CN109306372A - 一种巢式pcr检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法 - Google Patents

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姜海
朴东日
赵鸿雁
杨晓雯
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract

一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明巢式PCR技术，既可检测和鉴定纯菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以鉴定待测标本核酸DNA的布鲁氏菌种型，也可以鉴定其生物型。巢式PCR结果分析可以标准化，试验操作简单，具有普通PCR技术的人员就可以完成。

Description

一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，本发明涉及检测和鉴定布鲁氏菌菌株和检测样品 (如：血液、血清、组织液，肝脾等)中布鲁氏菌DNA的巢式PCR技术方法，通过对PCR 扩增产物的测序，鉴定其布鲁氏菌种型和生物型。运用本方法可以快速地从病原学上对布鲁氏菌病感染做出诊断，以及鉴定其布鲁氏菌种型和生物型。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热，俗称“懒汉病”，是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病，布病广泛分布于世界各地。
目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬。病畜的分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，在动物间传播，造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布鲁氏菌感染。
布鲁氏菌为小球杆状菌，革兰氏染色阴性。本菌侵入机体后，随淋巴液到达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如细菌未被吞噬细胞杀灭，则在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶。潜伏期为7-60天，平均15天，少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在肝、脾、淋巴结、骨髓等处形成多发性病灶，造成临床上不仅有菌血症、败血症，而且还有毒血症的表现。经一定时期后，感染灶的细菌生长繁殖再次入血，导致疾病复发。如此反复成为慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大关节，表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等临床症状及体征。
布鲁氏菌常规检测方法主要有培养方法和虎红平板凝集试验(RBPT)、血清凝集试验 (SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等免疫学方法。培养中分离到布鲁氏菌仍然是布鲁氏菌病诊断的“金标准”，但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力，而且具有较大的生物安全性危害。免疫学方法目前已经用于布鲁氏菌病的监测和流行病学调查研究中，但由于在感染早期，机体还未产生相关抗体或产生的抗体还未达到检测的限度，得到假阴性结果；而且布鲁氏菌与某些细菌间又存在交叉反应，得到假阳性结果，影响了检测的特异性。
随着分子生物学技术的发展，PCR方法(包括普通PCR和荧光定量PCR)已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。对待检样品中的微量核酸DNA，单一引物的普通PCR和多重PCR方法难以检测，对纯菌DNA，单一引物难以鉴定其布鲁氏菌的生物型，多重PCR方法可以鉴定其生物型，但操作过程复杂，而且对微量DNA不能检测到；荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。对纯菌DNA具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点，可以检测到1 个拷贝数的核酸DNA，但是目前荧光定量PCR技术，由于组织液血液中的影响因素众多，导致假阳性率和假阴性率均较高，影响其在组织血液中布鲁氏菌核酸DNA检测中的应用。
本发明巢式PCR技术，既可检测和鉴定纯菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以鉴定到种型，也可以鉴定到生物型，其检测的最低限为1个拷贝的布鲁氏菌核酸DNA，灵敏度等同于荧光定量PCR的水平，而且可以标准化，操作简单，具有普通PCR技术的人员就可以完成。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、特异的微量核酸DNA布鲁氏菌种型和生物型的检测及鉴定的巢式PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，可以检测和鉴定布鲁氏菌种型及生物型，包括以下步骤：
(1)待检测样品核酸DNA的提取，各种形式的提取方法皆可，可提取自血液、血清、组织液和肝脾等组织液和血液；
(2)引物对的设计：应用软件如Primer 5.0软件分别设计布鲁氏菌特异性巢式PCR引物，具体的引物序列包括如下：
