CN107723374A - 一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法；包括：PCR反应液，标准阳性模板、阴性质控标准品，所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种布鲁氏菌的两对引物：羊布鲁菌上游：5’‑CGC TGT CAC TGT TGC AAG TAT G‑3’；羊布鲁菌下游:5’‑TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT‑3’；牛布鲁菌上游:5’‑TTG AAG TCT GGC GAG CAT GA‑3’；牛布鲁菌下游:5’‑TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT‑3’；所述标准阳性模板包括牛种标准阳性模板和羊种标准阳性模板：所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板含有牛布鲁氏菌高度保守基因的113个碱基的核苷酸片段构成的pMD19‑T重组质粒；所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板含有羊布鲁氏菌高度保守基因的128个碱基的核苷酸片段构成的pMD19‑T重组质粒，上诉2个重组质粒在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增值。

Description

一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法。
背景技术
布鲁菌病它是全球最常见的人兽共患传染病之一，被世界卫生组织称为潜在的生物恐怖武器，可造成巨大的经济损失。同时牛羊布鲁菌病也是畜牧兽医等科学研究领域的教学中常用实验用动物，实验用动物疫病的检测，会提高实验动物的质量，从而提高实验结果的准确性，另外，避免携带或感染人畜共患病的动物作为实验动物导致出现的生物安全问题。中国流行的主要是羊布鲁氏菌，牛、猪三种布鲁氏菌，其中以羊布鲁氏菌病最为常见，其次是牛种布鲁氏菌。因此，建立一种快速鉴别实验用动物牛、羊布鲁菌的检测方法至关重要。
现阶段对于布鲁菌病的检测方法主要有3大类即病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测。其中，分子生物学检测方法应用较多的主要包括多重PCR、套式PCR、RT-PCR、荧光定量PCR检测方法等。以上方法中，细菌培养耗时，易污染周围环境，存在实验室人员感染的风险，培养布鲁菌要求在生物安全三级实验室进行，细菌培养方法当前很少采用。血清学检测方法种类繁多，为布鲁菌病流行病学监测的标准方法，但是由于布鲁菌菌种和其它革兰氏阴性菌的交叉反应，使其检测结果存在假阳性，特别是与小肠结肠炎耶尔森菌O:9。综上，用常规方法分离鉴定病源条件要求苛刻，且费时、费力、危险性高、检验结果可信度低。荧光定量PCR虽特异性高、时间短，但是实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌普通PCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，包括：PCR反应液，标准阳性模板、阴性质控标准品，
所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种布鲁氏菌的两对引物：
羊布鲁菌上游：5’-CGC TGT CAC TGT TGC AAG TAT G-3’
羊布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
牛布鲁菌上游:5’-TTG AAG TCT GGC GAG CAT GA-3’
牛布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
所述标准阳性模板包括牛种标准阳性模板和羊种标准阳性模板：
所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板含有牛布鲁氏菌高度保守基因的113个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒；
所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板含有羊布鲁氏菌高度保守基因的128个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒，上诉2个重组质粒在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可以快速诊断出是否感染布鲁菌，同时可以很好地鉴别是羊种布鲁菌还是牛种布鲁菌感染，其具有较好的敏感性、特异性和稳定性。整个检测过程在2～3h内完成，从而达到准确、快速地检测羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的目的。此诊断方法对将来鉴别实验用动物牛、羊布鲁菌的检测方法至关重要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中羊布鲁氏菌标准阳性模板PCR扩增图；
图2为本发明PCR试剂盒的特异性鉴定图；
图3-1、图3-2为本发明PCR试剂盒的敏感性鉴定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1、图2及图3，本发明提供一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，包括：PCR反应液，标准阳性模板、阴性质控标准品，
所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种布鲁氏菌的两对引物：
羊布鲁菌上游：5’-CGC TGT CAC TGT TGC AAG TAT G-3’
羊布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
牛布鲁菌上游:5’-TTG AAG TCT GGC GAG CAT GA-3’
牛布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
所述标准阳性模板包括牛种标准阳性模板和羊种标准阳性模板：
所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板含有牛布鲁氏菌高度保守基因的113个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒；
所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板含有羊布鲁氏菌高度保守基因的128个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒，上诉2个重组质粒在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增值。
作为本发明具体的实施方式，所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列为：
5’-tctcgcatgcgctatgatctggttacgttaaatgcagacacgccctagaacgcctttcggargtcagattaagccgaaacggccccagccgctcatgctcgccagacttcaaa-3’
所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列为：
5’-tctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcg-3’
进一步的，所述PCR反应液还包含有dNTPs、10×buffer(含Mg2+)及灭菌双蒸水。所述含有113个碱基的核苷酸片段是从牛布鲁氏菌A19号疫苗灭活菌液中克隆得到的，所述含有128个碱基的核苷酸片段是从羊布鲁氏菌5号疫苗株灭活菌液中克隆得到的。所述阴性质控标准品为灭菌双蒸水。
在本发明中，一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)、样本基因组核酸的提取；
步骤(2)、以提取样本的DNA为模板，分别将样本DNA、牛种阳性标准模板、羊种阳性标准模板、阴性质控标准品加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的EP管中，按照优化后的PCR反应条件进行扩增：预变性95℃5min；95℃5sec，60℃30sec，72℃30sec，循环30次；72℃延伸10min；
步骤(3)、取5μLPCR产物与6×loading buffer混合，以2％琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察是否有113bp或128bp的扩增条带。其中，待检测的样本可以为乳汁、阴道棉拭子、肛门棉拭子。
图1中，1是DNA标准DL500；2～3是羊种布鲁菌标准阳性模板及阴性对照；4～5是牛种布鲁菌标准阳性模板及阴性对照。
图2中，1是DNA标准DL500；2～3是羊种布鲁菌标准阳性模板及阴性对照；4～5是牛种布鲁菌标准阳性模板及阴性对照,6是小肠结肠炎耶尔森菌O:9,7是大肠杆菌O8,8是大肠杆菌O78,9是大肠杆菌O86,10是马流产沙门氏菌。
图3-1中，1是DNA标准DL500；2～10是倍比稀释的牛种布鲁菌标准阳性模板PCR扩增图，2的浓度是3.2×106pg；3是3.2×105pg；4是3.2×104pg；5是3.2×103pg；6是3.2×102pg；7是3.2×101pg；8是3.2×100pg；9是3.2×10-1pg；10是3.2×10-2pg；11是阴性对照。
图3-2中，1是DNA标准DL500；2～10是倍比稀释的羊种布鲁菌标准阳性模板PCR扩增图，2的浓度是2.8×105pg；3是2.8×104pg；4是2.8×103pg；5 是2.8×102pg；6是2.8×101pg；7是2.8×100pg；8是2.8×10-1pg；9是2.8×10-2pg；10是2.8×10-3pg；11是阴性对照。
普通PCR方法是这些方法中最优的选择。本研究建立的布鲁氏菌普通PCR检测方法具有快速、特异性好、敏感性高、稳定好的优点。可以制作成检测试剂并进行产业化开发，使牛支原体肺炎的快速准确诊断成为可能，具有广阔的应用前景。该方法即可诊断布鲁氏菌病，又可同时鉴别羊种布鲁菌和牛种布鲁菌，此诊断方法对将来的布鲁菌病防控有一定的价值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古农业大学、内蒙古大学
<120> 一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒及其检测方法
<130> 权利要求书、说明书
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> DNA
<213> 牛种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列
<400> 1
tctcgcatgc gctatgatct ggttacgtta aatgcagaca cgccctagaa cgcctttcgg 60
argtcagatt aagccgaaac ggccccagcc gctcatgctc gccagacttc aaa 113
<210> 2
<211> 128
<212> DNA
<213> 羊种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列
<400> 2
tctcgcatgc gctatgatct ggttacgttg aatgcagaca cgccctaggg gtgaatctgg 60
aaattgtcag aaagacagtg cttcgtcacg ctagagcgct cgctgccata cttgcaacag 120
tgacagcg 128

