CN104114718B - 超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对样品中分析物进行的基于邻近探针的检测分析(“邻近分析”)，特别是邻近探针延伸分析(PEA)，且尤其是涉及对降低非特异性“背景”信号的方法进行的改进，其中改进包括在这样的分析中使用超嗜热聚合酶，所述方法包括：(a)将样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；(b)在邻近探针与分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应包括将分析的温度提高至超过室温并使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40℃时其具有小于最大酶活性的20％的活性且25℃时其具有小于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃，且所述聚合酶选自强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶，或者它们的衍生物或突变体，优选地其中所述衍生物是序列‑修饰的衍生物；和(d)扩增和检测延伸产物。

Description

超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析
技术领域
本发明涉及一种针对样品中分析物进行的基于邻近探针的检测分析(“邻近分析”)，具体涉及邻近探针延伸分析(PEA)。特别地，本发明涉及对方法的改进，以便减少非特异性“背景”信号，所述非特异性“背景”信号出现在所有样品类型中，并且在复杂的生物样品中可能是特别有问题的。本发明的方法还可产生有利于所述分析的自动化和再现性的简化方法。所述改进包括在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶，特别是超嗜热聚合酶，在上述分析中的使用。本发明还提供了一种试剂盒，包含聚合酶，其是用于本发明方法的、在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶。
背景技术
在邻近探针延伸分析中使用了邻近探针，所述邻近探针结合于分析物并具有核酸结构域(或标记)，所述核酸结构域与所述分析物结合以邻近依赖性方式相互作用。所述相互作用通常通过一个或多个核酸双链体的形成(通过核酸结构域的杂交)进行，所述相互作用使得至少一个核酸结构域从其3’端延伸。该延伸产物形成可检测的，优选可扩增的，核酸检测产物或检测标记，借助其可以检测到所述分析物。
发明内容
本发明中，在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶可在所述聚合酶无活性或具有最小活性的条件下加入，例如，在实验室条件下。所述聚合酶可以在产生延伸产物所必需的其它分析组分之前加入，或者与其它分析组分同时加入，或者在其它分析组分之后加入。因此，人们认为，除非改变反应条件，特别是温度条件，使聚合酶在该参数条件下是有活性的，即具有可检测到的活性或者高于最小聚合物活性，否则在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶不能够与样品中的核酸分子，例如邻近探针的核酸结构域，发生相互作用产生延伸产物。
本发明中，在室温具有最小活性或无活性的聚合酶同时包含其它反应组分，可减少分析方法的步骤数目，即减少了从业者与反应混合物之间相互接触的次数，所述其它反应组分例如是靶标分析物的延伸、扩增和检测所需的组分。这有利于产生一致的分析结果。在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶不论是在其它分析组分之前加入，还是与其它分析组分同时加入或在其后加入，所述聚合酶的使用都能够使从业者不必直接接触反应混合物就可控制延伸产物的产生，即封闭管反应。在本发明的方法中，直到反应条件有利于激发聚合酶活性，才会产生延伸产物。这使得样品能够与分析组分一起进行培养足够的时间，包括在聚合酶存在下进行培养，以便使邻近探针的核酸结构域之间的非特异性相互作用最小化，从而增强了分析的特异性和灵敏性。
通常，邻近分析依赖于“邻近探测”原理，其中通过多个(即两个或多个，通常是两个或三个)探针的结合来检测分析物，当所述探针通过结合于分析物(因此是“邻近探针”)而进入邻近时，使得信号生成。一般地，邻近探针中的至少一个包括连接于探针的分析物结合结构域(或部分)的核酸结构域(或部分)，并且信号的生成涉及核酸部分和/或由其它探针(或多个探针)携带的另外的功能部分之间的相互作用。因此信号生成取决于探针之间(更具体地由它们携带的核酸或其它功能部分/结构域之间)的相互作用，因此仅当两个(或多个)必须的探针都结合于分析物时才生成信号，从而向检测系统提供改善的特异性。近年来发展了邻近探测的概念，现在基于该原则的许多分析在本领域是熟知的。例如，“邻近探针延伸分析”或“邻近延伸分析”(PEA)是指具体类型的分析，所述分析利用核酸结构域的延伸，即核苷酸模板化地加入核酸分子的末端，以生成可检测的信号。
基于邻近探针的检测分析，特别是邻近延伸分析使得能够通过将样品中的一种或多种分析物的存在的形式转化成可以容易地检测的或者可定量的基于核酸的信号，以灵敏、快速且方便地检测或者定量该一种或多种分析物，并且所述的分析可以按照均质或异质形式进行。
本领域的邻近探针通常成对使用，并且各自地由对靶标分析物具有特异性的分析物结合结构域和功能结构域所构成，所述功能结构域例如是偶联在其上的核酸结构域。所述分析物结合结构域例如可以是核酸“适体”(Fredriksson等人(2002)，自然生物技术20:473-477)(Fredriksson et al(2002)Nat Biotech20:473-477)或可以是蛋白质的，诸如单克隆或多克隆抗体(Gullberg等人(2004)，美国科学院院刊101:8420-8424)(Gullberg etal(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420-8424)。每个邻近探针对的各自的分析物结合结构域可以针对分析物上的不同结合位点具有特异性，所述分析物可以由单一分子或者相互作用的分子复合物构成，或者可以具有相同的特异性，例如在靶标分析物存在的情况下作为多聚体存在。当邻近探针对变得彼此紧密邻近时，这主要当两个均结合于相同分析物分子上的其各自的位点时发生，功能结构域(例如，核酸结构域)能够相互作用。在本发明的上下文中，例如，核酸结构域可以含有彼此互补的区域，因此邻近探针对的核酸结构域可以杂交以形成双链体。一个或多个结构域可以延伸以形成新的核酸序列，这通常借助由其它邻近探针的核酸结构域模板化的聚合反应来进行。由此，生成的新核酸序列用于报告样品中分析物的存在与否或含量，并且生成的新核酸序列可以被定性或定量检测，例如通过实时定量PCR(q-PCR)定量检测。
基于邻近探针的分析存在许多变化。例如，国际专利WO01/61037，美国专利6,511,809和国际专利WO2006/137932中对邻近延伸分析进行了描述，并且基于邻近探针的分析的异质(即分析物首先借助特异性分析物结合试剂固定在固体基质上)和均质(即在溶液中)形式在如下文献中被公开：国际专利WO01/61037，国际专利WO03/044231，国际专利WO2005/123963，Fredriksson等人(2002)自然生物技术20:473-477(Fredriksson et al(2002)NatBiotech20:473-477)和Gullberg等人(2004)美国科学院院刊101:8420-8424(Gullberg etal(2004)Proc Natl Acad Sci USA101:8420-8424)。
虽然通常使用邻近探针对，但是邻近探针检测分析的修饰已描述于例如国际专利WO01/61037，国际专利WO2005/123963和国际专利WO2007/107743，其中使用三种邻近探针来检测单个的分析物分子。例如，第三邻近探针可以用来提供可以与前两种邻近探针的核酸结构域相互作用的另外的核酸结构域。
除了对邻近探针检测分析的修饰，邻近探针本身结构的修饰已描述于例如国际专利WO03/044231中，其中使用了多价邻近探针。这样的多价邻近探针包括至少两个，但是多达100个的分析物结合结构域，所述分析物结合结构域缀合于至少一个核酸，优选多于一个核酸。
基于邻近探针的检测分析，且特别是邻近延伸分析，已经证明在许多不同的应用中在蛋白质的特异性和灵敏性检测中是非常有用的，所述应用例如是检测弱表达或低丰度蛋白质。然而，就分析的灵敏度和特异性两方面而言，这样的分析都不是没有其问题，并且存在改进空间。
例如上述邻近延伸分析的传统邻近分析的灵敏度受两个主要因素的限制：(i)分析物结合结构域对靶标分析物的亲和力，和(ii)由非结合探针特别是探针对的随机邻近产生的非特异性背景信号。使用具有对分析物亲和力高的结合结构域时，灵敏度被限制在检测约6000个分子。传统地，为了实现低水平的背景，必须使用非常低浓度的邻近探针。这阻止了试图通过使用高浓度的探针来补偿包括低亲和力分析物结合结构域的探针的任何尝试。因此发现这可能限制分析的灵敏度和可能获得定量结果的范围。
已经提出了用于减少非特异性背景信号的其它方法，诸如使用封闭剂，例如封闭寡核苷酸，所述封闭剂结合于邻近探针上的核酸结构域的游离端，直到被取代，例如被置换剂寡核苷酸取代。在允许邻近探针结合于分析物之后加入置换剂寡核苷酸，意味着邻近探针的核酸结构域的相互作用仅可能发生在结合于靶标分析物的邻近探针上。
改善邻近探针分析特别是邻近延伸分析的灵敏度的其它方法使用了包含3’核酸外切酶活性的组分，例如具有3’核酸外切酶活性的聚合酶，所述组分被认为是通过降解具有游离且未被保护的3’端的邻近探针核酸结构域来降低背景活性，所述游离且未被保护的3’端是指邻近探针上没有结合于靶标分析物且因此不形成特异性相互作用或双链体的结构域。这会阻止由非杂交的或“非双链的”核酸结构域产生非特异性延伸产物，因而同时增强分析的特异性和灵敏性。减少背景信号的其它方法集中在改进核酸延伸产物的检测上。
然而，仍然有改进背景信号水平的空间，并且为了克服邻近分析的局限性，特别是如上所述的本领域已知的邻近延伸分析，已发现使用在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶能显著改善分析的灵敏性和特异性，所述聚合酶在其它反应组分之前加入，或者与其它反应组分同时加入或在其后加入。优选地，在聚合酶无活性的条件下，例如在实验室条件下，将在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶与样品接触。在优选的具体实施方式中，如果靶标分析物存在于样品中，那么在已经使邻近探针与靶标分析物相互作用之后，加入用于延伸核酸结构域的聚合酶。在一些具体实施方式中，用于延伸核酸结构域的聚合酶与其它反应组分例如延伸反应所需的组分同时加入，这样，邻近延伸分析就是封闭管系统，即，反应混合物可以在使邻近探针与分析物相互作用(或者，在加入延伸反应组分之后，使反应混合物均匀且使邻近探针之间的相互反应稳定)但聚合酶不具有活性或不具有最小活性的条件下，例如在室温条件下，进行培养，随后在使聚合酶具有活性的条件下，例如高于室温的条件下，对反应混合物进行培养。因此，在一种特别优选的具体实施方式中，在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶是超嗜热聚合酶。
通过在分析中包括在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶，而有可能减少分析中存在的非特异性背景信号。或者，使用在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶可以视为减少或防止不需要的、不希望的或非特异性的延伸产物的产生。
在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶在检测样品中分析物的方法中的应用，特别是在本发明的邻近延伸分析中的应用，提供了与先前的基于邻近探针的分析相比独特且出乎意料的优点。
一般地，特别地选择基于邻近探针的分析的组分，以便在分析的最适条件下具有最大或接近最大的活性。邻近探针分析预期是依赖于在分析条件下灵敏且有效的分析组分，以便所述分析能够检测小量的分析物。因此，使用具有极端活性分布的组分，例如在分析所采用的温度范围之外的温度下具有最佳活性的酶，预期会延迟或阻碍充当标明靶标分析物存在的信号的核酸分子的产生，例如，通过与最适分析条件下具有最大活性的酶相比降低了核酸分子的产生速度。
然而，本发明的方法依赖于当室温下具有最小活性或无活性的聚合酶在PEA中接触样品时所看到的背景的显著降低(即：噪音比升高)。特别地，室温下具有最小活性或无活性的聚合酶与邻近延伸分析的其它组分中的至少一些同时与样品有利地接触。或者，也可以在分析的其它组分已经相互作用之后再提供室温下具有最小活性或无活性的聚合酶。由此可见，室温下具有最小活性或无活性的聚合酶可以在分析的任何合适阶段与样品接触。
虽然不希望受理论约束，但是理论认为，在组分首次接触的条件下，室温下具有最小活性或无活性的聚合酶不能够延伸邻近探针的核酸结构域。在这方面，在邻近探针的分析物结合结构域可以相互作用并且与分析物(如果存在于样品中)结合的条件下，反应混合物的全部分析组分可以存在于单个反应容器(例如，管)，并且邻近探针的核酸结构域之间形成的、均结合至靶标分析物的双链体可形成稳定的相互作用(在分析条件下，一旦结合，邻近探针就不容易从靶标分析物分离，从而实现稳定，即形成了非短暂的或长久的双链体)。在无聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的情况下形成双链体，会促进聚合物最终激活时特异性延伸产物的生产，即，只有结合于靶标分析物的邻近探针会形成稳定的双链体，在聚合酶有活性时进行延伸。由于在邻近探针双链体的形成过程中聚合酶可以存在于反应混合物中，因此不向反应混合物中加入任何其它组分也有可能激活聚合酶，例如，通过提高反应混合物的温度来激活聚合酶。可以假设的是，在聚合酶无活性或只有最小活性的情况下加入聚合酶，会给分析带来进一步水平的控制。给分析物检测分析增加其它步骤通常是不希望的，因为这会使方法变复杂，从而增加了自动化和/或适用于高通量应用的困难。类似地，向分析中添加组分会增加样品的复杂性，即，加入其它组分后反应混合物必须均衡，其它组分会降低分析的灵敏性。因此，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶的使用，使得在酶在激活之前反应混合物中的组分能够稳定或均衡。这很难采用室温下具有活性的聚合酶来实现，因为需要将聚合酶在无活性的条件下加入，例如低温，而这样的条件会干扰或影响邻近探针和靶标分析物之间的相互作用，和/或，结合于靶标分析物的、邻近的两个邻近探针的核酸结构域的相互作用。
