CN111218502B

CN111218502B - 提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法

Info

Publication number: CN111218502B
Application number: CN202010326989.0A
Authority: CN
Inventors: 纪博知; 吴康; 戴立忠; 邓中平; 缪为民; 刘佳
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: ZA202212648B; BR112022021338A2; US20230193369A1; EP4006167A4; WO2021212771A1; EP4006167C0; EP4006167A1; CN111218502A; EP4006167B1

Abstract

本发明涉及一种用于提升荧光定量PCR检测性能的组合物，所述组合物包括：牛血清蛋白、山梨醇、硫酸铵、甲酰胺和四甲基氯化铵，以及二硫苏糖醇和甜菜碱中的至少一种。本发明还涉及含有所述组合物的qPCR反应液，提及其配置方法。使用本发明的组合物，可以提高荧光定量PCR的灵敏度、特异性以及抗干扰性。

Description

提升qPCR检测性能的组合物、反应液、用途及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及提升PCR检测性能的组合物、试剂盒及方法，更具体地，涉及提升荧光定量PCR的灵敏度、特异性以及抗干扰性。

背景技术

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。用于qPCR检测的荧光指示剂主要分为两大类：一类是荧光探针，如Taqman探针，分子信标探针；另一类是能与双链DNA结合的荧光染料，如SYBR Green和EvaGreen等。本发明讨论的提升实时荧光定量PCR检测性能的技术主要涉及荧光探针的方法，尤其是Taqman探针法的qPCR检测性能的提升。

影响qPCR检测性能的因素非常多，迄今已有许多研究专注于改善qPCR的检测效果。例如，中国专利CN1981055A中提到利用含有多核苷酸聚合酶的混合物提升PCR反应液的稳定性的应用；又例如，中国专利CN103409540A中提到利用新型染料Gelgreen I搭配Taq酶进行提升和优化定性PCR的扩增效率，再例如，中国专利CN1464070A中提到利用不同粒径大小的纳米金颗粒作为DNA检测器的识别放大器，用于提升DNA检测中的检测灵敏度。

然而，在qPCR检测领域，目前尚缺乏一种简单、便捷的方案，能够同时提升qPCR检测性能的多个方面，包括但不局限于针对DNA/RNA的扩增检测灵敏度、抗干扰能力以及检测特异性等。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种用于提升qPCR检测性能的组合物，所述组合物包括：

牛血清蛋白、山梨醇、硫酸铵、甲酰胺和四甲基氯化铵，以及二硫苏糖醇和甜菜碱中的至少一种。

在一个具体的实施方案中，所述组合物包括牛血清蛋白、二硫苏糖醇、山梨醇、硫酸铵、甲酰胺和四甲基氯化铵。

在一个具体的实施方案中，所述组合物包括牛血清蛋白、山梨醇、甜菜碱、硫酸铵、甲酰胺和四甲基氯化铵。

在一个具体的实施方案中，所述组合物包括牛血清蛋白、二硫苏糖醇、山梨醇、甜菜碱、硫酸铵、甲酰胺和四甲基氯化铵。

在本发明中，牛血清蛋白在qPCR反应液中具有10-150μg/mL、优选80-120μg/mL的终浓度。例如，70μg/mL、75μg/mL、80μg/mL、85μg/mL、90μg/mL。更优选为80μg/mL的终浓度。

在本发明中，二硫苏糖醇在qPCR反应液中具有1-10mM，优选2-8mM的终浓度。例如，2mM、4mM、6mM、8mM。更优选为3mM的终浓度。

在本发明中，山梨醇在qPCR反应液中具有1-10w/v%，优选4-6w/v%的终浓度。例如，4w/v%、5w/v%、6w/v%。更优选为4w/v%的终浓度。

在本发明中，甜菜碱在qPCR反应液中具有0.5-4mol/L，优选0.6-1mol/L的终浓度。例如，0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L。更优选为0.8mol/L的终浓度。

