JP4950656B2 - 核酸検出 - Google Patents
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- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Description
本発明は、生物学的または環境サンプルから核酸を検出するための方法に関する。本発明は、核酸を検出するための診断用試験キット、ならびに該検出方法で使用するためのプライマーおよびプローブにも関する。
重症急性呼吸器症候群(SARS)は、ヒトの典型的な肺炎の新規に同定された形態である(Drosten et al., "Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome" The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, 2003年5月15日発行)。それは、SARSコロナウイルスまたはUrbani株SARS関連コロナウイルスと知られるコロナウイルスの新規株に起因する。そのウイルスは、エアロゾル状態によって効率よく蔓延し、対人接触感染がいわれてきた。疑わしいかまたはその可能性があるSARSの診断は、「重症急性呼吸器症候群(SARS)のサーベイランスについての症例の定義」で特定された次のWHO診断基準によってなされる(World Health Organization,2003年4月30日改定)。しかし、SARSの陽性診断は、新規コロナウイルスに対する抗体の存在の証明、または患者サンプル中のコロナウイルス核酸の存在の証明のいずれかによる病因物質の同定なしには為し得ない。疾患進行により、不可逆的肺損傷を導き、確認されたSARS感染患者の5-10%の死亡率が報告されている。疾患の重症度を制限し、疾患の蔓延を制御するために、出来るだけ早く感染患者を同定することが、迅速な処置を開始するために重要である。
一般的に、本発明は、様々な生物学的または環境サンプルから、例えばコロナウイルス核酸を抽出および検出するための方法を提供し、その方法は、次のステップ、
(A)SARSコロナウイルスを含有すると疑われるサンプルを回収すること、
(B)回収したサンプルからリボ核酸(RNA)を抽出すること、
(C)RNA/DNA増幅技術を用いて、特異的な標的配列を増幅すること、そして
(D)DNA増幅技術および適当な伝達系、例えば、Taqman(登録商標)プローブまたは分子ビーコンなどを包含する蛍光遺伝子プローブを用いて、標的増幅核酸産物を検出すること、
を含む。
最も好ましくは、該方法は下記ステップ:
i)生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ii)核酸を増幅すること、所望によりPCR、NASBAまたは他の核酸増幅技術を使用すること、そして
iii)リアル・タイムPCRを用いて、ステップ(ii)で産生した核酸を増幅および検出すること、
を含む。
i)生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ii)核酸を増幅すること、所望により、PCR、NASBAまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
iii)リアル・タイムPCRを用いて、ステップ(ii)から核酸を増幅および検出すること、
を含む配列番号1〜27を含む単離DNA配列の使用に関する。
(i)サンプル由来のSARSコロナウイルスRNAを単離するための単離用剤、
(ii)標的分子がSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列に相補的な核酸配列を包含する、標的分子を複製するための核酸複製剤、および
(iii)標的分子を検出するための核酸検出剤、ここで核酸検出剤が検出分子を包含する、
を含む。
A)配列番号1、2、3、4または5のいずれかから選択されたプライマー、
B)配列番号6、7、8、9または10のいずれかから選択されたプライマー、
C)配列番号11、12、13、14または15のいずれかから選択されたプライマー、
D)配列番号16、17、18、19または20のいずれかから選択されたプライマー、および
E)配列番号20〜25のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがPCRを包含する場合に使用され得る。さらに、プライマー対AおよびB;またはCおよびDは、従来のPCRおよび/またはRT−PCRのいずれかを互換的に使用され得る。
A)配列番号26または27から選択されたプライマー、
C)配列番号11、12、13、14または15から選択されたプライマー、
D)配列番号16、17、18、19または20から選択されたプライマー、