正是因为加入了室温下无活性或具有最小活性的聚合酶，而导致邻近探针延伸分析中非特异性背景信号的改进地减少。如实施例所更详细地显示的，本发明代表了与本领域已知的邻近延伸分析相比更显著的进步。令人吃惊的是，显示出，在使用室温下无活性或具有最小活性的聚合酶的本发明方法中观察到非特异性背景活性的降低，甚至可与利用室温下具有一些活性或显著活性的嗜热聚合酶或标准聚合酶的样品相比。另外，更出乎意料地发现，在PEA的典型温度下，例如30-40℃，具有小于其最大活性的20％的聚合酶在本发明的方法中是特别有用的。室温下无活性或具有最小活性的聚合酶的加入引起了分析中信号：噪音比的相似改进，其中，在例如37℃的PEA典型温度下以及例如45-55℃的较高温度下实施所述分析，这完全是出乎意料的。背景信号的这种减少的结果是邻近探针检测分析的特异性和灵敏性均提高。
此外，本文公开的方法还包括简化的PEA，其中，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶活化之前，可以将用于扩增延伸产物的组分与延伸分析的组分相结合。如下所讨论的，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶也可用作扩增反应中的聚合酶活性，从而在分析的延伸步骤之后避免了提供例如热稳定聚合酶的其它聚合酶和扩增组分的需要。然而，本文公开的方法描述了能够使两个分析阶段的试剂预混合的各种组分的修饰。有利的是，这导致较少的移液步骤和较少的动手操作时间，这使得此分析易于实现自动化且减少了误差。
因此，可以看出本发明提供了室温下无活性或具有最小活性的聚合酶在邻近探针延伸分析用于检测样品中分析物的用途，其中延伸产物随后被扩增和检测。
更具体地，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶使用来生成延伸产物，其是在用于邻近分析的邻近探针的核酸结构域相互作用(这样的相互作用通常是核酸结构域的杂交，以及随后的至少一个结构域的延伸；一般说来，核酸结构域杂交，以便一个核酸结构域可以模板化另一个结构域的延伸)之后，在邻近探针延伸分析中生成延伸产物的步骤中，特别是在进行聚合酶催化的延伸反应的步骤中进行的。因此，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶包括在下述步骤中：基于邻近探针的延伸分析中产生初始延伸产物的步骤中，或换言之，邻近探针延伸分析中由邻近探针的核酸结构域的相互作用而产生延伸产物的步骤中。
可选地，本发明的这个方面提供了一种检测样品中分析物的方法，该方法包括邻近探针延伸分析，其中，所述分析包括在分析的延伸步骤中应用室温下无活性或具有最小活性的聚合酶，以及随后对延伸产物进行扩增和检测。
另一方面，本发明提供了在用于检测样品中的分析物的邻近探针延伸分析中减少非特异性延伸产物(或者提高信号：噪声比)的方法，所述方法包括在所述分析的延伸步骤中使用包括室温下无活性或具有最小活性的聚合酶，其中，随后对特异性延伸产物进行扩增和检测。
如上所述，邻近探针延伸分析的延伸步骤是生成初始延伸产物的步骤，所述初始延伸产物随后作为检测分析物的手段而被检测。换言之，延伸步骤是生成延伸产物的步骤，其基于邻近探针的核酸结构域的相互作用，特别是基于核酸结构域的杂交和随后至少一个结构域的延伸，例如，使用另一个作为模板来进行延伸。
本发明的方法是基于邻近探针的分析，并且将室温下无活性或具有最小活性的聚合酶是用于基于邻近探针的分析中的，所述探针是邻近探针。基于邻近探针的分析可以是本领域已知的任何分析，例如如上所述的，所述分析使用邻近探针来检测样品中的分析物。具体地，该分析是邻近延伸分析，其基于通过杂交来检测邻近探针的核酸结构域之间的相互作用，和一个或多个这种结构域的延伸。
因此，在一个优选的方面，本发明提供了一种检测样品中分析物的方法，包括：
(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；
(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；
(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40℃时其具有小于最大酶活性的20％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃；和
(d)扩增和检测延伸产物。
如下更详细地描述，分析物结合结构域可以直接地或间接地结合分析物。
因此，可以看出，室温下无活性或具有最小活性的聚合酶可以用于扩大邻近延伸分析的敏感性和/或特异性。因此，本发明的方法可以认为是提高(针对分析物的)邻近延伸分析的信号：噪音比的方法。用另一种方式表达，本发明的方法可以用于降低在邻近延伸分析中的非特异性延伸产物的量。或者，本发明可以看做是提供了一种减少实施邻近延伸分析所需步骤数目的方法。此外，本发明可以看做是提供了一种使用邻近延伸分析来检测靶标分析物的简化方法。
可以看出，该方法包括改变或修改分析的条件以活化或增强聚合酶活性的其它步骤。因此，该方法可包括如下步骤：在聚合酶不具有(聚合酶)活性或具有最小(聚合酶)活性的条件下，例如，在室温或低于室温的条件下，使聚合酶与样品(或反应混合物)接触。可选地，聚合酶可以与其它分析组分同时与样品(或反应混合物)接触，其它分析组分例如是延伸反应所需的组分。在一个优选的具体实施方式中，聚合酶与样品接触的步骤发生在步骤(b)之后。
该方法还可包括改变或修饰样品已经接触聚合酶之后的分析条件以活化或增强聚合酶活性的步骤。在一个优选的具体实施方式中，该步骤包括将分析(反应混合物)的温度提高至室温之上。在一个特别优选的具体实施方式中，将分析的温度提供到至少30℃，优选至少35℃或40℃，或者至少45℃或50℃。在一些具体实施方式中，可以将分析的温度提高到至少55、60、70或75℃。因此，分析的温度可以由室温提高到30-80℃之间，优选地，35-75℃、35-70℃、35-65℃、35-60℃或35-55℃，更优选37-52℃，或者可选地，提高到37-55℃，40-55℃、40-52℃或40-50℃之间。因此，延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物的步骤可以在上述温度范围中的任何温度下实施，诸如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75℃。
在本发明方法的另一个具体实施方式中，一个或多个邻近探针可被提供为展开邻近探针，以便所述一个或多个探针的核酸结构域能够在其3’端形成发卡环，如下所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，本发明的方法包括使用具有3’核酸外切酶活性的组分。具有3’核酸外切酶活性的组分在用于延伸步骤的聚合酶之前加入，或者与用于延伸步骤的聚合酶同时加入。在一些具体实施方式中，用于邻近延伸分析的延伸步骤的聚合酶具有3’核酸外切酶活性。
综上所述，邻近延伸分析涉及在两个或多个邻近探针的核酸结构域之间形成双链体之后延伸至少一个核酸结构域，其中所述探针结合于靶标分析物。然而，所述双链体(两个互补核酸结构域的杂交体)可以按照多种方式形成，这取决于邻近探针上的核酸结构域的方向。
邻近延伸分析形式的代表性的例子示意性地显示在图1中，并且这些具体实施方式在下面进行更详细地描述。然而，这些不同“版本”的PEA并不意在限制本发明的范围。根据以下的描述，其它排列方式对本领域技术人员来说是显而易见的，并且意在将其包括在本发明中。实际上，本发明仅要求至少一个邻近探针(如所示，虽然这是发明的一个优选的方面，但是不限于蛋白质分子或抗体)具有包括能够延伸的游离3’端的核酸结构域，且其中所述延伸可以被第二邻近探针的核酸结构域模板化。在这方面，以及如下所更详细地描述的，邻近探针的核酸结构域可以是单链的或者部分双链的，但是被配置以便结构域的单链区域可以用于通过杂交而进行的彼此相互作用。各邻近探针的核酸结构域也可以通过各自杂交于共同的“夹板”核酸分子而相互作用，从而间接地形成双链体。因此，在上述方法的步骤(b)中，核酸结构域形成双链体的相互作用可以是直接的或者间接的；连接于邻近探针的分析物结合结构域的核酸结构域可以彼此杂交以直接形成双链体，或者它们可以通过各自杂交于另外的核酸分子来间接地形成双链体。这样的另外的核酸分子可以被视为部分双链核酸结构域的第二条链；它将与连接于邻近探针的分析物结合结构域的核酸分子的至少一个区域杂交(从而形成部分双链的核酸结构域，所述核酸结构域通过它的一条链进行连接)，留下一个末端(例如3’)单链区域，所述单链区域与另一个邻近探针的核酸结构域的区域互补，因此，所述单链区域可以用于通过与所述另一个邻近探针的核酸结构域杂交而相互作用。或者，“夹板”可以作为另外的邻近探针的核酸结构域提供。
图1的版本1描绘了“传统的”邻近延伸分析，其中，每个邻近探针的核酸结构域(显示为箭头)通过其5’端连接于分析物结合结构域(显示为倒置的“Y”)，从而留下两个游离的3’端。当所述邻近探针结合于其各自的分析物上的分析物结合靶时(图中未显示分析物)，在3’端互补的探针的核酸结构域能够通过杂交而相互作用，即形成双链体。核酸聚合酶的加入或活化，使得使用另一个邻近探针的核酸结构域能够来延伸每个核酸结构域，以模板化所述延伸。根据本发明的方法，可以特异性地扩增和检测延伸产物，从而检测靶分析物。
图1的版本2描绘了供选择的邻近延伸分析，其中，第一邻近探针的核酸结构域通过其5’端连接于分析物结合结构域，以及第二邻近探针的核酸结构域通过其3’端连接于分析物结合结构域。因此，第二邻近探针的核酸结构域具有游离的5’端(显示为钝箭头)，所述游离的5’端不能使用通常的核酸聚合酶(其仅延伸3’端)来延伸。第二邻近探针的3’端被有效地“封闭”，即它不是“游离的”且由于缀合于分析物结合结构域上因而被其封闭而不能被延伸。在这个具体实施方式中，当邻近探针结合于分析物上的它们各自的分析物结合靶时，在3’端共享互补区域的探针核酸结构域能够通过杂交而相互作用，即形成双链体。然而，与版本1相比，仅有第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离的3’端)可以使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板进行延伸。如上所述，可以扩增并检测延伸产物，从而检测靶标分析物。
在图1的版本3中，与版本2类似，第一邻近探针的核酸结构域通过其5’端连接到分析物结合结构域，并且第二邻近探针的核酸结构域通过其3’端连接到分析物结合结构域。因此，第二邻近探针的核酸结构域具有游离的5’端(显示为钝箭头)，所述5’端不能被延伸。然而，在这个具体实施方式中，连接到各自的邻近探针的分析物结合结构域的核酸结构域没有互补区域，因此不能直接形成双链体。作为替代，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域，该区域在核酸结构域之间充当“分子桥”或“夹板”。该“夹板”寡核苷酸桥接了核酸结构域之间的间隙，使它们彼此能间接相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。因此，当邻近探针结合到各自的在分析物上的分析物结合靶时，探针的核酸结构域各自通过杂交，即通过形成双链体来与夹板寡核苷酸相互作用。由此可见，第三核酸分子或夹板可以看作是在邻近探针之一上提供的部分双链的核酸结构域的第二条链。例如，邻近探针中的一个可以具有部分双链的核酸结构域，所述结构域通过一条链的3’端连接于分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离的3’端。因此，这样的核酸结构域具有末端单链区域，所述单链区域具有游离的3’端。在这个具体实施方式中，第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离的3’端)可以使用“夹板寡核苷酸”(或另一个核酸结构域的单链的3’端区域)作为模板延伸，并且可以有利地连接到第二邻近探针的核酸结构域的5’端(具体地为连接链的5’端，或者可选地是指核酸结构域的双链部分的5’端)。可选地或另外地，夹板寡核苷酸的游离3’端(即未连接的链，或3’单链区域)可以使用第一邻近探针的核酸结构域作为模板进行延伸。如上所述，可以扩增和检测延伸产物，从而检测靶标分析物。
在优选的具体实施方式中，本发明的方法并不涉及连接步骤或反应，即一个或多个核酸分子的5’和3’端的缀合或结合。更具体地，邻近探针的核酸结构域并不连接在一起，即本发明的方法不包括分子间的连接。
从以上描述可以清楚地看出，在一种具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以作为分析的单独组分而提供。换言之，可以将其单独加入反应混合物中(即与邻近探针分别地加入到含有分析物的样品中)。尽管如此，由于其杂交到作为邻近探针的部分的核酸分子，并且当与这样的核酸分子接触时会这样做，因此，尽管它是单独加入的，但是仍将其视为部分双链的核酸结构域的一条链。可选地，所述夹板可以预先杂交到邻近探针的一个核酸结构域，即在将邻近探针与样品接触之前进行杂交。在这个具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以直接看作邻近探针的核酸结构域的部分，即，其中核酸结构域是部分双链的核酸分子，例如，邻近探针可以通过将双链核酸分子连接到分析物结合结构域(优选地，核酸结构域通过单链缀合于分析物结合结构域)并且(使用能够杂交到其它邻近探针的核酸结构域的单链突出端)修饰所述核酸分子以生成部分的双链核酸结构域来制备。因此，如本文所定义的邻近探针的核酸结构域的延伸还包括“夹板”寡核苷酸的延伸。有利地，当延伸产物由夹板寡核苷酸的延伸产生时，所产生的延伸的核酸链仅通过核酸分子的两条链之间的相互作用(通过两条核酸链之间的杂交)偶联于邻近探针对。因此，在这些具体实施方式中，可以使用变性条件将所述延伸产物从邻近探针对上解离，所述变性条件例如是升高温度、降低盐浓度等。这在异质形式中是特别有用的，其中靶标分析物结合于固体基质，由于延伸产物可以容易地从分析的其它组分上分离，例如，结合于固定化的分析物的邻近探针可以在固相中，而延伸产物在变性之后可以在液相中。