在本发明中，硫酸铵在qPCR反应液中具有2-50mM，优选8-15mM的终浓度。例如，8mM、9mM、10mM、11mM、12mM。更优选为10mM的终浓度。

在本发明中，甲酰胺在qPCR反应液中具有0.1-10v/v%，优选0.5-5v/v%的终浓度。例如1v/v%、2v/v%、3v/v%、4v/v%、5v/v%。更优选为3v/v%的终浓度。

在本发明中，四甲基氯化铵在qPCR反应液中具有10-100mM，优选20-80mM的终浓度。例如，20mM、40mM、60mM、80mM。更优选为35mM的终浓度

第二方面，本发明提供一种qPCR反应液，其含有如上所述的组合物。

进一步地，所述qPCR反应液还包括样本，例如，经核酸提取的样本和/或未经核酸提取的样本。

进一步地，所述qPCR反应液还包括用于qPCR的引物和探针。

更进一步地，所述qPCR反应液还包括dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液。

在本发明的定义中，术语“qPCR反应液”是指能够使用荧光定量PCR检测核酸的混合物。

在一个具体的实施方案中，qPCR反应液包括如上所述组合物、引物和探针、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液。

第三方面，本发明提供一种上述组合物在改善qPCR检测性能中的用途，有利地，所述改善是指灵敏度、特异性，和/或抗干扰性的性能的提升。

在本发明的定义中，术语“检测性能”主要是指灵敏度、特异性和抗干扰性。

第四方面，本发明提供一种用于配制qPCR反应液的方法，所述方法包括将样本与反应缓冲液和上述组合物混合的步骤。

所述反应缓冲液包括例如dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液。进一步地，可以包括引物和探针。

使用本发明的组合物，可以提高荧光定量PCR的灵敏度、特异性以及抗干扰性，并且本发明的组合物所使用的浓度，能够使得荧光定量PCR的灵敏度、特异性以及抗干扰性得到进一步地提高。特别地，在复杂的临床检验情况下，提升检测性能能够更好的为疾病诊断提供分子证据，为疾病的防控做充分的准备；对传染性和危害性大的传染病可以做到及时控制传染源，阻断病毒大流行和大爆发。

附图说明

图1为APOE基因rs7412 A/C模板存在的情况下，利用同一套针对rs7412 A特异性扩增的引物探针，在无本发明组合物的情况下的扩增结果图；

图2为在同样浓度的APOE基因rs7412 A/C模板存在的情况下，利用同一套针对rs7412 A特异性扩增的引物探针，在有本发明组合物的情况下的扩增结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明不同组合物的HCV检测抗干扰性能

在临床应用过程中，样本中经常会加入带有PCR抑制或者干扰的物质，如SDS，胆红素，甘油三酯等，因此考察PCR扩增试剂的抗干扰的能力成为了PCR试剂性能的重点内容之一。为了考察本发明中的组合物在带有干扰物质的样本中进行PCR扩增的抗干扰能力验证。将本发明的组合物应用到带有干扰物质的HCV血浆样本当中，与无干扰物质的HCV血浆样本进行对比检测。

对带有干扰因素的低浓度HCV样本（约为500IU/mL）进行对比检测，干扰因素为浓度在2g/dL的血红蛋白，检测的方案为在每种条件下对样本进行十次重复，对比检测的重复性和检出率。采用的样本检测方式的10μL样本+10μL核酸释放剂+30μL PCR反应液的免核酸提取的样本直接扩增的方式。不同的组合是指在PCR反应液含有不同组合物的组合，如表1，其中“+”表示加入该组分，“-”表示未加入该组分（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3mM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。

表1 本发明中不同组合物对抗干扰能力的影响

表2 不同组合物对有抑制物的低浓度HCV样本的检出率

根据表2中的结果，本发明组合物对于低浓度下有抑制物的样本的检测能力的提升存在一定的差异，在含有全部成分的组合中（组合8），对于10个低浓度的样本全部检出。同时对于未含有本发明中任何组分的组合（组合9），10个样本中全部未检出，因此对于低浓度下的HCV样本检测中的抗抑制能力，本发明的组合物有明显的优势。本发明的不同组合物均能对抗干扰性的提升具有积极的作用。

