TW201245452A - Nucleic acid detection - Google Patents

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Description

201245452 六、發明說明： t發明所屬技領域】 發明所屬之技術領域 本發明係關於一種用於從生物或環境樣本偵測核酸之方 法。本發明亦關於一種用於偵測核酸之診斷檢驗套組，及用於 該偵測方法之引子及探針。 C先前技術3 先前技術 嚴重急性呼吸道症候群（SARS)係一種人類典型肺炎的新 鑑定形式（Drosten et al.，"Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome" The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, published on 15 May 2003)。其係由一種新的冠狀病毒品系所引起，稱為 SARS冠狀病毒或Urbani SARS-相關冠狀病毒。已證實該病毒係 有效率地藉由空氣及人與人接觸傳播。疑似或極可能SARS之診 斷是根據WHO在監督嚴重急性呼吸道症候群(SARS)案例（Cose Definitions for Surveillance of Severe Acute Respiratory 办(%4於)）所定義之診斷標準（世界衛生組織（w〇rld Health Organization) , 2003年4月30曰校訂）。然而，在未證明病 患樣本中存在辨識新冠狀病毒之抗體或冠狀病毒核酸以確定 病原因子時，則無法做出SARS陽性診斷。此疾病的病程會導致 無法復原的肺臟損害且已報導確定被SARS感染的病患有 5-10%的死亡率。為限制該疾病的危險性及控制該疾病的擴 散’儘早確定被感染的病患以開始立即的治療是很重要的。 201245452 鑑定病毒感染最普遍使用的方法是以標準血清學方法在 病患血清樣本中鑑定抗體，其包含有但不限於瓊脂膠體免疫擴 散(AGID)或酵素連結免疫吸附分析（ELISA)。這些方法是有限 制的’因在感染後需七至二十一天才可產生足夠濃度的抗體以 達到正確及靈敏的偵測》 在易受感染細胞中活體外培養病毒亦是一種偵測病毒的 習知方法。然而，SARS相關冠狀病毒係一新的個體且最適宜的 生長條件尚未被描述。此外，病毒的生長需要高度的生物安全 性，因為該分析產物為完整的傳染性病毒。因此訓練有素的人 員、設備及設施是必須的，而這限制該技術是否可適用為一般 性診斷。此外，病毒的生長可能太慢而無法在足以開始立即治 療的時間内加以偵測。 以病毒遺傳物質之增痘及偵測為基礎之分子方法已被描 述可用於許多病原性病毒，旅可應用於SARS冠狀病毒之偵測。 核酸增殖方法一般來說是快速的、高度專一性及靈敏的。 許多不同類型的核酸增殖方法已被描述，其包含聚合酶連 鎖反應（PCR)，接著進行瓊脂糖膠體電泳、套式PCR(nested PCR)、即時Taqman® PCR、分子信標PCR、核酸序列依賴性增 殖作用（NASBA)、等溫及嵌合體弓丨子起始的核酸增殖（ICAN) 等。 PCR之後進行膠體電泳（即已知的傳統PCR)為一在1985年 首次描述之標準技術。自此該技術即成為實驗室的例行作業。 然而，其相對地係較慢及耗費勞力。此外，與最近發展的傳統 PCR比較，其具有較低的靈敏度。 201245452 套式PCR之後進行膠體電泳，是一增加傳統PCR靈敏度之 技術。套式PCR包括使用一對特別的DNA寡核酸引子（外部引子) 來第一次增殖特定基因序列。該增殖產物作為第二回合增殖作 用之模板，另一對引子（内部引子）係從第一次增殖產物中的一 區域選出。第二次增殖產物比第一次增殖產物短。該方法是非 常需要勞力的，因其包含另一次的增殖步驟。因此，該方法容 易被污染。 NASBA 的發展係基於 Compton J "Nucleic acid sequence-based amplification" (1991) Nature 350:91-92 ； Heim A1 等人的文獻，"Highly sensitive detection of gene expression of an intronless gene: amplification of mRNA，but not genomic DNA by nucleic acid sequence based amplification (NASBA)" (1998) Nucleic Acids Research 26(9):2250-2251 ;以及DeimanB等人的 文獻，"Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification (NASBA)" (2002) Molecular Biotechnology 20:163-179。
一被稱為即時PCR之高度自動化方法（以下稱為RT-PCR)已 證實為一高度專一性且便於使用的技術，但其比起套式PCR的 靈敏度低。RT-PCR係與附加DNA寡核酸分子的運用結合，該寡 核酸分子一端標定螢光吸收部分，另一端標定螢光發射部分， 其係雜交於特定基因上介於DNA寡核酸引子之間的區域。標定 的分子即為螢光探針。當增殖過程持續進行，前進的DNA聚合 酶進行螢光探針的置換及分解而造成螢光信號增加。即時PCR 的發展係基於Desjardin LE等人的文獻，"Comparison of the ABI 201245452 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis." (1998) J Clin Microbiol. 36(7): 1964-8 ;以及Wang T等人的文獻， "mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection (1999) Anal Biochem. 269(1):198-201。
Yang等人發表於2003年5月8日的文獻，"Clinical detection of polymerase gene of SARS-associated coronovirus" Academic J First Med (2003) 23(5); 424-427，係與使用 SARS冠狀病毒-特定 引子之反轉錄酶PCR之用途有關。之前所提到的Drosten等人的 文獻，係與套式RT-PCR或RT-PCR分別用於偵測SARS冠狀病毒 之用途有關。 單獨使用傳統PCR、套式PCR及RT-PCR可能無法在大範圍 的病人樣本中充份正確或靈敏地偵測SARS冠狀病毒。PCR的陰 性結果並不必然代表病人沒有SARS，因為有許多因素會影響核 酸4貞測，該等因素包含有在增殖方法中所使用的引子及探針不 靈敏、無SARS-CoV感染、觀察到的疾病係由其他傳染原所引 起、偽陰性PCR結果、或該樣本在收集時病毒或其遺傳物質未 表現或為一般方法無法偵測的量時。因此，設計可充份靈敏篩 選SARS-CoV之方法，及藉由結合高靈敏度、高特異性及速度 之增殖技術，偵測SARS冠狀病毒核酸的特定部分以改良SARS 之診斷是很重要的》 應瞭解本發明並非只限制在SARS冠狀病毒偵測，亦可應用 在核酸偵測》因此，本發明可應用在許多不同類型病原體及病 6 201245452 毒之偵測，包含SARS冠狀病毒。 本發明之一目的係提供一種用於偵測包含SARS冠狀病毒 的核酸之高靈敏度方法，如此在感染早期的人可被識別。 本發明另一目的係設計一種方便使用之診斷套組以4貞測 核酸。 【發^明内容_】 發明内容 大體上，本發明係提供一種萃取及偵測之方法，例如來自 各種生物或環境樣本之冠狀病毒核酸，其包括下列步驟（A)收 集懷疑含有SARS冠狀病毒之樣本（B)從收集樣本萃取核糖核 酸(RNA) (C)使用RNA/DNA增殖技術以增殖特定目標序列（D) 使用DNA增殖技術及適當的報告系統，例如螢光探針其包含 Taqman®探針及分子信標’以偵測該目標增殖核酸產物。 此外’本發明亦提供一種用於偵測SARS冠狀病毒之套組， 其包含複製目標分子之核酸複製試劑，其中該目標因子包含含 有與該SARS冠狀病毒RNA序列之至少一部份互補之核酸序 列；及用於在增殖過程中增殖該複製的目標分子及偵測該複製 產物之核酸複製及偵測試劑。這些試劑包含一對可增殖該複製 產物之引子及互補於該複製產物之榮光探針。 根據本發明第一方面，係提供一種分離之DNA序列，其包 含SEQ ID NOs: 1至27中任一序列。 根據本發明第二方面’係提供一種在DNA增殖中用作引子 或螢光標定探針之分離之DNA序列，其包含SEQ ID NOs: 1至27 中任一序列。 201245452 根據本發明第二方面，係提供一種用於偵測核酸之方法， 其包括分離核酸’接著進行DNA增殖及接著進行即時pcr之步 驟。