CN111733217A - 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法 - Google Patents

一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111733217A
CN111733217A CN201910955795.4A CN201910955795A CN111733217A CN 111733217 A CN111733217 A CN 111733217A CN 201910955795 A CN201910955795 A CN 201910955795A CN 111733217 A CN111733217 A CN 111733217A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid dna
pcr
digital pcr
brucella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910955795.4A
Other languages
English (en)
Inventor
田国忠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority to CN201910955795.4A priority Critical patent/CN111733217A/zh
Publication of CN111733217A publication Critical patent/CN111733217A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明数字PCR技术，既可检测和鉴定纯菌布鲁氏菌核酸DNA，也可以检测和鉴定组织液如血液等微量布鲁氏菌核酸DNA；不仅可以定性的鉴定待测标本布鲁氏菌核酸DNA，也可以定量的检测待检样品的布鲁氏菌核酸DNA拷贝数，可检测核酸DNA最低量3.67fg/μL，即可检测的范围最小可到1个布鲁氏菌核酸DNA拷贝。另外，数字PCR结果分析能够标准化，可进行不同实验者数据比较。

Description

一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，本发明涉及检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，运用本方法可以快速的、定量的检测出待测样品中布鲁氏菌核酸DNA的拷贝数。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热，俗称“懒汉病”，是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病，布病广泛分布于世界各地。
目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬。病畜的血液等组织中，以及其分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，在动物间传播，造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布鲁氏菌感染。
传统的布鲁氏菌病的检测方法主要有培养方法和血清学方法，但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力，而且具有较大的生物安全性危害。血清学方法存在着假阳性和假阴性的结果，影响了检测结果。
随着分子生物学技术的发展，PCR方法(包括普通PCR和荧光定量PCR)已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。对待检样品中的微量核酸DNA，单一引物的普通PCR和多重PCR方法难以检测；荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。对纯菌DNA具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点，可以检测到1个拷贝数的核酸DNA，但是目前荧光定量PCR技术，由于组织液血液中的影响因素众多，导致假阳性率和假阴性率均较高，影响其在组织血液中布鲁氏菌核酸DNA检测中的应用。
数字PCR(Droplet Digital PCR，dd PCR))是几年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万个油包水的液化微滴中，理想的状态是每个微液中含有一个或者不含有核酸DNA，经过PCR扩增后，使用荧光检测器检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理计算出核酸DNA的拷贝数，与实时荧光定量PCR相比，该方法具有精确、灵敏度高和不易受PCR抑制物影响等优点，因此本发明在于研发针对布鲁氏菌核酸DNA检测的数字PCR技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异的定量检测布鲁氏菌核酸DNA的数字PCR方法，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判读。所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸 DNA、2╳ddPCRSupermix、引物、探针和双蒸馏水。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，可以定量的检测布鲁氏菌核酸DNA，包括以下步骤：
(1)待检测样品核酸DNA的提取，可提取布鲁氏菌核酸DNA的方法皆可；待检核酸DNA 为提取的核酸DNA；
(2)引物对的设计：在布鲁氏菌特异的编码bcsp31蛋白的基因核苷酸序列上设计引物和探针，其核苷酸序列如下：
正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列:Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3。其中， 5’端荧光基团FAM标记，3’端淬灭基团BHQ-1标记。
(3)PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix、正向引物F1、反向引物R1、探针Probe；
进一步优选PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补充双蒸馏水至20μL；引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L；
(4)PCR反应体系预处理过程如下：
①制备微滴：将20μLPCR反应体系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
②封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
③PCR反应：将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
进一步的优选方案：PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
进一步的优选方案：PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过软件如QuantaSoftV1.7.4软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。
与现有技术相比，本发明技术具有精确、灵敏和适用性广等优点；灵敏性高，可检测单拷贝核酸DNA；实现绝对定量的，不依赖Ct值，无需标准曲线，可检测布鲁氏菌微量核DNA。
附图说明
图1数字PCR探针浓度优化图谱：
根据阳性微滴数和阴性微滴数间距大(大于4000)，阳性微滴数和阴性微滴数相对集中，阳性微滴数多等特征进行优化。参考相关文献，初设引物浓度为800μmol/L(20μL反应体系，加引物浓度为10μmol/L的1.6μL)，探针初始浓度为10μmol/L，20μL反应体系分别设含有探针0.3μL，0.5μL，0.8μL，1.0μL，1.2μL，1.6μL，1.8μL，无探针等8 个反应体系，如图1所示，20μL反应体系含探针浓度为10μmol/L的0.8μL的探针最适宜。
图2数字PCR引物浓度优化图谱：
根据阳性微滴数和阴性微滴数间距大(大于4000)，阳性微滴数和阴性微滴数相对集中，阳性微滴数多等特征进行优化。20μL反应体系，设固定探针加入量为0.8μL(探针浓度为10μmol/L)，引物初始浓度为10μmol/L，分别设探针加入量为0.3μL，0.5μL，0.8 μL，1.0μL，1.2μL，1.6μL，1.8μL，无引物等8个反应体系。如图2所示，20μL反应体系加入1.6μL的引物(浓度为10μmol/L)的最适宜。
图3 PCR反应退火温度优化图谱：
数字PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各μL(浓度为10μmol/L)；探针Probe 0.8μL(浓度为10μmol/L)，补充双蒸馏水至20μL。PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度待优化，1min，循环40次；98℃酶失活10min。退火温度优化梯度分别为54.5℃， 55.7℃，57.2℃，59℃，59.9℃，60.8℃，62℃。如图3所示，最适退火温度选择59℃图4数字PCR灵敏性图谱：
可检测核酸DNA 3.67fg/μL，约等于1个核酸DNA拷贝数。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不作为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例灵敏性试验
1、待检测样品核酸DNA为试剂盒提取的核酸DNA；
2、正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端标记荧光基团FAM，3’端使标记淬灭基团BHQ-1。
3、数字PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL(为数字PCR专用酶体系)；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补充双蒸馏水至20μL。其中，引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L；
4、PCR反应体系预处理过程如下：
1.(1)制备微滴：将20μLPCR反应体系和70μL的微滴生成油(Droplet GenerationOil for Probe(Bio-Rad，USA)，for use with QX100TM/QX200TM droplet generator)，加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
(2)封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
(3)PCR反应：将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
5、数字PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
6、PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过QuantaSoftV1.7.4软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。如图所示，试管编号12，13，14，15，16， 17，18；20，21，22，23，24，25，26，其核酸DNA浓度分别为15.06pg/μL，7.53pg/μL， 3.77pg/μL，1.88pg/μL，940fg/μL，470fg/μL，235fg/μL，117.5fg/μL，58.75fg/μL，29.38 fg/μL，14.69fg/μL，7.34fg/μL，3.67fg/μL，1.84fg/μL，0.92fg/μL；其对应的阳性微滴数分别为(拷贝数/ul)：2820，1710，816，402，190，140，76；6，2，1，1，1，0，0。见图4。
7、分析
用所建立的数字PCR方法检测组织液提取的核酸DNA，特异性强，除布鲁氏菌核酸DNA，其它菌种没有特异扩增电泳条带；灵敏性高，只要有一个拷贝的核酸DNA，即可检出，该发明不仅优越于单重PCR，同时远远高于荧光定量PCR检测水平。
图中的实施例对应的待检核酸DNA 3.67fg/μL，约等于1个核酸DNA拷贝数。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>一种数字PCR检测布鲁氏菌核酸DNA的方法
<160>3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>1
acctt gccct tgcca tcat 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>2
agtcc ggctt tacgc agtca 20
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>“人工序列”
<400>3
tgccg ttata ggccc aatag gcaac g 26.

