JP2001242169A - 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法 - Google Patents
同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法
を提供する。 【構成】試料中の核酸を、２本鎖核酸は１本鎖に変性す
るが、同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件
においた後に、同一鎖内に２重鎖構造を有する核酸のみ
を検出する。試料中の全ての核酸を１本鎖に変性させて
から、同一鎖内に相補性領域を有する核酸のみが２重鎖
を形成する条件におき、公知の方法により２重鎖核酸を
検出してもよい。本発明は同一鎖内の相補性領域という
構造に特異的な検出法であり、特に相補性領域の繰り返
し構造を多数有するLAMP法の増幅産物の検出方法として
適している。
を提供する。 【構成】試料中の核酸を、２本鎖核酸は１本鎖に変性す
るが、同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件
においた後に、同一鎖内に２重鎖構造を有する核酸のみ
を検出する。試料中の全ての核酸を１本鎖に変性させて
から、同一鎖内に相補性領域を有する核酸のみが２重鎖
を形成する条件におき、公知の方法により２重鎖核酸を
検出してもよい。本発明は同一鎖内の相補性領域という
構造に特異的な検出法であり、特に相補性領域の繰り返
し構造を多数有するLAMP法の増幅産物の検出方法として
適している。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の検出方法に関する
ものであり、特に同一鎖内に相補性領域を有する核酸の
検出方法に関するものである。
ものであり、特に同一鎖内に相補性領域を有する核酸の
検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】DNAに代表される２重螺旋構造を有する
核酸の検出法として最も一般的なものは、エチジウムブ
ロマイドを核酸に結合させて、発せられる蛍光を観察す
るものである。エチジウムブロマイドは核酸の２重螺旋
構造の中にもぐり込むように結合し、結合したエチジウ
ムブロマイドの蛍光が増強される。このように２重螺旋
構造の内部に結合する物質をインターカレーター（Inte
rcalater:Groove Binderと呼ばれることもある）と総称
し、エチジウムブロマイドの他にもPicoGreenやSYBR Gr
een I（いずれもMolecular Probes Inc.の商品名）等が
知られている。インターカレーターは上記の性質を利用
して、２本鎖のDNAの検出および定量に汎用されてい
る。
核酸の検出法として最も一般的なものは、エチジウムブ
ロマイドを核酸に結合させて、発せられる蛍光を観察す
るものである。エチジウムブロマイドは核酸の２重螺旋
構造の中にもぐり込むように結合し、結合したエチジウ
ムブロマイドの蛍光が増強される。このように２重螺旋
構造の内部に結合する物質をインターカレーター（Inte
rcalater:Groove Binderと呼ばれることもある）と総称
し、エチジウムブロマイドの他にもPicoGreenやSYBR Gr
een I（いずれもMolecular Probes Inc.の商品名）等が
知られている。インターカレーターは上記の性質を利用
して、２本鎖のDNAの検出および定量に汎用されてい
る。
【０００３】インターカレーターによる２本鎖のDNAの
検出自体は公知技術であるが、応用技術としては次のよ
うなものがある。特開平５−６８５９６はPCRの増幅産
物をインターカレーターにより検出する際に、試料のpH
を10-12に保ち、プライマーに由来する非特異的な蛍光
を抑制しようというものである。特開平５−１８４３９
７、特開平５−２３７０００、および特開平６−２７１
０４は、遺伝子増幅反応をインターカレーターの存在下
に行い、増幅産物を検出するというものである。
検出自体は公知技術であるが、応用技術としては次のよ
うなものがある。特開平５−６８５９６はPCRの増幅産
物をインターカレーターにより検出する際に、試料のpH
を10-12に保ち、プライマーに由来する非特異的な蛍光
を抑制しようというものである。特開平５−１８４３９
７、特開平５−２３７０００、および特開平６−２７１
０４は、遺伝子増幅反応をインターカレーターの存在下
に行い、増幅産物を検出するというものである。
【０００４】PCRの増幅産物をインターカレーターによ
り検出する場合、試料中に存在する他の２本鎖DNAにも
インターカレーターが結合してバックグラウンドとなる
ことがある。この問題を解決するためにインターカレー
ターが結合したヌクレオチドを用いてPCR反応を行うこ
とが考案され、特許第２５１９４０６号はそのようなヌ
クレオチドの製造方法に記載している。特開平８−２１
１０５０はインターカレーターが結合したプローブを用
いて、プローブがハイブリダイズしたときにだけインタ
ーカレーターが２本鎖と結合し、結合した際の蛍光の変
化を検出するという技術である。
り検出する場合、試料中に存在する他の２本鎖DNAにも
インターカレーターが結合してバックグラウンドとなる
ことがある。この問題を解決するためにインターカレー
ターが結合したヌクレオチドを用いてPCR反応を行うこ
とが考案され、特許第２５１９４０６号はそのようなヌ
クレオチドの製造方法に記載している。特開平８−２１
１０５０はインターカレーターが結合したプローブを用
いて、プローブがハイブリダイズしたときにだけインタ
ーカレーターが２本鎖と結合し、結合した際の蛍光の変
化を検出するという技術である。
【０００５】インターカレーターは２重螺旋構造に結合
するので、２重螺旋構造を構成する核酸がRNAからなる
２本鎖やDNAとRNAからなる２本鎖であっても結合可能で
ある。また、互いに相補的な１本鎖核酸から構成される
２重螺旋構造ではなく、同一鎖内の相補性領域により形
成される２重螺旋構造にも結合可能である。自然界では
同一鎖内に相補性領域を有する核酸はtRNA、遺伝子発現
の調節領域（プロモーター、エンハンサー）、および複
製のori配列が知られているが、これらの核酸を相補的
なプローブによらずに特異的に検出する方法は知られて
いない。
するので、２重螺旋構造を構成する核酸がRNAからなる
２本鎖やDNAとRNAからなる２本鎖であっても結合可能で
ある。また、互いに相補的な１本鎖核酸から構成される
２重螺旋構造ではなく、同一鎖内の相補性領域により形
成される２重螺旋構造にも結合可能である。自然界では
同一鎖内に相補性領域を有する核酸はtRNA、遺伝子発現
の調節領域（プロモーター、エンハンサー）、および複
製のori配列が知られているが、これらの核酸を相補的
なプローブによらずに特異的に検出する方法は知られて
いない。
【０００６】インターカレーター以外の２重螺旋構造特
異的な検出方法としては抗体を用いる方法が挙げられ
る。２重螺旋構造を有する核酸（２本鎖核酸）を動物に
免疫して得られる抗体をラジオアイソトープや酵素で標
識して、通常のイムノアッセイと同様にして試料中の２
本鎖核酸を検出するというものである。また、抗体を固
相化し、アフィニティクロマトグラフィーの原理により
２本鎖核酸を分離精製してから、通常の核酸の検出法
（260nmの吸光度測定等）により検出することも可能で
ある。抗体を用いた２本鎖核酸の検出方法の欠点は２本
鎖核酸に特異的な抗体を得るのが困難な点である。さら
にインターカレーターによる検出に比べて操作が煩雑に
なるのも問題である。
異的な検出方法としては抗体を用いる方法が挙げられ
る。２重螺旋構造を有する核酸（２本鎖核酸）を動物に
