CN103276107B - 一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法，该方法以排除PCR扩增产物污染为前提、以多重PCR–质谱联用为平台的高灵敏度检测和/或鉴定人多瘤病毒的方法，本发明检测的12种人类多瘤病毒包括：BKPyV、JCPyV、KIPyV、WUPyV、MCPyV、HPyV6、HPyV7、TSPyV、HPyV9、MWPyV、STLPyV和HPyV12，检测部位为病毒基因组中编码病毒衣壳蛋白的晚期编码区VP1。
Description
技术领域
本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测和鉴定人多瘤病毒的方法。
背景技术
多瘤病毒是双链DNA病毒，基因组约4700-5400碱基对，编码结构蛋白和抗原。自Gross于1953年发现鼠多瘤病毒可引发鼠肿瘤以来，多瘤病毒一直被怀疑是人类肿瘤的致病因素。然而，虽然多瘤病毒感染能够在动物模型中诱发肿瘤，但是一直没有发现引起人类肿瘤的确切证据。在动物中，多瘤病毒DNA整合入宿主基因组经常先于肿瘤形成。
截止2013年3月，已发现的人多瘤病毒有12种。1971年报道的BK polyomavirus(BKPyV)和JC polyomavirus(JCPyV)被视为最早发现的人多瘤病毒。BKPyV被认为与肾病和膀胱炎有关；JCPyV则与进行性多灶性脑白质病有关；2007年，KI polyomavirus(KIPyV)和WUpolyomavirus(WUPyV)从呼吸道分离出来，但其致病性仍不清楚。美国学者Feng于2008年在《Science》杂志首次报道，从人类Merkel细胞瘤(简称MCC)样本中检测到未知病毒T抗原和人酪氨酸磷酸酶受体的融合基因转录本。经过鉴定和序列分析发现其为一个之前未知的多瘤病毒，含有5387个碱基对基因组，他们将之定名为Merkel细胞多瘤病毒（Merkel cellpolyomavirus，MCV或MCPyV)，成为首个被确定为与恶性肿瘤相关的人类多瘤病毒（Fenget al.2008）。由于MCPyV存在的拷贝数极其低，平均一个细胞仅含有一个病毒颗粒，一般技术难以检测到。美国国立肿瘤研究所（NCI）的学者Schowalter等发明了一种改进的滚动循环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术，从皮肤拭抹样本中分离到环型DNA病毒基因组，完整的MCPyV基因组可以从40%(14/35)的健康成人中获得。RCA分析还揭示了2个以前未知的多瘤病毒称为human polyomavirus6(HPyV6)and HPyV7，在健康人样本中检测到HPyV6（5/35）和HPyV7DNA（4/35）。经血清学研究发现，在95名献血员的血清中检出61%(58/95)MCPyV阳性，69%(66/95)HPyV6和35%（33/95）HPyV7阳性，该结果表明，这3种病毒的单独感染或共感染非常普遍(Schowalter et al.,2010)。荷兰莱顿大学的学者van der Meijden于2010年从心脏移植病人面部粉刺皮肤病中分离到一种多瘤病毒trichodysplasiaspinulosa-associated polyomavirus(TSPyV)（van der Meijden et al.,2010），成为第8种人类多瘤病毒。德国学者Scuda于2010年从肾移植免疫抑制治疗病人的血浆中检测到一个新的多瘤病毒，序列分析显示最靠近的亲缘关系为非洲绿猴起源的淋巴多瘤病毒，该病毒自然地感染人类，被命名为HPyV9(Scuda et al.,2011)。2012年，美国学者分别从粪便，患WHIM综合征，包括特征性的疣(warts)、低丙种球蛋白血症(hypogammaglobulinemia)、细菌感染(recurrentbacterial infection)和先天性骨髓粒细胞缺乏症(myelokathexis)病人皮肤中发现了第10种多瘤病毒MW polyomavirus(MWPyV),HPyV10和MX polyomavirus(MXPyV)（Lim et al.,2012,Bucket al.,2012,Yu et al.,2012)。序列分析表明MWPyV,HPyV10和MXPyV属于同一种人多瘤病毒。美国华盛顿大学Lim于2012年从美国和非洲儿童粪便中检出一种新的多瘤病毒STLpolyomavirus(STLPyV)，检出率约为1%，成为第11种人多瘤病毒（Lim et al.2012）。2013年，德国学者Korup等从人类肝组织中发现第12种人多瘤病毒，HPyV12(Korup,et al.2013)。
在已发现的12种人多瘤病毒中，至今已有4种人多瘤病毒确定与人类疾病相关（BKPyV,JCPyV,MCPyV和TSPyV），并且发现存在多种多瘤病毒共同感染的状况。然而，目前的人多瘤病毒DNA检测方法，还停留在单个病毒特异性PCR或荧光定量PCR检测阶段，尚未见有囊括多种人类多瘤病毒检测的方法报道。由于检测通量低，严重影响了人多瘤病毒与人类疾病关系的深入研究。
发明内容
本发明提供了一种高灵敏度、高通量可同时检测12种人多瘤病毒的方法。
本发明检测的12种人类多瘤病毒包括：BKPyV、JCPyV、KIPyV、WUPyV、MCPyV、HPyV6、HPyV7、TSPyV、HPyV9、MWPyV、STLPyV和HPyV12，检测部位为病毒基因组中编码病毒衣壳蛋白的晚期编码区VP1。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
1、引物设计：涵盖2013年3月之前公开发表的12种人类多瘤病毒，包括：BKPyV、JCPyV、KIPyV、WUPyV、MCPyV、HPyV6、HPyV7、TSPyV、HPyV9、MWPyV、STLPyV和HPyV12型。根据待测人多瘤病毒全序列，获取VP1基因区，选择每种病毒的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种人多瘤病毒的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种人多瘤病毒扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