实施例2、本发明不同组合物的2019新型冠状病毒检测抗干扰性能

对带有干扰因素的低浓度2019新型冠状病毒（下称新冠，或2019-nCoV）核酸样本（约为1000拷贝/mL）进行对比检测，干扰样本为带有明显浑浊沉淀的呼吸道口咽拭子样本，检测的方案为在每种条件下对样本进行十次重复，对比检测的重复性和检出率。采用的样本检测方式的10μL干扰样本+10μL核酸释放剂+1μL新冠病毒核酸样本+30μL PCR反应液的扩增的方式，考察在不同条件下对新冠病毒核酸扩增效果的影响。不同的组合是指在PCR反应液含有不同组合物的组合，如表3，其中“+”表示加入该组分，“-”表示未加入该组分（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3mM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。同时该方案采用了两组对照组合，对照1：无干扰样本（用TE替代），无添加剂组分PCR反应液；对照2：无干扰样本（用TE替代），带添加剂组分PCR反应液。

表3 本发明中不同组分缺失对干扰能力和检出限的影响

表4 不同组合对有抑制物的低浓度新冠样本的检出率

根据表4中的结果，本发明组合物对于低浓度下有抑制物的样本的检测能力的提升存在一定的差异，在含有全部成分的组合中（组合9），对于10个低浓度的样本全部检出。本发明的不同组合物均能对抗干扰性的提升具有积极的作用。相比较两组对照试验而言（对照1和对照2），两组对照均为未带有抑制效果的样本，仅对纯核酸进行扩增检测，全部检测为阳性。本发明的组合9采纳的添加剂组分（组合9），也全部检测为阳性。

实施例3、本发明组合物用于增加检测HCV的抗干扰性能

将本发明的含有7种组分的组合物（牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3MM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。应用到带有干扰物质的HCV血浆样本当中，与无干扰物质的HCV血浆样本进行对比检测。同时为了对比，将无本发明组合物的PCR扩增试剂作为对照组分，也同样加入到带有干扰物质和无干扰物质的HCV血浆样本进行对比检测。进行直接的样本检测，采取的方法是样本：样本释放剂：qPCR反应液=10:10:30（v/v）进行总体积为50μL的样本直接扩增方式，该方式因为采用了样本直接扩增的免核酸提取方式，因为更大维度的考察了扩增试剂对样本中干扰和抑制效果的抗干扰能力。该实验方案的干扰样本的制备方法、试验对比方案以及实验过程中使用的PCR扩增程序分别如下表5-7所示：

表5 干扰物质样本的组分和配置方式

表6 用于抗干扰能力检测的实验对比方案

表7 用于HCV样本直接扩增的抗干扰能力的检测实验

为了验证本发明中组合物在干扰样本的扩增效果，往无本发明组合物的PCR扩增试剂中加入组合物，与无本发明组合物的PCR扩增试剂进行对比测试，考察各样本的检测Ct值的对比，其Ct值与扩增效率呈负相关，即Ct值数值越大，则扩增效率越低。

表8 用于HCV样本直接扩增的抗干扰能力的测试实验

通过上述实验表明，在免核酸提取的样本直扩扩增试验当中，本发明中的组合物对于血清样本中的针对常见干扰物质的抗干扰能力有着明显的提升。无论是低浓度还是中高浓度的HCV样本，添加干扰因素的干扰样本与无干扰因素的对照样本，在扩增效率上无明显区别。但是相对于无本发明组合物的对照扩增试剂，在添加了干扰因素的样本中，在高浓度HCV样本中，对于含有甘油三酯和IgG的样本中，扩增效率有明显的下降（扩增的Ct值与扩增效率呈负相关，即Ct值数值越大，代表扩增效率越低，No Ct则代表无扩增）。对于含有胆红素和血红蛋白的干扰样本中，对照试剂则无法达到扩增检测的效果。对于浓度更低的中低浓度HCV样本中，则所有的干扰样本均无法扩增。此对照试验表明了，本发明的组合物对于qPCR扩增尤其是无需核酸提取纯化的样本裂解扩增技术中的抗干扰的能力，有着明显的提升。