E)配列番号20〜25のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがNASBAを包含する場合に使用され得る。 配列番号26および27は、SARS NASBA T7プライマーおよびSARS NASBA 電気化学発光(ECL)プライマーに各々一致する。
本発明は、図面を参照して説明される。
急速に、核酸増幅は、患者組織における感染生物体の存在を直接示すことによって多くの疾患の診断を確認するための標準的な臨床検査方法となってきた。該方法は、それらの特異性および感度により、迅速に感染を確認でき、抗ウイルス治療の効果をモニターされるようになったので、SARSの発生中に不可欠なものとなった。SARS−CoVに対する宿主抗体の存在を証明することによるSARS診断アッセイは、ELISAおよび免疫蛍光などを用いて開発されてきた。しかし、そのような試験は、核酸方法の感度を欠くことが多く、抗体が検出レベルに達するまでに7−21日を要するので、新たに感染した患者を検出できない。
この発明の好ましい実施態様は、図を参考にして説明される。表1は、図1〜3に使用される符号の説明を示す。
核酸単離:
SARSコロナウイルス・ウイルスRNA分子(10)は、適当な単離用剤を生物サンプルに適用することによって生物サンプルから単離され得る。好ましくは、溶菌剤が、単離用剤の前に用いられ得る。溶菌剤、例えば溶菌緩衝液は、タンパク質および脂質を溶解すること、そしてこれらの材料がより簡単にサンプルから除去され得るように生物サンプル中のタンパク質を変性させることに関与する。さらに、溶菌剤は、長期貯蔵目的のために、RNA分子を安定化するために緩衝液として働き得る。図2に示したとおり、RNA分子は、室温で48時間まで、溶菌緩衝液中で安定であり得るし、−70℃で無期限に貯蔵され得る。そのように行う利点は、かかるプロセスを行うのに適当でない試料採取場所で、分析を行う必要がないことである。
SARSコロナウイルスゲノムの一部が、いわゆる前増幅ステップにおいて、例えば、PCR技術またはNASBAまたはその他の適当な核酸増幅技術によって検出目的のために複製される。増幅中に、cDNAおよび一本鎖RNAの両方が合成される。
図3に示したように、増幅プロセスは、95℃に加熱することによって1本鎖形態となっている標的SARSコロナウイルスのウイルスcDNA(16)に対してプライマーA(18)およびB(20)をアニーリングして開始される。該プライマーAおよびBは、それらが標的cDNA分子に結合し得るように設計される。結合の正確な位置は、試験したウイルスの株に依存する。結合部位は、特定の期間の後に変化し得る。プライマーAおよびBの重要な技術的特徴は、それらが各々SARSコロナウイルスのウイルスcDNAの一部に結合し得るままであることである。
一方、前増幅は、核酸の増幅のために連続した、等温の、酵素を基にした方法であるNASBA(核酸配列を基にした増幅)によって生じさせ得る。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ-H、RNAポリメラーゼおよび2つの特別に設計されたDNAオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。増幅中、cDNAおよび1本鎖RNAの両方が合成される。そうして、TaqManリアル・タイムPCRは、NASBA産物中のcDNAの存在と共に行われうる。RNAは、NASBAについてのテンプレートとして作用できる、そのため、この状況ではSARS RNAをcDNAに変換する必要はない。
検出方法の感度を高めるために、前増幅ステップ、すなわちPCR反応またはNASBAの産物は、別の増幅方法、すなわちRT−PCR 方法において使用される。必要なら、プライマー配列番号1〜10を代わりに使用してもよいが、配列番号11〜20は、RT−PCRを実施するためのプライマーとして使用され得る。配列番号21〜25は、RT−PCRにおけるプローブとして使用される。
(a)元々のSARSコロナウイルスの一部分に相補的なDNA配列。
前増幅およびリアル・タイムPCR技術を組み合わせたこの技術は、"増強されたリアル・タイムPCR"(ERT)として示される。図3は、PCRおよびRT−PCRの組合せによって、SARSコロナウイルス・ウイルスRNAの増幅のための概略図を示す。
配列番号4、9、14、19、24は、SARSヌクレオカプシドタンパク質(NP)遺伝子から得られる、配列番号5、10、15、20および25は、SARSポリメラーゼ(Pol)遺伝子から得られる。
下記実施例で使用した成分および遺伝子プロトコールを、下記に説明する:
サンプル
核酸を単離するために使用したサンプルは、SARS患者から得たもので、中国の北京にある病院から提供された。
ボックスA(核酸単離)
Qiagen RNeasy(登録商標)Mini Kit 核酸単離キット
ボックスB(核酸増幅)
Mastermix (0.5 ml)(Eurogentecから購入)