第一次PCR扩增引物：
正向引物：F1：5’-AACGTAACCAGATCATAGCGCATG-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-ACAGATGAGCAATGGAACCGGAT-3’，SEQ ID NO：2；
第二次PCR扩增引物：
正向引物：F2：5’-GAATGCGGTCAATGTTTTCTCGC-3’，SEQ ID NO：3；
反向引物：R2：5’-ATATCTTCCGGGGCGAGTTGGTA-3’，SEQ ID NO：4；
(3)以步骤(1)提取的核酸DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通过PCR反应第一次扩增模板核酸DNA，得到第一次PCR产物的核酸DNA；利用SEQ IDNO:3-4所示引物，通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA；
其中PCR扩增反应：将核酸DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述 PCR反应混合液，包括：PCR反应液、布鲁氏菌引物混合液；
(4)检测并分析PCR扩增产物；反应结束后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶为琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；PCR产物经90V电压,1％琼脂糖凝胶电泳1h后，进行凝胶成像分析。
若电泳结果被检样品第二次PCR扩增出大小为665-667bp的目的条带，表明该样品中布鲁氏菌核酸DNA阳性；若电泳结果被检样品第二次PCR扩增未有条带的，表明被检样品不存在布鲁氏菌核酸DNA，或者核酸DNA量少至PCR无法检测到；
(5)PCR产物测序：测序引物为正向引物F2和反向引物R2，双向测序，测通为止；
(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析确定种型或生物型，核苷酸序列分析有两种方法，任选其一；
第一种方法，将核苷酸序列提交NCBI，BLAST进行匹配分析，结果(sequencesproducing significant arrangements)匹配度最高者(Max score)，即可定为所鉴定的布鲁氏菌种及生物型；
第二种方法，采用MEGA5.1软件，与已知菌种及生物型的布鲁氏菌的核苷酸序列进行比对分析，聚类分析，待检样品的核酸DNA序列与已知核酸DNA序列一致的，即可定为该布鲁氏菌种及生物型；
作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR反应，包括两次PCR，第一次PCR和第二次PCR；
作为本发明进一步的优选方案：第一次PCR体系中的模板核酸DNA，为待检标本直接提取的核酸DNA；
作为本发明的优选方案：第二次PCR体系中的模板核酸DNA，为第一次PCR反应产物的核酸DNA；
作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反应体系包括：正向引物F1和反向引物R1各0.6μL，待检测的血液和组织液样品核酸DNA 1μl-4μl，10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μl，4种dNTP Mixture 2μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，补充双蒸馏水至25μl体积；
作为本发明的优选方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反应体系包括:10×Buffer(Mg2+， 15mmol/L)2.5μl，4种dNTP混合物溶液2μl，正向引物F2和反向引物R2混合物溶液各0.6μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，第一次PCR扩增产物核酸DNA 1μl-4μl，补充双蒸馏水至25μl体积；
作为本发明进一步的优选方案：引物溶液的浓度为10μmol/L。
作为本发明进一步的优选方案：所述的dNTP混合物溶液中各NTP(A、T、G和C) 的浓度为2.5mmol/L。
作为本发明进一步的优选方案：若为纯菌提取的核酸DNA，第一次和第二次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA模板量都为1μl，同时，补充双蒸馏水18.1μl。
作为本发明进一步的优选方案：若为组织液或血液中提取的微量核酸DNA，第一次和第二次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA模板量都为4μl，同时，补充双蒸馏水15.1μl。
作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR，第一次PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。
作为本发明进一步的优选方案：所述的巢式PCR，第二次PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：既可检测和鉴定纯菌布鲁氏菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA。灵敏度高，只要PCR反应体系含有1个拷贝的布鲁氏菌核酸DNA，即可检测和鉴定其布鲁氏菌种型和生物型；特异性好，非布鲁氏菌核酸DNA没有扩增产物。结果分析可以标准化，试验操作简单，具有普通PCR 技术的人员就可以完成。
附图说明