較佳地，DNA增殖包含PCR、NASAB或其他適當的核酸增 殖技術^ 最佳地，該方法包括下列步驟： (i) 從生物或環境樣本中萃取核酸；及 (ii) 增殖該核酸’視需要使用PCR、NASBA或任何 其他核酸增殖技術；及 (iii) 增殖及偵測在步驟(ii)中使用即時PCr所製造之 核酸。 更佳地，步驟(ii)包括使用PCR增殖核酸。步驟(ii)亦被視為 前增殖步驟。該步驟可包括使用PCR增殖及偵測DNA ^或者， 可使用NASBA。步驟(ii)另一個適當的核酸增殖技術可選自聚 合酶連鎖反應(PCR) ’其接著進行瓊脂糖膠體電泳、套式PCR、 即時Taqman® PCR、分子信標PCR，等溫及嵌合體引子引發的 核酸增殖(ICAN)。 本發明之方法係藉由核酸增殖技術之新穎結合而達成。前 增殖步驟接著即時PCR之結合有利地提供用於偵測核酸之高靈 敏度方法。此保證在受病毒或病原體感染早期的人可輕易被識 別。 本發明更進一步方面係關於分離之包含SEQ ID NOs: 1至 27之DNA序列，其係用於偵測核酸之方法，及該分離之包含SEQ ID NOs: 1至27之DNA序列於製備用於偵測核酸之組合物之用 途，該方法包括下列步驟： 8 201245452 (i) 從生物或環境樣本中萃取核酸；及 (Π)增殖該核酸，視需要使用PCR、NASBA或任何 其他核酸增殖技術；及 (iii)增殖及偵測在步驟(ii)中使用即時PCR製造之核 酸。 步驟(H)亦被視為是前增殖步驟。前增殖可以PCR或NASBA 實行。用於該前增殖步驟之引子將根據所使用的方法而不同。 被偵測之核酸較佳地係衍生自SARS冠狀病毒RNA或 cDNA。 本發明一般地係指一種用於在生物或環境樣本中偵測 SARS冠狀病毒之診斷檢驗套組，其包含： (i) 用於從樣本分離SARS冠狀病毒RNA之分離試 劑；及 (ϋ) 用於複製目標分子之核酸複製試劑，其中該 目標分子包含：與SARS冠狀病毒RNA序列之至少一部分互 補之核酸序列；及 (iii)用於該偵測目標分子之核酸偵測試劑，其中該 核酸偵測試劑包含該偵測分子。 本發明更進一步方面係關於S A R S診斷檢驗套組，其包含相 當於SEQ IDNOs: 1至27之二或多個分離之DNA序列。 較佳地，該SARS診斷檢驗套組包含相當於SEQ ID NOs: 1、2、3、4或5及6、7、8、9或10中任一序列之前增殖引子。 引子對中的一引子係選自SEQ ID NOs: 1、2、3、4或5，另一引 子係選自 SEQ ID NOs: 6、7、8、9或 10。SEQ ID NOs: 1 至5相 201245452 當於PCR的正向引子，SEQ ID NOs: 1至5相當於PCR的反向引 子。或者，前增殖引子相當於SEQ ID NOs: 26及274EQ ID NOs: 卜2、3、4或5及6、7、8、9或10可用於前增殖PCR及SEQ ID NOs: 26及27可用於前增殖NASBA。 此外’ SARS診斷檢驗套組亦包含相當於SEqIDN〇s: 11、 12、 13、14或15及16、17、18、19或20中任一序列之即時PCR 引子。RT-PCR引子對中的一引子係選自SEq ID N〇s: ^ ' 12、 13、 14或 15 ’ 另一引子係選自 SEQ ID NOs: 16、17、18、19或 20。 此外，該SARS診斷檢驗套組亦包含相當於证(^1〇;^〇8· 21、 22、23、24或25的即時PCR探針《這些引子及探針係用於 即時PCR » SEQ ID NOs: 11至15相當於即時pCR正向引子，seq ID NOs·· 16至20相當於即時PCR反向弓丨子，SEQ m N〇s:扣至乃 相當於即時PCR探針。 用於前增殖PCR及RT-PCR之引子若需要可交換使用。 或者，該診斷檢驗套組包含下列引子组a)卿⑴n〇s: 12 或 13 及 16、17 或 18， 卜 2或3及6、7或8及 b) SEQ ID NOsn、 及選自SEQ ID NOs: 21、22或23之探針。 該診斷檢驗套纟且包含下列引子組A及 作為較佳實施態樣， B ;及C及D ;及探針E : A)選自 SEQ ID NOs 2、3、4或5中任一序列之 引子；及 B)選自 SEQ ID NOs: 6 7 ' 8、9或10中任一序列之 引子；及 C)選自 SEQ ID NOs: 11、 12、13、14或15中任一序 10 201245452 列之引子；及 D) 選自 SEQ ID NOs: 16、17、18、19或20中任一序 列之引子；及 E) 選自SEQ ID NOs: 20至25中任一序列之探針。 當前增殖步驟包含PCR時，可使用該診斷檢驗套組。此外， 引子組A及B ;或C及D可交換使用於傳統pcr及/或rt_pcr。 作為另一較佳實施態樣，該診斷檢驗套組包含下列引子組 A ;及C及D及探針E : A)選自SEQ ID NOs: 26或27之引子；及 C) 選自 SEQ ID NOs: 11、12' 13、14 或 15之引子； 及 D) 選自 SEQ ID NOs: 16、17、18、19或20之引子； 及 E) 選自SEQ ID NOs: 20至25之探針。 當前增殖步驟包括NASBA時，可使用該診斷檢驗套組。 SEQ ID NOs: 26 及 27相當於 SARS NASBA T7 引子及 SARS NASBA電化螢光(ECL)引子。 圖式簡單說明 本發明將參考以下圖式說明： 第1圖係根據本發明之較佳實施態樣之偵測SARS冠狀病 毒整體方法之流程圖。 第2圖顯示以本發明之較佳實施態樣分離SARS冠狀病毒 及轉變成互補DNA(cDNA)之方法之流程圖。
第3圖顯示以二個DNA分子，引子A及B，所表示之SARS 11 201245452 冠狀病毒cDNA分子片段，及此增殖產物之後作為用於以二個 DNA分子，引子c及D，進行進一步增殖之模板之用途，並根據 本發明較佳實施態樣以探針E進行偵測及定量。 第4圆顯示相當於5ΕρΙ£)Ν〇8:1-27之核酸序列。 第5至8圖顯示加強及標準即時增殖之比較。每一樣本之 △Rn (報告者螢光散發量與抑制者螢光散發量之比例)相對於週 期數目繪製成圖。螢光強度直接相關於目標DNA量》到達可偵 測程度螢光值之週期數目愈少，則起始複製數愈多。 第5圖顯示使用加強即時PCR分析臨床樣本。該 SARS-CoV陽性樣本可明顯區分於SARS-CoV陰性樣本，以箭號 指出。 第6圖之顯示使用標準即時PCR分析與顯示於A部分同 樣的臨床樣本。該sARS-CoV陽性樣本與SARS-CoV陰性樣本不 易區分。 第7圖顯示使用加強即時PCR所得之SARS-CoV的連續10 倍稀釋(2xl〇2·5 TCID50/ml [最高軌跡]至2xl〇-i〇 5 TCID 50/ml)。 較低軌跡顯示反轉錄的陰性控制組及TaqM a η®的陰性控制組。 第8圖顯示使用標準即時PCR所得之SARS-CoV的連續10 倍稀釋(2xl02·5 TCID50/ml [最高稀釋]至2xl〇-10.5 TCID50/ml)。 t實施方式3 較佳實施態樣的詳細說明 核酸增殖已快速成為碓認許多疾病診斷之標準實驗室方 法，其直接顯示病患組織中感染原是否存在。此方法因其專一 性及靈敏度而可快速確定感染與否並可追蹤抗病毒治療的效 12 201245452 果，故在SARS爆發期間已成為不可或缺的。依靠顯示宿主對抗 SARS-Co V之抗體的存在之SARS診斷分析已利用，例如， ELISA及螢光免疫法開發。然而，此測試常無核酸方法的靈敏 度，且無法偵測新感染的病患，因抗體需要7至21天以遠到可 偵測的量。 本發明提供一種用於偵測核酸之靈敏方法，例如生物或環 境樣本中SARS冠狀病毒RNA或cDNA。此生物樣本包含血液、 唾液、血清、血漿、鼻咽擦拭物、尿液、糞便、其他體液，及 環境樣本例如水、污水、廢棄物質等。 本發明用於偵測核酸之方法包括前增殖步驟接著即時 PCR。Lau等人的文獻“A real-time PCR fur SARS-coronavirus incorporating target gene pre-amplification” Biochemical and Biophysical Research Communication (2003) 312:1290-1296之内 容係以參考資料並入本文。PCR及即時PCR (RT-PCR)為習知技 術。即時聚合酶連鎖反應(RT-PCR)結合螢光定量為一快速、高 靈敏度及高專一性之方法，其係用於偵測DNA且可應用於 SARS冠狀病毒核酸之偵測。單獨使用此方法之結果可於三小時 内得到。RT-PCR可用螢光定量但不僅限於螢光定量。RT_P(：r 包含，例如，使用一附加的DNA寡核酸分子（在此稱為探針）， 較佳地在一端標定一螢光吸收部分’在另一端標定一螢光發射 部分。此附加的DNA寡核酸分子與所欲的核酸在寡核酸引子間 的區域雜交。因此，信號產生者可以是螢光分子、分子信標或 其他可被刺激並放出可被適當偵測器偵測並定量之光子之分 子。 