WO2005001097A1 - Ｓａｒｓコロナウイルスの検出法 - Google Patents

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sars coronavirus
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Harumi Minekawa
Keiko Watanabe
Shinichi Kojiya
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Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting SARS coronavirus, and more particularly to a method for diagnosing severe acute respiratory syndrome using a highly sensitive detection method for genes.
  • SARS coronavirus a pathogenic virus of SARS, is a single-stranded RNA virus (see, for example, Non-Patent Document 1). This virus is also known to infect non-human animals.
  • SARS severe respiratory syndrome
  • respiratory symptoms such as fever above 38 ° C, cough, dyspnea, and other symptoms such as headache, chills, poor appetite, general malaise, diarrhea, and consciousness turbidity. May be seen.
  • These symptoms are almost the same as other respiratory diseases, such as influenza, and it is difficult to distinguish them from other diseases based on symptoms alone.
  • An immunological method is known as a clinical screening method. This is to examine the presence of antibodies against viral antigens in blood, serum, urine or saliva.
  • SARS coronavirus two methods are known: enzyme immunoassay (ELISA) and immunofluorescence (IFA). ing. However, none of these are detected in the early stage of the onset of disease. In ELISA, antibodies are detected only after 20 days after onset, and in IFA after 10 days after onset (see, for example, Non-patent Document 2).
  • the present inventors have used the detection method of the present invention, ie, the LAMP method, which is more sensitive and has a higher sensitivity than the currently known methods, immunological measurement methods and PCR methods, that is, the LAMP method. The goal was achieved.
  • Non-Patent Document 1 World Health Organization Update 49-SARS case fatality ratio, incubation period 7 May 2003 Case fatality ratio Searched on June 24, 2003, Internet ⁇ Internet ⁇ URL: http: //www.who. mt / csr / sars / archive / 2003_05_07a / en /
  • Non-Patent Document 2 National Institute of Infectious Diseases, Infectious Disease Information Center, SARS: Diagnostic Test (April 29th, 4th revision -1) June 24, 2003 search
  • Non-patent document 3 Drosten C., et al. “New Eng. J. Med.” 2003, 348 ⁇ , P.1967-1976
  • Non-patent document 4 National Institute of Infectious Diseases, Infectious Disease Information Center, National Infectious Disease Laboratory virus Part 3 1st room Detection of SARS coronavirus gene by RT-PCR (updated on May 16, 2003) June 24, 2003 search, Internet
  • An object of the present invention is to detect SARS coronawinoles, which are pathogenic viruses, with high sensitivity for early diagnosis of SARS.
  • the present inventors have prepared an oligonucleotide primer that selectively hybridizes with a base sequence specific to SARS coronavirus, and the SARS by the LAMP method. It was found that SARS coronavirus can be detected with high sensitivity by amplifying a base sequence specific to coronavirus, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following configuration.
  • Oligonucleotide primer (1) Designed from an arbitrary base arrangement IJ selected from the base sequences from 4 to 256 of the RNA polymerase base sequence of SARS coronavirus represented by SEQ ID NO: 1, or a base sequence complementary thereto. Oligonucleotide primer.
  • SARS coronavirus RNA polymerase base sequence ability At least a sequence selected from the selected base sequence shown in SEQ ID NOs: 2-13 or a complementary base sequence thereof. Oligonucleo according to (1) comprising 15 bases that follow:
  • a base sequence specific to SARS coronavirus can be amplified and consists of a base sequence selected from (e) to (h) below from the 5 'end to the 3' end (1 )
  • the oligonucleotide primer according to (1) can be amplified and consists of a base sequence selected from (e) to (h) below from the 5 'end to the 3' end (1 )
  • the oligonucleotide primer according to (1) can be amplified and consists of a base sequence selected from (e) to (h) below from the 5 'end to the 3' end (1 )
  • the oligonucleotide primer according to (1) can be amplified and consists of a base sequence selected from (e) to (h) below from the 5 'end to the 3' end (1 )
  • the oligonucleotide primer according to (1) can be amplified and consists of a base sequence selected from (e) to (h) below from the 5 'end to the 3' end (1
  • a method for detecting SARS coronavirus which comprises carrying out an amplification reaction of a target nucleic acid region of SARS coronavirus using the oligonucleotide primer according to one (4).
  • the SARS coronavirus A method for diagnosing severe acute respiratory syndrome, wherein the presence or absence of SARS coronavirus infection is diagnosed by detecting amplification of a target nucleic acid region.
  • a kit comprising the oligonucleotide primer according to (1).