Claims (7)

1.一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于：包括：PCR反应液，标准阳性模板、阴性质控标准品，
所述PCR反应液包括鉴定牛种、羊种布鲁氏菌的两对引物：
羊布鲁菌上游：5’-CGC TGT CAC TGT TGC AAG TAT G-3’
羊布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
牛布鲁菌上游:5’-TTG AAG TCT GGC GAG CAT GA-3’
牛布鲁菌下游:5’-TCT CGC ATG CGC TAT GAT CT-3’
所述标准阳性模板包括牛种标准阳性模板和羊种标准阳性模板：
所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板含有牛布鲁氏菌高度保守基因的113个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒；
所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板含有羊布鲁氏菌高度保守基因的128个碱基的核苷酸片段构成的pMD19-T重组质粒，上诉2个重组质粒在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增值。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于：所述牛种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列为：
5’-tctcgcatgcgctatgatctggttacgttaaatgcagacacgccctagaacgcctttcggargtcagattaagccgaaacggccccagccgctcatgctcgccagacttcaaa-3’
所述羊种布鲁氏菌标准阳性模板核苷酸目的片段序列为：
5’-tctcgcatgcgctatgatctggttacgttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcg-3’。
3.根据权利要求2所述的一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液还包含有dNTPs、10×buffer(含Mg2+)及灭菌双蒸水。
4.根据权利要求3所述的一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于：所述含有113个碱基的核苷酸片段是从牛布鲁氏菌A19号疫苗灭活菌液中克隆得到的，所述含有128个碱基的核苷酸片段是从羊布鲁氏菌5号疫苗株灭活菌液中克隆得到的。
5.根据权利要求4所述的一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于：所述阴性质控标准品为灭菌双蒸水。
6.一种鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)、样本基因组核酸的提取；
步骤(2)、以提取样本的DNA为模板，分别将样本DNA、牛种阳性标准模板、羊种阳性标准模板、阴性质控标准品加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的EP管中，按照优化后的PCR反应条件进行扩增：预变性95℃5min；95℃5sec，60℃30sec，72℃30sec，循环30次；72℃延伸10min；
步骤(3)、取5μLPCR产物与6×loading buffer混合，以2％琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察是否有113bp或128bp的扩增条带。
7.根据权利要求6所述布鲁氏菌普通PCR检测试剂盒的鉴别实验用动物牛羊布鲁氏菌的检测方法，其特征在于：待检测的样本可以为乳汁、阴道棉拭子、肛门棉拭子。
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