13 201245452 套式PCR法’其中增殖起始回合之產物係作為之後增殖之 模板，已熟知其可提高許多目標基因偵測的準確度及靈敏度。 此前增殖法在許多即時PCR增殖時認為是不需要的，因為其超 越傳統PCR技術的靈敏度。然而’若目標基因报少或有其他污 染物的情況，則驚訝地發現根據本發明之前增殖對改良其偵測 限制是有益的。 本發明之方法，即前增殖接著即時PCR，在此稱為“加強即 時PCR”。前增殖可藉由PCR、NASBA或任何其他核酸増殖技 術。本ERT技術的一優點為其偵測限制驚訝地發現可提高至 TCID50 (2XHT11·5)，其為普通TaqMan®即時PCR之 100倍，為傳 統PCR之108倍。另一優點為加強即時PCR反應時間為5.5小時。 為了進一步縮短整個偵測方法的時間及提高該檢驗的靈敏 度，亦可使用結合NASBA技術用於即時PCR的前增殖之方法。 當前增殖步驟包括NASBA，發現有利地其反應時間在4小時 内。因此，結合前增殖/RT-PCR技術用於偵測限制及時間之優 點係不可預期且有利的》 ERT在一清晰的模式下可提高區分陽性及陰性樣本之可能 性。其在臨床檢驗上特別重要，因其不容許任何誤診或誤判。 當同樣樣本以標準即時PCR分析時，陽性及陰性訊號的判 斷會較模糊，其SARS CoV陽性及陰性增殖曲線傾向於與另— 樣本重疊（第6圖）。因此，一個較無經驗的臨床醫生可由Ert 所得之加強結果輕易地區分陽性及陰性訊號。此為本發明相較 於標準即時PCR很重要的優點。 加強即時P C R所提高的靈敏度使其除了簡單的臨床偵測之 14 201245452 外’可應用於許多領域。污染物及污水與8娜的爆發有關明 顯地該核酸彳貞财奸適狀環境樣本。檢驗公共區域表面（運 輸工具、等候區域等）的SARS_C()V核酸可提供追蹤疾病傳播及 監視清潔及消毒過裎效果之機會。 因SARS的徵候及症狀為高變異性，特別是處於高危險期的 病患例如年長者，其，例如，發燒通常不會發生，一種用於確 定SARS-CoV是否存在之靈敏方法在臨床上限制病毒傳播將會 非常有用。及早偵測亦可使緊急計畫盡快進行，以遏制 SARS-CoV區域性爆發及避免國際性擴散，減少公共擔心及潛 在經濟影響。 本發明較佳實施態樣在此需參照圖式說明。表1包含用於 第1至3圖之元件符號。 元件符號 項目 10 單股SARS冠狀病毒RNA 12 色層分析管柱 14 分離出的核酸混合物 16 互補 DNA (cDNA) 18 引子A 20 Η 引子B 22 "Ί 延長的引子A 24 延長的引子B 26 過多的雙股產物 28 引子 30 引子D 32 探針E 34 過多的雙股產物 表1 :第1至3圖之元件符號。 生物樣本中的SARS冠狀病毒濃度，例如口咽的拭子，可能 非常低，因此生物樣本無法直接偵測SARS冠狀病毒rnA是否存 在。為了增加該病毒RNA分子數目達足夠的偵測量，一適當增 15 201245452 殖技術是必須的，聚合酶連鎖反應(PCR)已知為具有特殊用途 之用於增殖DNA之靈活技術。將RNA轉變成DNA使得PCR方法 可擴展至適用於具有RNA基因體之病源菌，如SARS冠狀病毒。 增殖的DNA分子可以任何適當的技術偵測。 SARS冠狀病毒旗遺傳物質之形式為單股核醣核酸(RNA， 10)。此病毒RNA包含複製所需的基因，且必須基因的其中之一 為聚合酶。該基因的長度由其分子的5’端計算為接近2800個核 苷酸。 第1圖顯示以該偵測套組偵測SARS冠狀病毒之整體步 驟。如第1圖所示，目標SARS冠狀病毒核酸分子，其為單股 RNA形式，首先從生物樣本中萃取。生物樣本類型可包含血 液、血清、血漿、周邊血液單核細胞、周邊血液淋巴球 (PBMC/PBL)、痰、尿液、排泄物、咽喉栻子、皮膚病變拭子、 腦脊液、子宮頸抹片、膿樣本、食物基質、及來自身體不同部 位包含腦、脾及肝。其他沒有列出的樣本也可使用。一分離試 劑可使本發明的偵測套組之核酸萃取過程完成。 從生物樣本中分離目標SARS冠狀病毒RNA分子（10)後，樣 本中的RNA分子數量不足以被偵測。因此，部分SARS冠狀病毒 之病毒RNA分子係以適當的增殖技術複製成目標核酸分子，例 如，聚合酶連鎖反應(PCR)或NASBA或RT-PCR。該目標核酸分 子接著可被適當的方法偵測。在RT-PCR之前使用前增殖步驟較 單獨使用傳統PCR技術驚訝地提供廣泛的益處，包含較高的偵 測程度、改善的靈敏度及較短的時間。 分離及增殖步驟之細節將在此討論。 16 201245452 S冠狀病毒RNA分子（iG)可藉由施予該生物樣本適當 的分離試劑以從該生物樣本中分離。較佳地，在分離試劑前先 施予—溶解試劑。該溶解試劑，例如，溶解緩衝溶液，其係負 責溶解蛋自質及脂質，《生物縣巾的蛋Μ魏，如此這 些物質可輕易地從樣本中絲。此外，該溶解試劑亦可作為用 於穩定長時間保存臟分子之緩衝溶液。如第2圖所示該 在溶解緩衝中之臟分子可在室溫可穩定錢個小時，且在_7〇 C可不限時間儲存。如此操作的優點在於採樣時不須進行分 析’因採樣時不適當進行此步驟。 適田，合解緩衝溶液的例子可包含81^硫氰酸胍及Tris/HCI。 此溶解緩衝溶液係該領域所熟知者。具有可制溶解蛋白質及 脂類、變性蛋白質及穩定RNA分子之目的之不同成分之溶解試 劑’可用於本發明之偵測套組。 在溶解試劑施用於生物樣本後，下一步驟是使用分離試劑 從樣本中分離核酸分子。第2圖描述該偵測套組完整的分離 步驟。在溶解試劑施用於該生物樣本後，核酸與其他不必要成 份為溶液形式。此溶液接著施用於小色層分離管柱（12)，其對 於核酸有高度親合性。非核酸成份藉由清洗從管柱移除。核醆 可以適當的溶離液從管柱專一性地溶離出來。在此描述之核酽 純化步驟係該領域所熟知者。 樣本中所含有之核酸被分離後，若需要，可施用増殖試劑 於該核酸混合物（14) ’如此該SARS冠狀病毒RNA分子係使用反 轉錄酶轉變成互補DNA (CDNA) (16)。此步驟係該領域所熟知 17 201245452 者。轉變成cDNA只在特殊情況下需要。因此，Ri^^cDNA可 作為下一個步驟之模板，係依據使用何種步驟於前增殖過程而 定。 前增殖步驟： 部分SARS冠狀病毒基因組係為偵測目的被複製，例如藉由 PCR技術或NASBA或任何其他適當的核酸增殖技術，在所謂的 前增殖步驟。在增殖過程中，CDNA及單股RNA皆被合成。 NASBA(核酸序列依賴性增殖作用）是一連續的、等溫的、 以酵素為基礎之核酸增殖方法。此技術係在反轉錄酶、核糖核 酸酶-H、RNA聚合酶及二個專門設計之DNA寡核酸引子之混合 物中進行。NASBA可直接處理RNA，如此則不需將RNA轉變成 cDNA°SEQ ID NOs: 26及27可用作NASBA前增殖步驟之引子。 或者，傳統PCR或任何其他核酸增殖技術皆可用於此前增 殖步驟。SEQ ID NOs: 1至10可用作前增殖PCR步驟之引子。或 者’ SEQ ID NOs: 11至20可用作前增殖PCR步驟梔引子。為了 PCR，SARS的RNA首先轉變成cDNA，其接著用作前增殖PCR 之模板。 以PCR作用於前增殖步驟： 如第3圖所示，增殖過程係由引子A(18)及B(20)黏合至目 標SARS冠狀病毒cDNA(16)開始，其係藉由加熱至95°C形成單 股形式。引子A及B係經過設計使其可與目標cDNA分子結合。 結合的精確位置係依據所檢驗之病毒品系而定。該結合位置在 一段時間後可能會改變。引子A及B之重要技術特徵係其分別保 有結合部分SARS冠狀病毒cDNA之能力。 18 201245452 因此，引子A及B包含一段結合序列，其編碼與SARS冠狀 病毒cDNA之至少一部分互補之DNA序列。為了本發明之目 的，發現適當引子A結合於SARS冠狀病毒cDNA之區域為SARS 冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18319至18338之間的區域，其發 現包含用於結合功能之最少核苷酸數目。用於本研究個體之型 態為SARS冠狀病毒HKU-39849，基因庫存取號碼（GenBank Accession number)為AY278491。因此，引子A之結合序列較佳 地是包含SARS冠狀病毒之聚合酶基因核苷酸18319至18338之 間之互補DNA序列，其為第4圖之SEQ ID NO: 1。須注意的 是SEQ ID NO: 1係正式地以5'-3'之方向書寫。其結果為相對於 病毒基因之結合方向係自”後面”至”前面"。 或者，SARS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18363至18382 (SEQIDNO:2,第 4 圖）或核苷酸18404至 18386(SEQIDNO: 3，第4圖）可作為引子A之結合目的。此外，SEQ ID NO: 4或5 可作為引子A之結合目的。 為了本發明之目的，發現適當引子B結合SARS冠狀病毒 cDNA之區域為SARS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18157至 18179之間的區域，其發現包含用於結合功能之最少核苷酸數 目。