虽然在图1的版本3中描绘的夹板寡核苷酸显示为与全长的第二邻近探针的核酸结构域的互补，但是这仅仅是一个例子，并且对于夹板而言，能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体就足够了，即能够将间隙进行桥接就足够了，如下进一步定义的。
在另一个具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以作为如国际专利WO2007/107743所描述的第三邻近探针的核酸结构域提供，该国际专利通过引用整体并入本文，其说明将夹板寡核苷酸作为第三邻近探针的核酸结构域而提供能够进一步提高邻近探针分析的灵敏性和特异性。
图1的版本4是版本1的修饰，其中第一邻近探针的核酸结构域包括在其3’端与第二邻近探针的核酸结构域不完全互补的序列。因此，当所述邻近探针结合到分析物上它们各自的分析物结合靶时，所述探针的核酸结构域能够通过杂交，即形成双链体，而相互作用，但是第一邻近探针的核酸结构域的3’最末端(包括游离3’羟基的核酸分子的部分)不能杂交，因此作为单链的未杂交的“下垂物”(flap)存在。在加入或者活化核酸聚合酶时，通过如下方法只有第二邻近探针的核酸结构域可以被延伸：使用第一邻近探针的核酸结构域来模板化该延伸。如上所述，可以特异性地扩增和检测延伸产物，从而检测靶标分析物。
在这种构型中，在分析还包括具有3’核酸外切酶活性的组分的具体实施方式中，有益的是对第一邻近探针的核酸结构域3’端的一个或多个核苷酸进行修饰，例如，以使其具有对3’核酸外切酶活性的抗性。下面对合适的修饰作了进一步描述。如果核酸结构域是抗3’核酸外切酶活性的，那么只有第二邻近探针的核酸结构域可以被延伸。相反地，如果核酸结构域对3’核酸外切酶活性是敏感的，那么“下垂物”可以被降解，产生与第二邻近探针的核酸结构域完全杂交(退火)的3’端。因此，第一邻近探针的核酸结构域也可以使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸。
图1中描绘的最后的具体实施方式，即版本5，可以看作是版本3的修饰。然而，与版本3相比，两个邻近探针的核酸结构域均通过它们的5’端连接到它们各自的分析物结合结构域。在这个具体实施方式中，核酸结构域的3’端不互补，因此邻近探针的核酸结构域不能相互作用或直接形成双链体。作为替代，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域，该区域在核酸结构域之间充当“分子桥”或“夹板”。该“夹板”寡核苷酸桥接了核酸结构域之间的间隙，使得它们能够彼此间接地相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。因此，当邻近探针结合于分析物上它们各自的分析物结合靶时，探针的核酸结构域各自通过杂交即形成双链体而与夹板寡核苷酸相互作用。因此，根据版本3可以看出，第三核酸分子或夹板可以看作是在一个邻近探针上提供的部分双链的核酸结构域的第二条链。在一个优选的实施例中，可以将探针之一与部分双链的核酸结构域一起提供，所述结构域通过一条链的5’端连接到分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离的3’端。因此，这样的核酸结构域具有末端单链区域，该区域具有至少一个游离3’端。在这个具体实施方式中，第二邻近探针的核酸结构域(其具有游离3’端)可以使用“夹板寡核苷酸”作为模板延伸。可选地或另外地，夹板寡核苷酸的游离3’端(即，未连接的链，或第一邻近探针的3’单链区域)可以使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板进行延伸。如上所述，可以扩增和检测延伸产物，从而检测靶标分析物。
如上所讨论，与版本3相关，夹板寡核苷酸可以作为分析的单独的组分提供。另一方面，由于它杂交到作为邻近探针的部分的核酸分子，并且当与这样的核酸分子接触时会这样，因此，尽管它是单独加入的，但是仍将其视为部分双链的结构域的一条链。可选地，夹板可以预先杂交到邻近探针的一个核酸结构域，即，在将邻近探针与样品接触之前进行杂交。在这个具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以直接看作邻近探针的核酸结构域的部分，即，其中核酸结构域是部分双链的核酸分子，例如，邻近探针可以通过将双链核酸分子连接到分析物结合结构域(优选地，核酸结构域通过单链缀合到分析物结合结构域)并且(使用能够杂交到其它邻近探针的核酸结构域的单链突出端)修饰所述核酸分子以产生部分双链的核酸结构域。因此，如本文所定义的邻近探针的核酸结构域的延伸还包括“夹板”寡核苷酸的延伸。有利地，当延伸产物由夹板寡核苷酸的延伸产生时，所产生的延伸的核酸链仅通过核酸分子的两条链之间的相互作用(通过两条核酸链之间的杂交)偶联于邻近探针对。因此，在这些具体实施方式中，可以使用变性条件将所述延伸产物从邻近探针对上解离，所述变性条件例如是升高温度、降低盐浓度等。这在异质形式中是特别有用的，其中靶标分析物结合于固体基质，由于延伸产物可以容易地从分析的其它组分上分离，例如，结合于固定化的分析物的邻近探针可以在固相中，而延伸产物在变形之后可以在液相中。
虽然在图1的版本5中描绘的夹板寡核苷酸显示为与第一邻近探针的全长核酸结构域的互补，但是这仅仅是一个例子，并且对于夹板而言，能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体就足够了，即能够将间隙桥接就足够了，如下进一步定义的。
在另一个具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以作为如国际专利WO2007/107743所描述的第三邻近探针的核酸结构域提供，该国际专利通过引用整体并入本文，其说明将夹板寡核苷酸作为第三邻近探针的核酸结构域而提供能够进一步提高邻近探针分析的灵敏性和特异性。
从以上可以理解的是，邻近延伸分析有多个排列，其都依赖于当两个(或多个)邻近探针结合于分析物时，凭借探针之间相互作用形成包括可延伸的3’端(用于模板化的延伸)的核酸双链体。因此，探针之间(或更具体地，在它们各自的核酸结构域之间，所述核酸结构域包括夹板寡核苷酸)的相互作用是邻近依赖性的；检测探针在分析物上的结合共同地使得它们邻近，以使它们(或更具体地，它们的核酸结构域)可以相互作用。因此，可以通过检测该相互作用(或由此生成的延伸产物)来检测分析物。在本发明的方法中，邻近探针可以通过彼此杂交而(直接地或间接地)相互作用，以使得一个或多个核酸分子能够延伸。该延伸可以导致两个邻近探针的核酸结构域缀合或相互连接，并且夹板寡核苷酸(其可以形成邻近探针的核酸结构域的部分)协助或介导该相互作用(缀合)。可选地，本发明的方法并不包括连接反应，例如，邻近探针的核酸结构域不连接。延伸(如果适用，缀合)可以通过检测延伸和/或缀合产物(相互作用产物)来检测。
虽然不希望受理论约束，但是理论认为，本发明的方法依赖于室温下无活性或具有最小活性的聚合酶的加入，这使得在没有聚合酶活性或只有最小聚合酶活性的有利条件下对分析组分进行均衡和稳定。据认为，如果聚合酶在加入的条件下是有活性的，那么它的加入会干扰反应，这会产生非特异性/背景延伸产物，从而干扰分析物的检测。例如，将活性聚合酶与其它分析组分，例如引物、夹板、延伸反应组分、邻近探针等，一起加入反应混合物，或者将活性聚合酶在其它分析组分之前加入反应混合物，这会导致所述探针的核酸结构域的延伸，从而产生非特异性/背景延伸产物，其中，所述探针的核酸结构域是非特异性地和/或短暂地(暂时地)结合于其它未结合邻近探针或分析组分的。据认为，在分析的邻近探针，例如结合于靶标分析物的邻近探针和相邻结合的探针的双链形式的核酸结构域，已相互作用之后再将组分加入到反应混合物中，可暂时地使这些相互作用不稳定。聚合酶在有活性的条件下加入到反应混合物中的分析可导致由不稳定的邻近探针产生非特异性/背景延伸产物。然而，如果聚合酶在其加入到反应时的条件下是无活性的，那么它就不会干扰其它组分的相互作用。因此，聚合酶的存在可以使反应混合物的组分之间的相互作用稳定，其中，不需要修饰反应组分就可活化所述聚合酶，即，只需要修饰反应条件，例如温度。
核酸聚合酶是这样的酶：通过催化核酸分子3’端末端核苷酸与游离核苷酸之间形成磷酸二酯键而延伸核酸分子。通常，聚合酶反应以单链(或部分单链)核酸分子为模板，来直接形成新的分子。已知存在众多类型的核酸聚合酶，它们可以由DNA和/或RNA模板来合成DNA和/或RNA。
可用于本发明方法的聚合酶包括室温下无活性或具有最小活性的酶，这样，就可以在室温将聚合酶加入到邻近延伸分析中，而不会催化反应混合物中存在的核酸分子而发生延伸。可以在相对于特定酶在其最适条件下，特别是最适温度条件下的最大活性来定义室温下的最小(或可忽略的)活性。因此，在本发明的一个优选具体实施方式中，在其它参数是最适的分析条件下来测定不同温度下聚合酶的活性，所述其它参数例如是缓冲液、pH、盐浓度、模板和引物浓度、核苷酸浓度等。不同温度下酶的活性分布可以看作是特定条件下的平均活性，所述条件优选是除温度之外的其它参数的最适条件，即，其中发生修饰的条件只是温度。因此，酶的最大活性是包括最适温度的最适条件下的平均活性。除非特别说明，否则本文中提到的酶活性应解读为特定条件下的平均酶活。
因此，室温下具有最小或可忽略活性的聚合酶可被定义为这样的聚合酶：其在它参数处于最适条件，在室温下，其活性小于最大活性的5％(平均)。优选地，这其它参数处于最适条件，在室温下，所述聚合酶的活性小于其最大活性的4％、3％、2％或1％。
通常，室温用来描述20-25℃的温度范围。因此，用于本发明的聚合酶在20-25℃的活性通常小于其最大活性的5％(平均)。优选地，室温可被定义为标准环境温度(SAT)，其是25℃(298.15开尔文)。因此，在一个优选的具体实施方式中，用于本发明的聚合酶在25℃的活性小于其最大活性的5％(平均)。
用于本发明方法的优选的聚合酶可以定义为超嗜热聚合酶。通常，超嗜热酶是由超嗜热生物体衍生或获得的，所述生物体在高于90℃的极端温度下最适生长，例如，在约100℃(相比于在约70℃最适生长，70℃通常适合于绝大部分嗜热生物)。超嗜热聚合酶(或更具体地，来自超嗜热生物体的聚合酶)在高于正常生理(即一般的生物)温度下具有最佳酶活性，例如高于37℃，诸如高于40、50、60或70℃，一般高于60℃或70℃。显著地，在诸如室温的较低温度下，例如在25℃或30℃，这样的酶有利地显示了低的或降低的活性。特别有利地，直至达到至少45℃或50℃的温度，聚合酶的活性是低的。已经从生活在极端温度条件下的生物体中，例如古生菌(诸如强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)等)，鉴定出了这样的酶。这些生物体中特别令人关注的酶是这样的聚合酶：它们已经用于很多分子生物学技术的研发中，尤其是PCR。除了自然发生的超嗜热酶之外，还可以对高温下活性最佳的热稳定酶进行修饰以使其具有在室温降低的或低的活性，以便产生与自然发生的超嗜热酶具有相同或相似性质的酶，特别是具有相同或相似温度活性分布的酶，即高的最适温度下(例如高于50、55或60℃)与室温下(或在诸如30℃、37℃或40℃的较低温度下)具有低的或降低的活性相结合。这样的经过修饰的聚合酶可包括所谓的Taq聚合酶“热起始(hotstart)”衍生物，其在约50℃获得活性。如本文所用，术语“超嗜热聚合酶”不仅包括自然发生的酶，还包括所有这样的修饰衍生物，所述修饰衍生物还包括自然发生的超嗜热聚合酶的衍生物。
因此，用于本发明方法的聚合酶的特征在于其在40℃的活性小于等于其最大活性的20％，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度高于40℃。可选地，相比于聚合酶在较高温度下的最大活性，可以根据在特定温度诸如40℃测定的酶活性来对用于本发明方法的聚合酶进行定义。因此，当在40℃对用于本发明方法的聚合酶的活性进行测定时，它们的活性小于等于它们最大活性的20％，即，在最适条件下，即最适温度下获得的活性的20％。优选地，所述聚合酶的特征在于，其在40℃的活性小于等于其最大酶活性的15％，优选小于等于其最大酶活性的10％，例如小于等于其最大酶活性的9％、8％、7％、6％或5％。
可选地或另外地，所述聚合酶的特征在于，其在50℃的活性小于等于其最大酶活性的30％，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度高于50℃。优选地，所述聚合酶的特征在于，其在50℃的活性小于等于其最大酶活性的20％，优选小于等于其最大酶活性的15％，例如小于等于其最大酶活性的14％、13％、12％、11％或10％。
用于本发明方法的聚合酶的进一步的特征在于，其在25℃的活性小于等于其最大酶活性的10％，优选地，其在25℃的活性小于等于其最大活性的5％，例如，小于等于其最大活性的4％、3％、2％或1％。
因此，例如，本发明的聚合酶的特征在于，其在40℃的活性小于等于其最大酶活性的20％，且其在25℃的活性小于等于其最大酶活性的10％，其中，所述聚合酶最大活性的最适温度大于40℃。可选地，所述聚合酶的特征在于，其在50℃的活性小于等于其最大酶活性的30％，且其在25℃的活性小于等于其最大酶活性的10％，其中，所述聚合酶最大活性的最适温度大于50℃。
在特别优选的具体实施方式中，用于本发明方法的聚合酶包括至少是50℃的最大活性的最适温度，优选至少是60℃或70℃。
基于上述限定的温度活性分布的其它组合也适合于限定用于本发明方法的聚合酶。因此，上述特征的任何组合，其限定了在50℃或低于50℃时具有相对低活性(小于最大活性的30％)的聚合酶，优选地，在例如25℃的室温没有活性或具有最小活性，且其最大活性的最适温度高于40℃，例如50℃、60℃或70℃。
可以使用本领域已知的任何便捷方法来测定聚合酶活性。例如，可以通过监测聚合酶反应期间标记的核苷酸，例如[3H]TTP，掺入高分子量核酸来测定聚合酶活性。方便地，用于本发明方法的聚合酶的聚合酶活性可在聚合酶链式反应(PCR)中测定。