2、PCR反应:在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：使未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
4、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，
5、树脂脱盐：纯化延伸反应产物。
6、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MASS）系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人多瘤病毒类别，软件自动处理报告每种病毒的检测结果和可信程度。
本发明的检测方法，优选的包括以下步骤：
(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区中的保守序列设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；
（2）第一次PCR扩增反应，将dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
（3）用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；
（4）第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da；
（5）采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；
（6）纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPyV基因的类型。
其中所述步骤（1）引物设计中每一种待测人多瘤病毒，采用一种衣壳蛋白晚期转录区VP1基因区。引物序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.24，探针序列为SEQ ID NO.27至SEQID NO.38。
所述步骤（1）中，优选的采用β球蛋白基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26，探针序列为SEQ ID NO.39。
优选的在每次反应中加入阴性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水。
本发明的方法，检测浓度低至10拷贝/ul。
表1
| 序列编号 | 引物序列 | 人类多瘤病毒 |
| SEQ ID NO.1 | ACGTTGGATGAATCTACTGATGTGGGAGGC | BKPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.2 | ACGTTGGATGGACCCTGCATGAAGGTTAAG | BKPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.3 | ACGTTGGATGAGGAGAAAATGTTCCTCCAG | JCPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.4 | ACGTTGGATGTTGCAAAGTGGCCCAACACC | JCPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.5 | ACGTTGGATGATGGGAGCTGTACAGAATGG | KIPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.6 | ACGTTGGATGAGCCAGACCATGTACAACAC | KIPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.7 | ACGTTGGATGTAGCCCACTTAAAACTGCTG | WUPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.8 | ACGTTGGATGCAACCTGTGACAAGCTGTAG | WUPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.9 | ACGTTGGATGAACTGTAGGAGTRTGAGAGC | MCPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.10 | ACGTTGGATGGTATGGTGTCCTGATCCTTC | MCPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.11 | ACGTTGGATGAAGTGGAGGCAATTRTGCTG | HPyV6正向引物 |
| SEQ ID NO.12 | ACGTTGGATGGTGTCAGTAAAGGTGTAGGG | HPyV6反向引物 |
| SEQ ID NO.13 | ACGTTGGATGAGGAGGCGTTGAAGTRTTGG | HPyV7正向引物 |
| SEQ ID NO.14 | ACGTTGGATGTTTGGCAGCAACACTGCTTC | HPyV7反向引物 |
| SEQ ID NO.15 | ACGTTGGATGACCCAAGCCTGTTCCAAAAC | TSPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.16 | ACGTTGGATGATACTGTCAGGGCCTGTAAC | TSPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.17 | ACGTTGGATGGAGGCCTACCTAAATCCAAG | HPyV9正向引物 |
| SEQ ID NO.18 | ACGTTGGATGTATCACTAGCCTTGCTGGAG | HPyV9反向引物 |
| SEQ ID NO.19 | ACGTTGGATGTGGTATGGCTACAGTGATCC | HPyV10正向引物 |