用於本研究個體之型態為SARS冠狀病毒HKU-39849’基因 庫登入號碼為AY278491 »因此，引子B之結合序列較佳地是包 含SARS冠狀病毒之聚合酶基因核苷酸18157至18179之間之互 補DNA序列，其為第4圖之SEQIDNO:6。須注意的是SEQID NO: 6係正式地以5’-3·之方向書寫。 或者，SARS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18125至18144 19 201245452 (SEQIDN0.7，第 4 圖）或核苷酸 18103至 18122(SEQIDNO: 8第4圖）可作為引子b之結合目的。此外，seq id NO: 9或 10可作為引子B之結合目的。 引子A及B與SARS冠狀病毒cDNA結合後，引子a及B的3, 端在具有適當的核苷酸存在下，引子八及8係經適當的聚合酶作 用進行延長，例如DNA聚合酶。因此，包含下列序列：與 SARS冠狀病毒RNA之部分互補之DNA序列’之延長引子a(22) 及B(24)係被製造。 藉由一適當的增殖程序之應用，SARS冠狀病毒cdNA可轉 變成大量雙股DNA產物(26)。適當的增殖程序為： 起始步驟 50oC， 2分鐘 DNA聚合酶作用 950C， 3-5分鐘 40週期 95°C 30秒 50°C 45秒 72°C 15秒 以NASBA用於前增祐 或者，前增殖可藉NASBA(依賴於核酸序列之增殖）產生， 其為一連續的、等溫的及以酵素為基礎之用於核酸增殖方法。 此技術在反轉錄酶、核糖核酸酶-H、RNA聚合酶及二個特別設 計之DNA寡核酸引子的混合物中進行。在增殖過程中，cDNA 及單股RNA皆被合成。因此，TaqMan即時PCR可在NASBA產物 中的cDNA存在下進行。RNA可作為NASBA之模板，如此，在 此狀況下不需將SARS RNA轉變為cDNA。 進行NASBA之適當引子包含SEQ ID NOs: 26及27，其分別 相當於SARS之NASBA T7引子及SARS之NASBA ECL引子。這 20 201245452 些NASBA引子可用於代替前增殖步驟中的PCr引子SEq m NOs: 1 至 10 〇
即時PCR 為了提高偵測方法靈敏度，前增殖步驟，即PCR反應或 NASBA，之產物係用於進一步增殖過程，稱為RT_pCR過程。 SEQ ID NOs: 11至20可用作進行rT_pCr之引子，雖然若需要引 子SEQ ID NOs: 1至10亦可替代使用。SEq ID n〇s: 21至25係用 作RT-PCR之探針。為達到偵測目的，在前增殖步驟，例如pcR 或NASBA，增殖的雙股DNA產物(26)，係用作使用RT_pCR作進 一步增殖時之模板，較佳為Taqman®定量即時PCr。在其用作 進一步增殖之模板之前，該DNA必須以適當的液體稀釋，以使 進一步增殖過程達到最佳功效。用於複製的DNA分子之適當稀 釋液包含無核酸酶之水或緩衝液。用於RT-PCR方法之適當增殖 程序為： 起始步驟 50°C，2分鐘 DNA聚合酶作用 95°C，10分鐘 50週期 95°C ， 15秒 72°C，1分鐘 增殖的程度能在適當的設備中被自動偵測，例如ABI Prism 7700遺傳基因偵測系統(Applied Biosystems)。 以RT-PCR增殖需要二個DNA寡核酸引子（引子C (28)及引 子0 (30))及螢光探針(E，32)。 為了本發明之目的，發現適當引子C結合SARS冠狀病毒 cDNA之區域為Sars冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18264至 18245之間的區域，其發現包含用於結合功能之最少核苷酸數 目。用於本研究個體之型態為SARS冠狀病毒HKU-39849,基因 21 201245452 庫登入號碼為AY278491。因此，引子C的結合序列較佳地是包 含SARS冠狀病毒之聚合酶基因核苷酸18264至18245之間之互 補DNA序列，其為第4圖之SEQ ID NO: 11。須注意的是SEQ IDN〇: 11係正式地以5，_3，之方向書寫。其結果為相對於病毒基 因之結合方向係自，，後面"至"前面，，。 或者’ SARS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18295至18314 (SEQ ID MO: 12,第 4 圖）或核苷酸 18322至18304 (SEQ ID NO: ^ ’第4圖）可作為引子c之結合目的》此外，SEQ ID NO: 14 或15可作為引子c之結合目的。 為了本發明之目的，發現適當引子D結合SARS冠狀病毒 cDNA之區域為saRS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18193至 18211之間的區域，其發現包含用於結合功能之最少核苷酸數 目。用於本研究個體之型態為SARS冠狀病毒HKU-39849,基因 庫登入號碼為AY278491。因此，引子D的結合序列較佳地是包 含SARS冠狀病毒之聚合酶基因核苷酸18193至18211之間之互 補DNA序列，其為第4圖之SEQ ID NO: 16。須注意的是SEQ ID NO: 16係正式地以5’-3’之方向書寫。 或者，SARS冠狀病毒的聚合酶基因核苷酸18219至18336 (SEQ ID NO: 17,第 4 圖）或核苷酸 18205至18220 (SEQ ID NO: 18，第4圖）可作為引子D之結合目的。此外，SEQ ID NO: 19 或20可作為引子D之結合目的。 為了本發明之目的，發現適當探針E結合SARS冠狀病毒 cDNA之區域為SARS冠狀病毒聚合酶基因之核苷酸18217至 18234之間的區域，其發現包含用於結合功能之最少核苷酸數 22 201245452 目。用於本研究個體之型態為SARS冠狀病毒HKU-39849，基因 庫登入號碼為ΑΥ278491。因此，探針Ε的結合序列較佳地是包 含SARS冠狀病毒之聚合酶基因之核苷酸18217至18234之間之 互補DNA序列，其為第4圖之SEQ ID NO: 21。 或者’ SARS冠狀病毒聚合酶基因之核苷酸18241至18260 (SEQ ID NO: 22,第 4 圖）或核苷酸 18228至18246 (SEQ ID NO: 23 ’第4圖）可作為探針e之結合目的。此外，SEQ ID NO: 24 或25可作為探針e之結合目的。 經適當的酵素，例如DNA聚合酶，及加上的核苷酸之 作用’引子C及D係自3,端延長以形成雙股產物（34)。在增殖過 程中，探針E係藉由DNA聚合酶之外核酸酶作用而被置換及降 解。此造成螢光訊號之增加，其與增殖程度及增殖產物之濃度 相關。故該RT-PCR增殖過程之產物為大量的目標DNA分子，每 一分子含有下列DNA序列： (a)與原始SARS冠狀病毒之部分互補之DNA序列。 Taqman®即時探針之序列可與被兩端由引子c及d所定義 之增殖的DNA產物之任一區域互補。然而，該探針序列不能與 引子C及D序列重疊，因其會阻礙增殖反應之發生。
增強即時PCR 此結合刖增殖及即時PCR之技術在此稱為，，加強即時pcR” (ERT)為。第3圖顯示SARS冠狀病毒RNA以PCR及RT-PCR之 組合增殖之概要圖表。 此新分析方法之顯著特徵為使用前增殖步驟之產物，為傳 統PCR或NASBA之起始回合，作為RT_PCR第二回合之模板。此 23 201245452 結合技術增加SARS-CoV偵測之靈敏度。視需要地，相同的引 子可用於傳統PCR及RT-PCR之起始前增殖步驟。此附加之前增 殖步驟可改善SARS CoV臨床樣本之偵測靈敏度。 表2顯示所列出之引子序列如何相當於基於CUHK AG03 AY 345988基因庫序列之SARS序列。 SEQ ID NO· 1: 18323至 18304 SEQ ID NO: 2: 18367至 18348 SEQ ID NO: 3: 18389至 18371 SEQ ID NO: 6: 18142至 18160 SEQ ID NO: 7: 18110至 18129 " SEQ ID NO: 8: 18088至 19107 " SEQ ID NO: 11: 18249S18288 (BNITMSARSS2)~~ SEQ ID NO: 12: 18299至 18280 " ~ SEQ ID NO: 13: 18307至 18289 — SEQ ID NO: 16: 18178至 18196 (DNA SAHUF) SEQ ID NO: 17: 18204至 18221 (DNA SA HUT)" SEQ ID NO: 18: 18190至 18205 ~ SEQ ID NO: 21: 18202至 18219 — ~ SEQ ID NO: 22: 18226至 18245 ~ SEQ ID NO: 23: 18213至 18231 ~ 表2 SEQ ID NOs: 4、9、14、19、24係衍生自 SARS核鞘蛋白（NP) 基因及SEQ ID NOs: 5、10、15、20及25係衍生自SARS聚合酶 (Pol)基因。 