用于本申请方法的特别优选的超嗜热酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以及它们的衍生物，例如序列-修饰衍生物，及其突变体。
因此，本发明特别优选的方面提供了一种检测样品中分析物的方法，包括：
(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；
(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；
(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应使用聚合酶，所述聚合酶选自强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶或者它们的衍生物或突变体；和
(d)扩增和检测延伸产物。
Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的序列-修饰衍生物或突变体包括保留了野生型序列的至少一些功能活性的突变体，所述功能活性例如是聚合酶活性。突变会影响酶的活性分布，例如，在不同反应条件下，提高或降低聚合反应速率，其中反应条件例如是温度、模板浓度、引物浓度等。突变或序列修饰也会影响酶的保真性，例如，抑制或降低核酸外切酶活性。聚合酶可以作为包括其它组分的组合物的一部分而提供，所述其它组分例如是稳定组分可增强或改善聚合酶活性，例如美国专利US6183997和US6444428(通过引用整体并入本文)对这样的组合物进行了描述。Pfu DNA聚合酶或Pwo DNA聚合酶的很多序列-修饰衍生物或突变体以及包含未修饰的和修饰的酶的组合物是本领域已知的且可市购得到，例如，超超新星TM(Pwo)(HypernovaTM(Pwo))，德尔塔TM(Pwo)(Delta3TM(Pwo))，索尔金特TM(Pfu)(SolGentTM(Pfu))，并且，如上所述的，所有保留了必要温度活性分布的酶都被认为是可用于本发明的方法中的。
因此，在一个具体实施方式中，本发明的优选的超嗜热聚合酶由包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列或者与其具有至少80％、85％或90％序列一致性的核苷酸序列所编码。可选地或另外地，本发明的优选的超嗜热聚合酶包括SEQ ID NO:2的多肽序列或者与其具有至少80％、85％或90％序列一致性的多肽序列。因此，本发明的超嗜热聚合酶可以是Pfu酶或Pwo酶的天然变体或衍生物，例如，来自于诸如是火球菌(Pyrococcus)替代菌株或种的另一超嗜热生物体。例如，已经从其它火球菌的种，诸如甘氏火球菌(Pyrococcus glycovorans)和深海火球菌(Pyrococcus abyssi)(参见登录号AAA37131.1、CAB81809.1和NP127396.1，其通过引用整体并入本文)，识别出众多天然变体或衍生物。
优选地，所述核苷酸序列或多肽序列与其所比对的序列至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。
核苷酸分子的序列一致性可以通过使用GCG接口的FASTA搜索来测定，所述搜索具有缺省值和可变的姆因子，缺口产生罚分设为12.0，缺口延伸罚分设为4.0，具有6个核苷酸的窗口。
优选地，这样的序列一致性相关的核酸分子在功能上等效于SEQ ID NO:1中列出的核酸分子。这样的功能等效的核酸分子可以采用衍生物的形式并被认为是功能等效物，前提是它们编码根据本文描述的聚合酶活性测试被认为是功能等效物的多肽。优选的功能等效物是编码上文所记载的优选多肽的那些核酸分子。
多肽分子的序列一致性可以通过使用具有可变的帕姆因子的FASTA pep-cmp的SWISS-PROT蛋白质序列数据库来测定，缺口产生罚分设为12.0，缺口延伸罚分设为4.0，具有2个氨基酸的窗口。优选地，所述比对是针对全长序列进行的，但是，也可以对较小的窗口进行比对，例如，小于600、500、400、300、200、100或50连续氨基酸。
优选地，这样的序列一致性相关的多肽在功能上等效于SEQ ID NO:2中列出的多肽。如此，就可对具有SEQ ID NO:2中列出的序列的多肽进行不影响多肽的序列的修饰。
不影响多肽序列的修饰包括化学修饰，例如去糖基化和糖基化。通过多肽的后期合成/分离修饰，例如特定残基的糖基化和甲基化，来制备这样的多肽，而不会影响特定残基的功能。
如本文所提到，为了实现“功能等效”，多肽在聚合酶活性上可显示出一些相对于母体分子(即多肽所源自的分子，例如通过氨基酸替代)的增加或降低的功效，但是优选地，多肽与母体分子同样有效或更高效。在一些具体实施方式中，在功能等效多肽中，部分原酶活性例如核酸外切酶活性可能会降低或受到抑制。因此，功能等效涉及这样的多肽：其在邻近延伸反应中具有能够延伸核酸结构域的聚合酶活性，但是在室温不具有聚合酶活性或只具有最小聚合酶活性。通过衍生多肽的聚合酶活性相对于其所源自的多肽的比较，以定量方式，来测试等效多肽，如上所述。在本发明的方法中，衍生物优选与母体多肽至少是30％、50％、70％或90％等效的。
与自然发生的蛋白质有关或源自自然发生的蛋白质的功能等效蛋白质，通过一个或多个氨基酸的取代、添加和/或删除(假设它们满足上述序列一致的要求)来修饰天然氨基酸但不破坏分子功能从而获得功能等效蛋白质。优选地，天然序列具有小于20个取代、添加或删除，例如小于10、5、4、3、2或1个这样的修饰。这样的蛋白质由“功能等效核酸分子”编码，其中“功能等效核酸分子”是由一个或多个碱基的适当的取代、添加和/或删除而产生。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明的方法可包括使用具有3’核酸外切酶活性的组分。因此，本发明的方法包括使样品接触具有3’核酸外切酶活性的组分的另外步骤。具有3’核酸外切酶活性的组分在聚合酶之前加入或与之同时加入。在一些具体实施方式中，邻近延伸分析的延伸步骤所用的聚合酶具有3’核酸外切酶活性。
因此，本发明提供了一种检测样品中分析物的方法，包括：
(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；
(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；
(b')使所述样品与具有3’核酸外切酶活性的组分接触；
(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，该步骤可与步骤(b')同时发生或在步骤(b')之后发生，且其中，延伸反应使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于，其在40℃的活性小于其最大酶活性的20％，其中所述聚合酶最大活性的最适温度大于40℃；和
(d)扩增和检测延伸产物。
核酸外切酶是这样起作用的酶：通过在3’端或5’端水解磷酸二酯键从而从多核苷酸链末端一次一个地断裂核苷酸。因此，核酸外切酶作为5’核酸外切酶或3’核酸外切酶而存在，这种命名是参考断裂的起始端，即，3’核酸外切酶沿3’至5’的方向降解核酸分子。已知存在众多类型的核酸外切酶，它们降解DNA和/或RNA并且作用于双链核酸或单链核酸。虽然核酸外切酶可以是截然不同的实体(不同的酶，具有唯一的降解核酸的功能)，例如5’RNA核酸外切酶和来自大肠杆菌的核酸外切酶I，其中，在真核生物和原核生物中都发现了5’RNA核酸外切酶，其用于mRNA的转换，而来自大肠杆菌的核酸外切酶I以3’-5’方向降解单链DNA，很多核酸外切酶活性来自具有多种功能的酶，例如，很多DNA聚合酶也具有3’和/或5’核酸外切酶活性(来自强烈火球菌的Pfu DNA聚合酶)。
因此，用于本发明方法的具有3’核酸外切酶活性的组分包括能够从3’端降解核酸的任何要素。在本发明的优选方面，具有3’核酸外切酶活性的组分优先作用于单链核酸，即，它对单链分子比对双链具有更大的活性，例如，对单链核酸分子具有至少2、3、4、5、10、20、50或100倍活性。
包含核酸外切酶活性的组分必需能够完全地或部分地降解未结合的邻近探针的核酸结构域，未结合的邻近探针即没有结合到靶标分析物的探针，其中，所述核酸结构域具有游离的且未被保护的3’端。如下面所讨论的，邻近探针的核酸结构域可以由能够参与沃森-克里克型或同功碱基对相互作用的任何核苷酸残基所构成。然而，在一些具体实施方式中，其中，核酸结构域包括DNA，具有3’核酸外切酶活性的组分作用于DNA，且优选地，其对DNA具有比对RNA更高的活性，例如，其对DNA具有对RNA的至少2、3、4、5、10、20、50或100倍活性。类似地，在具体实施方式，其中，核酸结构域包括RNA，具有3’核酸外切酶活性的组分作用于RNA，且优选地，其对RNA具有比对DNA更高的活性，例如，其对RNA具有对DNA的至少2、3、4、5、10、20、50或100倍活性。
在本发明的一个方面，具有3’核酸外切酶活性的组分是酶。在特别优选的具体实施方式中，所述酶是同样具有3’核酸外切酶活性的能够延伸核酸分子3’端的核酸聚合酶。特别地，具有3’核酸外切酶活性的组分是选自包括如下物质的组的任一个或多个：强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶以及它们的序列-修饰衍生物或突变体，如上所描述。因此，在一些具体实施方式中，具有3’核酸外切酶活性的组分可以是超嗜热酶，特别是如上定义的具有3’核酸外切酶活性的超嗜热聚合酶。
在其他具体实施方式中，用于邻近探针核酸结构域(和/或夹板寡核苷酸)的延伸的聚合酶活性可以由无3’核酸外切酶活性或具有最小3’核酸外切酶活性的酶，例如Pfu(外切-)DNA聚合酶、Pwo(外切-)DNA聚合酶等来提供，并且，包括3’核酸外切酶组分可以作为独立的实体而被提供，独立的实体例如是具有3’核酸外切酶活性的其它酶。因此，无3’核酸外切酶活性或具有最小3’核酸外切酶活性的聚合酶可以是如上定义的超嗜热聚合酶。在另外的具体实施方式中，可以以多种形式来包括具有3’核酸外切酶活性的组分，即，可以提供多于一种的有3’核酸外切酶活性的组分，例如，作为聚合酶的一部分以及作为具有其主要功能3’核酸外切酶活性的独立的酶。在本发明的一个方面，具有3’核酸外切酶活性的组分是核酸外切酶I。
有利地，在核酸结构域延伸所需的组分即聚合酶之前或与之同时，但是在邻近探针的核酸结构域已相互作用之后，具有3’核酸外切酶活性的组分与样品接触以形成双链体。在该方面，与样品接触时，邻近探针的核酸结构域必需至少是部分单链的，以便在结合到靶标分析物后它们能够相互作用。因此，如果在前述双链体形成之前存在(以活性形式存在)具有3’核酸外切酶活性的组分，那么具有游离且未被保护的3’端的所有邻近探针的核酸结构域将对降解敏感。相反，一旦结合到靶标分析物的邻近探针之间已经形成了双链体，那么只有未结合的邻近探针的核酸结构域可降解。
在具体实施方式中，其中如上所述的聚合酶具有3’核酸外切酶活性，所述聚合酶(即具有3’核酸外切酶活性的组分)可在邻近探针的核酸结构域已相互作用之前接触样品，其中，邻近探针的核酸结构域是在聚合酶具有最小活性或无活性的条件下相互接触的，例如室温或标准环境温度。在这些条件下，具有3’核酸外切酶活性的组分将不会干扰邻近结合的探针的核酸结构域之间的相互作用，因为所述酶是无活性的。
没有结合到靶标分析物的探针不会形成稳定的双链体，并且，虽然它们会与其它未结合探针或样品的其它组分相互作用，但是这些相互作用很可能是短暂的(暂时的)，从而意味着，一旦加入到样品中或被活化(就具有3’核酸外切酶活性的超嗜热聚合酶而言)，这些探针的核酸结构域将是具有3’核酸外切酶活性的组分的可利用的底物。
如果具有3’核酸外切酶活性的组分与样品接触且同时与核酸结构域延伸所需的组分接触，例如其中所述聚合酶具有3’核酸外切酶活性，那么延伸反应和降解反应将同时发生。
如果具有3’核酸外切酶活性的组分在核酸结构域延伸所需的组分之前与样品接触，例如其中具有3’核酸外切酶活性的独立的酶(无实质的或可检测到的聚合酶活性)与样品接触，那么在延伸反应之前，未结合探针的具有游离且未被保护的3’端的核酸结构域将被降解，且具有3’核酸外切酶活性的组分会被灭活(例如，移除、抑制或变性)。然而，在延伸步骤和扩增步骤，3’核酸外切酶活性会被保留。
在一个具体实施方式中，在扩增延伸产物的步骤之前，具有3’核酸外切酶活性的组分是灭活的，以便阻止扩增步骤所需组分的降解。术语“灭活”(inactivated)意思是组分被例如热所抑制、变性或者从样品中物理移除。在该方面，仅3’核酸外切酶活性需要灭活。
例如，其中延伸产物由PCR扩增，标准的未修饰引物(具有游离且未被保护的3’端)是3’核酸外切酶的底物，不能灭活该活性会导致这些PCR试剂的降解从而限制扩增或使扩增无法进行。
在一个优选的具体实施方式中，在样品接触具有3’核酸外切酶活性的组分之前，将扩增反应所用的一些或全部试剂加入到样品。在特别优选的具体实施方式中，在上述步骤(b')和(c)之间，加入所述试剂。可选地，扩增反应所用的一些或全部试剂与具有3’核酸外切酶活性的组分同时加入到样品，即同时地或同步地。
在一个具体实施方式中，以修饰形式提供引物，以便它们具有抗3’核酸外切酶活性。对核酸分子进行修饰或对核酸分子包含的核苷酸进行修饰以阻止核酸外切酶引起的降解，这是本领域公知的，且通常是利用受保护端的，例如3’端的，一个或多个残基的修饰。本发明的方法可以利用适合于抗3’核酸外切酶活性的保护的任何修饰。在该方面，用于本发明的引物优选包含3’端至少一个修饰的核苷酸。例如，所述修饰可选择下述的任一个或多个：硫代磷酸酯-修饰的核苷酸、锁核酸核苷酸(不可进入的RNA核苷酸)、2’-OMe-CE亚磷酰胺修饰的核苷酸，或肽核酸核苷酸。
对于本发明方法中延伸产物的扩增步骤，使用“热起始”引物(描述于Kaboev等人,2000,核酸研究,28(21),e94页(Kaboev et al.,2000,Nuc.Acids Res.,28(21),pp.e94)，其通过引用整体并入本文)是有利的。热起始引物是寡核苷酸引物，其包含依赖于3’端和5’端互补区的茎-环结构。在该方面，将引物设计为与靶序列(延伸产物的特定区域)互补，并且将至少5-6个核苷酸添加到引物的5’端，形成与引物3’端互补的序列。在低温，例如反应的组分进行混合的温度或进行延伸反应的温度，引物形成茎环结构且不能发挥延伸产物扩增的有效引物的作用。然而，在加热至PCR退火温度之后，引物获得了线性结构且能够开始引物延伸(扩增)。据认为，热启动引物的使用可阻止PCR引物对本方法邻近探针之间相互作用的干扰且进一步保护所述引物免受3’核酸外切酶活性的影响。