  • an oligonucleotide primer that selectively hybridizes with a base sequence specific to SARS coronavirus is prepared, and a base sequence specific to SARS coronavirus is amplified by the LAMP method.
  • Samples used in the present invention include specimens derived from living organisms of humans or other animals suspected of having SARS infection, such as sputum, bronchoalveolar lavage fluid, nasal discharge, nasal aspirate, nasal rinse, nasal wipe, Examples include pharyngeal wipes, gargles, saliva, blood, serum, plasma, spinal fluid, urine, feces, and tissues.
  • cells that have been used for infection experiments, culture solutions thereof, or specimens containing viruses isolated from biological specimens or cultured cells can also serve as samples. These samples may be pretreated, such as separation, extraction, concentration, and purification.
  • Such nucleic acid amplification is a new nucleic acid amplification method developed by Natomi et al. That does not require temperature control, which is indispensable for PCR: Loop-mediated isothermal amplification called the LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method Achieved by law (Patent Publication WO 00/28082 pamphlet).
  • LAMP Loop-mediated Isothermal Amplification
  • complementary nucleotide synthesis is performed by combining the primer that anneals to the loop formed at this time by annealing the 3 ′ end of the nucleotide itself to the cage-shaped nucleotide and using it as a starting point for complementary strand synthesis.
  • the 3 'end of the primer is always annealed to the region derived from the sample, and the check mechanism based on complementary binding of the base sequence functions repeatedly.
  • a highly specific nucleic acid amplification reaction is possible.
  • the oligonucleotide primer used in the LAMP reaction is the base sequence of the cage nucleic acid.
  • the complementary sequences of Flc, F2c and F3c are called Fl, F2 and F3, and the complementary strands of Rl, R2 and R3 are called Rlc, R2c and R3c, respectively.
  • An inner primer is a nucleic acid synthesis reaction product that recognizes a “specific nucleotide sequence region” on the target base sequence and has a base sequence that gives a synthesis origin at the 3 ′ end, and at the same time starts from this primer.
  • a base sequence selected from F2 IJ and “a primer containing base sequence 1 selected from Flc” are referred to as an inner primer F (hereinafter referred to as IPF), and “a base sequence selected from R2”.
  • a primer containing “a base sequence selected from R 1 c” is referred to as an inner primer R (hereinafter IPR).
  • the outer primer refers to the base sequence 1J that recognizes the “specific nucleotide sequence region existing 3 ′ end of the“ specific nucleotide sequence region ”on the target base sequence and provides the origin of synthesis. It has an oligonucleotide.
  • a primer including “base alignment IJ selected from F3” is referred to as outer primer F (hereinafter OPF)
  • a primer including “base alignment U selected from R3” is referred to as outer primer R (hereinafter referred to as OPR). .
  • F in each primer is a primer indication that complementarily binds to the sense strand of the target base sequence and provides a starting point for synthesis, while R is complementary to the antisense strand of the target base sequence.
  • R is complementary to the antisense strand of the target base sequence.
  • a primer display that provides a starting point for synthesis.
  • the length of the oligonucleotide used as a primer is 10 bases or more, preferably 15 bases or more. Either a chemical synthesis or a natural primer may be used.
  • Each primer may be a single oligonucleotide. It may be a mixture of a plurality of oligonucleotides.
  • Loop Primer is a primer having a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded part of the loop structure at the 5 ′ end side of the dumbbell structure.
  • the base sequence of the loop primer is the above C As long as it is complementary to the base sequence of the single-stranded portion of the loop structure at the 5 ′ end side of the structure, it may be selected from the base sequence of the target gene or its complementary strand.
  • One or two loop primers may be used.
  • SARS coronavirus is an RNA virus.
  • the nucleic acid amplification reaction can be similarly promoted by adding reverse transcriptase to the reaction solution when the cocoon type is DNA (RT-LAMP method).
  • OPF-A 5'_ ACCAAGTCAATGGTTACCCT—3 '(1J number
  • OPR-A 5'-GTGTCAACATAACCAGTCGG -3 '(SEQ ID NO: 16)
  • LPR-A 5'- GTACTAACCTACCTCTCCAGC _3 '(SEQ ID NO: 21)
  • IPF— B 5'_ TGCATGACAGCCCTCGAAGAAGCTATTCGTCAC _3 '
  • OPF-B 5'- CTAATATGTTTATCACCCGC _3 '(SEQ ID NO: Ten)
  • OPR-B 5 CTCTGGTGAATTCTGTGTT _3, (Guide 'J number 1
  • LPF-B 5'- AAAGCCAATCCACGC -3 '(SEQ ID NO: 22)
  • LPR-B 5'-CCAGCTAGGATTTTCTACAGG -3 '(SEQ ID NO:
  • the enzyme used in the nucleic acid synthesis is not particularly limited as long as it is a cage-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity.
