CN112458204A - 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法,本发明的新型冠状病毒核酸检测的引物及探针序列如SEQ ID NO:1‑9所示。本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒采用一步法逆转录聚合酶链式反应(One step RT‑PCR)结合Taqman探针法,定性检测新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因特异性区域,以及一个非人源内标基因(SUC2基因)。本发明的新型冠状病毒核酸检测的引物及探针扩增效率高、引物探针覆盖区域碱基突变率低。因此,本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒具有灵敏度高、准确率高、覆盖度广的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)为新发急性呼吸道传染病,目前已经成为全球性的大流行病。而新型冠状病毒是引起COVID-19的病原体。
冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一类具有囊膜,基因组为线性单股正链的RNA病毒,是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒分为α、β、γ和δ共4个属,其中α和β冠状病毒可以感染哺乳动物,而γ和δ冠状病毒主要感染鸟类。此前已经发现有6种冠状病毒可感染人类:α冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63)和β冠状病毒(HCoV-HKU1,HCoV-OC43、 MERS-CoV、SARS-CoV),患者表现从普通感冒到重症肺部感染。新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2,SARS-CoV-2)是一种先前尚未在人类中发现的β属冠状病毒,在人群中具有极强的传染性,主要通过呼吸道飞沫、呼吸道分泌物和直接接触传播。COVID-19患者通常表现出特定的相似症状,例如发烧、全身乏力和咳嗽。大多数患者都表现出轻度的流感样症状,预后良好。但少数患者病情危重,并迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭甚至死亡。
新型冠状病毒具有极强的传染性、人群普遍易感、具有潜伏期,并且在潜伏期就具有传染性,因此需要及时地发现感染者、控制传染源,切断传播途径,才能有效地控制疫情的蔓延。而采取一切阻断措施的前提是需要有快速、准确、灵敏的诊断。
目前,国内外市面上有很多新型冠状病毒检测的试剂盒,主要基于两种方法:免疫学方法和分子生物学方法。其中,基于免疫学的方法主要是采用胶体金方法、化学发光法和酶联免疫法,检测患者血清或血浆中的新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体或抗原。但是,临床上一般不单独以血清学检测作为诊断依据。首先,新型冠状病毒IgM抗体、IgG抗体在患者发病一周内的阳性率均较低,因此不适合用于新型冠状病毒感染的早期筛查。其次,抗体检测可能会出现假阳性:其一是试剂盒阳性判断值设置,一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果,很可能是假阳性;其二胶体金试纸条检测是通过肉眼观察颜色有否来判断阳性和阴性,存在个体判断的差异;其三患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性干扰物质,如类风湿因子、补体、嗜异性抗体、溶菌酶等;其四标本采集、运送和保存等分析前过程中,标本溶血、标本贮存时间过长和标本凝固不全等也会对检测结果产生干扰。而基于分子生物学的方法主要是采用实时荧光PCR技术,特异性检测患者咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便、尿液等标本中的新型冠状病毒核酸。临床上将核酸检测结果作为诊断的依据之一,但是由于试剂本身的灵敏度问题和病毒待测靶序列的变异问题,核酸检测也会出现假阴性的结果。
发明内容
本发明的目的之一,在于提供新型冠状病毒核酸检测的引物及探针序列,其如SEQID NO: 1-9所示。
本发明的目的之二,在于提供新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其包前述的引物及探针序列。
本发明的目的之三,在于提供新型冠状病毒核酸检测方法,包括如下步骤:
1)合成前述的引物及探针序列;
2)采集样品,进行核酸提取及纯化;
3)RT-PCR反应成分及用量:
4)RT-PCR扩增和溶解程序
48-52℃,13-17min,1-3个循环;93-97℃,2-5min,1-3个循环;93-97℃,13-17s,55-65℃,25-35s,40-50个循环,与此同时采集荧光信号;