免疫して得られる抗体をラジオアイソトープや酵素で標
識して、通常のイムノアッセイと同様にして試料中の２
本鎖核酸を検出するというものである。また、抗体を固
相化し、アフィニティクロマトグラフィーの原理により
２本鎖核酸を分離精製してから、通常の核酸の検出法
（260nmの吸光度測定等）により検出することも可能で
ある。抗体を用いた２本鎖核酸の検出方法の欠点は２本
鎖核酸に特異的な抗体を得るのが困難な点である。さら
にインターカレーターによる検出に比べて操作が煩雑に
なるのも問題である。
【０００７】また、ハイドロキシアパタイトを用いた１
本鎖DNAと２本鎖DNAの分離法も知られている。核酸吸着
物質であるハイドロキシアパタイトは、低濃度のリン酸
濃度で核酸を吸着し、リン酸濃度が高くなるにつれて１
本鎖核酸、２本鎖核酸の順に溶出する。具体的にはハイ
ドロキシアパタイトを充填したカラムに試料をアプライ
し、0.1M程度のリン酸緩衝液で夾雑物と１本鎖核酸を溶
出してから、0.4M程度のリン酸緩衝液で２本鎖核酸溶出
し、公知の核酸検出法により２本鎖核酸を検出する。こ
の方法は少量の試料の処理には適さない。また、鎖長の
短い核酸はハイドロキシアパタイトに吸着しにくいた
め、そのような核酸の精製には適さない。ハイドロキシ
アパタイトによる２本鎖核酸の分離〜検出も抗体による
検出法と同様に操作が煩雑であるという問題点がある。
本鎖DNAと２本鎖DNAの分離法も知られている。核酸吸着
物質であるハイドロキシアパタイトは、低濃度のリン酸
濃度で核酸を吸着し、リン酸濃度が高くなるにつれて１
本鎖核酸、２本鎖核酸の順に溶出する。具体的にはハイ
ドロキシアパタイトを充填したカラムに試料をアプライ
し、0.1M程度のリン酸緩衝液で夾雑物と１本鎖核酸を溶
出してから、0.4M程度のリン酸緩衝液で２本鎖核酸溶出
し、公知の核酸検出法により２本鎖核酸を検出する。こ
の方法は少量の試料の処理には適さない。また、鎖長の
短い核酸はハイドロキシアパタイトに吸着しにくいた
め、そのような核酸の精製には適さない。ハイドロキシ
アパタイトによる２本鎖核酸の分離〜検出も抗体による
検出法と同様に操作が煩雑であるという問題点がある。
【０００８】本発明の発明者らは、先にポリメラーゼの
鎖置換反応を利用したLoop mediated isothermal ampli
ficaiton of DNA増幅法（以下LAMP法という）を開発し
特許出願した（国際出願番号PCT/JP99/06213）。LAMP法
は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン
構造を形成する特殊なプライマーを含む２組のプライマ
ーによる、遺伝子増幅法である。反応は等温で進行し、
様々な長さの増幅産物が生成する。増幅産物は多数の繰
り返し構造からなるが、繰り返し構造の単位はプライマ
ーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配
列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。LA
MP法の増幅産物は公知の２本鎖DNAの検出法により検出
することができるが、その独特な構造を生かした検出方
法は考案されていなかった。
鎖置換反応を利用したLoop mediated isothermal ampli
ficaiton of DNA増幅法（以下LAMP法という）を開発し
特許出願した（国際出願番号PCT/JP99/06213）。LAMP法
は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン
構造を形成する特殊なプライマーを含む２組のプライマ
ーによる、遺伝子増幅法である。反応は等温で進行し、
様々な長さの増幅産物が生成する。増幅産物は多数の繰
り返し構造からなるが、繰り返し構造の単位はプライマ
ーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配
列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。LA
MP法の増幅産物は公知の２本鎖DNAの検出法により検出
することができるが、その独特な構造を生かした検出方
法は考案されていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、LAMP法の増幅産物を含む、同一鎖内に相補性領域
を有する核酸の検出方法である。
題は、LAMP法の増幅産物を含む、同一鎖内に相補性領域
を有する核酸の検出方法である。
【００１０】本発明の発明者らはLAMP法増幅産物の独特
の構造に着目し、鋭意検討した結果、同一鎖内に相補性
領域を有する核酸の検出方法を完成した。本発明は以下
の構成からなる。
の構造に着目し、鋭意検討した結果、同一鎖内に相補性
領域を有する核酸の検出方法を完成した。本発明は以下
の構成からなる。
【００１１】（１）以下の工程からなる同一鎖内に相補
性領域を有する核酸の検出方法。 1)試料を、２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、同一鎖内
の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件におく工程。 2)試料中の同一鎖内の２重鎖構造を有する核酸のみを検
出する工程。
性領域を有する核酸の検出方法。 1)試料を、２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、同一鎖内
の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件におく工程。 2)試料中の同一鎖内の２重鎖構造を有する核酸のみを検
出する工程。
【００１２】（２）工程1)がさらに、試料中の２重鎖構
造を有する核酸を１本鎖に変性する工程と、同一鎖内の
相補性領域のみを相補結合させて２重鎖構造を形成する
工程からなることを特徴とする（１）に記載の核酸の検
出方法。
造を有する核酸を１本鎖に変性する工程と、同一鎖内の
相補性領域のみを相補結合させて２重鎖構造を形成する
工程からなることを特徴とする（１）に記載の核酸の検
出方法。
【００１３】（３）２重鎖構造を有する核酸の検出方法
が、２重鎖構造を有する核酸と１本鎖核酸の物性の違い
を利用して検出するものである（１）から（２）に記載
の核酸の検出方法。
が、２重鎖構造を有する核酸と１本鎖核酸の物性の違い
を利用して検出するものである（１）から（２）に記載
の核酸の検出方法。
【００１４】（４）２重鎖構造を有する核酸の検出が、
核酸の２重鎖構造に特異的に結合する物質を利用して検
出するものである（１）から（２）に記載の核酸の検出
方法。
核酸の２重鎖構造に特異的に結合する物質を利用して検
出するものである（１）から（２）に記載の核酸の検出
方法。
【００１５】（５）２重鎖構造を有する核酸に特異的に
結合する物質が抗体、または可変領域を含む抗体断片で
あることを特徴とする、（３）から（４）に記載の核酸
の検出方法。
結合する物質が抗体、または可変領域を含む抗体断片で
あることを特徴とする、（３）から（４）に記載の核酸
の検出方法。
【００１６】（６）２重鎖構造を有する核酸に特異的に
結合する物質がインターカレーターであることを特徴と
する、（４）に記載の核酸の検出方法。
結合する物質がインターカレーターであることを特徴と
する、（４）に記載の核酸の検出方法。
【００１７】（７）インターカレーターが、検出可能な
信号を放出する物質で標識されていることを特徴とする
（６）に記載の核酸の検出方法。
信号を放出する物質で標識されていることを特徴とする
（６）に記載の核酸の検出方法。
【００１８】（８）インターカレーターが蛍光物質であ