dUTP (0.2 mM dATP、dCTP、dGTP および 0.4 mM dUTP)を有するdNTPs、HotStart TaqDNAポリメラーゼ、MgCl2、ウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)含有物および不動対照(Passive Reference)。
SARSに関連のあるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子領域に相補的なDNAオリゴヌクレオチド、かつ配列番号1〜20および26および27の包含物。
SARSと関連があるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の領域に相補的なDNAオリゴヌクレオチドであって、蛍光放出標識と蛍光消光分子の両方で標識され、配列番号21〜25を包含するものである。
0.2 mMの各SARSプライマー+0.24 mM TaqMan SARSプローブを、ユニバーサル・マスターミックスに添加した。
SARSに関連するコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の一部分を含有する、高精製度かつ非感染プラスミド。
ボックスA(核酸単離)
要求されているように、RNeasy Mini-カラム(サンプルあたり1つ)の十分な数を調製した。RLT緩衝液(サンプルあたり0.4 ml)、RW1 緩衝液 (サンプルあたり0.7 ml)およびRPE緩衝液(サンプルあたり0.5 ml)(全てはRNeasy キットにおいて提供される)を要求されているように調製し、室温にゆっくりと温めた。70%のエタノール(サンプルあたり0.4 ml)およびヌクレアーゼ不含水(サンプルあたり50μ)を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
Mastermix、SARSプライマー、SARSプローブ、精製した核酸テンプレート(サンプル)およびヌクレアーゼ不含水を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
1.サンプル(0.4 ml)およびRLT緩衝液(0.4 ml)を一緒に混合した。
2.70%エタノール(0.4 ml)をチューブに添加した。
3.溶液混合物(0.6 ml)を、RNeasy カラムに添加した。該チューブをゆっくりと締めて、15秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液(flow-through)を、回収チューブ(2 ml)に取った。ステップ3を繰り返した。
4.RW1緩衝液(0.7 ml)をRNeasyカラムに添加した。チューブをゆっくりと締め、15秒間、約10,000xgで遠心分離し、カラムを洗浄した。洗液(flow-through)を廃棄した。
5.RPE緩衝液(0.5 ml)を、RNeasyカラムに添加し、15秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液を廃棄した。ステップ5を繰り返した。
6.該カラムを、さらに2分、約10,000xgで遠心分離した。
7.RNeasyカラムを、新規の1.5 ml回収チューブに移した。RNase不含水(50μl)を、シリカゲル膜上に直接ピペットで移し、3分間室温でインキュベートした。
8.RNAを、1分、約10,000xgで遠心分離に供し、溶出した。
9.核酸、RNAを得た。
アンプリコンが、目的の標的配列決定反応と一致することを確認するために増幅反応の産物を配列決定した。配列決定反応は、製品説明書に従って市販購入し得る配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて行った。DNA配列を、373A sequencer system (Applied Biosystems)を用いて配列決定反応を解析することによって得た。DNA配列を、the National Center for Bioethechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用できるBLAST配列比較ツールを用いて分析した。
前増幅のためのPCRを用いる増強強化リアル・タイムPCR
PCR前増幅:
全容量(25μl)において、下記成分を混合した:ヌクレアーゼ不含水、0.2mM dNTP、1U Platinum TaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen)、5mM MgCl2、1xPCR緩衝液、プライマー(10μM)およびcDNAテンプレート(約100ng)。PCR増幅を、下記の温度プロファイルを用いてMasterCycler (Eppendorf)で行った:
表5および6に示した結果を、様々な患者サンプルから単離された核酸を増幅することを試みることによって得た。サンプルは、SARS患者から得られ、中国の上海の病院から提供された。各サンプルを、3つの異なる方法によって試験した:
i)アガロースゲル電気泳動を用いる従来のPCR
