CN111733217A - 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法 - Google Patents

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Abstract

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明数字PCR技术，既可检测和鉴定纯菌布鲁氏菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液如血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以定性的鉴定待测标本布鲁氏菌核酸DNA，也可以定量的检测待检样品的布鲁氏菌核酸DNA拷贝数，可检测核酸DNA最低量3.67fg/μL，即可检测的范围最小可到1个布鲁氏菌核酸DNA拷贝。另外，数字PCR结果分析能够标准化，可进行不同实验者数据比较。

Description

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，本发明涉及检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，运用本方法可以快速的、定量的检测出待测样品中布鲁氏菌核酸DNA的拷贝数。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热，俗称“懒汉病”，是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病，布病广泛分布于世界各地。
目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬。病畜的血液等组织中，以及其分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，在动物间传播，造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布鲁氏菌感染。
传统的布鲁氏菌病的检测方法主要有培养方法和血清学方法，但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力，而且具有较大的生物安全性危害。血清学方法存在着假阳性和假阴性的结果，影响了检测结果。
随着分子生物学技术的发展，PCR方法(包括普通PCR和荧光定量PCR)已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。对待检样品中的微量核酸DNA，单一引物的普通PCR和多重PCR方法难以检测；荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。对纯菌DNA具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点，可以检测到1个拷贝数的核酸DNA，但是目前荧光定量PCR技术，由于组织液血液中的影响因素众多，导致假阳性率和假阴性率均较高，影响其在组织血液中布鲁氏菌核酸DNA检测中的应用。
数字PCR(Droplet Digital PCR，dd PCR))是几年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万个油包水的液化微滴中，理想的状态是每个微液中含有一个或者不含有核酸DNA，经过PCR扩增后，使用荧光检测器检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理计算出核酸DNA的拷贝数，与实时荧光定量PCR相比，该方法具有精确、灵敏度高和不易受PCR抑制物影响等优点，因此本发明在于研发针对布鲁氏菌核酸DNA检测的数字PCR技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异的定量检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判读。所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸 DNA、2╳ddPCRSupermix、引物、探针和双蒸馏水。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，可以定量的检测布鲁氏菌核酸DNA，包括以下步骤：
(1)待检测样品核酸DNA的提取，可提取布鲁氏菌核酸DNA的方法皆可；待检核酸DNA 为提取的核酸DNA；
(2)引物对的设计：在布鲁氏菌特异的编码bcsp31蛋白的基因核苷酸序列上设计引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列:Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3。其中， 5’端荧光基团FAM标记，3’端淬灭基团BHQ-1标记。
(3)PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix、正向引物F1、反向引物R1、探针Probe；
进一步优选PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补充双蒸馏水至20μL；引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L；
(4)PCR反应体系预处理过程如下：
①制备微滴：将20μLPCR反应体系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
②封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
③PCR反应：将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
进一步的优选方案：PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
进一步的优选方案：PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过软件如QuantaSoftV1.7.4软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。
与现有技术相比，本发明技术具有精确、灵敏和适用性广等优点；灵敏性高，可检测单拷贝核酸DNA；实现绝对定量的，不依赖Ct值，无需标准曲线，可检测布鲁氏菌微量核DNA。
附图说明
图1数字PCR探针浓度优化图谱：
根据阳性微滴数和阴性微滴数间距大(大于4000)，阳性微滴数和阴性微滴数相对集中，阳性微滴数多等特征进行优化。参考相关文献，初设引物浓度为800μmol/L(20μL反应体系，加引物浓度为10μmol/L的1.6μL)，探针初始浓度为10μmol/L，20μL反应体系分别设含有探针0.3μL，0.5μL，0.8μL，1.0μL，1.2μL，1.6μL，1.8μL，无探针等8 个反应体系，如图1所示，20μL反应体系含探针浓度为10μmol/L的0.8μL的探针最适宜。
图2数字PCR引物浓度优化图谱：
根据阳性微滴数和阴性微滴数间距大(大于4000)，阳性微滴数和阴性微滴数相对集中，阳性微滴数多等特征进行优化。20μL反应体系，设固定探针加入量为0.8μL(探针浓度为10μmol/L)，引物初始浓度为10μmol/L，分别设探针加入量为0.3μL，0.5μL，0.8 μL，1.0μL，1.2μL，1.6μL，1.8μL，无引物等8个反应体系。如图2所示，20μL反应体系加入1.6μL的引物(浓度为10μmol/L)的最适宜。
图3 PCR反应退火温度优化图谱：
数字PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各μL(浓度为10μmol/L)；探针Probe 0.8μL(浓度为10μmol/L)，补充双蒸馏水至20μL。PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度待优化，1min，循环40次；98℃酶失活10min。退火温度优化梯度分别为54.5℃， 55.7℃，57.2℃，59℃，59.9℃，60.8℃，62℃。如图3所示，最适退火温度选择59℃图4数字PCR灵敏性图谱：
可检测核酸DNA 3.67fg/μL，约等于1个核酸DNA拷贝数。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不作为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例灵敏性试验
1、待检测样品核酸DNA为试剂盒提取的核酸DNA；
2、正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端标记荧光基团FAM，3’端使标记淬灭基团BHQ-1。
3、数字PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL(为数字PCR专用酶体系)；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补充双蒸馏水至20μL。其中，引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L；
4、PCR反应体系预处理过程如下：
1.(1)制备微滴：将20μLPCR反应体系和70μL的微滴生成油(Droplet GenerationOil for Probe(Bio-Rad，USA)，for use with QX100TM/QX200TM droplet generator)，加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
(2)封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
(3)PCR反应：将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
5、数字PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
6、PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过QuantaSoftV1.7.4软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。如图所示，试管编号12，13，14，15，16， 17，18；20，21，22，23，24，25，26，其核酸DNA浓度分别为15.06pg/μL，7.53pg/μL， 3.77pg/μL，1.88pg/μL，940fg/μL，470fg/μL，235fg/μL，117.5fg/μL，58.75fg/μL，29.38 fg/μL，14.69fg/μL，7.34fg/μL，3.67fg/μL，1.84fg/μL，0.92fg/μL；其对应的阳性微滴数分别为(拷贝数/ul)：2820，1710，816，402，190，140，76；6，2，1，1，1，0，0。见图4。
7、分析
用所建立的数字PCR方法检测组织液提取的核酸DNA，特异性强，除布鲁氏菌核酸DNA，其它菌种没有特异扩增电泳条带；灵敏性高，只要有一个拷贝的核酸DNA，即可检出，该发明不仅优越于单重PCR，同时远远高于荧光定量PCR检测水平。
图中的实施例对应的待检核酸DNA 3.67fg/μL，约等于1个核酸DNA拷贝数。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法
<160>3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>1
acctt gccct tgcca tcat 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>2
agtcc ggctt tacgc agtca 20
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>3
tgccg ttata ggccc aatag gcaac g 26.

Claims (8)

1.一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断；所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸DNA、2╳ddPCR Supermix、引物、探针和双蒸馏水。
2.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，待检测样品核酸DNA为各种可用的试剂盒提取的核酸DNA。
3.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针，根据布鲁氏菌特异编码bscp31蛋白基因的核苷酸序列，应用软件分别设计布鲁氏菌特异的引物和探针，其物核苷酸序列如下所示：
正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端标记荧光基团FAM，3’端使标记淬灭基团BHQ-1。
4.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补水至20μL。
5.按照权利要求4所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L。
6.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系预处理过程如下：
(1)制备微滴：将20μL PCR反应体系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
(2)封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
(3)将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
7.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，数字PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
8.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。
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