ることを特徴とする、（６）に記載の核酸の検出方法。
ることを特徴とする、（６）に記載の核酸の検出方法。
【００１９】（９）蛍光物質が、エチジウムブロマイ
ド、PicoGreen、SYBR Green I、およびその誘導体から
選択されたものであり、これらの物質が核酸の２重鎖構
造に結合した際の蛍光の変化を検出することを特徴とす
る（８）に記載の核酸の検出方法。
ド、PicoGreen、SYBR Green I、およびその誘導体から
選択されたものであり、これらの物質が核酸の２重鎖構
造に結合した際の蛍光の変化を検出することを特徴とす
る（８）に記載の核酸の検出方法。
【００２０】（１０）２重鎖構造を有する核酸を１本鎖
に変性する方法が、熱変性、および／またはアルカリ変
性であることを特徴とする（１）から（９）に記載の核
酸の検出方法。
に変性する方法が、熱変性、および／またはアルカリ変
性であることを特徴とする（１）から（９）に記載の核
酸の検出方法。
【００２１】（１１）同一鎖内に相補性領域を有する核
酸が、遺伝子増幅法による増幅産物であることを特徴と
する（１）から（１０）に記載の核酸の検出方法。
酸が、遺伝子増幅法による増幅産物であることを特徴と
する（１）から（１０）に記載の核酸の検出方法。
【００２２】（１２）遺伝子増幅産物が、同一鎖内の相
補性領域のお互いに逆向きの繰り返し構造を有するもの
であることを特徴とする（１１）に記載の核酸の検出方
法。
補性領域のお互いに逆向きの繰り返し構造を有するもの
であることを特徴とする（１１）に記載の核酸の検出方
法。
【００２３】（１３）遺伝子増幅法がLAMP(Loop mediat
ed isothermal amplificaiton of DNA)法であることを
特徴とする（１２）に記載の検出方法。
ed isothermal amplificaiton of DNA)法であることを
特徴とする（１２）に記載の検出方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明では、相補性結合を形成し
た核酸を以下のように定義する。 ２本鎖核酸：互いに相補的な領域を有する２分子の１本
鎖核酸が相補結合し２重螺旋構造を形成しているもの。 ２重鎖核酸：相補結合による２重螺旋構造を有する核
酸。２重螺旋構造を形成する相補性領域は同一分子内に
あってもよい。２本鎖核酸は２重鎖核酸に含まれる。
た核酸を以下のように定義する。 ２本鎖核酸：互いに相補的な領域を有する２分子の１本
鎖核酸が相補結合し２重螺旋構造を形成しているもの。 ２重鎖核酸：相補結合による２重螺旋構造を有する核
酸。２重螺旋構造を形成する相補性領域は同一分子内に
あってもよい。２本鎖核酸は２重鎖核酸に含まれる。
【００２５】本発明は、同一鎖内の相補性領域は、互い
に相補的な２本の核酸よりも相補結合しやすいことに基
づいている。すなわち、核酸を１本鎖に変性した後に急
激に２本鎖を形成する条件に移行する（熱変性の場合急
冷する、アルカリ変性の場合酸性の緩衝液を加える）
と、同一鎖内の相補性領域は相補結合して２重鎖核酸に
なるが、１本鎖核酸は相補結合できず２本鎖核酸になら
ない。あるいは、２重鎖核酸のうち２本鎖核酸だけが変
性するような条件（pH、または温度）のもとでインキュ
ベーションすると２本鎖核酸は１本鎖に変性し、同一鎖
内の相補性領域に由来する２重鎖核酸のみが残る。これ
は同一鎖内の相補性領域では２本鎖核酸に比べて領域同
士が近距離に存在するため、いったん変性しても再び相
補結合を形成しやすい、また、ループ構造で結合された
相補性領域の末端は、２重鎖核酸から１本鎖に変性しに
くいためと考えられる。そして、このようにして形成さ
れた２重鎖核酸を公知の核酸検出法により検出するもの
である。
に相補的な２本の核酸よりも相補結合しやすいことに基
づいている。すなわち、核酸を１本鎖に変性した後に急
激に２本鎖を形成する条件に移行する（熱変性の場合急
冷する、アルカリ変性の場合酸性の緩衝液を加える）
と、同一鎖内の相補性領域は相補結合して２重鎖核酸に
なるが、１本鎖核酸は相補結合できず２本鎖核酸になら
ない。あるいは、２重鎖核酸のうち２本鎖核酸だけが変
性するような条件（pH、または温度）のもとでインキュ
ベーションすると２本鎖核酸は１本鎖に変性し、同一鎖
内の相補性領域に由来する２重鎖核酸のみが残る。これ
は同一鎖内の相補性領域では２本鎖核酸に比べて領域同
士が近距離に存在するため、いったん変性しても再び相
補結合を形成しやすい、また、ループ構造で結合された
相補性領域の末端は、２重鎖核酸から１本鎖に変性しに
くいためと考えられる。そして、このようにして形成さ
れた２重鎖核酸を公知の核酸検出法により検出するもの
である。
【００２６】本発明は、同一鎖内に相補性領域を有する
核酸に特異的な検出方法であり、２本鎖核酸は検出され
ない。検出対象となる核酸の由来は自然界に存在する核
酸を抽出したものであるか、化学的にあるいは酵素反応
により合成したものであるかを問わない。また、全ての
２重鎖核酸を変性した後に、同一鎖内に相補性領域を有
する核酸のみに再び相補結合を形成させて検出する場合
には、試料中の同一鎖内に相補性領域を有する核酸は２
重鎖を形成せずに１本鎖のままであっても検出可能であ
る。
核酸に特異的な検出方法であり、２本鎖核酸は検出され
ない。検出対象となる核酸の由来は自然界に存在する核
酸を抽出したものであるか、化学的にあるいは酵素反応
により合成したものであるかを問わない。また、全ての
２重鎖核酸を変性した後に、同一鎖内に相補性領域を有
する核酸のみに再び相補結合を形成させて検出する場合
には、試料中の同一鎖内に相補性領域を有する核酸は２
重鎖を形成せずに１本鎖のままであっても検出可能であ
る。
【００２７】本発明における同一鎖内の相補性領域は、
２重鎖を形成しうるものであれば特に制限はない。相補
性領域の長さは少なくとも5bp以上、好ましくは8bp以上
である。相補性領域の中には２重鎖の形成を阻害しない
限り、塩基配列のミスマッチの存在が許容される。ま
た、相補性領域は同一鎖内に複数存在してもかまわない
し、それらが同一の相補性領域の繰り返しであってもか
まわない。
２重鎖を形成しうるものであれば特に制限はない。相補
性領域の長さは少なくとも5bp以上、好ましくは8bp以上
である。相補性領域の中には２重鎖の形成を阻害しない
限り、塩基配列のミスマッチの存在が許容される。ま
た、相補性領域は同一鎖内に複数存在してもかまわない
し、それらが同一の相補性領域の繰り返しであってもか
まわない。
【００２８】本発明は、先に述べたような原理に基づ
き、２重鎖核酸のみを特異的に検出する方法である。す
なわち、1)試料を、２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、
同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件におく
工程、および 2)試料中の同一鎖内の２重鎖構造を有す
る核酸のみを検出する工程、からなる。
き、２重鎖核酸のみを特異的に検出する方法である。す
なわち、1)試料を、２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、
同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件におく
工程、および 2)試料中の同一鎖内の２重鎖構造を有す
る核酸のみを検出する工程、からなる。
【００２９】２本鎖核酸と同一鎖内の相補性領域に由来
する２重鎖構造とでは、１本鎖に変性する条件が異なる
ために、その中間の条件では２本鎖核酸のみが１本鎖に
変性する、あるいは同一鎖内に相補性領域を有する１本
鎖核酸のみを２重鎖核酸にすることが可能である。具体