此外，本發名亦關於第一次及第二次純化及分離之DNA分 子用於製造在生物或環境樣本中偵測SARS冠狀病毒之套組之 用途，其中SARS冠狀病毒RNA分子係使用分離試劑從生物或環 境樣本中分離，目標分子係由包含該第一次及第二次純化及分 離之DNA分子之複製試劑複製，其中該目標分子包含：與SARS 冠狀病毒RNA分子之至少一部分互補之核酸序列；及與偵測分 24 201245452 子結合之核酸序列；該目標分子由核酸偵測試劑偵測，其中該 核酸偵測試劑包含該偵測分子。 較佳地，該目標分子為cDNA分子，雖然其可為RNA或其 他核酸。該第一次純化及分離之DNA分子可包含與SARS冠狀 病毒RNA分子之至少一部分互補之核酸序列，如此當該第一次 純化及分離之DNA分子與SARS冠狀病毒cDNA序列之至少一 部分結合時，該第一次純化及分離之DNA分子在酵素及DNA核 苷酸存在下延長而產生一DNA序列，其包含與SARS冠狀病毒 RNA序列之至少一部分互補之DNA序列。 更佳地，該第一次DNA序列可編碼列於SEQ ID NOs: 1、2、 3、4或5之DNA序列中之一序列與列於SEQ ID NOs: 6、7、8、9 或10之DNA序列中之一序列。或者，該第一次DNA序列可編碼 列於SEQ ID NOs: 26及27之DNA序列。 此外，該核酸複製試劑可包含第二次純化及分離之DNA分 子，其包含與SARS冠狀病毒RNA序列之至少一部分互補之 DNA序列，如此當該二次純化及分離之DNA分子與SARS冠狀 病毒cDNA序列之至少一部分之DNA分子結合時，該第二次純 化及分離之DNA分子在酵素及DNA核苷酸存在下延長而產生 一DNA序列，其包含與SARS冠狀病毒RNA序列之至少一部分 互補之DNA序列。較佳地，該DNA序列編碼列於SEQ ID NOs: 11、12、13、14或15之DNA序列中之一序列與列於SEQ ID NOs: 16、17、18、19或20之DNA序列中之一序列。該複製DNA可在 進一步增殖前先稀釋。 該偵測分子可包含編碼SARS冠狀病毒RNA序列之至少一 25 201245452 部分之DNA序列，其係用於與目標分子結合；及一訊號產生者β 該訊號產生者可包含下列之一：螢光分子、分子信標、其 他可被刺激並放出可被適當偵測器偵測並定量之光子之分 子。較佳地，該偵測分子的DNA序列編碼列於SEQ ID NOs: 20 至25之DNA序列中之一序列。 本發明現以下列非限制實例例示。應注意的是在不悖離本 發明範圍内，不同的改變及修飾皆可應用於下列實例及方法。 實例 用於下列例子之成份及一般程序茲詳述如下： 樣本 用於分離核酸之樣本係得自SARS病患，且其係由中國北京 醫院所提供。 A盒(核酸分離）
Qiagen RNeasy®迷你套組(Qiagen RNeasy® Mini Kit)核酸 分離套組。 盒B (核酸增殖） 主要混合物(0.5ml)(購自Eurogentec) 包含具有 dUTP (〇.2mM 之 dATP、dCTP、dGTP 及 〇.4mM dUTP)之dNTP、熱起始的丁叫DNA聚合酶、MgCl2、尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)及參考榮光。 SARS 引子(20/zl) 與SARS相關冠狀病毒的聚合酶基因之一區域互補之DNA 寡核酸並包含SEQ ID NOs: 1至20及26及27。 SARS 探針(10/zl) 26 201245452 與S ARS相關冠狀病毒的聚合酶基因之一區域互補之dna 寡核酸，且其以螢光發射標定及螢光抑制分子標定並包含SEQ ID NOs: 21 至25。 0.2mM之母—種SARS引子及〇.24mM之TaqMan SARS探針 係加入通用的主要混合物。 SARS陽性控制组(l〇y 1) 一包含SARS相關冠狀病毒的聚合酶基因之部分區域之高 度純化及非感染性之質體。 試劊釐備程序 A盒(核酸分離） 準備所需的足夠數量之RNeasy迷你管柱(每一樣本一個）。 準備所需的RLT緩衝溶液(每一樣本〇.4ml)、RW1緩衝溶液(每一 樣本0.7ml)及RPE緩衝溶液（每一樣本〇.5ml)(所有皆包含於 RNeasy套組中）並緩慢增溫至室溫，準備所需的70%乙醇（每一 樣本0.4ml)及無核酸水(每一樣本50μ1)並緩慢增溫至室溫。 Β盒(核酸增殖） 準備所需的主要混合物、SARS引子、SARS探針、純化的 核酸模板(樣本)及無核酸水並緩慢增溫至室溫。 核酸萃取程序（Qiagen RNeasy®迷你套组（Qiagen RNeasy® Mini Kit)) 1. 混合〇.4ml之樣本及0.4m〖之RLT緩衝溶液。 2. 0.4ml之70%乙醇加入管中。 3. 0.6ml之該混合溶液加入RNeasy管柱中。緩慢地蓋緊 該管並以約l〇,〇〇〇xg離心15秒。丟棄流過的溶液於一2mi 27 201245452 收集管中。重複步驟3。 4· 0.7ml之RW1緩衝溶液加入RNeasy管柱中。緩慢地蓋 緊该官並以約10,000xg離心15秒以清洗該管柱。丢棄流過 的溶液。 5. 0.5ml之RPE緩衝溶液加入RNeasy管柱中。以約 10,000xg離心15秒》丟棄流過的溶液《重複步驟5。 6. 該管柱以約10,〇〇〇xg離心額外2分鐘。 7. 該RNeasy管柱移至一新的i.5ml收集管。50 v丨無核 酸酶水以微量分注器直接加在矽膠膜上並至於室溫3分鐘。 8. 該RNA以約10,000xg離心1分鐘洗提。 9. 得到核酸，即RNA。 定序程序 增殖反應的產物係以定序確定複製區域是否相當於目標 序列。使用可購得之定序套組(Applied Biosystems)，根據說明 書進行定序反應。DNA序列係使用373A定序儀系統(Applied Biosystems)解析定序反應而得。DNA序列係使用來自National Center for Biotechnology Information (NCBI)之BLAST序列比較 工具分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。 實例1 :
使用PCR作為前增殖之加強即時PCR PCR前增殖： 在251的總體積中，混合下列各項成份：無核酸酶水、 0.2mM之dNTPs、1U之Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen)、 5mM之MgC12、lx PCR緩衝溶液、引子（10μΜ)及cDNA模板（約 28 201245452 100ng)。在Mastercycler (Eppendort)中以下列溫度模式進行 PCR : 起始步驟 50°C，2分鐘 DNA聚合酶活化 95°C，3-5分鐘 40週期 95°C ， 30秒 50°C ， 45秒 72°C ， 15秒
即時PCR 在PCR前增殖之第一回合之後，一部分產物用作使用 RT-PCR之進一步增殖之模板。 PCR成分係如表3所述之比例混合。 成份 體豬（ζζΠ 無核酸酶水 7.8 主要混合物 10 SARS引子 0.8 SARS探針 0.4 模板（l〇〇ng) 1 總體積 20 表3 如表4中之增殖模式設定RT-PCR設備（ABI 7700)。 起始步驟 50°C，2分鐘 DNA聚合酶活化 95°C，10分鐘 50週期 95。(：，15秒 72°C，1分鐘
表4 :即時PCR模式(ABI Prism 7700序列偵測器（ABI
Prism 7700 Sequence Detector)) 使用PCR前增殖接著RT-PCR偵測SARS冠狀病毒之結果顯 示於表5及6，其結果係以使用Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzer及上述之一般步驟之DNA定序確認。 29 201245452 比鲛得自SARS病患之核酸樣本之不同增殖方法 顯示於表5及6之結果係得自嘗試增殖分離從不同病患樣 本之核酸。該樣本係得自SARS病患並由中國北京醫院提供。每 一樣本由三種不同方法測試： 傳統PCR與洋菜膠電泳， 即時 Taqman®PCR，及 該新描述之方法’使用前增殖步驟之加強RT-PCR» 傳統PCR與PCR前增殖使用相同的步驟進行。即時Taqman® PCR使用與ERT方法相同之步驟進行。