实施例4、本发明组合物用于增加检测HCV的灵敏度

为了测评该发明含有全部7种成分的组合物（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3mM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。对应急情况中的核酸检测性能，将带有本发明组合物的核酸扩增试剂与无本发明组合物的商用试剂进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的丙肝病毒（HCV）样本逐级的梯度稀释，稀释10倍（1:9,v/v），稀释100倍（1:99,v/v），稀释1000倍（1:999,v/v），以10μL核酸释放剂+10μLHCV样本 +30μL PCR反应液的方式进行对比测试。实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）扩增检测程序如表9：

表9 本发明采用的对HCV样本的扩增检测程序。

表10的对比结果表明，对于本发明中的PCR扩增体系中的本发明组合物，在RT-PCR的灵敏度方面有这显著的提升。试剂盒的检测能力与Cycle threathold （Ct）值呈负相关的关系，及同等浓度下Ct值越小，则表示检测能力越高，Ct值越大，则表示检测能力越低，NoCt则表示无扩增。本发明组合物对于核酸检测能力有明显的提升，对于低浓度核酸的检出能力，相对于本发明组合物的对照组结果，有明显的提升效果，对于临床中低浓度样本的检测能力，有显著的提升作用。用本发明中的PCR添加剂组分可显著提升检测丙肝病毒（HCV）的灵敏度和抗干扰性，可以做到疾病的及时快速诊断。

表10 本发明组合物对核酸扩增Ct值的影响。

实施例5、本发明组合物用于增加检测新冠的抗干扰性能

为了证明本发明中含有全部7种成分的组合物（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3MM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。在新冠病毒检测中的应用，由于新冠病毒采样方式为口咽拭子/鼻咽拭子并且用保存液保存起来用于检测。为了验证本发明组合物在新冠病毒核酸检测的抗干扰能力的对比验证，对比方案为在配制的PCR Mastermix中间加入1μL的浓度约为1000拷贝/mL的新冠病毒核酸，同时分别加入带有抑制效果的样本10μL和核酸释放剂10μL，构建成总体积为50μL的反应体系，验证扩增体系中新冠病毒检测体系的抗干扰能力。为了对比验证，同时采用对照组和空白组验证，具体如表11。所有条件均采用表7的扩增程序进行扩增检测。

表11 本发明方案在2019-nCoV核酸检测体系中的抗干扰能力对比

表12 本发明方案对2019-nCoV核酸检测的抗干扰能力提升

本实验方案为验证本发明组合物对于2019-nCoV检测体系的抗干扰能力的影响。从表12的对比结果可以看出来，在加有本发明组合物的核酸检测试剂当中，对于带有明显抑制效应的样本存在的条件下，对浓度约为1000拷贝/mL的2019-nCoV核酸均能全部检出。同等条件下，在未加入本发明组合物的对照组中，对于带有抑制效果的样本存在的条件下，对同等浓度的2019-nCoV核酸的检测阳性率就低很多，只有2/10的检出。相比较而言，如果在没有本发明的组合物中，对于没有抑制效果的样本存在下，同等浓度的2019-nCoV核酸全部检测出阳性。因此发现有强烈抑制效果的样本对于扩增体系的作用非常明显，能够很强烈的抑制商用对照体系的扩增效果，但本发明的组合物对于检测试剂组分的抗干扰能力有明显的提升。

实施例6、本发明组合物用于增加检测新冠的灵敏度

为了测评该发明含有全部7种成分的组合物（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3MM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。对应急情况中的核酸检测性能，将带有本发明组合物的核酸扩增试剂与无本发明组合物的商用试剂进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸样本逐级的梯度稀释，稀释10倍（1:9,v/v），稀释100倍（1:99,v/v），稀释1000倍（1:999,v/v），稀释10000倍（1:9999,v/v），以45μLPCR反应液+5μL核酸样本的方式进行对比测试。实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）扩增检测程序如表13：