| SEQ ID NO.20 | ACGTTGGATGTAGCTGTACTYTAAGTGGGC | HPyV10反向引物 |
| SEQ ID NO.21 | ACGTTGGATGCCTCACAGACATGTCCAATG | STLPyV正向引物 |
| SEQ ID NO.22 | ACGTTGGATGACAGACAGACTTTTGGCACG | STLPyV反向引物 |
| SEQ ID NO.23 | ACGTTGGATGATAGCTGTGCTAGAATCACC | HPyV12正向引物 |
| SEQ ID NO.24 | ACGTTGGATGCAGCTTCCCACATAGGTAGG | HPyV12反向引物 |
| SEQ ID NO.25 | ACGTTGGATGACTGTGCTTGACCTAGGAAC | β球蛋白正向引物 |
| SEQ ID NO.26 | ACGTTGGATGAAAGCAGCACTTGACTAGAG | β球蛋白反向引物 |
表2.
| 序列编号 | 基因型别 | 碱基延伸探针序列 | 延伸碱基 |
| SEQ ID NO.27 | BKPyV | CAATGACATGCTAGTTATTC | G |
| SEQ ID NO.28 | JCPyV | GGCTGCAACACTGTTG | T |
| SEQ ID NO.29 | KIPyV | TACCAGAGTTGCTTGTTG | T |
| SEQ ID NO.30 | WUPyV | CTCGAAGCTGCTAATGTTA | C |
| SEQ ID NO.31 | MCPyV | GATGAAAACAGTAGATACTATG | C |
| SEQ ID NO.32 | HPyV6 | ACTGCCTCTGGATCCAAT | A |
| SEQ ID NO.33 | HPyV7 | ACCTGAAGTTTTGGATACAGT | A |
| SEQ ID NO.34 | TSPyV | AGGACTTATTATGAAGGGCAATAT | A |
| SEQ ID NO.35 | HPyV9 | TACCGAATGGGAAACAATAACCC | C |
| SEQ ID NO.36 | HPyV10 | TACGTGATCCAATAACAGTAACAAA | T |
| SEQ ID NO.37 | STLPyV | TCCGATGATCATATTCACATCTTC | A |
| SEQ ID NO.38 | HPyV12 | CTATGCCCTCCCCTTATTGA | A |
| SEQ ID NO.39 | β球蛋白 | GACATTTTATTCCCCAAGTGA | C |
表1，表2中列出的合成的多核苷酸，均采用常规的多核苷酸合成方法合成。
与现有检测人多瘤病毒的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了PCR-质谱联用检测病毒的优势，对大于10重以上PCR反应产物，作一次性质谱检测，不需要荧光染料标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行，使试剂耗材成本与检测PCR重数成反比，从而实现以多种探针，在一个反应中同时检测12种人多瘤病毒的目标。首轮PCR扩增区域为60-120bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环,最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成的假阴性问题。同时采用UNG酶技术和基因型特异性片段扩增设计技术，彻底排除了PCR产物污染和同源序列探针错配引起的假阳性问题。为多瘤病毒致病机理研究提供了可靠的实验方法。
根据本发明的检测方法，本发明人还设计了一种检测试剂盒，以期用于临床样品的检测，本发明的试剂盒，可以包括一种或多种如表1，表2的合成的多核苷酸试剂。
优选的，本发明试剂盒包括以下试剂：
合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为12种人类多瘤病毒（HPyV）的正向和反向引物序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24；
碱基延伸探针序列SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.38；
质控引物序列为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26和探针序列SEQ ID NO.39。
根据需要，本发明的试剂盒中还可以包括有利于实验室操作的试剂如：溶剂，缓冲溶剂，辅助材料等。
本发明的试剂盒，可以包括以上组分制备而成的试剂，试剂的配制方法均为常规技术，只需要将各种原材料在常温下混合均匀即可，无需特殊设备和条件。
本发明的试剂盒，可以将不同试剂分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的方法进行操作。
附图说明
图1、13Plex人多瘤病毒碱基延伸探针质谱峰图
具体实施方式
本发明包括同时检测12种已知人多瘤病毒中的一种或多种，每种基因型采用VP1基因区作检测。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施方式提供的高灵敏度检测和/或鉴定人类多瘤病毒的方法，待检测12种人多瘤病毒包括：BKPyV、JCPyV、KIPyV、WUPyV、MCPyV、HPyV6、HPyV7、TSPyV、HPyV9、MWPyV、STLPyV和HPyV12。包括如下步骤:
（1）根据待测人多瘤病毒全序列，获取VP1基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种HPyV基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区，设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少30Da。各种HPyV探针引物序列见表2。
（2）通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
PCR反应体系配制见表3.