ii)リアル・タイム TaqMan(登録商標)PCR、および
iii)新規に説明した方法、前増幅ステップを用いる増強されたRT−PCR。
前増幅についてPCRを用いる増幅されたリアル・タイムPCR
臨床サンプルを、疑わしいか、もしくは潜在的SARS症例として診断された120人の患者から回収し、実施例1のプロトコールを用いて、従来のPCRの後のアガロースゲル電気泳動、従来のTaqMan(登録商標)リアル・タイムPCRおよび本発明の増強されたTaqMan(登録商標)リアル・タイムPCRアッセイによって分析した。
各増幅方法の検出限界を、香港の患者から得たSARS−CoV(2x102.5 TCID50/ml)の培養サンプルから抽出した全核酸を連続希釈することによって測定した。従来のPCR、標準的なリアル・タイムPCRおよび増強されたリアル・タイムPCR方法の検出限界は、各々2x 10-5.5 TCID50/ml、2x10-10.5 TCID50/ml (図1D)および2x10-12.5TCID50/ml(図1C)に相当する。このように、増強されたリアル・タイムPCR方法は、標準的なリアル・タイムPCRよりも少なくとも102倍以上の高い感度であり、SARS−CoVの分子検出のために現在使用されている従来のいずれのPCR技術よりも10 7 倍以上感度が高い。ウイルス培養によるSARS−CoVの検出は、増強されたリアル・タイムPCRによって検出された3/28(10.7%)の症例のみがウイルス培養によるSARS−CoVに対して陽性であった場合、感度が最も低い方法といえる。
反応混合物を、65℃で5分間インキュベートし、次いで41℃で5分間冷却した。次いで、5μlの酵素混合物(1酵素範囲について、全量55μl)を反応混合物に添加した。短時間の混合後、41℃に冷却し、5分インキュベートした。該反応混合物を、短時間回転させ、次いで1.5時間、41℃でインキュベーションに供した。
Claims (28)
- SARSコロナウイルスcDNAを検出する方法であって、以下の連続するステップを含む方法:
(a) SARSコロナウイルスcDNAを含む核酸サンプルを単離するステップ、
(b) SARSコロナウイルスcDNAをPCRまたはNASBAの核酸増幅技術を用いて前増幅するステップ、そして検出を行わずに、
(c)ステップ (b)において前増幅されたSARSコロナウイルスの核酸に対してリアル・タイムPCRを実施してステップ (b)で産生される核酸を増幅および検出するステップ、
ここでプライマーおよび/またはプローブが、ステップ(b)および(c)で使用され、使用されるプライマーおよびプローブが、配列番号1〜27のいずれかからなる単離DNA分子に一致する、方法。 - 核酸前増幅が、NASBAを用いて行われる請求項1記載の方法。
- リアル・タイムPCRが蛍光標識プローブを使用する、請求項1または2に記載のSARSコロナウイルスcDNA検出のための方法。
- ステップ(c)で使用されるプライマーがプローブと重複しない、請求項1から3いずれかに記載の方法。
- ステップ(b)で使用されるプライマー対が、配列番号1、2、3、4または5のいずれかからなる第一のプライマー;および配列番号6、7、8、9または10のいずれかからなる第二のプライマーに一致する、請求項1、3または4記載の方法。
- ステップ(b)で使用されるプライマー対が、配列番号26からなる第一のプライマーおよび配列番号27からなる第二のプライマーと一致する、請求項1から4いずれかに記載の方法。
- ステップ(c)で使用されるプライマー対が、配列番号11、12、13、14または15のいずれかからなる第三のプライマー;および配列番号16、17、18、19または20のいずれかからなる第四のプライマーに一致する、請求項1から6いずれかに記載の方法。
- ステップ(c)で使用されるプローブが、配列番号21、22、23、24または25のいずれかからなるプローブに一致する、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜8いずれかの方法に使用するための、配列番号1〜27のいずれかからなる、単離DNA分子。
- 請求項1〜8いずれかの方法に使用するための組成物の製造における、配列番号1〜27のいずれかからなる、単離DNA分子の使用。
- 請求項1〜8いずれかの方法によって、SARSコロナウイルス感染を検出するための診断用試験キットの製造におけるSARSコロナウイルスに特異的なプライマーおよび/またはプローブの使用であって、該プライマーおよび/またはプローブが配列番号1〜27のいずれかからなる、使用。
- 配列番号1〜27のいずれかからなる2以上のDNAに一致する2以上の単離DNA分子を含む、請求項1〜8いずれかの方法によって、SARSコロナウイルス感染を検出するためのSARS診断用試験キット。
- 配列番号1、2、3、4または5のいずれかからなる第一のプライマー、および配列番号6、7、8、9または10のいずれかからなる第二のプライマーに一致しているプライマー対を含む、請求項12記載のSARS診断用試験キット。