Claims (8)

1.一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，配置PCR反应体系，经过预处理后，在一定的PCR反应条件下，使用PCR仪，进行PCR扩增，扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断；所述PCR反应体系，包括：待检样品核酸DNA、2╳ddPCR Supermix、引物、探针和双蒸馏水。
2.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，待检测样品核酸DNA为各种可用的试剂盒提取的核酸DNA。
3.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针，根据布鲁氏菌特异编码bscp31蛋白基因的核苷酸序列，应用软件分别设计布鲁氏菌特异的引物和探针，其物核苷酸序列如下所示：
正向引物：F1：5’-ACCTTGCCCTTGCCATCAT-3’，SEQ ID NO：1；
反向引物：R1：5’-AGTCCGGCTTTACGCAGTCA-3’，SEQ ID NO：2；
探针序列：Probe：5’-TGCCGTTATAGGCCCAATAGGCAACG-3’，SEQ ID NO：3，其中，5’端标记荧光基团FAM，3’端使标记淬灭基团BHQ-1。
4.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系包括：2╳ddPCR Supermix 10μL；待检核酸DNA 1μL；正向引物F1和反向引物R1各1.6μL，探针Probe 0.8μL，补水至20μL。
5.按照权利要求4所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，引物和探针溶液的浓度皆为10μmol/L。
6.按照权利要求1所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR反应体系预处理过程如下：
(1)制备微滴：将20μL PCR反应体系和70μL的微滴生成油加入到微滴生成卡槽内，盖上胶垫，放入微滴生成仪中产生微滴；
(2)封膜：将微滴生成仪中产生微滴约40μL，用移液枪转移到96孔PCR板中，盖上锡纸膜，用封膜仪将96孔PCR板封膜；
(3)将封膜的PCR板，放在PCR仪中运行。
7.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，数字PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度59℃，1min，循环40次；98℃酶失活10min。
8.按照权利要求6所述的一种数字PCR技术检测布鲁氏菌核酸DNA的方法，其特征在于，PCR扩增结果使用微滴分析仪，进行分析判断，将96孔PCR板放在微滴分析仪中读取荧光信号，通过软件对结果进行分析，阳性对照和阴性对照成立的前提下，计数阳性微滴数，即核酸DNA的拷贝数。
CN201910955795.4A 2019-10-09 2019-10-09 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法 Pending CN111733217A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910955795.4A CN111733217A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910955795.4A CN111733217A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111733217A true CN111733217A (zh) 2020-10-02