表13 本发明采用的对2019-nCoV核酸的扩增检测程序。

表14的对比结果表明，对于本发明中的PCR扩增体系中的本发明组合物，在RT-PCR的灵敏度方面有这显著的提升。试剂盒的检测能力与Cycle threathold （Ct）值呈负相关的关系，及同等浓度下Ct值越小，则表示检测能力越高，Ct值越大，则表示检测能力越低，NoCt则表示无扩增。本发明组合物对于核酸检测能力有明显的提升，对于低浓度核酸的检出能力，相对于本发明组合物的对照组结果，有明显的提升效果，对于临床中低浓度样本的检测能力，有显著的提升作用。

表14 本发明组合物对核酸扩增Ct值的影响。

提升检测新型冠状病毒2019-nCoV的灵敏度和抗干扰性，可以做到及时控制传染源，阻断病毒大流行和大爆发。

实施例7、本发明组合物用于增加检测特异性

为了测评本发明中含有7种组分的组合物（所有成分被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：牛血清蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3MM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM）。用于检测特异性的作用，将本发明组合物添加到PCR扩增体系当中，与没有本发明组合物的PCR扩增体系进行对比研究。为了突出组合物的作用，使用同样引物探针序列及浓度以及同等核酸浓度进行扩增检测。本发明的组合物在验证检测特异性方面，应用于人基因组多态性分析（人APOE基因rs7412）进行扩增检测的特异性对比。该实验设计如下：

表15 基于人APOE基因rs7412多态性分析的特异性扩增对比试验

表16 检测人基因APOE多态性分析的qPCR扩增程序

人基因组多态性分析对于扩增的特异性要求非常高。通过本实验设计结果图1结果可以看出，在不含本发明组合物的常规qPCR反应体系中，检测APOE基因rs7412 A的探针在APOE基因rs7412 C模板存在的情况下，存在明显的非特异扩增曲线，其非特异扩增曲线由于其结合力较弱，曲线荧光强度较低，但是依然会对结果判断产生不利的影响。加入本发明组合物后，明显改善了检测体系的非特异性扩增，APOE基因rs7412 C模板的存在对于检测完全没有影响，完全没有扩增信号。此对照试验表明了，即使在用量非常小的情况下，本发明的组合物对于qPCR非特异性扩增有明显的抑制能力，显著改善qPCR的特异性。

Claims

1.一种用于提升qPCR检测性能的组合物，所述组合物由以下成分组成：

牛血清白蛋白、山梨醇、硫酸铵、甲酰胺、四甲基氯化铵、二硫苏糖醇，以及甜菜碱；

其中，所述组合物中各组分的浓度被配制为使得在被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：

牛血清白蛋白10-150μg/mL、二硫苏糖醇1-10mM、山梨醇1-10w/v%、甜菜碱0.5-4mol/L、硫酸铵2-50mM、甲酰胺0.1-10v/v%，和四甲基氯化铵10-100mM。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中各组分的浓度被配制为使得在被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：

牛血清白蛋白80-120μg/mL、二硫苏糖醇2-8mM、山梨醇4-6w/v%、甜菜碱0.6-1mol/L、硫酸铵8-15mM、甲酰胺0.5-5v/v%、四甲基氯化铵20-80mM。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中各组分的浓度被配制为使得在被添加至qPCR反应液中后具有以下终浓度：

牛血清白蛋白80μg/mL、二硫苏糖醇3mM、山梨醇4w/v%、甜菜碱0.8mol/L、硫酸铵10mM、甲酰胺3v/v%、四甲基氯化铵35mM。

4.qPCR反应液，其含有如权利要求1~3中任一项所述的组合物。

5.根据权利要求4所述的qPCR反应液，其进一步包括样本。

6.权利要求1~3中任一项所述组合物在改善qPCR检测性能中的用途。

7.一种用于配制qPCR反应液的方法，所述方法包括将样本与反应缓冲液和权利要求1~3中任一项所述的组合物混合的步骤。