而侵入宿主体内。在进入细胞后，支原体快速繁殖，由于不能产生典型的与细菌或真菌污染有关的浊度，因此，不能将细胞培养液的支原体污染可视化。此外，在受影响的细胞培养过程中，随之发生的细胞形态学改变和改变的细胞生长速率并不明显，如何能高效、准确鉴定细胞样品是否有支原体污染已成为生物医药行业中亟待解决的重要问题。
现阶段对于细胞样品的支原体检测方法主要由3大类，即培养法、荧光染色法和PCR法的分子生物学检测。培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测方法。荧光染色法的灵敏度太低，当细胞样品被检测为阳性时，细胞经常已经被支原体严重污染。目前，通常使用PCR分子生物学检测细胞培养液中支原体污染。但是PCR法也有明显的缺点：(1)耗时长：整个过程大约需要3-4个小时；(2)操作复杂：细胞培养过程中，细胞培养液中经常含有严重抑制PCR产物扩增的代谢物，所以细胞培养液的前处理是PCR法不可或缺的环节；(3)高风险：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，需要用到EB等潜在致癌物质，对实验人员造成潜在危险。
发明内容
本发明解决的技术问题在于现有技术无法快速、定量诊断细胞培养液中支原体的污染。
本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：
用于检测支原体的荧光定量PCR引物，所述引物对为上游引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'，下游引物：5'-GATTACTAGCGATTCCGACTTCAT-3'。
优选的，所述支原体为细胞培养中污染的支原体。
优选的，所述支原体为口腔支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、炎支原体、猪鼻支原体和菜氏无胆甾原体中的一种或多种。
优选的，所述引物对特异于细胞培养液支原体的16SrRNA基因。
优选的，所述引物对适用于SYBR Green实时荧光定量PCR技术的检测。
优选的，所述上游引物与下游引物摩尔比为1:1。
本发明还提供用于检测或辅助检测细胞培养液支原体的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物对、dNTP、荧光染料、无菌双蒸水、模板。
优选的，所述荧光染料为SYBR Green。
优选的，所述试剂盒在检测或辅助检测细胞培养液支原体产品中的应用。
本发明还提供用于检测支原体的荧光定量PCR检测方法，所述荧光定量PCR技术的检测中反应体系为：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5μL、上下游引物各1μL，模板1μL，无菌双蒸水补至25μL；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环，于60℃时测定荧光值。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种利用荧光定量PCR技术检测细胞培养液中支原体污染的高灵敏度的引物对，细胞培养液支原体的实时荧光定量检测方法明显优于现有的支原体检测方法，具有灵敏度高、重复性佳及快速检测等优势，并且其污染低和成本低廉等特点可用于科研、生产及临床实验中的细胞培养液中支原体的定量鉴定。
附图说明
图1本发明细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测方法的技术路线图；
图2以标准品质粒pMD19-myco为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线；
图3以标准品质粒pMD19-myco为模板进行实时荧光定量PCR的拟合标准曲线；
图4细胞培养液支原体实时荧光定量PCR检测方法灵敏度的检测结果；
图5支原体普通PCR检测方法灵敏度的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用主要材料的来源为：
pMD19-T空载体：购于Transgen全式金；
Trans10感受态细胞：购于Transgen全式金；
Taq PCRMasterMix：购于TakaRa公司。
实施例1
细胞培养液支原体进行定量检测的实时荧光定量PCR引物设计与合成
(1)引物设计
从EZBioCloud的支原体核酸数据库(http://www.ezbiocloud.net/)检索获得口腔支原体(M.orale)、发酵支原体(M.Fermentans)、精氨酸支原体(M.arginini)、炎支原体(M.arthritidis)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii)16S rRNA基因的序列，用DNA Man软件进行比对后，根据荧光定量PCR引物设计原则，使用Primerpremier5.0，针对支原体的16S rRNA基因(此为支原体的保守区域)，设计上下游引物，引物为PAGE纯化，所述用于检测支原体的荧光定量PCR引物序列如下：
上游引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'(如SEQ NO.1所示)
下游引物：5'-GATTACTAGCGATTCCGACTTCAT-3'(如SEQ NO.2所示)
所述引物的合成由南京金斯瑞生物科技有限公司公司进行。
实施例2
荧光定量PCR引物进行细胞培养支原体的实时荧光定量PCR检测
图1为本发明细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测方法的技术路线图；