  • examples of such an enzyme include Bst DNA polymerase (large fragment), Bca (exo_) DNA polymerase, E. coli DNA polymerase I Talenow fragment, and preferably Bst DNA polymerase (large fragment).
  • the reverse transcriptase used in the RT-LAMP method is not particularly limited as long as it has an activity of synthesizing DNA using RNA as a cage.
  • Such enzymes include AMV,
  • RT-LAMP reaction can be performed with a single enzyme using an enzyme that has both reverse transcriptase activity and DNA polymerase activity, such as Bca DNA polymerase.
  • Enzymes and reverse transcriptases used in nucleic acid synthesis may be purified from viruses or bacteria, or may be produced by gene recombination techniques. These enzymes may be modified by fragmentation or amino acid substitution.
  • a known technique can be applied to the detection of the nucleic acid amplification product after the LAMP reaction.
  • a labeled oligonucleotide that specifically recognizes the amplified base sequence or a fluorescent intercalator method Japanese Patent Laid-Open No. 2001-242169
  • the reaction solution after completion of the reaction is used as it is.
  • It can also be easily detected by agarose gel electrophoresis. In agarose gel electrophoresis, a large number of bands with different base lengths are detected as ladders in the LAMP amplification product.
  • Various reagents necessary for detection of nucleic acid amplification using the primer of the present invention can be packaged by first packaging. Specifically, various oligonucleotides necessary as primers or loop primers of the present invention, four types of dNTPs that serve as substrates for nucleic acid synthesis, DNA polymerase that performs nucleic acid synthesis, enzymes with reverse transcription activity, and enzyme reactions Buffers and salts that give suitable conditions, protecting agents that stabilize enzymes and molds, and reagents necessary for detection of reaction products, if necessary, are provided as kits.
  • the detection sensitivity was compared between the LAMP method and the PCR method.
  • RNA of SEQ ID NO: 1 selected from the SARS coronavirus RNA polymerase sequence is dissolved in Yeast RNA (Ambion) solution (SOng / ⁇ L) and diluted from 10 copies to 10 4 copies per ⁇ L And 2.5, 5, and 10 copy dilutions were prepared and used as sample solutions.
  • the Yeast RNA solution was used as a 0-copy sample solution.
  • Non-Patent Document 4 two types of primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 24 and 25 that amplify 195 bp of the RNA polymerase genome are used as primers for detecting SARS coronavirus used in the PCR method. According to the same procedure.
  • each reagent concentration in 25 ⁇ L of the final reaction solution was prepared as follows.
  • the sample solution 5 mu L containing the target Hai ⁇ IJ0 or 10 10 3 copies in addition to the above cDNA synthesis reaction solution was subjected 42 ° C50 minutes then 70 ° C15 minutes.
  • For PCR reaction add 1 ⁇ L of cDNA synthesis solution to the above PCR reaction solution to make 50 ⁇ L of the final reaction solution, and use a thermal cycler PTC_200 (MJ Research) in a 0.2 mL dedicated tube. Denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds, and polymerase extension reaction at 72 ° C for 30 seconds for a total of 40 cycles. The journey took about an hour. After completion of the reaction, 5 ⁇ L of the reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel.
  • Fig. 1 shows the results of PCR electrophoresis
  • Fig. 2 shows the results of LAMP electrophoresis using primer set A.
  • amplification products could be confirmed in both PCR and LAMP methods.
  • the PCR method up to 10 2 copies were observed as a thin band with a force 10 copies of specific bands of 195bp was observed clearly.
  • the LAMP method was able to confirm a ladder-like band of specific amplification up to 10 copies.
  • the detection time of the LAMP method using primer set B was examined by a real-time turbidity measurement method using a real-time turbidity measurement apparatus LA-200 (manufactured by Terrametas). It was carried out using the composition 25 zL of the LAMP method in Example 1 and fixing the reaction temperature at 63 ° C.
  • Figure 4 shows the results.
  • FIG. 1 Shows the detection sensitivity of the PCR method by electrophoresis.
  • Lanes 1 and 7 are marker lane 2 is reagent blank lane 3 is 0 copy lane 4 is 10 copy lane 5 is 10 2 copy lane 6 is 10 3 copy
  • FIG. 2 Shows the detection sensitivity of the LAMP method using primer set A by electrophoresis.