在本发明的一个特别优选的具体实施方式中，一些或全部反应组分，“反应混合物”，例如邻近探针、聚合酶、扩增试剂和检测试剂，可同时接触或在同一反应容器中接触，以便在不加入任何其它组分的情况下能够产生扩增产物，该扩增产物在样品中靶标分析物存在时是无活性的。因此，可在单一反应容器中，例如反应管中，来准备“反应混合物”，以实现“封闭的”或“封闭管”反应。在这一具体实施方式中，可以通过将反应混合物的温度提高到足以活化聚合酶的温度来开始延伸反应，即以便使核酸双链体的至少一个核酸结构域延伸以生成延伸产物。合适的温度和反应条件在下面进行详细描述，但是其可以是至少35℃，优选至少37℃，例如至少40、45、50、55、60、65、70或75℃。
在一些具体实施方式中，延伸产物的扩增步骤可以在相同的反应容器中进行，即可以修饰反应条件来开始扩增反应，例如PCR。下面描述了合适的PCR条件。在其它具体实施方式中，可以将含有延伸产物的反应混合物的一份转移到新的反应容器中，分析的剩余步骤可在一个或多个分开的反应容器中进行。
在本发明的另一具体实施方式中，一个或多个邻近探针的核酸结构域可作为展开的邻近探针而被提供，其包含偶联至具有至少一个发夹结构的核酸结构域的分析物结合结构域。发夹结构也被称为发夹-环或茎-环，这些术语在本文中可互换使用。发夹是可发生在单链DNA或RNA分子中的分子内碱基配对模式。当同一链的两个区域通过碱基配对形成了双螺旋(双链体)时，发夹发生，其中，沿反方向阅读时所述两个区域在核苷酸序列上通常是互补的，且所述双螺旋(双链体)终止于不配对的环即单链环。可将产生的结构描述为棒棒糖形状(lollipop-shaped)。
在本发明的一个优选的具体实施方式中，一个或多个邻近探针的核酸结构域被提供，以便游离的3’可延伸端能够形成发夹结构。因此，一个或多个邻近探针可提供为展开邻近探针，其中，发夹结构可以是展开的以使核酸结构域的3’端与反应混合物中的其它核酸分子相互作用，如上所述，以便与第二邻近探针的核酸结构域形成双链体，其中所述第二邻近探针结合到与第一、展开邻近探针邻近的靶标分析物上。因此，展开后，(如上定义的)第一和第二邻近探针的核酸结构域互相互补，或与通用模板互补。虽然不希望受理论约束，但是理论认为，使用展开邻近探针可阻止或降低邻近探针之间非特异性/背景相互作用的数目，即，两个邻近探针核酸结构域中的一个或者二者的3’端不能自由地相互作用或者仅是暂时地游离的，那么就不大可能发生邻近探针之间的非特异性相互作用，例如，邻近探针不结合至靶标分析物的相互作用。
在本发明的使用一个或多个展开邻近探针的具体实施方式中，明显的是，对于邻近探针的直接或间接相互作用的核酸结构域而言，一个或多个展开探针的核酸结构域必需是展开的。在一些具体实施方式中，可以设计一个或多个展开邻近探针的核酸结构域的发夹结构，以使发夹结构是不稳定的，如此，在分析的条件下，发夹结构可以随机地由开放形式(展开、线性状态)转变为封闭形式(折叠的发夹状态)。可对发夹结构进行设计以确保邻近探针的核酸结构域之间形成的双链体比发夹结构更稳定。因此，如果一个或多个展开邻近探针的核酸结构域展开在可形成稳定相互作用的核酸的邻近处，例如在结合至靶标分析物的探针的邻近处，那么在反应条件下不易断裂的延伸双链体将形成，即这样的核酸双链体：该双链体中的一个或多个游离3’端可使用该双链体的另一链为模板通过聚合酶来延伸。
在其它具体实施方式中，可将一个或多个展开邻近探针的核酸结构域设计为在其它条件下展开。也可通过将发夹结构的双链元件的至少部分断裂而实现展开。这可以通过改变样品条件而实现，以便发夹结构不再是热力学有利结构，例如，通过改变溶液的温度或盐浓度。因此，在一些具体实施方式中，活化聚合酶所需的温度的提高可有利于展开过程，即，促进开放形式或状态的而非封闭形式或状态的邻近探针。
可选地，通过使发夹结构的双链元件与“抗封闭”寡核苷酸竞争可使发夹结构展开。例如，在高浓度的、与发夹结构的一条链互补的抗封闭寡核苷酸存在的情况下，抗封闭寡核苷酸与邻近探针的核酸结构域之间的相互作用(杂交)强于发夹结构。因此，在本发明的邻近分析中，“抗封闭”寡核苷酸可以是邻近探针的核酸结构域的形式，例如，延伸模板寡核苷酸或夹板寡核苷酸。明显的是，当邻近探针都结合到分析物时，所述探针的核酸结构域以高的局部浓度而有效存在。因此，如果邻近探针的核酸结构域之间的相互作用(杂交)比展开邻近探针的发夹结构的元件之间的相互作用更稳定(热力学有利的)，那么发夹结构将展开以实现邻近探针的核酸结构域之间的相互作用。
在一些优选的具体实施方式中，邻近分析包括一个或多个展开邻近探针。在这样的具体实施方式中，明显的是，这样的展开邻近探针的发夹结构可以在同一反应中以不同的方式来展开，例如，第一展开邻近探针可通过抗封闭寡核苷酸而展开，第二展开邻近探针可通过与另一邻近探针的核酸结构域竞争而展开。例如，展开第一邻近探针可产生引起第二邻近探针的发夹结构断裂的互补区域。
在其它具体实施方式中，一个或多个展开邻近探针可以与“标准”非-展开邻近探针联合使用。在优选的具体实施方式中，这样的标准邻近探针可利用封闭寡核苷酸(如下所进一步描述)来保护(掩饰或遮蔽)所述邻近探针的核酸结构域的反应元件，以便使它们与其它邻近探针的核酸结构域或样品中的其它组分的相互作用最小化。
第一和第二邻近探针的核酸结构域可被视为相互作用以形成可检测的产物的核酸“标记”，可检测所述产物以报告对分析物的检测。因此，核酸结构域可被视为反应核酸官能度，其相互作用以提供信号，借助该信号可检测分析物(更具体地，形成信号-发出的产物)。换言之，核酸结构域可被视为“检测标记”，其相互作用以形成“检测”标记或产物，或者其能够形成检测”标记或产物。当同一样品中存在两个或多个分析物时，可以使用两组或多组邻近探针同时对它们进行检测，其中，将每组邻近探针设计为在相互作用后形成一个或多个唯一的核酸序列延伸产物或“检测标记”。在扩增同时或之后，使用文献中已知的方法分别对这些唯一的“检测标记”进行检测和定量，文献中已知的方法包括液相色谱法、电泳法、质谱分析法、DNA测序、基于微球的以及平面的DNA阵列技术和多色实时PCR。
在优选的具体实施方式中，通过定量PCR(qPCR)来对可检测标记(即延伸产物)进行扩增和检测，定量PCR(qPCR)也称为实时PCR。在特别优选的具体实施方式中，qPCR使用了插入核酸分子以提供检测信号的染料，所述检测信号优选是荧光信号。在本发明中特别有用的荧光插入染料是SYBR和EvaGreenTM，虽然本发明qPCR具体实施方式并不限于这些染料。
在本发明的方法中，第一和第二邻近探针的核酸结构域的一个或两个可被延伸，这会导致可被扩增和检测的新的核酸分子或“延伸产物”的形成。
在一些具体实施方式中，在一个核酸结构域延伸之后，核酸结构域可被连接到一起(即分子间连接)，以产生延伸产物或检测标记，即，使用“夹板”寡核苷酸作为模板由聚合酶“填入”核酸结构域之间的间隙。在核酸结构域被连接的具体实施方式中，这种连接由夹板介导，如上所述，可认为所述夹板是邻近探针之一的核酸结构域的一部分，即，其中核酸结构域是部分双链的。夹板可以作为游离核酸分子而提供，或者夹板可以作为第三邻近探针的核酸结构域而被提供。
所述连接引起可被扩增和检测的新的核酸分子或序列的形成。
在优选的具体实施方式中，本发明的方法不包括连接反应或步骤。更特别地，本发明的方法不包括连接邻近探针的核酸结构域的步骤，例如，本发明不包括分子间连接，即，其中两个或多个核酸分子，例如两个或多个邻近探针的核酸结构域相连接以形成单一核酸分子。然而，在一些具体实施方式中，本发明的方法可包括分子内连接，例如，其中单一邻近探针的核酸结构域(例如，夹板寡核苷酸)(在其已延伸之后)进行连接以形成环状核酸分子，或者，其中锁式探针使用核酸结构域的延伸部分作为连接模板而进行连接。
核酸结构域可以是单链核酸分子(例如，寡核苷酸)，部分双链且部分单链的分子，或者双链分子，所述双链分子包括双链区域和两条核酸链不互补因此是单链的区域。因此，在特定的具体实施方式中，核酸结构域由单链核酸组成。在其它具体实施方式中，核酸结构域可以由两条部分互补的核酸链组成，其中，这两条链包括杂交的区域和未杂交的区域。在其它具体实施方式中，如上所述，核酸结构域可包括发夹结构。
第一和第二邻近探针的核酸结构域必需能够通过杂交而相互作用，即形成一个或多个双链体。这种相互作用可以是直接的，例如，核酸结构域包括彼此互补的区域，优选在它们的3’端(虽然互补区域可以在一个核酸结构域的内部，参见图1的版本2和4)，或者，这种相互作用也可以是间接的，例如，所述第一和第二邻近探针的核酸结构域可以各自与称作“夹板”寡核苷酸的区域杂交。
核酸结构域通常都足够长，以便当结合到靶标分析物(夹板-介导的相互作用)时能与另一邻近探针的核酸结构域相互作用。核酸结构域的长度范围通常是约8个至约1000个核苷酸，其中，在特定的具体实施方式中，它们的长度范围是约8个至约500个核苷酸，包括约8个至约250个核苷酸，例如，约8个至约160个核苷酸，诸如约12个至约150个核苷酸，约14个至约130个核苷酸，约16个至约110个核苷酸，约8个至约90个核苷酸，约12个至约80个核苷酸，约14个至约75个核苷酸，约16个至约70个核苷酸，约16个至约60个核苷酸，等等。在特定的具有代表性的具体实施方式中，核酸结构域的长度范围是约10个至约80个核苷酸，约12个至约75个核苷酸，约14个至约70个核苷酸，约34个至约60个核苷酸，以及上述长度范围间的任何长度。在一些具体实施方式中，核酸结构域的长度通常不大于约28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、65或70个核苷酸。
核酸结构域可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及合成的核苷酸残基组成，所述合成的核苷酸残基能够参与沃森-克里克型或同功碱基对相互作用，即“杂交”或形成“双链体”。因此，核酸结构域可以是DNA或RNA或它们的任何变型，例如PNA或含有非核苷酸主链的其它衍生物。
第一和第二邻近探针的核酸结构域的序列(即“检测”核酸结构域)可以是这样的任何序列：其能够形成双链体且可相对彼此或夹板，如果存在，而被选择。因此，只要第一和第二结构域可以彼此杂交，或杂交至第三核酸结构域(夹板)，那么所述序列就不至关重要。然而，应当对所述序列进行选择，以避免如下杂交事件的发生：没有发生在第一和第二邻近探针的核酸结构域之间的杂交，或者不是与夹板寡核苷酸的核酸结构域发生的杂交。一旦序列被选择或鉴定，就可使用任何便捷的方法来合成核酸结构域。
术语“扩增”(amplifying)或“扩增的”(amplified)在本文中通常用于包括在分析中增加延伸产物或其部分的拷贝数的任何手段，作为指示样品中靶标分析物存在的手段。例如，本领域已知的任何扩增手段都可以用于本发明的方法中，例如，PCR、LCR、RCA、MDA等。根据样品中靶标分析物的丰度，可能需要扩增延伸产物或其部分，以使延伸产物的浓度翻倍，即在扩增前存在的拷贝数的2倍。可选择地，可以优选地使拷贝数增加多个数量级。在一些具体实施方式中，样品中的扩增结果包括了延伸产物或其部分的初始量的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50或75倍。在进一步优选的具体实施方式中，优选地扩增延伸产物以使样品包括延伸产物或其部分的初始量的至少102、103、104、105、106、107、108、109、1010倍。
明显的是，不需要扩增所有延伸产物以确定样品是否包括靶标分析物。仅有必要扩增一部分延伸产物，所述延伸产物在延伸反应发生之前不存在与样品中。例如，延伸产物将有效地包括两部分：含有由邻近探针(或夹板)的核酸结构域构成的核苷酸序列的第一“旧的”部分(现有的部分)，和含有由模板化的延伸反应生成的核苷酸序列的第二“新的”部分(延伸的部分)。对第二“新的”部分或“延伸”的部分的检测使得能够检测靶标分析物，即如果没有分析物，就没有延伸，因此没有“新的”或“延伸的”部分。因此，在本发明优选的方面，扩增延伸产物的步骤包括扩增延伸产物的延伸部分的一部分。
一部分延伸的部分需要具有足够的尺寸以使其可以与存在于样品中的其它序列区分开。实际上，延伸产物的延伸部分的部分充当与靶标分析物的存在相对应的独特的标志物或信号。因此，如果该部分包括了不存在于样品中的核苷酸序列，则该序列的扩增足以指示样品中靶标分析物的存在和定量。
因此，所述部分可以包括至少8个核苷酸，优选至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸。延伸产物的延伸部分的部分长度范围通常是约8个至约1000个核苷酸，其中在特定的具体实施方式中，它们的长度范围是约8个至约500个核苷酸，包括约8个至约250个核苷酸，例如，约8个至约160个核苷酸，诸如约12个至约150个核苷酸，约14个至约130个核苷酸，约16个至约110个核苷酸，约8个至约90个核苷酸，约12个至约80个核苷酸，约14个至约75个核苷酸，约16个至约70个核苷酸，约16个至约60个核苷酸，等等。在特定的具有代表性的具体实施方式中，延伸产物的延伸部分的长度范围是约10个至约80个核苷酸，约12个至约75个核苷酸，约14个至约70个核苷酸，约34个至约60个核苷酸，以及上述长度范围间的任何长度。
虽然设想的是可以扩增整个延伸产物，即现有的和延伸的部分，但扩增产物包括延伸产物的延伸部分的至少一部分就足够了。在本发明的一个方面，引物可以设计成在延伸产物的延伸部分的部分的任一侧，并且可以如下所描述的来检测例如通过PCR进行的该部分的扩增，和扩增产物(包括延伸产物的部分)。在本发明的另一个方面，延伸产物的延伸部分的部分可以形成用于连接例如锁式探针的(如本文别处所述的)模板以形成环状寡核苷酸，并且该序列的扩增，例如通过滚环扩增(RCA)进行的该序列的扩增会产生包括与延伸产物的延伸部分的部分相对应的序列的多个拷贝而得到扩增产物。因此，以这种方式可以扩增延伸产物，或更具体地扩增其部分。可选地或另外地，延伸产物的延伸部分的部分可以充当用于环状寡核苷酸的RCA的引物，所述寡核苷酸包括与延伸产物的延伸部分互补的序列。如上所述，得到的产物会包括与延伸产物的延伸部分的部分相对应的序列的多个拷贝，如下所述，可以对其进行检测。因此，在该具体实施方式中，也扩增了延伸产物，或更具体地扩增了其部分。