的には２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、同一鎖内の相
補性領域に由来する２重鎖構造は変性しない温度、ある
いはpHを保つことにより可能となる。相補的な配列が相
補結合を形成しうる条件は、配列の長さ、GC含量等によ
って変化するので、塩基配列に応じて選択する必要があ
るが、そのような条件はアルカリ変性の場合にはpH 9.0
以上、熱変性の場合には、（反応液中にTmを変化させる
物質が存在しないとして）70℃以上である。検出対象の
核酸が遺伝子増幅反応の増幅産物の場合、増幅反応後の
反応液をそのような条件に保つことにより２本鎖核酸の
みを１本鎖に変性することができる。さらに遺伝子増幅
反応が等温で行われる場合には、増幅反応自体をそのよ
うな条件の下で行って、反応終了後直ちに２重鎖核酸を
検出することもできる。
する２重鎖構造とでは、１本鎖に変性する条件が異なる
ために、その中間の条件では２本鎖核酸のみが１本鎖に
変性する、あるいは同一鎖内に相補性領域を有する１本
鎖核酸のみを２重鎖核酸にすることが可能である。具体
的には２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、同一鎖内の相
補性領域に由来する２重鎖構造は変性しない温度、ある
いはpHを保つことにより可能となる。相補的な配列が相
補結合を形成しうる条件は、配列の長さ、GC含量等によ
って変化するので、塩基配列に応じて選択する必要があ
るが、そのような条件はアルカリ変性の場合にはpH 9.0
以上、熱変性の場合には、（反応液中にTmを変化させる
物質が存在しないとして）70℃以上である。検出対象の
核酸が遺伝子増幅反応の増幅産物の場合、増幅反応後の
反応液をそのような条件に保つことにより２本鎖核酸の
みを１本鎖に変性することができる。さらに遺伝子増幅
反応が等温で行われる場合には、増幅反応自体をそのよ
うな条件の下で行って、反応終了後直ちに２重鎖核酸を
検出することもできる。
【００３０】さらに工程1)を、試料中の２重鎖構造を有
する核酸を１本鎖に変性する工程と、同一鎖内の相補性
領域のみを相補結合させて２重鎖構造を形成する工程、
とに分けて実施することも可能である。２本鎖核酸は１
本鎖に変性するが、先に述べた同一鎖内の相補性領域に
由来する２重鎖構造が変性しない条件は、試料中に存在
する２本鎖核酸と検出対象となる２重鎖核酸により左右
されるために、あらかじめ試料中に存在する全ての核酸
を１本鎖に変性してしまうのが容易である。１本鎖に変
性した核酸は、速やかに２重鎖を形成する条件におく
と、同一鎖内に相補性領域を有する核酸のみが２重鎖構
造を形成する。具体的には熱変性により核酸を変性した
場合には氷水等により急冷する、アルカリ変性により核
酸を変性した場合には酸性の緩衝液を添加することによ
り達成される。
する核酸を１本鎖に変性する工程と、同一鎖内の相補性
領域のみを相補結合させて２重鎖構造を形成する工程、
とに分けて実施することも可能である。２本鎖核酸は１
本鎖に変性するが、先に述べた同一鎖内の相補性領域に
由来する２重鎖構造が変性しない条件は、試料中に存在
する２本鎖核酸と検出対象となる２重鎖核酸により左右
されるために、あらかじめ試料中に存在する全ての核酸
を１本鎖に変性してしまうのが容易である。１本鎖に変
性した核酸は、速やかに２重鎖を形成する条件におく
と、同一鎖内に相補性領域を有する核酸のみが２重鎖構
造を形成する。具体的には熱変性により核酸を変性した
場合には氷水等により急冷する、アルカリ変性により核
酸を変性した場合には酸性の緩衝液を添加することによ
り達成される。
【００３１】２重鎖核酸を１本鎖に変性する方法として
は、熱変性による方法と、アルカリ変性による方法が一
般的である。本発明において核酸の変性はどちらの方法
を採ることもできる。しかしながら、アルカリ変性では
２重鎖核酸を１本鎖に変性するために、試料にアルカリ
性の溶液を添加した後に、酸性の緩衝液を添加しなけれ
ばならず、熱変性に比べて操作が煩雑になる。特に試料
が遺伝子増幅反応の増幅産物である場合には、溶液を添
加するために試料容器を開けることは増幅産物が飛散す
るおそれがあるので好ましくない。
は、熱変性による方法と、アルカリ変性による方法が一
般的である。本発明において核酸の変性はどちらの方法
を採ることもできる。しかしながら、アルカリ変性では
２重鎖核酸を１本鎖に変性するために、試料にアルカリ
性の溶液を添加した後に、酸性の緩衝液を添加しなけれ
ばならず、熱変性に比べて操作が煩雑になる。特に試料
が遺伝子増幅反応の増幅産物である場合には、溶液を添
加するために試料容器を開けることは増幅産物が飛散す
るおそれがあるので好ましくない。
【００３２】本発明において、試料を熱変性により１本
鎖核酸に変性する場合には、各種の融点降下剤と呼ばれ
る物質を添加することも可能である。融点降下剤とは２
重螺旋構造が１本鎖に解離する際のTmを低下させる作用
を持つ物質であり、ベタイン、プロリン、DMSO等が知ら
れている。融点降下剤を用いることで、２本鎖核酸は１
本鎖に変性するが、同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変
性しない条件を制御することが可能である。
鎖核酸に変性する場合には、各種の融点降下剤と呼ばれ
る物質を添加することも可能である。融点降下剤とは２
重螺旋構造が１本鎖に解離する際のTmを低下させる作用
を持つ物質であり、ベタイン、プロリン、DMSO等が知ら
れている。融点降下剤を用いることで、２本鎖核酸は１
本鎖に変性するが、同一鎖内の２重鎖構造は１本鎖に変
性しない条件を制御することが可能である。
【００３３】２重鎖構造を有する核酸のみを検出する方
法としては、以下のものがあげられる。 a.２重鎖核酸と１本鎖核酸を分離してから、公知の核酸
検出法により検出する。本発明の工程1)により所望の２
重鎖核酸のみを得た後、公知の核酸分離法により、２重
鎖核酸と１本鎖核酸とを分離する。２重鎖核酸と１本鎖
核酸を分離する材料としては、ハイドロキシアパタイト
があげられる。
法としては、以下のものがあげられる。 a.２重鎖核酸と１本鎖核酸を分離してから、公知の核酸
検出法により検出する。本発明の工程1)により所望の２
重鎖核酸のみを得た後、公知の核酸分離法により、２重
鎖核酸と１本鎖核酸とを分離する。２重鎖核酸と１本鎖
核酸を分離する材料としては、ハイドロキシアパタイト
があげられる。
【００３４】核酸吸着物質であるハイドロキシアパタイ
トは、低濃度のリン酸濃度で核酸を吸着し、リン酸濃度
が高くなるにつれて１本鎖核酸、２本鎖核酸の順に溶出
する。具体的にはハイドロキシアパタイトを充填したカ
ラムに試料をアプライし、0.1M程度のリン酸緩衝液で夾
雑物と１本鎖核酸を溶出してから、0.4M程度のリン酸緩
衝液で２本鎖核酸溶出する。
トは、低濃度のリン酸濃度で核酸を吸着し、リン酸濃度
が高くなるにつれて１本鎖核酸、２本鎖核酸の順に溶出
する。具体的にはハイドロキシアパタイトを充填したカ
ラムに試料をアプライし、0.1M程度のリン酸緩衝液で夾
雑物と１本鎖核酸を溶出してから、0.4M程度のリン酸緩
衝液で２本鎖核酸溶出する。
【００３５】ハイドロキシアパタイトによる分離方法は
特異性に問題があり、２本鎖核酸の収率を上げようとす
ると１本鎖核酸も混入も多くなるという欠点を持つ。そ
の場合、分離前の試料を１本鎖核酸特異的な消化酵素で
あるS1ヌクレアーゼで消化すれば、１本鎖核酸の混入を
減らすことができる。
特異性に問題があり、２本鎖核酸の収率を上げようとす
ると１本鎖核酸も混入も多くなるという欠点を持つ。そ
の場合、分離前の試料を１本鎖核酸特異的な消化酵素で
あるS1ヌクレアーゼで消化すれば、１本鎖核酸の混入を
減らすことができる。
【００３６】上記の方法で２重鎖核酸を分離してから公