5)结果判读。
本发明步骤2)所述的样品包括但不限于商品、环境中的样品,例如进口冷冻食品。
在本发明中,步骤3)中,若为液体试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品5μL,阳性质控品5μL,阴性质控品5μL;若为干试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品25μL,阳性质控品25μL,阴性质控品25μL,总反应体积为25μL。
本发明开发了一种能够克服现有试剂盒局限性的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。本发明使用一步法逆转录聚合酶链式反应(One step RT-PCR)结合Taqman探针法,定性检测 SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因特异性区域,通过荧光信号的变化来实现样本RNA的检测。同时引入外源性内标SUC2基因来质控从核酸提取到检测的整个过程,可以避免假阴性的结果。
本技术方案与背景技术相比,具有如下优点:
(1)本发明采用新冠病毒ORF1ab和N基因双靶标检测,使检测结果更加准确可靠,可以避免由于其中一个待测靶标发生突变而导致假阴性的结果。并且,本发明还使用了一个外源性的内标SUC2基因,作为本发明试剂盒的质控系统,监测从样本RNA提取到核酸检测的全过程,可最大程度避免由于实验设置或操作不当、试剂异常或设备故障等原因导致检测结果不准确。
(2)本发明所使用的引物探针均为自行设计,通过大量新冠病毒基因组序列的比对,设计了多条引物和探针,通过引物探针组合的筛选,最终选定表1中的引物探针序列为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒的引物探针序列。与同类试剂盒比较(如图1所示),本发明试剂盒的ORF1ab基因引物探针覆盖区域的突变率最低,N基因引物探针覆盖区域的突变率也为目前靶向N基因反应中最低。因此,本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒可以最大程度上减少由于病毒待测靶序列发生基因突变而导致假阴性
(3)通过引物探针设计、引物探针筛选实验、试剂成分优化实验、PCR程序优化实验,最终成功开发了一个高灵敏的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。如图2所示,本发明试剂盒 ORF1ab、N基因反应均比中国CDC推荐的ORF1ab、N基因反应更灵敏。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为SARS-CoV-2不同检测试剂盒引物、探针区的突变情况。
图2为本发明试剂盒与中国CDC推荐的检测体系的比较。
图3SARS-COV-2核酸检测试剂盒的典型结果图。
图4为SARS-COV-2核酸检测试剂盒的样本检测结果图。
具体实施方式
1.本发明试剂盒引物探针
参照中国CDC新型冠状病毒核酸检测的引物探针设计区域,自行设计新型冠状病毒 ORF1ab和N基因、外源性内标SUC2基因的扩增引物和检测探针(如表1所示)。其中ORF1ab基因的检测探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记淬灭基团;N基因的检测探针5′端标记ROX荧光基团,3′端标记淬灭基团;SUC2基因检测探针5′端标记HEX荧光基团,3′端标记淬灭基团。
表1.SARS-CoV-2核酸检测试剂盒引物、探针序列
2.样本处理
采集疑似COVID-19患者的鼻咽拭子、口咽拭子、前鼻和中鼻拭子、鼻咽冲洗/鼻吸取物或支气管肺泡灌洗(BAL)样本。使用厦门致善生物科技股份有限公司生产的手工提取试剂盒“病毒RNA提取试剂盒(货号:602101)”进行核酸提取及纯化。提取试剂盒的提取纯化过程包括4个步骤:裂解、结合、洗涤和洗脱。提取时,分别取20μL内对照和1mL待测样本加入提取加样孔,然后按照提取试剂盒说明书中的操作方法进行提取。
为了对提取及检测过程进行质量控制,取20μL内对照与20μL的新冠病毒阳性对照、 20μL内对照与20μL阴性对照分别加入另外的提取加样孔,与待测样本同步进行提取。每个样本中加入内对照同步进行提取,目的是为了质控样本的提取过程。提取试剂盒中核酸洗脱体积为60μL,提取后获得的RNA应立即使用或储存在-70℃保存。
注:内对照为SUC2假病毒、阴性对照为不含核酸的溶液、新冠病毒阳性对照为新冠病毒 ORF1ab、N基因的假病毒。
3.本发明试剂盒三重RT-PCR反应体系组分
本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂盒RT-PCR反应成分及用量如下表2所示。
表2.SARS-CoV-2RT-PCR组分及用量