Family

ID=72646127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910955795.4A Pending CN111733217A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111733217A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755618A (zh) * 2021-10-14 2021-12-07 中国动物卫生与流行病学中心 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法
CN114107530A (zh) * 2021-12-15 2022-03-01 上海交通大学 一种生菜中基于液滴数字pcr技术的沙门氏菌检测方法及试剂盒
CN117660672A (zh) * 2023-12-28 2024-03-08 山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心) 基于布鲁氏菌的双重数字pcr方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006097347A2 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra, S.A. Methods for detecting, identifying and differentiating species and vaccine strains of the brucella genus
KR20170055766A (ko) * 2015-11-12 2017-05-22 전북대학교산학협력단 약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물
US20170321257A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bacterial pathogen identification by high resolution melting analysis
CN109306372A (zh) * 2018-09-14 2019-02-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种巢式pcr检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006097347A2 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra, S.A. Methods for detecting, identifying and differentiating species and vaccine strains of the brucella genus
KR20170055766A (ko) * 2015-11-12 2017-05-22 전북대학교산학협력단 약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물
US20170321257A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bacterial pathogen identification by high resolution melting analysis
CN109306372A (zh) * 2018-09-14 2019-02-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种巢式pcr检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
石丽瑞等: "布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用", 《中国动物检疫》 *
韩冰等: "数字PCR和荧光定量PCR诊断急性期布鲁氏菌病的灵敏度比较初步研究", 《传染病信息》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755618A (zh) * 2021-10-14 2021-12-07 中国动物卫生与流行病学中心 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法
CN114107530A (zh) * 2021-12-15 2022-03-01 上海交通大学 一种生菜中基于液滴数字pcr技术的沙门氏菌检测方法及试剂盒
CN117660672A (zh) * 2023-12-28 2024-03-08 山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心) 基于布鲁氏菌的双重数字pcr方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9222126B2 (en) Methods for point-of-care detection of nucleic acid in a sample
DK2271767T3 (en) Amplikonredning-multiplex polymerase chain reaction for the amplification of multiple target
CN111733217A (zh) 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法
CN113502352B (zh) 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
CN114085896A (zh) 使用非干扰性噪音消除性多核苷酸鉴定标签的多重焦磷酸测序
Li et al. Rapid detection of Brucella spp. and elimination of carryover using multiple cross displacement amplification coupled with nanoparticles-based lateral flow biosensor
Pusterla et al. Real‐time polymerase chain reaction: a novel molecular diagnostic tool for equine infectious diseases
CN108796131A (zh) 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN103614489B (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN116171198A (zh) 用于快速早期检测感染的宿主rna生物标志物和早期鉴定人的covid-19冠状病毒感染的系统、方法和组合物
CN111876502B (zh) 双重实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌s2疫苗株的方法及其使用的成套试剂
CN111206121A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒
CN111500778A (zh) 逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法
CN106434996A (zh) 一种检测鲍曼不动杆菌dna的试剂盒及检测方法
CN114774563B (zh) 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用
CN103210093B (zh) 一种检测消化道病原体的方法
Foord et al. Microsphere suspension array assays for detection and differentiation of Hendra and Nipah viruses
CN113186312A (zh) 一种区分布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的分子标记
KR20140008788A (ko) ＩＰ-10(ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ-10) ｍＲＮＡ표적 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트
CN106566889A (zh) 检测奇异变形杆菌的引物及探针、试剂盒、方法
KR101336862B1 (ko) 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트
Saeed et al. Real-time polymerase chain reaction: applications in diagnostic microbiology
CN103276107B (zh) 一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法
RU2738901C1 (ru) Тест-система для выявления генома вируса ЧМЖ методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
RU2762759C1 (ru) Способ пробоподготовки образцов изолятов коронавируса SARS-CoV-2 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201002