知の核酸検出法により検出する。その場合、核酸検出法
は２重鎖核酸に特異的な方法である必要はない。したが
って260nmにおける吸光度を測定するのが簡便である。
検出対象の２重鎖核酸が遺伝子増幅法による増幅産物の
場合、増幅反応に用いるヌクレオチドをラジオアイソト
ープや蛍光物質等で標識しておけば検出は一層容易にな
る。また、後で述べる２重鎖核酸に特異的な検出方法も
適用可能である。
知の核酸検出法により検出する。その場合、核酸検出法
は２重鎖核酸に特異的な方法である必要はない。したが
って260nmにおける吸光度を測定するのが簡便である。
検出対象の２重鎖核酸が遺伝子増幅法による増幅産物の
場合、増幅反応に用いるヌクレオチドをラジオアイソト
ープや蛍光物質等で標識しておけば検出は一層容易にな
る。また、後で述べる２重鎖核酸に特異的な検出方法も
適用可能である。
【００３７】b.核酸の２重鎖構造に特異的に結合する物
質を利用して検出する 核酸の２重鎖構造に特異的に結合する物質のうち、代表
的なものは抗体とインターカレーターである。
質を利用して検出する 核酸の２重鎖構造に特異的に結合する物質のうち、代表
的なものは抗体とインターカレーターである。
【００３８】核酸の２重鎖構造に対する抗体は、２重鎖
核酸を動物に免疫して得られる。抗体はポリクローナル
なものでもモノクローナルなものでもかまわないが、特
異性の高い抗体をコンスタントに得るために、モノクロ
ーナル抗体とするのが今日では一般的である。また、抗
体は全分子を使用することもできるし、酵素処理して抗
体断片として用いられることもある。さらに、遺伝子組
み換えにより様々な改変を施した上で用いられることも
ある。具体的には、抗体分子をファージで発現させたフ
ァージ抗体、特異性の異なる重鎖分子と軽鎖分子の対を
一組ずつ結合させた２特異性抗体、あるいは可変領域遺
伝子に変異を導入し特異性や親和性を改変した抗体など
である。
核酸を動物に免疫して得られる。抗体はポリクローナル
なものでもモノクローナルなものでもかまわないが、特
異性の高い抗体をコンスタントに得るために、モノクロ
ーナル抗体とするのが今日では一般的である。また、抗
体は全分子を使用することもできるし、酵素処理して抗
体断片として用いられることもある。さらに、遺伝子組
み換えにより様々な改変を施した上で用いられることも
ある。具体的には、抗体分子をファージで発現させたフ
ァージ抗体、特異性の異なる重鎖分子と軽鎖分子の対を
一組ずつ結合させた２特異性抗体、あるいは可変領域遺
伝子に変異を導入し特異性や親和性を改変した抗体など
である。
【００３９】２重鎖核酸を抗原として、抗体や抗体断片
（以下抗体とする）により検出する技術は、イムノアッ
セイの手法として確立されている。以下に述べる内容は
免疫学的な手法による２重鎖核酸の検出方法の一部にす
ぎない。
（以下抗体とする）により検出する技術は、イムノアッ
セイの手法として確立されている。以下に述べる内容は
免疫学的な手法による２重鎖核酸の検出方法の一部にす
ぎない。
【００４０】抗体は必要に応じて担体に固相化したり、
ラジオアイソトープや蛍光物質等により標識した上で、
２重鎖核酸の検出に用いられる。不溶性担体に固相化し
た抗体は、アフィニティクロマトグラフィーの原理によ
り２重鎖核酸のみを単離した後に、公知の方法、たとえ
ば260nmの吸光度を測定することにより２重鎖核酸を検
出できる。検出対象の２重鎖核酸が遺伝子増幅法による
増幅産物の場合、増幅反応に用いるヌクレオチドをラジ
オアイソトープや蛍光物質等で標識しておき、標識を検
出してもよい。抗体を固相化する担体としては各種材料
が使用できるが、アガロースやセファロースの粒子が好
適である。その他固相化抗体による２重鎖核酸の検出方
法としては、金属薄膜上に抗体を固定して、２重鎖核酸
が結合した際の表面プラズモン共鳴の変化を検出する方
法や、水晶振動子に抗体を固定して、２重鎖核酸が結合
した際の振動数の変化を検出する方法をあげることがで
きる。
ラジオアイソトープや蛍光物質等により標識した上で、
２重鎖核酸の検出に用いられる。不溶性担体に固相化し
た抗体は、アフィニティクロマトグラフィーの原理によ
り２重鎖核酸のみを単離した後に、公知の方法、たとえ
ば260nmの吸光度を測定することにより２重鎖核酸を検
出できる。検出対象の２重鎖核酸が遺伝子増幅法による
増幅産物の場合、増幅反応に用いるヌクレオチドをラジ
オアイソトープや蛍光物質等で標識しておき、標識を検
出してもよい。抗体を固相化する担体としては各種材料
が使用できるが、アガロースやセファロースの粒子が好
適である。その他固相化抗体による２重鎖核酸の検出方
法としては、金属薄膜上に抗体を固定して、２重鎖核酸
が結合した際の表面プラズモン共鳴の変化を検出する方
法や、水晶振動子に抗体を固定して、２重鎖核酸が結合
した際の振動数の変化を検出する方法をあげることがで
きる。
【００４１】また、抗体は検出可能な信号を放出する物
質で標識して、２重鎖核酸を抗原とするサンドイッチイ
ムノアッセイの形で検出することもできる。標識物質と
しては、ラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素等があげ
られる。これらの標識物質は公知の方法により抗体と結
合することができる。１例をあげるとラジオアイソトー
プの場合にはクロラミンＴ法により、酵素の場合にはマ
レイミド法により、抗体の標識が可能である。さらに抗
体が直接標識されていなくても、標識した抗IgG抗体等
により検出することが可能である。
質で標識して、２重鎖核酸を抗原とするサンドイッチイ
ムノアッセイの形で検出することもできる。標識物質と
しては、ラジオアイソトープ、蛍光物質、酵素等があげ
られる。これらの標識物質は公知の方法により抗体と結
合することができる。１例をあげるとラジオアイソトー
プの場合にはクロラミンＴ法により、酵素の場合にはマ
レイミド法により、抗体の標識が可能である。さらに抗
体が直接標識されていなくても、標識した抗IgG抗体等
により検出することが可能である。
【００４２】抗体を用いる検出法では、抗体の２重鎖核
酸に対する特異性に問題があるが、S1ヌクレアーゼによ
り試料中の１本鎖核酸を消化したり、試料にインターカ
レーターを添加して２重鎖核酸と結合させて立体構造を
変化させ、インターカレーターが結合した２重鎖核酸に
対する抗体を用いて測定することで解決できる。
酸に対する特異性に問題があるが、S1ヌクレアーゼによ
り試料中の１本鎖核酸を消化したり、試料にインターカ
レーターを添加して２重鎖核酸と結合させて立体構造を
変化させ、インターカレーターが結合した２重鎖核酸に
対する抗体を用いて測定することで解決できる。
【００４３】２重鎖核酸の検出方法として、簡便かつ特
異性の高い方法は、インターカレーターを用いた検出法
である。インターカレーターは２重鎖核酸の中に特異的
に結合する物質の総称である。２重鎖核酸の検出におい
ては、特に２重鎖核酸と結合した際に蛍光強度や蛍光ス
ペクトルが変化するインターカレーター性蛍光色素が好
んで用いられる。
異性の高い方法は、インターカレーターを用いた検出法
である。インターカレーターは２重鎖核酸の中に特異的
に結合する物質の総称である。２重鎖核酸の検出におい
ては、特に２重鎖核酸と結合した際に蛍光強度や蛍光ス
ペクトルが変化するインターカレーター性蛍光色素が好
んで用いられる。
【００４４】このようなインターカレーター性蛍光色素
としては、エチジウムブロマイド、PicoGreen、SYBR Gr
een I、Vistra Green（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテクの商品名）、アクリジンオレンジ、チアゾール
オレンジ、オキサゾールイエロー、ビスベンチミド、ジ