图1是本发明巢式PCR特异性扩增电泳图谱；
其中a,b,c,d,e,f,g,h分别指代蜡样芽胞杆菌，炭疽芽孢杆菌，大肠杆菌O:157，沙门氏菌,绿脓杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌O:9血清型，霍乱弧菌N330，牛种生物1型布鲁氏菌544A； a1,b1,c1,d1,e1,f1,g1,h1是用正向引物F1和反向引物R1(F1&R1)扩增图谱； a2,b2,c2,d2,e2,f2,g2,h2是用正向引物F2和反向引物R2扩增图谱(F2&R2)； a3,b3,c3,d3,e3,f3,g3,h3是用正向引物F1和反向引物R1扩增图谱(F1&R1)第一次PCR扩增标本核酸DNA，其产物行正向引物F2和反向引物R2第二次PCR扩增电泳图谱(F1&R1→ F2&R2)，阳性对照在666bp处有电泳条带，其它菌株核酸DNA没有电泳条带。
图2巢式PCR灵敏性测试电泳图谱；
其中1,2,3,4,5,6,7,8分别为巢式PCR反应体系中加入的布鲁氏菌羊种1型菌株16M核酸DNA倍比稀释菌浓度编号，其核酸DNA浓度分别为： 3.350fg/μl,1.675fg/μl,0.837fg/μl,0.419fg/μl,0.209fg/μl,0.105fg/μl,0.053fg/μl,0.0265fg/μl；用正向引物F1和反向引物R1第一次PCR扩增所加标本核酸DNA模板量为1μl，其PCR产物行正向引物F2和反向引物R2第二次PCR扩增，核酸DNA模板取第一次PCR扩增产物1μl，结果3.350fg/μl,1.675fg/μl,0.837fg/μl,0.209fg/μl组，PCR扩增出现特异电泳条带， 0.419fg/μl,0.105fg/μl,0.053fg/μl,0.0265fg/μl组，PCR扩增没有出现特异电泳条带。
图3血液提取核酸DNA巢式PCR扩增电泳图谱；
其中i,j,k,l,m,n,o分别为不同的病人血液提取的核酸DNA标本编号，p为布鲁氏菌核酸 DNA阳性对照：牛种布鲁氏菌生物1型544A菌株。i1,j1,k1,l1,m1,n1,o1,p1是用正向引物 F1和反向引物R1(F1&R1)扩增图谱，PCR反应体系中加入标本核酸DNA为4μl； i2,j2,k2,l2,m2,n2,o2,p2是用正向引物F2和反向引物R2扩增图谱(F2&R2)，PCR反应体系中加入标本核酸DNA为4μl；i3,j3,k3,l3,m3,n3,o3,p3是用正向引物F1和反向引物R1扩增图谱(F1&R1)第一次PCR扩增标本核酸DNA，PCR反应体系中加入标本核酸DNA为4μl，其产物行正向引物F2和反向引物R2第二次PCR扩增电泳图谱(F1&R1→F2&R2)，PCR反应体系中加入第一次PCR产物核酸DNA为4μl，结果，阳性对照在665-667bp处有电泳条带。巢式PCR扩增病人血液提取的核酸DNA，病人i和l血液中含有布鲁氏菌核酸DNA，病人j,k,m,n,o血液中不含有布鲁氏菌核酸DNA，或者该技术未检测到。
图4为实施例1使用MEGA5.1软件，采用非加权组平均法(UPGMA)与已知的核苷酸序列进行聚类分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不作为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，巢式PCR同时检测和鉴定布鲁氏菌种型及生物型，首先根据GenBank 登录的transposase orfA和transposase orfB基因序列，应用Primer 5.0软件分别设计巢式PCR 第一次和第二次扩增引物。
第一次PCR扩增引物：
正向引物：F1：5’-AACGTAACCAGATCATAGCGCATG-3’，如SEQ ID NO：1所示；
反向引物：R1：5’-ACAGATGAGCAATGGAACCGGAT-3’，如SEQ ID NO：2所示；
第二次PCR扩增引物：
正向引物：F2：5’-GAATGCGGTCAATGTTTTCTCGC-3’，如SEQ ID NO：3所示；
反向引物：R2：5’-ATATCTTCCGGGGCGAGTTGGTA-3’，如SEQ ID NO：4所示；请参阅图1～4，本发明从以下具体实施步骤进行试验：
1、引物特异性验证
1)正向引物F1和反向引物R1扩增蜡样芽胞杆菌，炭疽芽孢杆菌，大肠杆菌O:157，沙门氏菌，绿脓杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌O:9血清型，霍乱弧菌N330核酸DNA模板。
2)正向引物F2和反向引物R2扩增蜡样芽胞杆菌，炭疽芽孢杆菌，大肠杆菌O:157，沙门氏菌，绿脓杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌O:9血清型，霍乱弧菌N330核酸DNA模板。
3)第一次用正向引物F1和反向引物R1扩增蜡样芽胞杆菌，炭疽芽孢杆菌，大肠杆菌O:157，沙门氏菌，绿脓杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌O:9血清型，霍乱弧菌N330核酸DNA模板；第二次用正向引物F2和反向引物R2扩增第一次PCR扩增产物模板。
4)PCR反应体系包括:10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μl，4种dNTP Mixture(各2.5mmol/ L)2μl，正向引物和反向引物各0.6μl(10μmol/L)，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，核酸DNA模板1μl，补充双蒸馏水18.1μl，至25μl体积。PCR反应条件：94℃预变性4min； 94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环：72℃延伸5min。