(1)待测样品的制备
a.转移100μL细胞培养液到1.5mL无菌EP管中，确保EP管盖密封严密，防止蒸发；
贴壁细胞：待细胞培养2-3天，生长至汇合度80％-90％；悬浮细胞：待细胞培养2-3天，细胞密度达到5×105-1×106左右；
b.取50μL细胞培养液转移至无菌PCR管中，95℃热处理5min；
c.12000rpm 5s，取上清液转移至无菌PCR管中，样品可即可检测，或存放于-20度冰箱，冷冻保存。
(2)构建携带细胞培养基支原体16S rRNA基因的克隆质粒
①pMD19-myco质粒阳性对照品的制备
在16S rRNA基因的序列中选取一段覆盖设计引物的序列进行合成，将序列经过纯化连接到pMD19-T空载体上；然后转化至大肠杆菌Trans10感受态细胞中；构建的pMD19-myco重组质粒经双向DNA测序鉴定，提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到2.0×108拷贝/微升，于-20℃保存；
②对照品的选择
所述阴性对照为不含支原体16S rRNA基因的pMD19-T空载体质粒；pMD19-myco重组质粒(2×1010拷贝/微升)为阳性对照；
③荧光PCR反应液的组成
④反应条件
所述实时荧光定量PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环，于60℃时测定荧光值。
(3)建立实时荧光定量PCR曲线
①每个模板样品的CT值与该样品模板的起始拷贝数的对数呈线性关系；起始样品拷贝数越少，样品的CT值越高，起始样品拷贝数越多，样品的CT值越低；利用已知样品起始拷贝数的标准品可拟合出标准曲线，其中横坐标代表拷贝数的对数，纵坐标代表CT值，只需获得未知样品的的CT值，就可以推算出该样品的起始拷贝数；
②以获得的拷贝数分别为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1拷贝/微升的标准品质粒为模板，去离子水作为阴性对照(NC对照)，利用实施例中的引物再荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增；
实时荧光定量PCR反应体系为：12.5μL，TransStart Green qPCR SuperMix，上下游引物各1μL，模板1μL，无菌双蒸水补至25μL。反应条件为：94度预变性3min，94度变性10s，60度退火30s，共40个循环，于60度时测定荧光值，所述TransStart Green qPCR SuperMix包括dNTP、荧光染料等。
结果显示各稀释度的阳性质粒均能产生荧光信号，扩增曲线如图2所示，从左至右依次为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1拷贝/微升阳性质粒为模板的扩增曲线，横坐标为起始样品模板拷贝数的对数值，纵坐标为阳性质粒的CT值；拟合出的标准曲线为：y＝-3.5696x+33.983，以标准品质粒pMD19-myco为模板进行实时荧光定量PCR的拟合标准曲线如图3所示。
实施例3
细胞培养液支原体样品的检测
采集10份细胞培养液阳性污染样品，对样品进行处理：转移100μL细胞培养液到1.5mL无菌EP管中，确保EP管盖密封严密，防止蒸发；取50ul细胞培养液转移至无菌PCR管中，95度热处理5min；12000rpm 5s，取上清液转移至无菌PCR管中。每组样品设3个复孔，并设置阴性对照(加入新鲜培养基，NTC)，用步骤3中的反应体系和荧光定量PCR反应条件进行细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测。检测结果为：10份细胞培养液支原体污染均均为阳性，将样品的CT值代入标准曲线的直线回归方程中，即可计算出样品拷贝数，即为细胞培养液样品中支原体DNA的拷贝数。
实施例4
检测细胞培养液支原体实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度
方法：采用绝对检测低限测定本发明中细胞培养液支原体实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度，检测细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测方法与普通PCR检测方法的灵敏度，方法为：首先利用阳性质粒样本pMD19-myco，10倍梯度浓度进行稀释，模板浓度分别为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1拷贝/微升，以去离子水作为阴性对照，每个浓度的模板取1μL，分别采用实时荧光定量PCR检测方法和普通PCR(引物为实施例1中的上游引物和下游引物)对细胞培养液支原体进行检测；
普通PCR检测的反应体系及反应条件为：25μL PCR反应体系为：阳性质粒样本pMD19-myco 1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上游引物(10μM)1.0μL，下游引物(10μM)1.0μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；最后72℃终延伸10min。反应结束后，取10μLPCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