  • Lane 1 is 0 copy lane 2 is 10 copy lane 3 is 10 2 copy lane 4 is 10 3 copy lane 5 is 10 4 copy lane 6 is a marker
  • FIG. 3 shows the detection time of real-time fluorescence measurement using primer set A.
  • FIG. 4 shows the detection time of the real-time turbidity measurement method using primer set B.

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Abstract

【課題】 　重症急性呼吸器症候群の診断のために、その病原ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスを高感度かつ迅速に検出する方法を提供すること。 【解決手段】 　ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼの塩基配列から設計された任意の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、該プライマーを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるＳＡＲＳコロナウイルス感染の診断方法、並びに重症急性呼吸器症候群診断用キット。

Description

明 細 書
SARSコロナウィルスの検出法
技術分野
[0001] 本発明は、 SARSコロナウィルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感 度な検出法を利用した重症急性呼吸器症候群の診断方法に関するものである。 背景技術
[0002] 重症急性呼吸器症候群（SARSと略す）は、 2002年 11月力も中国広東省に端を 発し、香港、台湾、カナダなどの国で爆発的な感染を引き起こした感染症である。世 界保健機関 (WHO)によると、 SARS感染者の死亡率は平均 15%、 65歳以上の高 齢者では 50%以上と推計されてレ、る。 SARSの病原ウィルスである SARSコロナウイ ルスは、 1本鎖 RNAウィルスである（例えば、非特許文献 1参照）。またこのウィルス は、ヒト以外の動物でも感染する事が知られている。
[0003] SARSの主な臨床症状は 38°C以上の発熱、咳、呼吸困難等の呼吸器症状であり 、ほかに頭痛、悪寒戦慄、食欲不振、全身倦怠感、下痢、意識混濁などの症状が見 られることもある。し力 これらの症状は、他の呼吸器疾患、例えばインフルエンザな どとほとんど同じで、症状のみから他の疾患と鑑別する事は難しレ、。
[0004] 臨床検查法として免疫学的方法が知られている。これは血液、血清、尿あるいは唾 液中のウィルスの抗原に対する抗体の存在を調べるもので、 SARSコロナウィルスで は酵素免疫測定法（ELISA)と免疫蛍光法（IFA)の二つの方法が知られている。しか し、これらはいずれも発病初期には検出されず、 ELISAでは発病後 20日以降、 IFAで は発病後 10日以降でないと抗体が検出されなレ、（例えば、非特許文献 2参照）。
[0005] この他にウィルスの遺伝子を PCR法で増幅する事で検出する方法も知られている。
し力、しこの方法は、増幅と検出に 1時間以上必要であり、検出感度が低いという問題 が示唆されていた。そこで、迅速かつ高感度に SARSコロナウィルスを検出できる検 查法が望まれていた。 （例えば、非特許文献 3、 4参照）
[0006] 本発明者らは、現在知られている方法、免疫学的測定法や PCR法より高感度で特 異的かつ所要時間が短い検出方法、すなわち LAMP法を用いることで、本発明の 目的を達成できた。
[0007] 非特許文献 1： World Health Organization Update 49 - SARS case fatality ratio, incubation period 7 May 2003 Case fatality ratio 平成 15年 6月 24日検索、インタ ~ネット < URL:http://www.who.mt/ csr/ sars/ archive/2003_05_07a/ en/
非特許文献 2：国立感染症研究所感染症情報センター、 SARS：診断検査法 (4月 29 日 4訂 -1)平成 15年 6月 24日検索、インターネットく
URL:http:/ 1 idsc.nih.go.jp/ others/ urgent/ update41-Nol.html >
非特許文献 3： Drosten C.， et al. 「New Eng. J. Med.」2003年、 348卷、 P.1967-1976 非特許文献 4 :国立感染症研究所感染症情報センター、国立感染症研究所ウィルス 第三部第 1室 RT-PCR法による SARSコロナウィルス遺伝子の検出（2003年 5月 16日 更新）平成 15年 6月 24日検索、インターネットく
URL:http:/ 1 idsc.nih.go.jp/ others/ urgent/ update56-b.html
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、 SARSの早期診断のために、その病原ウィルスである SARSコロナウイ ノレスを高感度に検出させることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、 SARSコロナ ウィルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドプライ マーを作製し、 LAMP法により SARSコロナウィルスに特異的な塩基配列を増幅す ることで、 SARSコロナウィルスを高感度に検出できることを見出し、本発明を完成し た。
[0010] すなわち、本発明は以下の構成からなる。
(1)配列番号 1で示される SARSコロナウィルスの RNAポリメラーゼ塩基配列の、 4 1番ー 256番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配歹 IJ、又はそれらと相補的な塩基 配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