在“夹板”寡核苷酸被延伸的具体实施方式中，所述延伸的寡核苷酸可以被环化(即分子内连接)以提供用于扩增的模板，优选用于滚环扩增的模板。在这些具体实施方式中，延伸的寡核苷酸的3’端(延伸端)连接于延伸的寡核苷酸的5’端(非延伸端)，其中所述连接可以由任何合适的手段来介导，如本文别处所描述的。在特别优选的具体实施方式中，连接反应是模板化的连接，其中，延伸的寡核苷酸的3’端和5’端通过杂交于核酸分子而彼此邻近，所述核酸分子例如是加入到反应中以便在延伸的寡核苷酸的3’端和5’端之间充当“夹板”或“分子桥”的寡核苷酸(如本文别处所述)。当延伸的寡核苷酸的末端与“夹板”核酸分子杂交时，末端可以连接，例如通过连接酶的活性连接，以形成含有延伸产物的延伸部分的环状寡核苷酸。因此，所述环状寡核苷酸的扩增，例如通过滚环扩增的扩增，导致延伸产物的扩增。在这种情况下，扩增产物包括与延伸产物的延伸部分互补的序列。因此，环化的寡核苷酸的扩增导致延伸产物的间接扩增。
从上文显而易见的是，延伸产物的延伸部分仅需要包括相对少量的核苷酸。此外，延伸产物的最大尺寸将取决于邻近探针的核酸结构域和/或充当用于延伸产物的模板的夹板寡核苷酸(如下所定义)的尺寸。延伸产物可以由核酸结构域和/或夹板寡核苷酸的全部或部分延伸而产生，即，延伸反应可以产生延伸到模板核酸的末端的延伸产物，或延伸反应可以使用条件以使延伸产物仅为模板核酸的部分互补链。
术语“检测”(detecting)或“检测”(detected)广泛地用于本文中，包括测定分析物存在(即，其存在与否)的任何手段或测量分析物的任意形式。在本发明的方法中，通过扩增延伸产物(其包括扩增基于或来自延伸产物或使用延伸产物生成的产物)并检测所述扩增产物来间接地检测分析物。因此，检测分析物相当于检测上述定义的扩增产物，并且这些术语在本文中可互换使用。
因此，“检测”(detecting)可以包括以任何方式测定、测量、评估或分析分析物的存在或不存在或量或位置。包括了定量和定性测定、测量或评估，包括半定量。这样的测定、测量或评估可以是相对的，例如当样品中的两种或多种不同的分析物被检测时，或者这样的测定、测量或评估也可以是绝对的。因此，当用于定量样品中的靶标分析物(或多种靶标分析物)的情况下，术语“定量”是指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包括已知浓度(或多个浓度)的一种或多种对照分析物和/或将靶标分析物的检测水平与对照分析物进行对照(例如，通过生成标准曲线)来实现。可选地，相对定量可以通过比较两种或多种不同的靶标分析物的检测水平或量以提供两种或多种不同的靶标分析物中每个的相对定量，即相对于彼此的量，来实现。
“分析物”可以是想要通过本发明的方法检测的任何物质(例如分子)或实体。分析物是本发明的分析方法的“靶标”。因此，分析物可以是希望检测的任何生物分子或化学化合物，例如，肽或蛋白质，或者核酸分子或小分子，包括有机分子和无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或者其片段或其产物。因此，可以看出分析物可以是可形成特异性结合伴侣(例如，亲和结合伴侣)的任何物质或实体。所有要求的是，分析物能够同时结合至少两个结合伴侣(更具体地，至少两个邻近探针的分析物结合结构域)。基于邻近探针的分析，如本发明的分析，在蛋白质或多肽的检测中是特别有用的。因此，令人特别感兴趣的分析物可以包括蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或者朊病毒或者包括蛋白质或多肽组分的任何分子，等等，或者它们的片段。在本发明特别优选的具体实施方式中，分析物完全地或部分地是蛋白质分子。分析物可以是含有两个或多个分子亚基的单一分子或复合物，所述亚基可以或可以不彼此共价结合，并且可以是相同的或不同的。因此，除了细胞或微生物，这样的复合物分析物也可以是蛋白质复合物。因此，这样的复合物可以是均多聚体或杂多聚体。例如蛋白质的分子的聚集体也可以是靶标分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是蛋白质或肽与诸如DNA或RNA的核酸分子之间的复合物。令人特别感兴趣的是蛋白质与核酸之间的相互作用，例如，调节因子，诸如转录因子和DNA或RNA。
包括所有的生物和临床样品，例如生物体的任何细胞或组织样品，或者任何体液或来自其的制剂，以及诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等的样品。环境样品也包括在内，例如，土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的，或者它们可以是以任何便捷的方式被前处理过的，例如用于储存。
因此，代表性的样品包括任何材料，所述材料可以含有生物分子，或任意其它希望的分析物或靶标分析物，包括例如食物和有关产品、临床样品和环境样品。样品可以是生物样品，所述生物样品可以含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。因此，这样的生物材料可以包括所有类型的哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻的藻类、真菌、细菌、原生动物等。因此，代表性的样品包括全血和血衍生物产品、尿液、粪便、脑脊液或任何其它液体(例如，呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活体组织切片、细胞培养物、细胞混悬液、条件培养基或细胞培养物成分的其它样品等，其中所述全血和血衍生物产品诸如是血浆、血清、白细胞层、血细胞。可以按照任何便捷或理想的方式对样品进行预处理以制备用于本发明的方法中，例如，通过细胞裂解或分析物的纯化、分离等。
用于本发明方法的邻近探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并且实际上，它们是(通过分析物结合结构域)结合于分析物的检测探针，可以通过在这样的结合后检测其核酸结构域之间发生的相互作用来检测所述检测探针的结合(以检测分析物)。因此，可以将探针视为核酸标记的亲和配体或针对分析物的结合伴侣，所述分析物结合结构域是亲和结合伴侣，并且核酸结构域是核酸标记。核酸结构域偶联于分析物结合结构域，并且该“偶联”或连接可以采用本领域已知的任何手段，且其可以是所希望的或便捷的，可以是直接的或间接的，例如通过连接基团。例如，结构域可以通过共价连接(例如化学交联)或通过非共价结合来彼此相连，例如，通过基于链酶亲和素-生物素的偶联(在一个结构域上提供生物素，在另一个结构域上提供链酶亲和素)。
分析物结合结构域可以是针对靶标分析物的任何结合伴侣，并且可以是针对其的直接或间接结合伴侣。因此，它可以直接结合于靶标分析物，或通过中间分子或结合于靶标分析物的结合伴侣来间接地结合于靶标分析物，所述分析物结合结构域结合于所述中间分子(结合伴侣)。特别地，分析物结合结构域或中间结合伴侣是针对分析物的特异性结合伴侣。结合伴侣是能够与其靶标结合的任意分子或实体，所述靶标例如是靶标分析物，并且，特异性结合伴侣是能够特异性结合于其靶标(例如靶标分析物)的结合伴侣，即结合伴侣以比样品中其它组分更高的亲和力和/或特异性而结合于靶标(例如分析物)。因此，与靶标分析物的结合可以区别于非靶标分析物；特异性结合伴侣不结合于非靶标分析物或可忽略地或不可检测地结合于非靶标分析物，或者任何这样的非特异性结合，如果发生的话，就可被区分。靶标分析物及其结合伴侣之间的结合通常是非共价的。
可以选择分析物结合结构域以具有针对靶标分析物的高的结合亲和力。高的结合亲和力是指至少约10-4M，通常至少约10-4M或更高，例如10-9M或更高。分析物结合结构域可以是多种不同类型的分子的任一种，只要它在作为邻近探针的部分存在时显示针对靶标蛋白的所需的结合亲和力。在其它具体实施方式中，分析物结合结构域可以是对其靶标分析物具有中等或甚至低亲和力的配体，例如，小于约10-4M。
分析物结合结构域可以是小分子配体或大分子配体。小分子配体是指尺寸为约50至约10,000道尔顿的配体，通常为约50至约5,000道尔顿，更通常地为约100至约1000道尔顿。大分子配体是指尺寸为约10,000道尔顿或分子量更大的配体。
小分子可以是能够以需要的亲和力结合于靶标分析物的任何分子，以及它们的结合部分或片段。一般地，小分子是能够结合于感兴趣的靶标分析物的有机小分子。小分子会包括与靶标分析物结构相互作用所必需的一个或多个官能团，例如疏水、亲水、静电或甚至共价相互作用所需的基团。当靶标分析物是蛋白质时，小分子配体包括与蛋白质在结构上相互作用所需的官能团，如氢键、疏水-疏水相互作用、静电相互作用等，并通常包括至少一个氨基、酰胺基、巯基、羰基、羟基或羧基，优选地至少两个化学官能团。小分子还可以包括一个这样的区域：其可以被修饰和/或参与邻近探针的核酸结构域的共价连接，而基本没有不利地影响小分子结合于其靶标分析物的能力。
小分子亲和配体通常包括被一个或多个上述官能团取代的碳环或杂环结构和/或芳香或聚芳香结构。此外，令人感兴趣的小分子还是在生物分子中发现的结构，它们的衍生物、结构类似物或组合，其中在生物分子中发现的结构包括肽、多糖、脂肪酸、甾体、嘌呤、嘧啶。可以对这样的化合物进行筛选以确定感兴趣的化合物，其中多种不同的筛选方案在本领域是已知的。
小分子可以来自由多种来源获得的天然存在或合成的化合物，包括合成或天然化合物库。例如，可以使用许多方法来随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化的制备寡核苷酸和寡肽。可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可得的或容易制备的。此外，天然或合成制备的库和化合物容易通过传统的化学、物理和生物化学手段修饰，并且可以用于制备组合库。已知的小分子可以进行定向或随机的化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
如此，所述的小分子可以从天然存在或合成分子库中获得，所述的库包括通过组合手段制备的化合物库，即化合物多样性组合库。当从这样的库中获得时，在便捷的结合亲和力分析中采用的小分子会显示对蛋白质靶标具有某些理想的亲和力。组合库及其制备和筛选方法是本领域已知的，并描述于下述美国专利文献中：US5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，这些专利文献通过引用整体并入本文。
分析物结合结构域也可以是大分子。特别令人感兴趣的大分子分析物结合结构域是抗体，及其结合片段和衍生物或其模拟物。当抗体是分析物结合结构域时，它们可以来自多克隆组合物，以使通过从特异性上进行区分的抗体的异种群体各自“标记”相同的标记核酸(核酸结构域)，或它们可以来自单克隆组合物，其中对靶标分析物具有相同特异性的相同抗体的同种群体各自标记相同的标记核酸。因此，分析物结合结构域可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在其它具体实施方式中，亲和配体是抗体结合片段或其衍生物或其模拟物，其中这些片段、衍生物和模拟物对靶标分析物具有所需要的结合亲和力。例如，抗体片段，诸如Fv、F(ab)2和Fab，可以通过裂解完整蛋白质来制备，例如，通过蛋白酶或化学裂解来进行裂解。令人感兴趣的还有重组地或合成地制备的抗体片段或衍生物，诸如单链抗体或scFvs，或者其它抗体衍生物诸如嵌合抗体或CDR-接枝的抗体，其中该重组地或合成地制备的抗体片段保留了上述抗体的结合特性。这样的抗体片段或衍生物通常至少包括抗体的VH和VL结构域，以保留主体抗体的结合特性。本发明的这样的抗体片段、衍生物或模拟物可以使用任何便捷的方法制备，诸如在美国专利第5,851,829号和第5,965,371号中公开的方法；这些专利通过引用整体并入本文。
上面描述的抗体、其片段、衍生物和其模拟物可以由商业来源获得和/或使用任何便利的技术制备，其中制备多克隆抗体，单克隆抗体，它们的片段、衍生物和模拟物的方法，包括制备它们的重组衍生物的方法，是本领域技术人员已知的。
此外，适合用作结合结构域的是多聚核酸适体。多聚核酸适体可以是RNA寡核苷酸，其作用是以与受体或抗体相同的方式选择性地结合蛋白质(Conrad等人,酶学方法.(1996),267(组合化学),336-367)(Conrad et al.,Methods Enzymol.(1996),267(Combinatorial Chemistry),336-367)。在分析物结合结构域是例如适体的核酸的特定具体实施方式中，靶标分析物并不是核酸。
重要的是，分析物结合结构域是包括如下部分的结构域：该部分能够共价连接于核酸分子结构域而基本不消除分析物结合结构域对其靶标分析物的结合亲和力。
除了基于抗体的肽/多肽或基于蛋白质的结合结构域，分析物结合结构域也可以是凝集素，可溶性的细胞表面受体或其衍生物，亲和体或来自如下的任意组合衍生的蛋白质或肽：噬菌体展示或核糖体展示或任何类型的组合肽或蛋白质库。可以使用任意分析物结合结构域的组合。
分析物上的结合位点可以是相同的或不同的，所述结合位点是针对一组中的邻近探针的各分析物结合结构域的。因此，例如在同聚蛋白质复合物或聚集物包括两种或多种相同的亚基或蛋白质组分的情况下，两个或多个探针的分析物结合结构域可以是相同的。当分析物为单一分子或包括不同的亚基或组分时(例如，异聚复合物或不同蛋白质聚集体)，分析物结合结构域是不同的。
由于邻近探针的核酸结构域的长度可以构建成跨越不同的分子距离，分析物上的针对分析物结合结构域的结合位点不需要在相同的分子上。它们可以在不同的但是紧挨着的分子上。例如，可以通过本发明的方法靶向生物体的多个结合结构域，所述生物体例如是细菌或细胞，或病毒。
如上所述，分析物结合结构域可以直接或间接地结合于分析物上。在间接结合的情况下，靶标分析物可以首先被特异性结合伴侣(或亲和配体)所结合，并且邻近探针的分析物结合结构域可以结合于特异性结合伴侣。这使得邻近探针能够作为通用试剂来设计。例如，分析物特异性结合伴侣可以是抗体，并且通用邻近探针可以通过结合于各种不同的分析物特异性抗体的Fc区域而用于检测不同的分析物。