アミノフェニルインドール、アクチノマイシン、クロモ
マイシン、ミトラマイシン、キナクリンマスタード、ダ
ウノマイシンおよびこれらの物質の誘導体をあげること
ができる。
としては、エチジウムブロマイド、PicoGreen、SYBR Gr
een I、Vistra Green（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテクの商品名）、アクリジンオレンジ、チアゾール
オレンジ、オキサゾールイエロー、ビスベンチミド、ジ
アミノフェニルインドール、アクチノマイシン、クロモ
マイシン、ミトラマイシン、キナクリンマスタード、ダ
ウノマイシンおよびこれらの物質の誘導体をあげること
ができる。
【００４５】本発明において試料中の同一鎖内の相補性
領域に由来する２重鎖核酸をインターカレーターにより
検出する場合、インターカレーターを添加するのはどの
時点であってもかまわない。インターカレーターの添加
が２本鎖核酸のみを１本鎖に変性する前に行われても、
全行程の終了後に行われても、同一鎖内に相補性を有す
る核酸の検出には何ら影響を及ぼさない。
領域に由来する２重鎖核酸をインターカレーターにより
検出する場合、インターカレーターを添加するのはどの
時点であってもかまわない。インターカレーターの添加
が２本鎖核酸のみを１本鎖に変性する前に行われても、
全行程の終了後に行われても、同一鎖内に相補性を有す
る核酸の検出には何ら影響を及ぼさない。
【００４６】試料が遺伝子増幅反応における増幅産物の
場合にも同様であるが、特に増幅産物を本発明により検
出する場合には、本発明の全行程に先立ち、遺伝子増幅
反応の試料調製の際にインターカレーターを添加するこ
とが好ましい。その理由は、遺伝子増幅反応後にインタ
ーカレーターを添加するために試料容器を開ける必要が
なく、増幅産物が飛散するおそれがなくなるためであ
る。遺伝子増幅反応の際にインターカレーターが共存し
ても、核酸を合成するポリメラーゼの活性に影響しない
ことが確認されている。
場合にも同様であるが、特に増幅産物を本発明により検
出する場合には、本発明の全行程に先立ち、遺伝子増幅
反応の試料調製の際にインターカレーターを添加するこ
とが好ましい。その理由は、遺伝子増幅反応後にインタ
ーカレーターを添加するために試料容器を開ける必要が
なく、増幅産物が飛散するおそれがなくなるためであ
る。遺伝子増幅反応の際にインターカレーターが共存し
ても、核酸を合成するポリメラーゼの活性に影響しない
ことが確認されている。
【００４７】さらにインターカレーターを検出可能な信
号を放出する標識物質と結合することにより、検出に使
用するインターカレーターの幅を広げることもできる。
蛍光性ではないインターカレーターが使用可能になるば
かりでなく、インターカレーター性蛍光色素に由来する
蛍光強度、あるいは蛍光スペクトルの変化では感度が十
分でない場合に有用である。このような例としては、ダ
ウノマイシンとグルコースオキシダーゼのコンジュゲー
トによる２重鎖核酸の検出が知られている。
号を放出する標識物質と結合することにより、検出に使
用するインターカレーターの幅を広げることもできる。
蛍光性ではないインターカレーターが使用可能になるば
かりでなく、インターカレーター性蛍光色素に由来する
蛍光強度、あるいは蛍光スペクトルの変化では感度が十
分でない場合に有用である。このような例としては、ダ
ウノマイシンとグルコースオキシダーゼのコンジュゲー
トによる２重鎖核酸の検出が知られている。
【００４８】本発明で検出する核酸は、同一鎖内に相補
性領域を有するものである。このような構造を持つ核酸
は自然界では少なく、したがって、本発明は遺伝子増幅
反応の増幅産物に適用するのが好ましい。同一鎖内に相
補性領域を有する核酸を増幅産物として産生可能な遺伝
子増幅反応としては、PCR法、LAMP法が適当である。通
常、PCR法の増幅産物は１対のプライマーに挟まれた領
域からなる２本鎖核酸であるが、プライマーの配列を工
夫することで同一鎖内に相補性領域を有する核酸を増幅
産物として産生可能である。たとえばプライマーの5'側
同士を連結したものをプライマーとしてPCRを行えば、
その増幅産物は同一鎖内に相補性領域を有するものとな
る。また、後述するLAMP法と同じプライマーを用いても
同一鎖内に相補性領域を有する増幅産物が得られる。
性領域を有するものである。このような構造を持つ核酸
は自然界では少なく、したがって、本発明は遺伝子増幅
反応の増幅産物に適用するのが好ましい。同一鎖内に相
補性領域を有する核酸を増幅産物として産生可能な遺伝
子増幅反応としては、PCR法、LAMP法が適当である。通
常、PCR法の増幅産物は１対のプライマーに挟まれた領
域からなる２本鎖核酸であるが、プライマーの配列を工
夫することで同一鎖内に相補性領域を有する核酸を増幅
産物として産生可能である。たとえばプライマーの5'側
同士を連結したものをプライマーとしてPCRを行えば、
その増幅産物は同一鎖内に相補性領域を有するものとな
る。また、後述するLAMP法と同じプライマーを用いても
同一鎖内に相補性領域を有する増幅産物が得られる。
【００４９】LAMP法では、プライマーの5'側の塩基配列
をプライマーの3'側から伸長反応が開始された際に合成
される塩基配列と実質的に同一とすることで、同一鎖内
に相補性領域を有する増幅産物が得られる。しかも、増
幅産物はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２
本の相補的核酸の塩基配列が逆向きになったものを単位
とする多数の繰り返し構造からなる。
をプライマーの3'側から伸長反応が開始された際に合成
される塩基配列と実質的に同一とすることで、同一鎖内
に相補性領域を有する増幅産物が得られる。しかも、増
幅産物はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２
本の相補的核酸の塩基配列が逆向きになったものを単位
とする多数の繰り返し構造からなる。
【００５０】
【発明の効果】本発明により新しい核酸の検出方法が提
供される。本発明は特に相補性領域の繰り返し構造を多
数有するLAMP法の増幅産物の検出方法として適してい
る。遺伝子増幅反応後の試料中に増幅反応物以外の核酸
が存在する場合、既存の核酸検出法ではバックグラウン
ドとなって増幅産物の検出が困難になることがあった。
しかし、本発明は同一鎖内の相補性領域という核酸の構
造を検出するために、通常の２本鎖核酸による影響を大
幅に低減できる。
供される。本発明は特に相補性領域の繰り返し構造を多
数有するLAMP法の増幅産物の検出方法として適してい
る。遺伝子増幅反応後の試料中に増幅反応物以外の核酸
が存在する場合、既存の核酸検出法ではバックグラウン
ドとなって増幅産物の検出が困難になることがあった。
しかし、本発明は同一鎖内の相補性領域という核酸の構
造を検出するために、通常の２本鎖核酸による影響を大
幅に低減できる。
【００５１】
【実施例】実施例１ LAMP法による遺伝子増幅 M13mp18を鋳型として、LAMP法により遺伝子増幅を行っ
た。すでに判明しているM13mp18の塩基配列を基にM13F
A、M13RA、M13F3、およびM13R3の４種類のプライマーを
設定した。M13F3とM13R3は、それぞれM13FAとM13RAを合
成起点として得られた第１の核酸を置換するためのアウ
タープライマーである。また、M13FA（あるいはM13RA）
のアニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー
濃度を高く設定した。 反応液組成（25μl中） 20mM Tris-HCl pH8.8 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 6mM MgSO4 0.1% Triton X-100 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 0.4mM dNTP プライマー： 800nM M13FA 800nM M13RA 200nM M13F3 200nM M13R3 ターゲット：M13mp18 dsDNA 反応：上記反応液を95℃で5分間加熱し、ターゲットを
変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し、Bst
DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を4U添加し、6
5℃で1時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱し反
応を停止した。
た。すでに判明しているM13mp18の塩基配列を基にM13F
A、M13RA、M13F3、およびM13R3の４種類のプライマーを
設定した。M13F3とM13R3は、それぞれM13FAとM13RAを合
成起点として得られた第１の核酸を置換するためのアウ
タープライマーである。また、M13FA（あるいはM13RA）
のアニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー
濃度を高く設定した。 反応液組成（25μl中） 20mM Tris-HCl pH8.8 10mM KCl 10mM (NH4)2SO4 6mM MgSO4 0.1% Triton X-100 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 0.4mM dNTP プライマー： 800nM M13FA 800nM M13RA 200nM M13F3 200nM M13R3 ターゲット：M13mp18 dsDNA 反応：上記反応液を95℃で5分間加熱し、ターゲットを
変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し、Bst
DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を4U添加し、6
5℃で1時間反応させた。反応後、80℃で10分間加熱し反
応を停止した。
【００５２】実施例２ PicoGreenによるLAMP法増幅産
物の検出 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes
Inc.製)に付属のλファージDNAを500μg/mlになるよう
に、同じくkitに付属のTE bufferで希釈し、トータル量
を150μlとした。また、実施例１のLAMP増幅産物0.125
μlを同様にTE bufferで希釈し、トータル量を150μlと
した。調製したλファージDNAと、LAMP産物を99℃で10
分間加温し変性させた後、氷上で急冷した。リファレン
スとしては変性させないサンプルをそれぞれ調製した。
ここに、あらかじめ氷上で冷やしておいたPicoGreen（T
E bufferで200倍希釈したもの）を150μl加えトータル
量を300μlとし、撹拌後氷上で5分インキュベートし、
島津のSPECTROFLUOROPHOTOMETER RF-5000で蛍光強度を
測定した。なお、励起光は480nm、蛍光波長は520nmとし
た。
物の検出 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes
Inc.製)に付属のλファージDNAを500μg/mlになるよう
に、同じくkitに付属のTE bufferで希釈し、トータル量
を150μlとした。また、実施例１のLAMP増幅産物0.125
μlを同様にTE bufferで希釈し、トータル量を150μlと
した。調製したλファージDNAと、LAMP産物を99℃で10
分間加温し変性させた後、氷上で急冷した。リファレン
スとしては変性させないサンプルをそれぞれ調製した。
ここに、あらかじめ氷上で冷やしておいたPicoGreen（T
E bufferで200倍希釈したもの）を150μl加えトータル
量を300μlとし、撹拌後氷上で5分インキュベートし、
島津のSPECTROFLUOROPHOTOMETER RF-5000で蛍光強度を
測定した。なお、励起光は480nm、蛍光波長は520nmとし
た。
【００５３】各サンプルの蛍光強度測定結果を図１に示
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約8%であったのに対し、LAMP増幅産物では約61%で
あった。
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約8%であったのに対し、LAMP増幅産物では約61%で
あった。
【００５４】実施例３ SYBR Green IによるLAMP法増幅
産物の検出 実施例２と同様の検討をSYBR Green I（TaKaRa/FMC）を
用いて行った。SYBR Green Iの濃度は1/5000とし、この
溶液150μlと、実施例２と同じ濃度のDNA溶液150μlと
混合し蛍光強度を測定した。なお、励起光は515nm、蛍
光波長は590nmとした。
産物の検出 実施例２と同様の検討をSYBR Green I（TaKaRa/FMC）を
用いて行った。SYBR Green Iの濃度は1/5000とし、この
溶液150μlと、実施例２と同じ濃度のDNA溶液150μlと
混合し蛍光強度を測定した。なお、励起光は515nm、蛍
光波長は590nmとした。
【００５５】各サンプルの蛍光強度測定結果を図２に示
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約21%であったのに対し、LAMP法増幅産物では約71%
であった。
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約21%であったのに対し、LAMP法増幅産物では約71%
であった。
【００５６】実施例４ エチジウムブロマイドによるLA
MP法増幅産物の検出 実施例２と同様の検討をエチジウムブロマイド（EtBr）
を用いて行った。EtBr濃度は、2μg/mlとし、この溶液1
50μlと、ラムダDNAは2μg/ml、LAMP産物は1/300に希釈
した溶液150μlと混合し蛍光強度を測定した。なお、励
起光は515nm、蛍光波長は590nmとした。
MP法増幅産物の検出 実施例２と同様の検討をエチジウムブロマイド（EtBr）
を用いて行った。EtBr濃度は、2μg/mlとし、この溶液1
50μlと、ラムダDNAは2μg/ml、LAMP産物は1/300に希釈
した溶液150μlと混合し蛍光強度を測定した。なお、励
起光は515nm、蛍光波長は590nmとした。
【００５７】各サンプルの蛍光強度測定結果を図３に示
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約43%であったのに対し、LAMP法増幅産物では約75%
であった。
す。熱変性させないサンプル（対照）に比べて熱変性さ
せたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λファージDNA
では約43%であったのに対し、LAMP法増幅産物では約75%
であった。
【００５８】実施例５ アルカリ変性によるLAMP法増幅
産物の検出 実施例２と同様にPicoGreenを用いた検討を、DNAの変性
方法を変えて行った。実施例２と同じ濃度に調製したDN
A溶液に1/10量の2N NaOHを加え、室温で5分インキュベ
ートし変性させた後、1/10量の3M sodium acetate(pH4.