(2) SARSコロナウィルスの RNAポリメラーゼ塩基配列力 選ばれた配列番号 2— 13で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連 続する 15塩基を含む（1)記載のオリゴヌクレオ：
(3)SARSコロナウィルスの標的核酸上の 3'末端側力 F3c、 F2c、 Flcという塩基 配列領域を、 5'末端側から R3、 R2、 R1という塩基配列領域を選択し、それぞれの 相補的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして R3c、 R2c、 Rlcとしたときに、以下の（a)—（ d)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（1)一（2)記載のオリゴヌクレオチ
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の R2領域を 3'末端側に有し、 5'末端側に標的核酸の Rlc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の R3領域を有する塩基配列。
(4) SARSコロナウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5'末端から 3'末端に向 かい以下の（e)— (h)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（1)一（3)記 載のオリゴヌクレオチプライマー。
(e) 5 '— (配列番号 2の塩基配列に相補的な塩基配歹 lj)一 (塩基数 0— 50の任意の塩 基配列) - (配列番号 3の塩基配列) - 3 '
(f ) 5 '- (配列番号 5の塩基配列) - (塩基数 0— 50の任意の塩基配歹 IJ) - (配列番号 6 の塩基配列に相補的な塩基配歹 一 3 '
(g) 5 '— (配列番号 8の塩基配列に相補的な塩基配歹 一 (塩基数 0— 50の任意の塩 基配列) - (配列番号 9の塩基配列) - 3 '
(h) 5'~ (配列番号 11の塩基配列) - (塩基数 0— 50の任意の塩基配歹 IJ) - (配列番 号 12の塩基配列に相補的な塩基配列)一 3 '
(5) (1)一（4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 SARSコロナウィルスの 標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする SARSコロナウィルスの検出方法。
(6) SARSコロナウィルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であることを特徴 とする（5)記載の SARSコロナウィルスの検出方法。
(7) (1)一（4)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて SARSコロナウィルスの 標的核酸領域の増幅を検出することにより、 SARSコロナウィルス感染の有無を診断 することを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
(8)重症急性呼吸器症候群の診断方法において、（1)一（4)記載のオリゴヌクレオチ ドプライマ一を含むことを特徴とするキット。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、 SARSコロナウィルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダ ィズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、 LAMP法により SARSコロナウィルス に特異的な塩基配列を増幅することで、 SARSコロナウィルスを高感度かつ迅速に 検出すること力 Sできる。
以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明において使用される試料としては、 SARS感染を疑われる人間あるいは他 の動物の生体由来の検体、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、 鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、 尿、糞便、組織などが挙げられる。また、感染実験などに用レ、られた細胞やその培養 液、あるいは生体由来の検体や培養細胞などから分離したウィルスを含む検体など も試料となりうる。これらの試料は分離、抽出、濃縮、精製などの前処理を行っても良 レ、。
[0013] このような核酸の増幅は、納富らが開発した、 PCR法で不可欠とされる温度制御が 不要な新しい核酸増幅法： LAMP ( Loop-mediated Isothermal Amplification)法と呼 ばれるループ媒介等温増幅法 (特許公報国際公開第 00/28082号パンフレット）で達 成される。この方法は、铸型となるヌクレオチドに自身の 3'末端をァニールさせて相 補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにァニールするプライマー を組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である 。また、 LAMP法では、プライマーの 3'末端が常に試料に由来する領域に対してァ ニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するた め、その結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