实验结果：细胞培养液实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测结果如图4所示，从图中可以看出，阳性质粒样本pMD19-myco浓度为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1拷贝/微升时均有明显的荧光倍增信号及扩增曲线，最低检测浓度为1.0×101拷贝/微升。
普通PCR的灵敏度的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示：泳道1-6为不同浓度模板的PCR扩增产物，模板浓度分别为1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1拷贝/微升，泳道7为阴性对照(去离子水)，从图中可以看出，当pMD19-myco浓度低于1.0×103拷贝/微升时无明显条带，普通PCR检测方法的最低检测浓度为1.0×103拷贝/微升。
实验结果表明：本发明细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏度，其灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。
实施例5
检测细胞培养液支原体实时荧光定量PCR检测方法的重复性
以pMD19-myco阳性质粒为模板，以稀释度为1.0×108拷贝/微升的DNA为模板，作三次稀释以1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/微升为模板分别作3次重复检测，进行三次重复检测，用所得CT值计算出CT值平均值、标准差和变异系数，建立组内重复性试验；以稀释度为1.0×108拷贝/微升的DNA为模板，作三次稀释以1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/微升为模板分别作3次重复检测，进行三次重复检测，用所得CT值算出CT值平均值、标准差和变异系数(CV值)，分析其组间重复性。
检测结果如表1所示，结果同一模板的不同稀释度的组内重复测定其CV值在1％-1.6％之间，不同模板的组间重复测定其CV值在1％-1.5％之间，CV值均低于2％，表明本发明细胞培养液支原体的实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好。
表1细胞培养液支原体实时荧光定量PCR检测方法的重复性结果
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽古一生物科技有限公司
<120> 用于检测支原体的荧光定量PCR引物、检测方法及应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actcctacgg gaggcagcag ta 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 安徽古一生物科技有限公司
<400> 2
gattactagc gattccgact tcat 24

Claims (10)

1.用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述引物对为上游引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3'，下游引物：5'-GATTACTAGCGATTCCGACTTCAT-3'。
2.根据权利要求1所述的用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述支原体为细胞培养中污染的支原体。
3.根据权利要求2所述的用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述支原体为口腔支原体、发酵支原体、精氨酸支原体、炎支原体、猪鼻支原体和菜氏无胆甾原体中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述引物对特异于细胞培养液支原体的16SrRNA基因。
5.根据权利要求1所述的用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述引物对适用于SYBR Green实时荧光定量PCR技术的检测。
6.根据权利要求1所述的用于检测支原体的荧光定量PCR引物，其特征在于：所述上游引物与下游引物摩尔比为1:1。
7.根据权利要求1所述的用于检测或辅助检测细胞培养液支原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有上述引物对、dNTP、荧光染料、无菌双蒸水、模板。
8.根据权利要求7所述的用于检测或辅助检测细胞培养液支原体的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为SYBR Green。
9.根据权利要求7所述的用于检测或辅助检测细胞培养液支原体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒在检测或辅助检测细胞培养液支原体产品中的应用。
10.根据权利要求1所述的用于检测支原体的荧光定量PCR检测方法，所述荧光定量PCR技术的检测中反应体系为：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5μL、上述上下游引物各1μL，模板1μL，无菌双蒸水补至25μL；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性10s，60℃退火30s，共40个循环，于60℃时测定荧光值。
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