樣本編號 樣本形式 傳統 PCR 即時 PCR 加強 RT-PCR 臨床診斷 1 白血球細胞 NEG NEG POS SARS 2 鼻拭子 NEG NEG POS SARS 3 咽喉栻子 NEG NEG POS SARS 4 咽喉拭子 NEG NEG POS SARS 5 血清 NEG NEG POS SARS 6 鼻拭子 NEG NEG POS SARS 7 糞便 NEG NEG POS SARS 8 血清 NEG NEG POS SARS 9 咽喉栻子 NEG NEG POS SARS 10 尿液 NEG NEG POS SARS 11 尿液 NEG NEG POS SARS 12 鼻拭子 NEG NEG POS SARS 13 糞便 NEG NEG POS SARS 14 血清 NEG NEG POS SARS 15 尿液 NEG NEG POS SARS 表5 :不同增殖及偵測技術之結果 靈敏度研究之結果 冠狀病毒RNA係經萃取並轉譯成cDNA。該cDN八係經連續 稀釋並以表6所述之三種方法測試。 30 201245452 樣本編號 稀釋倍率 傳統PCR 即時PCR 加強RT-PCR 1 10e-l POS POS POS 2 10e-2 POS POS POS 3 10e-3 POS POS POS 4 10e-4 POS POS POS 5 10e-5 NEG POS POS 6 10e-6 NEG POS POS 7 10e-7 NEG NEG POS 8 10e-8 NEG NEG POS 9 10e-9 NEG NEG POS 10 10e-10 NEG NEG NEG 11 10e-ll NEG NEG NEG 表6 :靈敏度研究 實例2
使用PCR作為前增技之加強即時pcR 從120個診斷為疑似疑似或極可能SARS病例之病患收集臨 床樣本’並以傳統PCR接著洋菜膠電泳、傳統TaqMan®即時PCR 及根據本發明實例1的步驟之加強TaqMan®即時PCR分析分析。 使用ERT，一段SARS-CoV聚合酶之約190 bp片段係以傳統 PCR從cDNA增殖。該複製區域係經定序並確定是否相當於 SARS-CoV的預期區域。此PCR產物接著用作使用rt-PCR引子 進行之加強即時PCR之模板。以此步驟，28/120 (23.3%)病患樣 本係被鑑定為SARS-CoV陽性’相較於以標準即時方法之21/120 (18.3%) ’及以不同傳統PCR方法之平均僅10.6%。適當的陰性， 陽性及PCR抑制控制使用於該增殖步驟的每一階段。 以標準及加強即時PCR用於臨床樣本之篩選資料係顯示於 第5至8圖。SARS-CoV陽性及SARS-CoV陰性樣本之間的不同 可清楚觀察（第5圖，以箭頭指出）。當同樣的樣本之陽性及陰 性訊號之間的區別以標準即時PCR分析則較不明顯，其 SARS-CoV陽性及陰性增殖曲線幾乎互相重疊（第7圖）。如此 31 201245452 可較輕易地解釋即時PCR結果可輕易地區分具有得自ERT之加 強陽性及陰性訊號。該加強即時PCR方法相較於傳統即時方 法’造成SARS-CoV陽性樣本的週期數值(Ct)降低。ct值$35 為用於清楚區分樣本中含有及不含SARS-CoV核酸之較適當的 截止點。 分析的靈敏度 每一種分析方法之極限係藉由得自香港病患之SARS-CoV (2 X1 〇2'5 TCID^/ml)培養樣本所萃取之總核酸連續稀釋而測 定。傳統PCR、標準即時PCR及加強即時PCR方法之偵測極限 為2xl〇-5.5TCID50/ml、2xl(Tlo.5TCID50/ml (第 1D 圖）及2χ1〇-12·5 TClDso/ml(第1C圖）。因此，加強即時PCR方法相較於標準即 時PCR至少靈敏1〇2倍，且相較於目前使用mSars-CoV之分子 偵測之任何傳統PCR技術靈敏1 〇7倍。以病毒培養之SARS-CoV 偵測可能是最不靈敏的方法，以加強即時PCR偵測之病例只有 3/28 (10.7%)可被病毒培養彳貞測為SARS-CoV陽性。 發現數個病例以加強即時PCR方法偵測為SARS-CoV陽性 樣本，而以其他分析方法則無法確認。因此，任何可改善偵測 正確性之新偵測方法，皆可有價值地增加為適用於臨床之檢驗 工具。單獨使用傳統PCR及即時PCR只可鑑定少數SARS-CoV 陽性病例。由病毒培養確定之結果為3/28個病例。加強即時PCR 方法之偵測極限高於標準即時PCR分析1 〇2倍，且高於傳統pcr 方法107倍。增加的靈敏度可幫助控制未來SARS爆發期間疾病 的傳播。 實例3 32 201245452 使用NASBA作為加強即時PCR之前增殖 i) NASBA 反應 NASBA試劑混合物成分（最終濃度）： SARS引子對
Tris-Cl > pH8.5
MgCl2 KC1 DTT DMSO 0.2mM (SEQ ID NOs: 26及27) 40mM 12mM 70mM 5mM 10%
DNTPs 每一種 ImM
NTPs 每一種2mM NASBA酵素混合物成分（最終濃度）： BSA 0.1mg/ml T7RNA聚合酶 30單位 反轉錄酶 8單位 RNase Η 0.1 單位 NASBA反應混合物： 5 β 1 模板 0.83//1 SARS引子混合物（10//Μ) 6.67//1 試劑混合物 \.\Ί β\ 水 15 y 1 總體積： 反應混合物在65°C下培養5分鐘接著冷卻至41°C5分鐘。接 著將5 y 1之酵素混合物（共55/z 1用於1個酵素球面）加入該反應 混合物，簡短混合後，冷卻至41°C並培養5分鐘。該反應混合 33 201245452 物在簡短離心後在41°C培養1.5小時。
ii) TaqMan 即時 PCR NASBA前增殖的第一回合後，NASBA產物係用作使用 RT-PCR之進一步增殖之模板，如下：
TaqMan反應混合物 2.0 μ 1 模板 \.6μ\ 引子及探針混合物（10/ζΜ) ΙΟβΙ 通用混合物（2χ) 8.9 μ 1 DEPC-水 20βΙ 總體積： 熱週期模式： 5(TC，2分鐘 95°C，10分鐘 40個週期：95°C，15秒 58°C，1分鐘 NASBA加強即時PCR之結果： 發現該冠狀病毒NASBA產物可成功增殖且被TaqMan即時 PCR偵測，如表7、8及9所示。 樣本 NASBA讀數 樣本 NASBA讀數 RS 34574 TCIDjo 10" (2χ10-8.5) 401 TCID50 10—2 (2χ10°·5) 992660 TCID50 1012 (2xl〇·9·5) 355 TCIDjo 10'4 (2χ10·丨.5) 1566632 TCIDjo 10u (2xl〇·105) 411 TCIDso ΙΟ'" (2χ1〇·3·5) 10000001 TCIDjo 10'14 (2x10-丨丨·5) 355 TCIDjo ΙΟ'7 (2χ10-4·5) 2382494 TCID50 10'15 (2x10-丨2.5) 506 TCIDjo ΙΟ'8 (2χ1〇-5.5) 7404 NASBA陰性 352 34 201245452
TCIDjo 10'9 (2χ1〇·6·5) 415 陰性 142 TCIDso 10ιυ (2χ10'7·5) 341 表7:以電化螢光法(ECL)偵測NASBA
樣本 ct值 樣本 Ct值 TCIDso 10" (2χ10°·5) 11.29 TCIDso 10'" (2χ10_8.5) 40 TCIDjo ΙΟ'4 (2x10-丨·5) 14.12 TCIDso ΙΟ'1" (2χ10·9.5) 40 TCIDso ΙΟ'6 (2χ10'3·5) 10.79 TCIDso l〇'，J (2xl0'10S) 40 TCIDso 10ν (2χ1〇·4·5) 8.30 TCID50 1014 (2xl〇·"·5) 40 TCIDjo ΙΟ'8 (2χ10-5.5) 7.16 TCIDso 10'15 (2xl〇·125) 40 TCIDso ΙΟ'9 (2χ1〇-6·5) 40 陰性 40 TCIDso 10"1ϋ (2χ10'7·5) 40 表8 : NASBA-TaqMan即時PCR
樣本 Ct值 樣本 Ct值 TCIDso 10'J (2xl〇·0·5) 25.99 TCIDso l〇'IU (2χ10·7.5) 40 TCIDso ΙΟ'4 (2xl〇-丨.5) 32.82 TCIDso ΙΟ'11 (2xl〇·8'5) 40 TCIDso 10° (2χ102·5) 40 TCIDso ΙΟ'12 (2χ1〇·95) 40 TCID50 10'6 (2xl〇·3·5) 40 TCIDso 10'IJ (2x10-丨0.5) 40 TCIDso 10'7 (2xl0'4·5) 40 TCIDso ΙΟ'14 (2χ10'η 5) 40 TCID5〇 ΙΟ'8 (2xlO'5·5) 40 TCIDso 1〇'15 (2χ1〇·12·5) 40 TCIDso 10y (2x10—6·5) 40 陰性 40 表9 :傳統即時PCR 35 201245452 發現NASBA-TaqMan PCR的反應條件經最佳化。 NASBA-TaqMan及一般NASBA的靈敏度相似，其接近TCID5〇 2χ10·5·5。表7 (NASBAECL結果）顯示該測試可備測低至TCId5〇