- 配列番号26からなる第一のプライマーおよび配列番号27からなる第二のプライマーに一致するプライマー対を含む、請求項12記載のSARS診断用試験キット。
- 配列番号11、12、13、14または15のいずれかからなる第三のプライマー、および配列番号16、17、18、19または20のいずれかからなる第四のプライマーに一致するプライマー対を含む、請求項13または14のいずれかに記載のSARS診断用試験キット。
- 配列番号21、22、23、24または25のいずれかからなるプローブを含む、請求項12〜15いずれかに記載のSARS診断用試験キット。
- 請求項1〜8いずれかの方法によって、生物学的または環境サンプル中のSARSコロナウイルスを検出するための診断用試験キットであって、
(i)サンプルからSARSコロナウイルスRNAを単離するための単離用剤、
(ii)標的分子を複製するための核酸複製剤であって、該標的分子はSARSコロナウイルスのRNA配列の少なくとも一部分に相補的な核酸配列を含む、そして
(iii)該標的分子の複製に続いて、該標的分子の核酸を検出するための核酸検出剤であって、該核酸検出剤が検出分子を含む、
を含む、キット。 - 標的分子がcDNA分子である、請求項17記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
- 請求項17または18記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、SARSコロナウイルスのRNA配列の少なくとも一部分に結合するDNA配列を含む第一の対の精製および単離DNA分子を含むことにより、該第一の対の精製および単離DNA分子がSARSコロナウイルスのcDNA配列の少なくとも一部分に結合する場合、該第一の対の精製および単離DNA分子が酵素およびDNAヌクレオチドの存在下で伸長して、SARSコロナウイルスのcDNA配列の少なくとも一部分に相補的なDNA配列を含むDNA分子が生成する、
キット。 - 第一の対のDNA分子が配列番号1、2、3、4または5に示すDNA配列のいずれか、および配列番号6、7、8、9または10に示すDNA配列のいずれかをコードするか、あるいは、配列番号26および27に示すDNA配列をコードする、請求項19に記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
- 請求項17〜19のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、第二の対の精製かつ単離されたDNA分子を含み、
該DNA分子は、第一ラウンドの増幅によって生じたSARSコロナウイルスのDNA配列の少なくとも一部分に結合するためのDNA配列を含むことにより、第二の対の精製および単離されたDNA分子がSARSコロナウイルスのcDNA配列の少なくとも一部分に結合する場合、酵素およびDNAヌクレオチドの存在下で第二の対の精製および単離されたDNA分子が伸長して、第一ラウンドの増幅の際に生じたSARSコロナウイルスのcDNA配列の少なくとも一部分に相補的なDNA配列を含むDNA分子が生成する、
キット。 - 第二の対のDNA分子が、配列番号11、12、13、14または15に示すDNA配列のいずれか一つ、および、配列番号16、17、18、19または20に示すDNA配列のいずれか一つをコードしている、請求項21に記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
- 第一ラウンドの増幅において複製されたDNA産物が、さらなる増幅の前に希釈される、請求項21または22のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
- 検出分子が、標的分子に結合するためにSARSコロナウイルスのRNA配列に相補的な少なくとも一部分をコードしているDNA配列;およびシグナル発生物を含む、請求項17〜23のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
- 検出分子のDNA配列が、第二の対の精製および単離されたDNA分子のDNA配列と重複しない、請求項24記載のキット。
- シグナル発生物が、
検出器において検出され、定量され得る光子を放出するように刺激され得る分子を含む、請求項24または25に記載のキット。 - 検出器において検出され、定量され得る光子を放出するように刺激され得る分子が、蛍光分子または分子ビーコンである、請求項26に記載のキット。
- 検出分子が、配列番号21〜25のDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項17〜27のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。
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