(1)第一次PCR扩增，应用正向引物F1和反向引物R1，其DNA模板量为1μl，第二次PCR扩增，应用正向引物F2和反向引物R2，其DNA模板为第一次PCR扩增产物1μl；
(2)反应条件，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增完全一致。
2、引物灵敏性验证
1)第一次用正向引物F1和反向引物R1扩增鲁氏菌羊种1型菌株16M核酸DNA倍比稀释核酸DNA浓度分别为 3.350fg/μl,1.675fg/μl,0.837fg/μl,0.419fg/μl,0.209fg/μl,0.105fg/μl,0.053fg/μl,0.0265fg/μl等8个组别，取布鲁氏菌核酸DNA模板1μ；
2)第二次应用正向引物F2和反向引物R2行PCR扩增第一次PCR扩增产物1μl；
3)反应体系及反应条件：
(1)PCR反应体系包括:10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μl，4种dNTP Mixture(各2.5mmol/L) 2μl，正向引物和反向引物各06μl(10μmol/L)，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)02μl核酸DNA 模板1μl，补充双蒸馏水18.1μl，至25μl体积。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。
(2)第一次PCR扩增，应用正向引物F1和反向引物R1，第二次PCR扩增，应用正向引物F2和反向引物R2；
(3)反应条件，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增完全一致。
3、结果
第二次PCR反应结束后，其扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶为琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；
1)引物特异性的PCR扩增产物的电泳结果如图1所示，由图可知：本发明所设计的巢式PCR 引物均具有较高的特异性，其它他菌株没有特异电泳条带。
2)引物灵敏性的PCR扩增产物的电泳结果如图2所示，由图可知：本发明所设计的巢式PCR 引物均具有较高的灵敏性。PCR反应体系只要有1个拷贝数的布鲁氏菌核酸DNA，即能对核酸DNA进行检测和布鲁氏菌种型和生物型的鉴定。本发明研究巢式PCR灵敏度试验重复了4次，扩增结果：
①≥6.7ng/ul的浓度全部能扩增出条带。
②3.350ng/ul的100％(4/4)，(相当于1个布鲁氏菌核酸DNA拷贝数(1copy)/ul，1ul 有100％的机率有1个拷贝数)。
③1.675fg的50％(2/4)出现条带，(1copy)/2ul，即1ul有50％的机率有1个拷贝数。
④0.837fg的50％(2/4)出现条带，(1copy)/4ul，1ul有25％的机率有1个拷贝数。
⑤0.419fg的50％(2/4)出现条带,(1copy)/8ul，1ul有12.5％的机率有1个拷贝数。
⑥0.209fg的25％(1/4)出现条带,(1copy)/16ul，1ul有6.26％的机率有1个拷贝数。
只要有1个拷贝数的布鲁氏菌核酸DNA，巢式PCR即可检测并鉴定其种和生物型。
3)临床分离菌株及血液标本提取核酸DNA巢式PCR检测结果：
本发明共选择了118份纯菌，22份血液标本提取的核酸DNA进行测试，使用本发明上述巢式PCR扩增，扩增产物提交公司进行测序。
(1)测序结果提交NCBI，进行序列比对分析，除了下列菌株结果不一致之外，其它测序结果与已知菌株资料完全一致，从而得到待测标本核酸DNA的布鲁氏菌的种型和生物型结果。
①菌株686B.suis bv.3，CCM4915B.miroti，513B.suis bv.5三株菌株序列完全一致，不能鉴定其布鲁氏菌种型。
②B1119B.abortus Rough与B.canis B.ovis CCM4915B.miroti，B.suis序列一致，不能鉴定其布鲁氏菌种型。
③B.ovis与某些B.canis，B.ovis和B.suis一致，不能鉴定其布鲁氏菌种型。
④5k33B.neotomae与某些B.abortus序列一致，不能鉴定其布鲁氏菌种型。
序列比对结果符合率为95.71％(134/140)。
(2)使用MEGA5.1软件，采用非加权组平均法(UPGMA)与已知菌株资料的核苷酸序列进行聚类分析，见图4，聚类分析结果：5K33B.neotomae种归在牛种内，羊种EtherB.melitensis bv.3菌株归在牛种内，CCM4915B.microti种归在猪种内，2株犬种归在猪种内。其它菌株完全一致，符合率为96.42％(135/140)。
4、分析
用所建立的巢式PCR方法检测纯菌和组织液提取核酸DNA，特异性强，除布鲁氏菌核酸DNA，其它菌种没有特异扩增电泳条带；灵敏性高，只要有一个拷贝数的核酸DNA，即可检测到，并且可以进行待测标本核酸DNA的布鲁氏菌种型和生物型的鉴定，该发明不仅优越于多重PCR的种型和生物型的鉴定，同时也优越于荧光定量PCR，灵敏度高于纯菌的荧光定量PCR(6.7fg/ul,相当于2个布鲁氏菌核酸DNA拷贝数)，却远远高于荧光定量PCR 检测血液标本。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 1
aacgtaacca gatcatagcg catg 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 2