x 1 〇 ’ 其與NASBA TaqMan PCR (ERT)相同。然而，NASBA ECL 之讀數為7407，其與其他陽性訊息非常不同（通常超過百萬讀 數）。因此，在真實的情況下’此結果不易被判定為陽性。然而， 對於NASBA即時PCR (ERT) ’其Ct為7.16，與其他陽性訊息相 似。因此，我們的NASBA即時PCR(ERT)仍然勝過傳統NASBa 方法。 如上述實例所示，可瞭解該偵測套組可方便地用於各種檢 驗。此外，該偵測套組較現有方法相對簡單，並可在短時間内 k供偵測結果，若需要則谓測結果可在三小時内得到。因其為 一基於DNA之偵測系統，其專一性及靈敏度皆可加強，在本實 例中描述之偵測套組為對S A R S冠狀病毒具有專一性，且樣本中 的SARS冠狀病毒濃度可不再是重要的，因病毒將被複製達可偵 測之目標分子。 雖然本發明較佳實施態樣已於先前段落中描述，應明白熟 習該項技藝者修飾或改變本發明是可能的，且該等修飾或改變 仍屬於本發明之範圍内，其列於在下列申請專利範圍中。此 外，本發明之實施態樣不應被解釋為只限於實例或圖式。 【圖式簡單說明]| 第1圖係根據本發明之較佳實施態樣之偵測SARS冠狀病 毒整體方法之流程圖。 第2圖顯不以本發明之較佳實施態樣分離5八113冠狀病毒 36 201245452 及轉變成互補DNA(cDNA)之方法之流程圖。 第3圖顯示以二個DNA分子，引子A及B，所表示2SARS 冠狀病毒cDNA分子片段，及此增殖產物之後作為用於以二個 DNA分子，引子c及進行進一步增殖之模板之用途，並根據 本發明較佳實施態樣以探針E進行偵測及定量。 第4圖顯示相當於SEQ ID NOs:卜27之核酸序列。 第5至8圖顯示加強及標準即時增殖之比較。每—樣本之 △Rn (報告者螢光散發量與抑制者螢光散發量之比例)相對於週 期數目繪製成圖。螢光強度直接相關於目標0\八量》到達可偵 測程度螢光值之週期數目愈少，則起始複製數愈多。 第5圖顯示使用加強即時PCR分析臨床樣本。該 SARS-CoV陽性樣本可明顯區分於SARS-CoV陰性樣本，以箭號 指出。 第6圖之顯示使用標準即時PCR分析與顯示於A部分同 樣的臨床樣本。該SARS-CoV陽性樣本與SARS-CoV陰性樣本不 易區分。 第7圖顯示使用加強即時PCR所得之SARS-CoV的連續1〇 倍稀釋(2xl02·5 TCID50/ml [最高軌跡]至2χΚΓ10 5 TCID 50/ml)。 較低軌跡顯示反轉錄的陰性控制組及TaqMan®的陰性控制組。 第8圖顯示使用標準即時PCR所得之SARS-CoV的連續10 倍稀釋(2xl02.5 TCID50/ml [最高稀釋]至2xl(T10.5 TCID50/ml)。 【主要元件符號說明】 10單股SARS冠狀病毒RNA 14分離出的核酸混合物 12色層分析管柱 16互補DNA(cDNA) 37 201245452 18引子A 20 引子B 22延長的引子A 24延長的引子B 26 雙股DNA產物 28引子C 30引子D 32探針E 34雙股DNA產物 38 201245452 核笞酸序列表 <110〉香港基因晶片開發有限公司 <120>核苷酸之偵測 <130〉 58277 <150> GB 0310181.3 <151> 2003-05-02 <160> 27 <170〉Patentln 版本 3.1 <210〉 1 <211> 20 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 1 accagtcggt acagctacta 20 <210〉 2 <211> 20 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 2 gcattaactc tggtgaattc 20
<210〉 3 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 3 ctggtcacct ggtggaggt 19 <210> 4 <211> 20
<212〉 DNA <213> SARS冠狀病毒 201245452 <400> 4 gcgctaacaa agaaggcatc 20 <210> 5 <211〉 22 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 5 ggattatgtg ttgacatacc ag 22 <210〉 6 <211〉 23
<212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 6 attaccaagt caatggttag ggt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 7 tagactcatc tctatgatgg 20 <210〉 8 <211〉 20 <212> DNA <213〉SMS冠狀病毒 <400〉 8 taccaaagga catgacctac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 9 ccttgttgtt gttggccttt 20 201245452 <210> 10 <211〉 22
<212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400〉 10 ccagtcggta cagctactaa gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 11 ctctagttgc atgacagccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 12 aacacctgta gaaaatccta 20 <210〉 13 <211> 19 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400〉 13 actaagttaa cacctgtag 19 3 201245452 <210> 14 <211〉 19
<212〉 DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 14 gcggcagtca agcctcttc 19 <210〉 15 <211> 18 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400〉 15 cccgcgaaga agctatcg 18 <210> 16 <211〉 1.9 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 16 cccgcgaaga agctattcg 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 17 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 18 <211〉 16 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 18 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 4 201245452 <400> 19 tgctgccagg agttgaattt C 21 <210〉 20 <211〉 18 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 20 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 21 ttcgtgcgtg gattggct 18 <210〉 22 <211> 20 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 22 tagagggctg tcatgcaact 20 <210> 23 <211〉 19
<212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400:> 23 attggctttg atgtagagg 19 <210〉 24 <211:> 29
<212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 24 cgctcctcat cacgtagtcg ctgtaattc 29 it 5 201245452 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 25 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 26 <211〉 56 <212:> DNA <213〉SARS冠狀病毒 <400> 26 aattctaata cgactcacta tagggagaag gagctggaga ggtaggttag taccca 56 <210> 27 <211:> 42 <212> DNA <213> SARS冠狀病毒 <400> 27 gatgcaaggt cgcatatgag taccgtagac tcatctctat ga 42 6