[0014] LAMP反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、铸型核酸の塩基配列の 計 6領域、すなわち 3'末端側から F3c、 F2c、 Flcという領域と、 5 '末端側から R3、 R 2、 R1という領域の塩基配列を認識する少なくとも 4種類のプライマーであって、各々 インナープライマー F及び Rとアウタープライマー F及び Rと呼ぶ。また、 Flc、 F2c、 F 3cの相補配列をそれぞれ Fl、 F2、 F3、また Rl、 R2、 R3の相補鎖を Rlc、 R2c、 R 3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列 領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を 3'末端に有し、同時にこのプライ マーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、 「F2より選ばれた塩基配歹 IJ」及び「 Flcより選ばれた塩基配歹 1 を含むプライマーをインナープライマー F (以下 IPF)、そ して「R2より選ばれた塩基配列」と「R 1 cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーを インナープライマー R (以下 IPR)と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配 列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の 3 '末端側に存在するある特定のヌクレ ォチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配歹 1Jを有するオリゴヌクレオチド である。ここで、 「F3より選ばれた塩基配歹 IJ」を含むプライマーをアウタープライマー F (以下 OPF)、「R3より選ばれた塩基配歹 U」を含むプライマーをアウタープライマー R ( 以下 OPR)と呼ぶ。ここで、各プライマーにおける Fとは、標的塩基配列のセンス鎖と 相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方 Rとは、標的塩基 配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であ る。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、 10塩基以上、好 ましくは 15塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良ぐ各プライマーは単 一のオリゴヌクレオチドであってもよぐ複数のオリゴヌクレオチドの混合物であっても よい。
LAMP法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれ とは別のプライマー、すなわちループプライマーを用いる事ができる。ループプライマ 一 (Loop Primer)は、ダンベル構造の 5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配 列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合 成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる (特許文献国際 公開第 02/24902号パンフレット）。ループプライマーの塩基配列は上述 C 構造の 5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的 遺伝子の塩基配列あるいはその相補鎖から選ばれても良ぐ他の塩基配列でも良い 。また、ループプライマーは 1種類でも 2種類でも良い。
[0016] SARSコロナウィルスは RNAウィルスである。 LAMP法は錡型が RNAの場合には 、铸型が DNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で、同様に核酸増幅反 応を進めることができる（RT— LAMP法）。
[0017] 本発明者らは SARSコロナウィルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できる LAM P法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、 SARSコロナ ウィルスの RNAポリメラーゼの塩基配列（非特許文献 3)より配列番号 1で示される塩 基配列から、プライマーセットとして次の A、 Bの 2組を選定した。
(プライマーセット A)
-3' (配列番号 14)
OPF-A： 5'_ ACCAAGTCAATGGTTACCCT—3' (酉己歹 1J番号
4)
IPR-A: 5，-
-3' (配 列番号 15)
OPR-A: 5'- GTGTCAACATAACCAGTCGG -3' (配列番号 16)
LPF-A: 5'- ACGAACGTGACGAATAGCT -3' (配列番号 2 0)
LPR-A: 5'- GTACTAACCTACCTCTCCAGC _3' (配列番号 21)
(プライマーセット B)
IPF— B : 5'_ TGCATGACAGCCCTCGAAGAAGCTATTCGTCAC _3'
配列番号 17)
OPF-B : 5'- CTAATATGTTTATCACCCGC _3' (配列番号 10)
(配列番号 18)
OPR-B： 5し CTCTGGTGAATTCTGTGTT _3， （配歹' J番号 1
9)
LPF-B： 5'- AAAGCCAATCCACGC -3' (配列番号 22)
LPR-B： 5'- CCAGCTAGGATTTTCTACAGG -3' (配列番号
23)
[0018] 核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する錡型依存性核酸合成酵素であ れば特に限定されない。このような酵素としては、 Bst DNAポリメラーゼ (ラージフラグ メント)、 Bca(exo_)DNAポリメラーゼ、大腸菌 DNAポリメラーゼ Iのタレノウフラグメント 等が挙げられ、好ましくは Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント)が挙げられる。
[0019] RT-LAMP法に用いる逆転写酵素としては、 RNAを铸型として DNAを合成する 活性を有する酵素であれば特に限定されなレ、。このような酵素としては、 AMV、
Cloned AMV、 MMLVの逆転写酵素、 Superscripts ReverTraAce, Thermoscript等 が挙げられ、好ましくは、 AMVあるいは Cloned AMV逆転写酵素が挙げられる。また Bca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性と DNAポリメラーゼ活性の両活性 を有する酵素を用いると、 RT-LAMP反応を 1つの酵素で行う事ができる。
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウィルスや細菌などから精製されたも のでも良ぐ遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵 素はフラグメント化やアミノ酸の置換などの改変をされたものでも良い。