5)を加えた。これを実施例２と同じ濃度に調製したPico
Greenと等量混合し蛍光強度を測定した。
産物の検出 実施例２と同様にPicoGreenを用いた検討を、DNAの変性
方法を変えて行った。実施例２と同じ濃度に調製したDN
A溶液に1/10量の2N NaOHを加え、室温で5分インキュベ
ートし変性させた後、1/10量の3M sodium acetate(pH4.
5)を加えた。これを実施例２と同じ濃度に調製したPico
Greenと等量混合し蛍光強度を測定した。
【００５９】各サンプルの蛍光強度測定結果を図４に示
す。アルカリ変性させないサンプル（対照）に比べてア
ルカリ変性させたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λ
ファージDNAでは約12%であったのに対し、LAMP法増幅産
物では約60%であった。
す。アルカリ変性させないサンプル（対照）に比べてア
ルカリ変性させたサンプル（本発明）の蛍光強度は、λ
ファージDNAでは約12%であったのに対し、LAMP法増幅産
物では約60%であった。
【図１】本発明による各種核酸の検出結果を示すグラフ
（インターカレーターとしてPicoGreenを用いた場合）
（インターカレーターとしてPicoGreenを用いた場合）
【図２】本発明による各種核酸の検出結果を示すグラフ
（インターカレーターとしてSYBRGreenを用いた場合）
（インターカレーターとしてSYBRGreenを用いた場合）
【図３】本発明による各種核酸の検出結果を示すグラフ
（インターカレーターとしてエチジウムブロマイドを用
いた場合）
（インターカレーターとしてエチジウムブロマイドを用
いた場合）
【図４】核酸の変性方法としてアルカリ処理を行った場
合の結果を示すグラフ
合の結果を示すグラフ
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 長谷 哲 栃木県大田原市下石上1381−３栄研化学株 式会社那須事業所内 Ｆターム(参考） 2G045 BB12 BB60 DA13 FB01 FB03 FB07 FB12 4B024 AA20 BA80 CA01 CA09 HA19 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR41 QR42 QR62 QR66 QS24 QS36 QS39 QX02
Claims (13)
- 【請求項１】以下の工程からなる同一鎖内に相補性領域
を有する核酸の検出方法。 1)試料を、２本鎖核酸は１本鎖に変性するが、同一鎖内
の２重鎖構造は１本鎖に変性しない条件におく工程。 2)試料中の同一鎖内に２重鎖構造を有する核酸のみを検
出する工程。 - 【請求項２】工程1)がさらに、試料中の２重鎖構造を有
する核酸を１本鎖に変性する工程と、同一鎖内の相補性
領域のみを相補結合させて２重鎖構造を形成する工程か
らなることを特徴とする請求項１に記載の核酸の検出方
法。 - 【請求項３】２重鎖構造を有する核酸の検出方法が、２
重鎖構造を有する核酸と１本鎖核酸の物性の違いを利用
して検出するものである請求項１から２に記載の核酸の
検出方法。 - 【請求項４】２重鎖構造を有する核酸の検出が、核酸の
２重鎖構造に特異的に結合する物質を利用して検出する
ものである請求項１から２に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項５】２重鎖構造を有する核酸に特異的に結合す
る物質が抗体、または可変領域を含む抗体断片であるこ
とを特徴とする、請求項３から４に記載の核酸の検出方
法。 - 【請求項６】２重鎖構造を有する核酸に特異的に結合す
る物質がインターカレーターであることを特徴とする、
請求項４に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項７】インターカレーターが、検出可能な信号を
放出する物質で標識されていることを特徴とする請求項
６に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項８】インターカレーターが蛍光物質であること
を特徴とする、請求項６に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項９】蛍光物質が、エチジウムブロマイド、Pico
Green、SYBR Green I、およびその誘導体から選択され
たものであり、これらの物質が核酸の２重鎖構造に結合
した際の蛍光の変化を検出することを特徴とする請求項
８に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項１０】２重鎖構造を有する核酸を１本鎖に変性
する方法が、熱変性、および／またはアルカリ変性であ
ることを特徴とする請求項１から９に記載の核酸の検出
方法。 - 【請求項１１】同一鎖内に相補性領域を有する核酸が、
遺伝子増幅法による増幅産物であることを特徴とする請
求項１から１０に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項１２】遺伝子増幅産物が、同一鎖内の相補性領
域のお互いに逆向きの繰り返し構造を有するものである
ことを特徴とする請求項１１に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項１３】遺伝子増幅法がLAMP(Loop mediated iso
thermal amplificaiton of DNA)法であることを特徴と
する請求項１２に記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000053780A JP4437856B2 (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000053780A JP4437856B2 (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001242169A true JP2001242169A (ja) | 2001-09-07 |
| JP4437856B2 JP4437856B2 (ja) | 2010-03-24 |
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ID=18575114
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000053780A Expired - Fee Related JP4437856B2 (ja) | 2000-02-29 | 2000-02-29 | 同一鎖内に相補性領域を有する核酸の検出方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP4437856B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005001097A1 (ja) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Ｓａｒｓコロナウイルスの検出法 |
| WO2006049061A1 (ja) | 2004-11-01 | 2006-05-11 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法 |
| EP2107113A1 (en) | 2002-02-20 | 2009-10-07 | Sysmex Corporation | Primers for nucleic acid amplification in detecting housekeeping gene mRNA and test method using these primers |
| WO2009145314A1 (ja) | 2008-05-29 | 2009-12-03 | 花王株式会社 | パエシロマイセス バリオッティの検出方法 |
| WO2009145279A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 花王株式会社 | 耐熱性菌類の検出方法 |
| EP2527475A1 (en) | 2007-05-28 | 2012-11-28 | Ehime University | Primers for detecting plasmodium |
| WO2019163672A1 (ja) | 2018-02-22 | 2019-08-29 | 佐藤製薬株式会社 | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 |
| WO2021177372A1 (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 栄研化学株式会社 | コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法 |
-
2000
- 2000-02-29 JP JP2000053780A patent/JP4437856B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| EP2388340A1 (en) | 2004-11-01 | 2011-11-23 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of detecting H5 or H7 avian influenza virus |
| WO2006049061A1 (ja) | 2004-11-01 | 2006-05-11 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法 |
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| EP2712923A1 (en) | 2008-05-28 | 2014-04-02 | Kao Corporation | Method of detecting heat-resistant fungus |
| WO2009145279A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 花王株式会社 | 耐熱性菌類の検出方法 |
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| EP2712924A1 (en) | 2008-05-28 | 2014-04-02 | Kao Corporation | Method of detecting heat-resistant fungus |
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| US11560602B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-01-24 | Sato Pharmaceutical Co., Ltd. | Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same |
| WO2021177372A1 (ja) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 栄研化学株式会社 | コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出方法 |
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