acagatgagc aatggaaccg gat 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 3
gaatgcggtc aatgttttct cgc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> “人工序列”
<400> 4
atatcttccg gggcgagttg gta 23

Claims (9)

1.一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待检测样品核酸DNA的提取；
(2)引物对的设计：应用软件分别设计布鲁氏菌特异性巢式PCR引物，具体的引物序列包括如下：
第一次PCR扩增引物：
正向引物：SEQ ID NO：1；
反向引物：SEQ ID NO：2；
第二次PCR扩增引物：
正向引物：F2：SEQ ID NO：3；
反向引物：R2：SEQ ID NO：4；
(3)以步骤(1)提取的核酸DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物，通过PCR反应第一次扩增模板核酸DNA，得到第一次PCR产物的核酸DNA；利用SEQ IDNO:3-4所示引物，通过PCR反应第二次扩增第一次PCR产物的核酸DNA；
(4)检测并分析PCR扩增产物；反应结束后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳；所述的1％的琼脂糖凝胶为琼脂糖：凝胶的质量体积比为0.01g/ml；PCR产物经90V电压,1％琼脂糖凝胶电泳1h后，进行凝胶成像分析。
若电泳结果被检样品第二次PCR扩增出大小为665-667bp的目的条带，表明该样品中布鲁氏菌核酸DNA阳性；若电泳结果被检样品第二次PCR扩增未有条带的，表明被检样品不存在布鲁氏菌核酸DNA；
(5)PCR产物测序：测序引物为正向引物F2和反向引物R2，双向测序，测通为止；
(6)对步骤(5)测序核苷酸序列进行分析确定种型或生物型。
2.按照权利要求1所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，其中PCR扩增反应：将核酸DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、布鲁氏菌引物混合液。
3.按照权利要求1所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，核苷酸序列分析有两种方法，任选其一；
第一种方法，将核苷酸序列提交NCBI，BLAST进行匹配分析，结果(sequencesproducing significant arrangements)匹配度最高者(Max score)，即可定为所鉴定的布鲁氏菌种及生物型；
第二种方法，采用MEGA5.1软件，与已知菌种及生物型的布鲁氏菌的核苷酸序列进行比对分析，聚类分析结果，待检样品的核酸DNA序列与已知核酸DNA序列一致的，即可定为该布鲁氏菌种及生物型。
4.按照权利要求1所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，第一次PCR反应体系包括：正向引物F1和反向引物R1各0.6μL，待检测样品核酸DNA 1-4μl，10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μl，4种dNTP Mixture 2μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，补充双蒸馏水至25μl体积；
第二次PCR反应体系包括:10×Buffer(Mg2+，15mmol/L)2.5μl，4种dNTP混合物溶液2μl，正向引物F2和反向引物R2混合物溶液各0.6μl，Taq酶(TaKaRa LA Taq酶5U/μl)0.2μl，第一次PCR扩增产物核酸DNA 1-4μl，补充双蒸馏水至25μl体积。
5.按照权利要求4所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，引物溶液的浓度为10μmol/L；所述的dNTP混合物溶液中4种NTP(A、T、G和C)的浓度为2.5mmol/L。
6.按照权利要求4所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，若为纯菌提取的核酸DNA，第一次和第二次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA的量都为1μl，其它条件不变。
7.按照权利要求4所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，若为组织液或血液中提取的微量核酸DNA，第一次和第二次PCR反应体系中，加入待测核酸DNA的量都为4μl，其它条件不变。
8.按照权利要求4所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述的巢式PCR，第一次PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min；第二次PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。
9.按照权利要求1所述的一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于，步骤(1)待检测样品核酸DNA的提取为纯菌核酸DNA，或从组织液或/和血液中提取的微量核酸DNA。
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