[0020] LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増 幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレ 一ター法（特許文献特開 2001-242169号公報）を用いたり、あるいは反応終了後の反 応液をそのままァガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。ァガロースゲ ル電気泳動では、 LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はし ご)状に検出される。また、 LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、 副産物であるピロリン酸力 共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムと なり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがって、この白濁を、反応終 了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば
400醒の吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を 検出することも可能である（特許文献国際公開第 01/83817号パンフレット)。
[0021] 本発明のプライマーを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、 あら力、じめパッケージングしてキットィ匕する事ができる。具体的には、本発明のプライ マーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の 基質となる 4種類の dNTP、核酸合成を行う DNAポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵 素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や铸型を安定化する保護 剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される 実施例
[0022] 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら 限定されるものではない。
実施例 1.検出感度の確認
LAMP法と、 PCR法との検出感度の比較を行った。
1.試料及び試薬の調製
1 )試料
SARSコロナウィルスの RNAポリメラーゼの配列より選ばれた配列番号 1の RNAを Yeast RNA(Ambion社製)溶液 (SOng/ μ L)に溶解し、 1 μ Lあたり 10コピーから 104コピ 一までの希釈液と、 2.5、 5、 10コピーの希釈液を作製し、試料溶液とした。また同 Yeast RNA溶液を 0コピーの試料溶液とした。
[0023] 2) PCR法に用いる試薬組成及び濃度
PCR法で使用する SARSコロナウィルス検出用プライマーとして、 RNAポリメラー ゼゲノムの 195bpを増幅する配列番号 24および 25で示される塩基配列からなる 2種 類のプライマーを使用した、非特許文献 4記載の方法に準じて行った。
cDNAの合成反応溶液組成
• 5 X First strand Buffer (Invitrogen) 4 μ L 10mM dNTPs 1 μ L
Figure imgf000010_0001
Random primer (50ng/ μ 1,TAKARA) I μL
RNase Inhibitor (40U/ μ ljnvitrogen) I μL
SuperScriptll (200U/ μ ljnvitrogen) I μL
Distilled water 5 μL
試料溶液
PCR反応溶液組成
10 X Ex Taq buffer(Mg free) (TAKARA) 5μL
25mM MgCl 4μL
2.5mM dNTPs 4μ L
lOpmol/ μ 各 L
Ex Taq (5U/ μ L,TAKARA) 0.5 μ L
Distilled water 33.5 μ L
cDNA合成溶液 1 i L
3) LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
プライマーセット Aを用いた LAMP法による増幅のため、最終反応溶液 25μ L中の 各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成
•20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KC1
■8mM MgSO
1.4mM dNTPs
lOmM (NH ) SO
0.8M Betaine (Sigma)
0.1% Tween20
1.6 μΜ IPF及び IPR
0.2 μ M〇PF及び〇PR •0.8 M LPF及び LPR
•AMV Reverse Transcriptase 0.625U (Invitrogen)
•Bst DNA polymerase 8U (New England Biolabs)
•0.25 z g/mL EtBr (二ツボンジーン）
プライマーセット Bを用いた反応では AMV Reverse Transcriptase 0.625Uに代えて Cloned AMV Reverse 1 ranscnptase (Invitrogenノ 2Uを用レヽた。
[0025] 2. 酉^ ¾ ¾による )^
1 ) PCR法による反応
cDNA合成反応は、標的配歹 IJ0または 10 103コピーを含む試料溶液 5 μ Lを上記の cDNA合成反応溶液に加え、 42°C50分その後 70°C15分で行った。 PCR反応は、 上 記 PCR反応溶液に、 cDNA合成した溶液 1 μ Lを加え、最終反応溶液 50 μ Lとし、 0.2mLの専用チューブ内でサーマルサイクラ一 PTC_200(MJリサーチ社製)を用い、 熱変性 95°C30秒、アニーリング 56°C30秒、ポリメラーゼ伸長反応 72°C30秒を 1サイク ルとして計 40サイクル行った。所要時間は約 1時間だった。反応終了後の反応溶液 5 μ Lを 2%ァガロースゲルで電気泳動を行った。
2) LAMP法による反応