Claims (1)

  1. 201245452 拾、申請專利範圍： 1. 一種分離之DAN序列，其包含SEQ ID NOs 1至27中任一 段序列。 2. 根據申請專利範圍第1項之分離之DAN序列，其係由包含 SEQ ID NOs 1至27中任一段序列所組成。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之分離之DAN序列，其係用 於DNA增殖。 4. 根據申請專利範圍第3項之分離之DAN序列，其係用作引 子或探針，其中該探針可為螢光標定。 5. —種用於偵測核酸之方法，其包括核酸分離接著核酸增殖及 其後即時PCR之步驟。 6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其核酸增殖包含PCR、 NASBA或任何其他核酸增殖技術。 7. 根據申請專利範圍第5或6項之方法，其中即時PCR係使 用螢光標定之探針。 8. 根據申請專利範圍第5至7項中任一項之方法，其中該被偵 測之核酸為DNA或cDNA。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該核酸為SARS冠狀 病毒cDNA。 10. 根據申請專利範圍第5至9項中任一項之方法，其中該方 法包括下列步驟： i) 從生物或環境樣本中萃取核酸； ii) 增殖該核酸，視需要使用PCR、NASBA或任何其 他核酸增殖技術；及 201245452 iii) 使用即時PCR增殖及偵測步驟(ii)中所製造之 核酸。 11. 根據申請專利範圍第10項中之方法，其中若該核酸係得自 RNA，則步驟⑴之後有一附加步驟，其中該步驟包括使用反 轉錄酶將RNA轉變成cNDA。 12. 根據申請專利範圍第5至11項中任一項之方法，其中引子 及/或探針係用於步驟(ii)及（iii)。 13. 根據申請專利範圍第12項之用於檢驗SARS冠狀病毒 cDNA之方法，其中該引子及/或探針係與SARS冠狀病毒 cDNA之至少一部分結合。 14. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中該所用之引子及/ 或探針係相當於包含SEQ ID NOs: 1至27之分離之序列。 15. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中該用於步驟(iii)之 引子係與該探針不重疊。 16. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中該用於步驟(ii)之引 子組當於5£()10\〇3:1、2、3、4或5;及6、7、8、9或 10中任一序列。 17. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中該用於步驟(ii)之引 子組係相當於SEQ ID NOs: 26及27中任一序列。 18. 根據申請專利範圍第14或15項之方法，其中該用於步驟 (iii)之引子組係相當於 SEQ ID NOs: 11、12、13、14 或 15 ; 及16、17、18、19或20中任一序列。 2 201245452 19. 根據申請專利範圍第16至丨8項中任一項之方法，其中該 用於步驟（iii)之探針係相當於SEQ ID NOs: 21、22、23、24 或25中任一序列》 20. 根據申請專利範圍第1項之分離之DNA序列，其係用於偵 測核酸之方法。 21. 根據申請專利範圍第20項之分離之DNA序列，其中該核 酸為該SARS冠狀病毒RNA或cDNA。 22. —種根據申請專利範圍第1項之分離之DNA序列用於製造 用於偵測核酸之方法之組合物之用途，其中該方法包括下歹4 步驟： i) 從生物或環境樣本中萃取核酸； ii) 增殖該核酸，視需要使用PCR、NASBA或壬 他核酸增殖技術；及 iii) 使用即時PCR增殖及偵測得自步驟(ii)之核酸。 23. 根據申請專利範圍第22項之用途，其中該核酸為dna气 cDNA 〇 24. 根據申請專利範圍第23項之用途，其中該核酸為SARS冠 狀病毒cDNA。 25. —種專一性對SARS冠狀病毒之引子用於製造用於偵測病 毒感染之診斷檢驗套組之用途，其中該病毒為SARS冠狀病 毒及該引子係由SEQ ID NOs: 1至27所組成。 26. —種SARS診斷檢驗套組’其包含二或多個相當於SEQ id NOs: 1至27之分離之DNA序列。 201245452 27. 根據申請專利範圍第26項之SARS診斷檢驗套組，其包含 相當於5丑(）10 1^〇8:卜2'3、4或5;及6、7、8、9或1〇 中任一序列之引子。 28. 根據申請專利範圍第26項之SARS診斷檢驗套組，其包含 相當於SEQ ID NOs: 26及27中任一序列之引子。 29. 根據申請專利範圍第26至28項中任一項之SARS診斷檢 驗套組，其包含相當於SEQ ID NOs: 11、12、13、14或15 及16、17、18、19或20中任一序列之引子。 30. 根據申請專利範圍第29項之SARS診斷檢驗套組，其包含 相當於SEQ ID NOs: 21、22、23、24或25中任一序列之探 針。 31. —種用於偵測生物及環境樣本中之SARS冠狀病毒之診斷 套組，其中該套組包含； (i) 用於從該樣本分離SARS冠狀病毒RNA之分離 試劑；及 (ϋ)用於複製目標分子之核酸複製試劑’其中該目標 分子包含：與SARS冠狀病毒RNA序列之至少 一部分互補之核酸序列；及 (iii)用於偵測該目標分子之核酸偵測試劑’其中該核 酸偵測試劑包含該偵測分子。 32. 根據申請專利範圍第31項之用於偵測SARS冠狀病毒之套 組，其中該目標分子為cDNA分子。 33. 根據申請專利範圍第31或32項之用於偵測SARS冠狀病 毒之套組，其中該核酸複製試劑包含第一次純化及分離之 4 201245452 DNA分子，其包含：與SARS冠狀病毒RNA序列之至少一 部分結合之DNA序列，如此當該第一次純化及分離之DNA 分子與SARS冠狀病毒cDNA序列之至少一部分結合時，該 第一次純化及分離之DNA分子在酵素及DNA核苷酸存在下 延長而產生一 DNA序列，其包含與SARS冠狀病毒cDNA 序列之至少一部分互補之DNA序列。 34. 根據申請專利範圍第31至33項中任一項之用於偵測SARS 冠狀病毒之套組，其中該第一次DNA序列編碼SEQ ID NOs: 1、2、3、4或5中其中之一序歹|J與歹1J於SEQ ID NOs: 6、7、 8、9或10中其中之一序列，或SEQ ID N〇s: 26及27。 35. 根據申請專利範圍第31至33項中任一項之用於偵測SARS 冠狀病毒之套組，其中該核酸複製試劑包含第二次純化及分 離之DNA分子，其包含：用於與增殖之第一回合所製造之 SARS冠狀病毒DNA序列之至少一部分結合之DNA序列， 如此當該二次純化及分離之DNA分子與SARS冠狀病毒 cDNA序列之至少一部分結合時，該第二次純化及分離之 DNA分子在酵素及DNA核苷酸存在下延長而產生一 DNA 序列，其包含與增殖之第一回合所製造之SARS冠狀病毒 cDNA序列之至少一部分互補之DNA序列。 36. —種根據申請專利範圍第32至33項中任一項之用於偵測 SARS冠狀病毒之套組，其中該第二次DNA序列編碼列於 SEQ ID NOs: 11、12、13、14或15中其中之一序列與列於 SEQ ID NOs: 16、17、18、19 或 20 中其中之一序列。 201245452 37. 根據申請專利範圍第31至36項中任一項之用於偵測SARS 冠狀病毒之套組，其中該複製的DNA產物在進行進一步增 殖前先稀釋。 38. 根據申請專利範圍第31至37項中任一項之用於偵測SARS 冠狀病毒之套組，其中該檢驗分子包含：用於結合目標分子 之編碼與SARS冠狀病毒RNA序列之至少一部分互補之 DNA序列；及訊號產生器。 39. 根據申請專利範圍第38項之套組，其中該第一次DNA分 子的DNA序列與第二次DNA分子不重疊。 40. 根據申請專利範圍第38或39項之套組，其中該訊號產生 器包含下列之一：螢光分子、分子信標、或其他可被刺激並 放出可被適當偵測器偵測並定量之光子之分子。 41. 根據申請專利範圍第38至40項中任一項之用於偵測SARS 冠狀病毒之套組，其中該偵測分子編碼SEQ ID NOs: 21至 25中任一序列。 6
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