邻近探针的两个组分通过键直接地连接在一起或通过连接基团间接地连接在一起。当采用连接基团时，可以选择这样的基团以提供核酸和分析物结合结构域通过连接基团进行共价连接，以及维持分析物结合结构域对其靶标分析物理想的结合亲和力。令人感兴趣的连接基团可以根据分析物结合结构域而有很大不同。在很多具体实施方式中，当连接基团存在时，其是生物惰性的。各种连接基团是本领域技术人员已知的，并且在所述邻近探针中是有用的。在具有代表性的具体实施方式中，连接基团通常为至少约50道尔顿，通常为至少约100道尔顿，并且可以是1000道尔顿或更大，例如，如果连接基团含有间隔子(spacer)那么可高达1000000道尔顿，但是通常不会超过约500道尔顿且通常不超过约300道尔顿。通常地，这样的连接物包括间隔子基团，该基团在任一端以能够共价结合于核酸或分析物结合部分的反应官能团封端。令人感兴趣的间隔子基团可以包括脂肪族和不饱和的烃链、含有杂原子如氧(醚，如聚乙二醇)或氮(多胺)的间隔子、肽、糖类、可以含有杂原子的环状或非环状系统。间隔子基团也可以包含结合于金属的配体，以使金属离子与两个或多个配体配位以形成复合物。特异性的间隔子元件包括：1,4-二氨基己烷，苯二甲撑二胺，对苯二甲酸，3,6-二氧杂辛烷二酸，乙二胺-N,N-二乙酸，1,1’-亚乙基双(5-氧代-3-吡咯烷羧酸),4,4’-亚乙基二哌啶。可能的反应官能团包括亲核官能团(胺、醇、硫醇、酰肼)，亲电官能团(醛、酯、乙烯基酮、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺)，能够环加成反应、形成二硫键或者结合于金属的官能团。具体的例子包括伯胺和仲胺，异羟肟酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯，氧基羰基咪唑，硝基苯基酯，三氟乙基酯，缩水甘油醚，乙烯基砜和马来酰亚胺。可用于所述邻近探针的具体的连接基团包括杂官能化合物，诸如叠氮苯甲酰肼、N-[4-(对叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、双-磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、二亚胺代己二酸二甲酯、二琥珀酰亚胺酒石酸酯、N-马来酰亚胺丁酰基氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亚氨基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)以及类似的物质。
可以使用任何便捷的方法来制备本发明的方法所采用的邻近探针。在具有代表性的具体实施方式中，核酸结构域可以直接或通过连接基团缀合于分析物结合结构域。如本领域已知的，可以通过官能团而将组分彼此共价连接，其中，这样的官能团可以存在于组分上或使用一个或多个步骤而被引入到组分中，所述步骤例如是氧化反应、还原反应、裂解反应等。可用于将组分共价连接到一起以产生邻近探针的官能团包括：羟基、巯基、氨基等。经修饰以提供用于共价连接的不同组分的具体部分可以经选择以便于基本上不会不利地干扰组分对靶标分析物所需的结合亲和力。如果必要和/或需要的话，可以使用如本领域已知的封闭基团来保护组分的某些部分，参见例如Green和Wuts著，有机合成中的保护基团(John Wiley&Sons出版社)(1991)(Green&Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis(John Wiley&Sons)(1991))。用于产生核酸/抗体缀合物的方法对本领域技术人员是众所周知的。参见美国专利第5,733,523号，其通过引用而整体并入本文。
在其它具体实施方式中，可以使用产生核酸-蛋白质缀合物的体外方法来制备邻近探针，所述核酸-蛋白质缀合物即具有共价连接至蛋白质的核酸的分子，例如编码序列，即其中通过载体在体外产生编码邻近探针的分析物结合结构域。这样的令人感兴趣的体外方法包括：基于RepA的方法(参见Fitzgerald,药物发现.今天(2000)5:253-258(Fitzgerald,Drug Discov.Today(2000)5:253-258)和国际专利WO98/37186)，基于核糖体展示的方法(参见Hanes等人,美国科学院院刊(1997)94:4937-42(Hanes et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA(1997)94:4937-42)；Roberts,生物化学当代观点(1999)六月；3:268-73(Roberts,Curr Opin Chem Biol(1999)Jun；3:268-73)；Schaffitzel等人,免疫学方法杂志(1999)十二月10；231:119-35(Schaffitzel et al.,J Immunol Methods(1999)Dec10；231:119-35)；和国际专利WO98/54312)等。
在利用夹板寡核苷酸(其可以是第三邻近探针的核酸结构域)的具体实施方式中，所述夹板寡核苷酸的功能是介导第一和第二邻近探针的核酸结构域(即“检测”结构域)之间的相互作用。如上所述，夹板寡核苷酸也可充当待延伸的的核酸结构域，产生延伸产物以根据本发明方法而被扩增和检测。因此，夹板可以视为“连接者”(connector)寡核苷酸，其作用是使第一和第二邻近探针的检测结构域进行连接或“结合在一起”，如此，它们可相互作用或可连接在一起。可选地，本发明的方法并不包括连接反应或步骤，特别是分子间连接，即，其中，第一和第二邻近探针的核酸结构域是连接在一起的。可选地或另外地，夹板可以视为核酸结构域或标记的可延伸的结构域，或者单独的核酸结构域，其充当用于延伸的“引物”以生成用于扩增和检测的延伸产物。
在这些具体实施方式中，夹板与第一和第二邻近探针的核酸结构域杂交。更具体地，夹板同时与至少第一和第二邻近探针的核酸结构域杂交(退火)。然而，其中，将“夹板”寡核苷酸预杂交至至少一个所述邻近探针的核酸结构域，它先与一个邻近探针的核酸结构域杂交，再与另一个杂交。然而，优选地，“夹板”将与两个邻近探针的核酸结构域同时杂交以形成能够被延伸的稳定复合物。
当夹板寡核苷酸作为第三邻近探针的核酸结构域提供时，所有邻近探针组的核酸结构域的这种相互杂交提高了结合于靶标分析物后的探针-靶标复合物的亲和力。通过支持产生信号的邻近探针-靶标分析物复合物的形成，该亲和力的影响有助于提高分析的灵敏性。
本文所用的术语“杂交(hybridisation)”和“杂交(hybridise)”是指核苷酸序列之间的双链体的形成，所述核苷酸序列足够互补以通过沃森-克里克碱基配对来形成双链体。当两个核苷酸序列具有碱基配对组织同源性时，两个核苷酸序列彼此“互补”。“互补”的核苷酸序列在合适的杂交条件下将特异性地结合以形成稳定的双链体。例如，当第一序列的一部分可以按照反式平行的方式结合于第二序列的一部分时，两个序列是互补的，其中每个序列的3’端结合于另一个序列的5’端，并且一个序列的每个A、T(U)、G和C与另一个序列的T(U)、A、C和G分别配对。RNA序列也可以包括互补的A＝U或U＝A碱基对。因此，在本发明中，两个序列不需要为了“互补”而具有完美的同源性。通常当至少约80％(优选至少约90％，且最优选至少约95％)的核苷酸在限定长度的分子或结构域上具有确定互补的碱基对组织时，两个序列是充分互补的。因此，第一和第二邻近探针的核酸结构域含有对另一个邻近探针的核酸结构域互补的区域。可选地，当使用夹板寡核苷酸时，第一和第二邻近探针含有与夹板寡核苷酸(可能存在于第三邻近探针上)互补的区域，反过来说，夹板寡核苷酸含有对第一和第二邻近探针的每个核酸结构域互补的区域。
互补的区域(即，杂交区域)的长度范围是4-30bp，例如6-20、6-18、7-15或8-12bp。
夹板核苷酸的长度通常足以提供第一和第二探针的核酸结构域进行如上文所述的同时结合。在具有代表性的具体实施方式中，夹板寡核苷酸的长度范围是约6至约500个核苷酸，包括约20至约40个核苷酸，例如约25至约30个核苷酸。
如上所述，第一和第二邻近探针的核酸结构域之间的相互作用主要是双链体的形成，其中，核酸结构域的一个或两个都可以被延伸，特别是使用另一个邻近探针的核酸结构域作为模板进行模板导向的延伸。这会导致形成完全双链的核酸，例如其中两个结构域完全延伸，或导致形成部分双链的分子，例如仅有一条单链延伸或两条链部分的延伸。因此，一个或两个核酸结构域的延伸可以被认为是各自结构域的“接合”，例如，由两条单链的分子产生一个双链核酸。
在其它具体实施方式中，该“接合”可以是连接，特别地，其中，例如，第一邻近探针的核酸结构域被延伸以使其3’端与第二邻近探针的5’端邻近，以使得两个结构域模板导向连接，即分子间连接。在这种情况下，可清楚理解的是，连接模板可以由夹板提供，所述夹板可以形成核酸结构域之一的部分，或可以在溶液中分别游离地被提供，或作为第三邻近探针的核酸结构域提供。这样的连接可以使用连接酶进行，所述连接酶可以在聚合酶介导的第一邻近探针的核酸结构域的延伸之后加入反应中。
因此，在本发明方法的优选的具体实施方式中，第一和第二探针的核酸结构域可以借助这样的反应而连接：该反应由杂交的夹板而被模板化，使所述核酸结构域连接(在其中一个核酸结构域延伸后)，并且对“连接”产物进行扩增和检测，所述“连接”产物也是延伸产物。因此，在这样的具体实施方式中，夹板可以视为“夹板模板”或“连接模板”或“夹板寡核苷酸”。在这样的具体实施方式中，还可以延伸夹板以产生另外的“延伸产物”，对所述“延伸产物”进行扩增和检测。
在一些具体实施方式中，本发明的方法不包括连接步骤或反应。更具体地，本发明不包括分子间连接。
如上所述，为了使核酸结构域之间发生各种相互作用，第一和第二邻近探针的核酸结构域需要按照特定的方向来偶联到分析物结合结构域上。例如，为了延伸两个包括单链核酸的结构域，每个核酸结构域必须通过其5’端偶联到分析物结合结构域，留下游离的3’羟基端，当邻近时，所述3’羟基端可以“退火”或“杂交”。然而，为了单一结构域的延伸和/或两个结构域的缀合，通常(虽然不是必须的，参见图1的版本4)通过5’端偶联第一邻近探针的核酸结构域(留下可以被延伸的游离的3’羟基端)，而另外的结构域可以通过其3’端偶联(留下游离的5’磷酸酯端，其不能使用传统聚合酶来延伸)。
在核酸结构域是可连接的具体实施方式中，第一和第二核酸结构域各自杂交于夹板或其中一个邻近探针的核酸结构域是部分双链的，其具有单链突出段，另一个邻近探针的核酸结构域杂交于该突出段的结构域。随后可以将具有3’端的结构域通过模板导向的延伸来延伸至另一个结构域的5’磷酸酯，其中可以利用连接酶将两条链结合在一起。因此，3’和5’端不立即在各自彼此邻近地在夹板(模板)上杂交，而是杂交于夹板，在它们之间留下空间(或一段核苷酸)。
两端之间的间隔或空间或一段核苷酸的长度范围是约8至约1000个核苷酸，其中，在特定的具体实施方式中，长度范围是约8至约500个核苷酸，包括约8至约250个核苷酸，例如约8至约160个核苷酸，诸如约12至约150个核苷酸，约14至约130个核苷酸，约16至约110个核苷酸，约8至约90个核苷酸，约12至约80个核苷酸，约14至约75个核苷酸，约16至约70个核苷酸，约16至约60个核苷酸，等等。在特定的代表性具体实施方式中，核酸结构域的长度范围是约10至约80个核苷酸，约12至约75个核苷酸，约14至约70个核苷酸，约34至约60个核苷酸，和以及上述长度范围间的任何长度。在一些具体实施方式中，核酸结构域的长度通常不超过约28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、46、50、55、60、65或70个核苷酸。
因此，夹板可以包括与5’游离邻近探针的核酸结构域互补的第一3’区域，和与3’游离邻近探针的核酸结构域互补的第二5’区域。夹板的第一和第二区域的长度可以是3至20，6至17，6至15或6至12或8至12个核苷酸，例如，约13至17，12至16，11至15或12至14个核苷酸，或者约6至12，7至11或8至10个核苷酸。
如以下将更详细地描述的，连接/延伸产物的扩增在检测过程之前或与检测过程同时进行。因此，在一些具体实施方式中，所希望的是，设计夹板以尽量减少在这样的步骤中可能发生的任何假扩增，例如，夹板充当扩增中使用的聚合酶的模板的任何可能性。因此，例如，夹板可以作为RNA寡核苷酸或DNA/RNA杂交体而被提供；通常用于扩增反应的聚合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶，不能使用RNA模板。可选地，使用具有两个短杂交区域的DNA夹板可实现类似的效果；由于杂交是弱的，因此这样的夹板将不能在PCR所使用的高温条件下模板化DNA聚合反应。
可选地，在其它优选的具体实施方式中，使夹板有利地延伸以产生如上所定义的延伸产物，根据本发明的方法对该延伸产物自身进行扩增与检测。
在特定的具体实施方式中，可针对两种或多种不同的靶标分析物来分析样品。在这样的具体实施方式中，针对每个靶标分析物，使样品接触一组邻近探针，如此，与样品接触的组的数目会是两组或多组，例如，三组或多组，四组或多组等。这样的方法在多重的或高通量的应用中是特别有用。
可以选择加入到样品中的邻近探针的量用以提供反应混合物中足够低浓度的邻近探针，以便确保邻近探针在没有结合到靶标分析物时将不会随机地彼此紧密邻近，至少不会达到紧密邻近到任何大的或实质的程度。因此，目的是，仅当邻近探针通过邻近探针的分析物结合结构域与分析物的结合位点之间的结合相互反应而结合分析物时，邻近探针彼此紧密邻近。
然而，已经令人吃惊地发现，加入室温下无活性或具有最小活性的聚合酶可以减少未结合于靶标分析物的邻近探针之间的相互作用所产生的延伸产物的数目，这可能是暂时的。在这方面，在聚合酶存在的情况下，在聚合酶无活性或具有最小活性的条件下，邻近探针可以相互作用。因此，不需要例如通过加入其它组分，来打破反应混合物的平衡，以提供聚合酶活性，并且聚合酶可优先与稳定的双链体结合，所述稳定的双链体即结合于靶标分析物的邻近探针的核酸结构域之间形成的双链体。因此，在本发明的方法中，有可能使用之前在基于邻近的检测分析中不能使用的邻近探针的浓度。当邻近探针的分析物结合结构域对靶标分析物具有中度或低亲和力时，这是特别有利的，并且因此在更高的浓度下需要如此。
已经发现了其它预料之外的优点，其中分析也包括具有3’核酸外切酶活性的组分，例如也具有3’核酸外切酶活性的在室温下无活性或具有最小活性的聚合酶。据认为，通过降解具有游离且未受保护的3’端的核酸结构域，可以减少未结合于靶标分析物的邻近探针的相互作用的数目。在这方面，这样的相互作用不如结合于靶标分析物的探针之间的相互作用稳定，因此是暂时的。因此，通过具有3’核酸外切酶活性的组分对所述未结合的邻近探针进行降解。因此，在本发明的方法中，有可能使用之前在基于邻近的检测分析中不能使用的邻近探针的浓度。当邻近探针的分析物结合结构域对靶标分析物具有中度或低亲和力时，这是特别有利的，并且因此在更高的浓度下需要如此。