プライマーセット Aを用いた LAMP用試薬に、標的配歹 IJ0または 10— 103コピーを含 む試料溶液 1 μ Lを加え、最終反応溶液 25 μ Lとし、 0.2mLの専用チューブ内で、 63 °Cで 60分 LAMP反応を行った。反応終了後の反応溶液 5 /i Lを 2%ァガロースゲルで 電気泳動を行った。
3.雷気泳動法による各増幅反応の検出感度の比較結果
PCR法の電気泳動の結果を図 1に、プライマーセット Aを用いた LAMP法の電気 泳動の結果を図 2に示す。その結果、 PCR法、 LAMP法とも増幅産物の確認ができ た。 PCR法では、 102コピーまでは 195bpの特異的バンドが明瞭に認められた力 10コ ピーでは薄いバンドとして観察された。これに対し LAMP法では、 10コピーまで特異 的増幅のラダー状のバンドを確認することができた。
[0026] 実施例 2. LAMP法のリアルタイム測定法による検出時間の検討
-セット Aを用レ、た LAMP法の検出時間の検討は、実施例 1.の LAMP法 の組成 25 しを用い、リアルタイム蛍光測定装置 PRISM 7700 (Applied Biosystems社 製）によって反応温度を 63°Cに固定して行った。図 3に結果を示す。
この結果、 0コピーでは 60分でも蛍光の増加は見られず、 10コピー以上では 20分以 内に蛍光の増加が確認され、 20分で 10コピーの存在を検出できた。
プライマーセット Bを用いた LAMP法の検出時間の検討は、リアルタイム濁度測定 装置 LA-200 (テラメッタス社製）を用いてリアルタイム濁度測定法によって行った。実 施例 1.の LAMP法の組成 25 z Lを用い、反応温度を 63°Cに固定して行った。図 4に 結果を示す。
この結果、 0コピーでは 60分でも濁度の増加は見られず、 2.5コピー以上では 35分以 内に濁度の増加が確認され、 35分で 2.5コピーの存在を検出できた。
図面の簡単な説明
[図 1]電気泳動法による PCR法の検出感度を示す。レーン 1と 7はマーカーレーン 2 は試薬ブランクレーン 3は 0コピーレーン 4は 10コピーレーン 5は 102コピーレーン 6は 103コピー
[図 2]電気泳動法によるプライマーセット Aを用いた LAMP法の検出感度を示す。レ ーン 1は 0コピーレーン 2は 10コピーレーン 3は 102コピーレーン 4は 103コピーレーン 5 は 104コピーレーン 6はマーカー
[図 3]プライマーセット Aを用いたリアルタイム蛍光測定法の検出時間を示す。
[図 4]プライマーセット Bを用いたリアルタイム濁度測定法の検出時間を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1で示される SARSコロナウィルスの RNAポリメラーゼ塩基配列の、 41番 一 256番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配歹 IJ、又はそれらと相補的な塩基配 歹 IJから設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
[2] SARSコロナウィルスの RNAポリメラーゼ塩基配列力、ら選ばれた配列番号 2— 13で 示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた、少なくとも連続する 15塩基を含む請求項 1記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
[3] SARSコロナウィルスの標的核酸上の 3 '末端側力 F3c、 F2c、 Flcという塩基配列 領域を、 5'末端側から R3、 R2、 R1という塩基配列領域を選択し、それぞれの相補 的塩基配列を F3、 F2、 Fl、そして R3c、 R2c、 Rlcとしたときに、以下の（a)—（d)か ら選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 1一 2記載のオリゴヌクレオチド プライマー。
(a)標的核酸の F2領域を 3'末端側に有し、 5 '末端側に標的核酸の Flc領域を有す る塩基配列。
(b)標的核酸の F3領域を有する塩基配列。
(c)標的核酸の R2領域を 3'末端側に有し、 5 '末端側に標的核酸の Rlc領域を有す る塩基配列。
(d)標的核酸の R3領域を有する塩基配列。
[4] SARSコロナウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき、 5 '末端から 3'末端に向かい 以下の（e) （h)から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項 1一 3記載 のオリゴヌクレオチドプライマー。
(e) 5 '— (配列番号 2の塩基配列に相補的な塩基配歹 1J)一 (塩基数 0— 50の任意の塩 基配列) - (配列番号 3の塩基配列) -3 '
(f ) 5 '— (配列番号 5の塩基配列) - (塩基数 0 50の任意の塩基配歹 1J) - (配列番号 6 の塩基配列に相補的な塩基配歹 3 '
(g) 5 ' (配列番号 8の塩基配列に相補的な塩基配歹 (塩基数 0— 50の任意の塩 基配列) - (配列番号 9の塩基配列) - 3 '
(h) 5 ' - (配列番号 11の塩基配列) - (塩基数 0— 50の任意の塩基配歹 - (配列番 号 12の塩基配列に相補的な塩基配列)一 3 '
[5] 請求項 1一 4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、 SARSコロナウィルスの 標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする SARSコロナウィルスの検出方法。
[6] SARSコロナウィルスの標的核酸領域の増幅反応が LAMP法であることを特徴とす る請求項 5記載の SARSコロナウィルスの検出方法。
[7] 請求項 1一 4記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて SARSコロナウィルスの標 的核酸領域の増幅を検出することにより、 SARSコロナウィルス感染の有無を診断す ることを特徴とする重症急性呼吸器症候群の診断方法。
[8] 重症急性呼吸器症候群の診断方法において、請求項 1一 4記載のオリゴヌクレオチ
-を含むことを特徴とするキット。
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