表3
| 试剂 | 最终浓度 | 体积(1×) |
| Water,HPLC grade | N/A | 0.3μL |
| 10X Buffer w/20mM MgCl2 | 2mM MgCl2 | 0.5μL |
| 25mM MgCl2 | 2mM | 0.4μL |
| 25mM dUTP/dNTP Mix | 500mM | 0.1μL |
| UNG Enzyme（1U/ul） | 0.5U | 0.5μL |
| 0.5mM Primer mix | 0.1mM | 1.0μL |
| 5U/ml PCR enzymea | 1Unit | 0.2μL |
| Template DNA(5-20ng/μL) | 2.0μL | |
| Total | 5.0μL |
先用37℃-50℃2分钟，进行dUTP的消化，然后94℃4分钟灭活，（同时这一步也达到预变性的效果），随后作PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
（3）通过虾碱性磷酸酶（SAP）处理，使未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表4。
表4
| 试剂 | 体积/反应 |
| Water,HPLC grade | 1.53μL |
| 10×SAP buffer | 0.17μL |
| SAP enzyme(1.7U/ml) | 0.3μL |
| Total | 2.0μL |
反应条件为37℃孵育40分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活。
（4）通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表5。
表5
| 试剂 | 体积/反应 |
| Water,HPLC grade | 0.619μL |
| 10×iPLEXbuffer plus | 0.2μL |
| iPLEXterminator mix | 0.2μL |
| Primer mix* | 0.94μL |
| iPLEXenzyme | 0.041μL |
| Total | 2.0μL |
*延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为8-15M，最终浓度约为0.84-1.57M。
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入退火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
（5）采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
（6）将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人多瘤病毒类别。图1中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检出型别拷贝数大于10，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用TYPE4.0软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一种人多瘤病毒和内参HBB的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子量峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，有相应人多瘤病毒感染，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样品，在必要时可作重复性验证试验。
Claims (1)
1.一种可同时检测多种人多瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.39的多核苷酸，其中，SEQ ID NO.1 - SEQ ID NO.24为12种人多瘤病毒的正向和反向引物序列；SEQ ID NO.27- SEQ ID NO.38为碱基延伸探针序列；SEQ ID NO.25 和SEQ ID NO.26为质控引物序列；SEQ ID NO.39为探针序列；
其中所述人多瘤病毒包括：BK polyomavirus (BKPyV)、JC polyomavirus (JCPyV)、KI polyomavirus (KIPyV)、WU polyomavirus (WUPyV)、Merkel cell polyomavirus (MCPyV)、Human polyomavirus 6 (HPyV6)、Human polyomavirus 7 (HPyV7)、trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus (TSPyV)、Human polyomavirus 9 (HPyV9)、MW polyomavirus (MWPyV) 、Human polyomavirus 10 (HPyV10) 、MX polyomavirus (MXPyV)、STL polyomavirus(STLPyV)和Human polyomavirus 12 (HPyV12)。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Anna Soderlund Strand et. al..High-Throughput Genotyping of Oncogenic Human Papilloma Viruses with MALDI-TOF Mass Spectrometry.《Clinical Chemistry》.2007,P. 86-92. * |
| High-Throughput Genotyping of Oncogenic Human Papilloma Viruses with MALDI-TOF Mass Spectrometry;Anna Soderlund Strand et. al.;《Clinical Chemistry》;20071010;P.86-92 * |
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| Publication number | Publication date |
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