注:1)若为液体试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品5μL,阳性质控品5μL,阴性质控品5μL;若为干试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品25μL,阳性质控品25μL,阴性质控品25μL,总反应体积为25μL。
2)Solution 1来源于菲鹏生物股份有限公司,是产品AnstartOne-Step RT-PCRMix中的一种组成成分,产品编号MD013。
3)Enzyme mix来源于菲鹏生物股份有限公司,是产品AnstartOne-Step RT-PCRMix中的一种组成成分,产品编号MD013,主要成分为超级反转录酶(Super MMLV ReverseTranscriptase) 和热启动酶(AnstartTaq DNA Polymerase)。
4.本发明试剂盒三重RT-PCR反应程序
经过大量实验的对比优化,最终确定的RT-PCR扩增反应条件见表3。
表3.SARS-CoV-2RT-PCR程序设置
5.检测结果解释
若阴性对照在ORF1ab和N基因对应的检测通道无Ct值(没有扩增/荧光曲线或CT≥40),同时,内控通道(SUC2)存在CT值(Ct≤32),则阴性对照质控合格。阴性对照由于在提取前加入了SUC2(内对照),因此检测结果中SUC2为阳性。
若阳性对照在ORF1ab和N基因对应的检测通道均有Ct值(分别为Ct≤34和Ct≤31),且内控SUC2的Ct值≤32,则阳性对照质控合格。
临床标本检验结果的评估应在阳性和阴性对照已检测并确定有效后进行。如果对照品无效,则无法解释病人的结果。当上述质量控制符合要求时,可根据下表4对样本的ORF1ab、 N和SUC2基因的Ct值进行评价。
表4.阳性参考值范围
注:“+”指阳性;“-”指阴性。
表5.待测样品的检测结果可能情况
注:“+”指阳性;“-”指阴性。
*由于PCR中存在竞争关系,SARS-CoV-2阳性结果(ORF1ab+或N+)不要求HEX检测通道必须为检出,病毒载量较高可引起SUC2信号无法检出或受到抑制的情况。
图3为本发明SARS-COV-2核酸检测试剂盒的典型结果图,对于SARS-COV-2的N基因、 ORF1ab基因和内对照SUC2基因在相对应的荧光通道均有特征扩增曲线,且无任何交叉反应。
图4为本发明SARS-COV-2核酸检测试剂盒的样本检测结果图,在阳性对照、阴性对照均质控合格的情况下,才对待测样本的结果进行解释,待测样本的结果解释参照表4、表5。
序列表
<110> 厦门大学
厦门致善生物科技股份有限公司
<120> 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttgtgatc aactccgcga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taagacgggc tgcacttaca 20
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgctgccgat ataggtcaca gc 22
Claims (9)
1.新型冠状病毒核酸检测的引物及探针序列,如SEQ ID NO:1-9所示。
2.新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的引物及探针序列。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:步骤2)所述的样品包括商品、环境中的样品。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:步骤3)中,若为液体试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品5μL,阳性质控品5μL,阴性质控品5μL;若为干试剂,则向反应管中分别加入处理后的样品25μL,阳性质控品25μL,阴性质控品25μL,总反应体积为25μL。
6.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:步骤4)所述的荧光包括FAM、HEX、ROX荧光。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:步骤5)中,若阴性对照在ORF1ab和N基因对应的检测通道无Ct值,同时,内控通道SUC2存在CT值,则阴性对照质控合格;
若阳性对照在ORF1ab和N基因对应的检测通道均有Ct值,且内控SUC2的Ct值≤32,则阳性对照质控合格。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:步骤5中,所述的无CT值是指没有扩增/荧光曲线或CT≥40。
9.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:在ORF1ab和N基因对应的检测通道均有Ct值分别为Ct≤34和Ct≤31。
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