在本发明方法的具体实施方式中，还发现了其它的优点，其中，一个或多个邻近探针是展开邻近探针，包含具有发夹结构的核酸结构域。可以相信的是，展开邻近探针也可减少未结合于靶标分析物的邻近探针之间的相互作用的数目。只在稳定的条件下，例如当两个探针都结合于靶标分析物时，展开邻近探针的核酸结构域可与其它邻近探针的核酸结构域相互作用。因此，使用展开邻近探针也使得有可能使用之前在基于邻近的检测分析中不能使用的邻近探针的浓度。如上所述，当邻近探针的分析物结合结构域对靶标分析物具有中度或低亲和力时，这是特别有利的，并且因此在更高的浓度下需要如此。
在具有代表性的具体实施方式中，在与样品组合后，反应混合物中的邻近探针的浓度范围是约1fM至1μM，诸如约1pM至约1nM，包括约1pM至约100nM。
在样品和邻近探针组进行组合后，如果分析物存在于样品中，可以将反应混合物培养一段时间，该时间足够使邻近探针结合靶标分析物。在代表性的具体实施方式中，可以在约4℃至约50℃，优选约4℃至约40℃，包括约20℃至约37℃的温度下，将产物混合物(反应混合物或分析混合物)培养约5分钟至约48小时的一段时间，包括约30分钟至约12小时。反应混合物维持的条件应进行优化以促进邻近探针与分析物的特异性结合，同时抑制非特异性相互作用。条件应使得在上述的核酸结构域之间能有效的和特异的杂交。
在邻近探针在上述聚合酶存在下进行培养的具体实施方式中，在使聚合酶活性最小化的条件下，将聚合酶加入反应混合物中，和/或，培养反应混合物。因此，在一些具体实施方式中，在低于40℃的温度下，优选低于35℃或30℃的温度下，加入聚合酶，和/或，培养反应混合物。在特别优选的具体实施方式中，在室温或更低的条件下，即25℃或更低，例如24、23、21、20℃或更低，培养包含聚合酶的反应混合物。
在一些具体实施方式中，邻近探针是冻干的。在本发明的一个方面，所述冻干的邻近探针在接触含分析物的样品之前是再水化的。在本发明的一个优选的方面，冻干邻近探针在加入含靶标分析物的样品时是在水化的。
在特定的具体实施方式中，至少在邻近探针结合于靶标分析物的培养步骤期间，减小培养混合物的有效体积，假设靶标分析物存在于样品中。在这些具体实施方式中，可出于多种原因而减小培养混合物的有效体积。在特定的具体实施方式中，减小培养混合物的有效体积以使用中度或低亲和力分析物结合结构域和/或提高分析的敏感性。例如，在一些特定的具体实施方式中，当培养混合物的有效体积减小时，分析物结合结构域可以是中度或低亲和力结合剂，借此意味着分析物结合结构域对它们的靶标分析物的亲和力小于约10-4M，诸如约1nM Kd。在特定的具体实施方式中，可以提高分析的灵敏度，以便分析可以检测1μl样品中少至约100个或更少的靶标分析物，包括1μl样品中少至约75个或更少的靶标分析物，包括1μl样品中少至约50个或更少的靶标分析物。
在特定具体实施方式中，在上述培养步骤的过程中，在混合物中包括“加浓试剂”或“体积排阻剂”，例如，用来在邻近探针与其靶标分析物结合的过程中降低培养混合物的有效体积。典型地，“加浓试剂”是水溶性的大分子材料。适合的大分子材料广泛地包括平均分子量为约1500至几百万的生物相容的天然或合成聚合物，所述聚合物不与混合物中的其它试剂或产物特异性地相互作用。这样的聚合物在本领域中称为“体积排阻剂”，因为其主要功能是占据体外反应介质中的体积并为生化反应提供高度浓缩的环境，例如接近于体内条件的环境。体积排阻聚合物当然必须足够可溶以提供所需的浓度。合适的典型聚合物包括但不限于：市售的聚乙二醇(PEG)，例如具有高于约2000的平均分子量的聚乙二醇聚合物，FICOLL聚合物如具有约70,000的平均分子量的那些，牛血浆白蛋白，糖原，聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖，例如交联葡聚糖等等。在具有代表性的具体实施方式中，采用了更高分子量的PEG聚合物，特别是分别具有约1450、3000-3700、6000-7500和15,000-20,000的平均分子量的PEG1450、PEG3350、PEG6000(也作为PEG8000出售)和PEG20,000。具有代表性的具体实施方式中采用了PEG6000和PEG8000。在具有代表性的具体实施方式中，培养反应中的体积排阻聚合物的浓度根据聚合物的类型及其分子量落入约5％w/v至约45％w/v的范围。一般地，所希望的是，给定类型的更高的分子量的聚合物需要以比相同类型的分子量较低的聚合物更低的浓度存在，以实现酶活性的相同效果。
在优选的具体实施方式中，加浓试剂或体积排阻剂是交联葡聚糖。在特别优选的具体实施方式中，交联葡聚糖是G-100型。
在采用体积排阻剂的那些具体实施方式中，在方法的下一步骤之前，可以由于存在体积排阻剂而根据存在的体积排阻剂的量、稀释流体的性质等将培养混合物稀释，例如稀释到至少约2倍或更多，如至少约5倍或更多，包括至少约10倍或更多，其中，在具有代表性的具体实施方式中，稀释流体是水，或者水和一种或多种溶质的其它的合适的水性流体，所述溶质例如是盐、缓冲剂等。
作为体积排阻剂的替代，或在使用体积排阻剂的同时，可以通过将一部分水从培养混合物中除去，来减少培养混合物在培养过程中的体积，例如通过蒸发。在这些具体实施方式中，根据需要，流体的体积可以减少至少约2倍或更多，如至少约5倍或更多，包括至少10倍或更多。重要的是，在这些具体实施方式中，并非所有的水均从培养混合物中除去。可以采用任何便捷的方法，通过从培养混合物中除去选择的部分的水，来减小培养混合物的体积。可以采用通过监测和调节湿度与温度来控制蒸发的仪器，其中在某些具体实施方式中，培养混合物的体积被监测，例如通过连续测量培养混合物的体积来进行监测，其中，当适当地蒸发时，可以加入如上所述聚合酶和PCR混合物。根据需要，可以使用加热块来加快蒸发，优选地，如果反应混合物中存在聚合酶，那么在使聚合酶活性最小化的温度条件下，使用加热块来加快蒸发。可选地，通过将水过滤掉，可以减小培养混合物的体积。在具有代表性的具体实施方式中，使用体积排阻过滤器来选择性地容纳尺寸大于临界值的分子，而较小的分子和水将通过过滤器而被除去。施加于溶液使其通过过滤器的力可以通过离心或真空抽吸而达到。
当邻近探针的结合结构域与分析物结合时，邻近探针的核酸结构域互相紧密邻近。因此，第一和第二邻近探针的核酸结构域能够彼此直接杂交或间接杂交，所述间接杂交例如是通过夹板间接杂交。
当存在时，夹板可以在邻近探针之前、与邻近探针同时或在邻近探针之后加入样品中。在一个具体实施方式中，夹板预先杂交至邻近探针。在另一个具体实施方式中，夹板寡核苷酸形成了邻近探针的核酸结构域的一部分。在另一个具体实施方式中，夹板寡核苷酸可以以第三邻近探针的形式偶联至分析物结合结构域，其中，优选地，将其与第一和第二邻近探针同时加入。
样品与邻近探针组合后，可将样品稀释，优选地，通过加入延伸反应的酶组分和/或非酶组分，例如缓冲液、盐、核苷酸等，但是不加入具有3’核酸外切酶活性的组分，来将样品稀释，但是如果具有3’核酸外切酶活性的组分以室温下无活性或具有最小活性的聚合酶的形式存在，那么可将其加入。在优选的具体实施方式中，稀释还可包括用于扩增反应的试剂，例如缓冲液、盐、核苷酸、引物和聚合酶。稀释步骤的作用是降低未结合邻近探针之间相互作用的可能性和/或它们与样品中其它组分相互作用的可能性。
稀释还可以破坏结合的探针的核酸结构域之间的相互作用。然而，由于结合的探针紧密邻近，因此在合适的条件下将使被破坏的任何相互作用稳定化(即重新退火或重新杂交)。因此，在一个具体实施方式中，样品可以被培养更长的一段时间，该时间足以使结合的邻近探针之间的相互作用稳定化。在具有代表性的具体实施方式中，在约4℃至约50℃，优选约4℃至约40℃，包括约20℃至约37℃的温度下，可将产物混合物培养约1分钟至约48小时的一段时间，包括约5分钟至约12小时。应当对反应混合物培养的条件进行优化，以维持邻近探针与分析物的特异性结合，同时抑制非特异性相互作用。条件也应使得在上述的核酸结构域之间发生有效的和特异性的杂交。
在上述聚合酶存在的情况下邻近探针被重新培养的具体实施方式中，可在使聚合酶活性最小化的条件下对反应混合物进行培养。因此，在一些具体实施方式中，可在低于40℃的温度下，优选低于35℃或30℃的温度下培养反应混合物。在特别优选的具体实施方式中，可在室温或更低的温度下，即25℃或更低，例如24℃、23℃、21℃、20℃或更低，重现培养含有聚合酶的反应混合物。
在一些具体实施方式中，在已经对邻近探针进行培养以与靶标分析物相互作用之后，或者在已经对邻近探针进行重现培养以使结合于靶标分析物的邻近探针的核酸结构域之间的相互作用稳定之后，将室温下无活性或具有最小活性的聚合酶加入到反应混合物中。优选地，在使聚合酶活性最小化的条件下，将聚合酶加入到反应混合物中。因此，在一些具体实施方式中，在低于40℃的温度下，优选低于35℃或30℃的温度下，加入聚合酶。在一些特别优选的具体实施方式中，在室温或更低的温度下，即25℃或更低，例如24℃、23℃、21℃、20℃或更低，可将聚合酶加入反应混合物中。例如，可在15℃、10℃或5℃或更低的温度下，加入聚合酶。
在一些具体实施方式中，将聚合酶与其它组分一起加入反应混合物中，所述其它组分例如是用于本文别处所述方法的延伸、扩增和/或检测步骤的组分。
在一些具体实施方式中，在聚合酶活性最小的条件下将聚合酶和/或其它组分加入之后，可使反应混合物均衡，所述条件例如是聚合酶加入到样品中的条件。这可以起到稳定结合于靶标分析物的邻近探针核酸结构域之间的相互作用的作用。因此，在约4℃至约30℃，优选约4℃至约25℃，包括约20℃至约25℃的温度下，可使反应混合物均衡约1分钟至约1小时的一段时间，包括约5分钟至约30分钟。
一些方法包括具有3’核酸外切酶活性的组分并且在培养探针与样品的步骤之后将扩增试剂加入样品中，在这样的方法的具体实施方式中，优选的是，例如如上所述通过引物的3’端进行修饰，来保护引物的3’核酸外切酶活性。在进一步优选的具体实施方式中，可选地或另外地，引物可以是热起始PCR引物，例如，茎环引物。在一个优选的具体实施方式中，使用同一聚合酶来延伸邻近探针的核酸结构域并扩增延伸产物。在另一优选的具体实施方式中，缓冲液和/或盐活化加入样品中的所有酶。
在一些具体实施方式中，在延伸步骤完成之后，将等分的反应混合物转移到新的容器中以扩增和检测。单独的反应容器可包含另一聚合酶(和反应组分)，诸如，如下进一步限定的嗜热聚合酶。
一些方法包含与室温下无活性或具有最小活性的聚合酶分开的且具有3’核酸外切酶活性的组分，在该方法的具体实施方式中，在任何稀释步骤之后，具有3’核酸外切酶活性的组分与样品接触。该步骤可包括进一步稀释样品，例如，加入具有合适缓冲液的组分和/或其它盐/组分。如上所述，具有3’核酸外切酶活性的组分可以在延伸反应所需的聚合酶之前加入，或与之同时加入。在优选的具体实施方式中，用于本发明方法的聚合酶还具有3’核酸外切酶活性。可在合适的条件下进一步培养样品，以使3’核酸外切酶活性作用在未结合邻近探针的核酸结构域。如果样品中存在聚合酶，那么所述条件还应当有利于核酸结构域的延伸。在一些具体实施方式中，可在具有3’核酸外切酶活性的组分之后加入聚合酶，其中可以进一步培养样品以产生延伸产物。培养条件将取决于反应所用的组分，且一些典型的条件如上所述。然而，在一些具体实施方式中，用于延伸核酸结构域的聚合酶是如上定义的超嗜热聚合酶，例如，修饰的Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶，在该方法的核酸外切酶和/或延伸阶段可优选其它反应条件，特别是温度条件。例如，用于延伸反应的、且如果聚合酶还具有3’核酸外切酶活性则也用于核酸外切酶反应的温度的范围是约25℃至约80℃，包括约25℃至约75℃，约30℃至约65℃，或约40℃至约60℃，最优选约45℃至约55℃。
产生延伸产物之后，具有3’核酸外切酶活性的组分会灭活。在优选的具体实施方式中，通过热变性，例如65-80℃10分钟，而使3’核酸外切酶活性丧失，虽然明显的是所需的条件会根据组分的性质而不同，例如，通过上述条件不会使包括3’核酸外切酶的超嗜热聚合酶失去活性。在一些具体实施方式中，热失活可能是扩增反应的第一步。
在邻近探针与样品接触的步骤之后，或者在分析的延伸步骤之前，如果不将扩增反应物加入到样品，那么所述反应物将在该阶段与样品接触。在优选的具体实施方式中，将等分的样品转移到包含扩增组分的新容器中，以扩增和检测。在该方面，具有3’核酸外切酶活性的组分灭活之后，引物不需要抗3’核酸外切酶活性。即使具有3’核酸外切酶活性的组分不灭活，只要包含延伸产物的等份只含有最低3’核酸外切酶活性，那么也允许使用不抗3’核酸外切酶活性的引物。
在一些具体实施方式中，能够延伸邻近探针的核酸结构域的聚合酶也可用于扩增反应，例如，如果聚合酶是上述超嗜热聚合酶，例如Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、修饰的Taq聚合酶等。
如果在邻近探针与样品接触的步骤之后将扩增试剂加入到样品中，那么有可能直接进行扩增反应。在优选的具体实施方式中，将等分的反应混合物转移到新容器以扩增和检测。
通常，可以采用能够检测邻近相互作用存在的任何便捷的方法。检测方法可以是或可以不需要分离步骤。
在一个具有代表性的具体实施方式中(本发明方法的其它具有代表性的具体实施方式如上所述)，通过第一和第二邻近探针的核酸结构域的游离3’羟基的核酸延伸可以得到第一和第二邻近探针的相互作用产生的延伸产物，并且通过随后的延伸产物的扩增和检测可以检测该相互作用。在该具有代表性的具体实施方式中，通过在聚合酶有活性的条件下使反应混合物与聚合酶接触来实现第一和第二邻近探针的核酸结构域的延伸。因此，如上所述，在聚合酶无活性或具有最小活性的条件下，聚合酶可以在邻近探针之前、与邻近探针同时、或在邻近探针之后与样品接触。在适合邻近探针与靶标分析物相互作用且适合邻近探针的核酸结构域相互作用的条件下培养反应混合物之后，含有聚合酶的反应混合物可经受并保持在如下条件下：该条件足以使核酸结构域延伸，即反应混合物的温度提高到聚合酶具有上述最小活性的温度下，例如约25℃至约80℃，包括约25℃至约75℃，约30℃至约65℃，或约40℃至60℃，最优选约45℃至约55℃。
如本领域已知的，聚合酶催化在并列的核苷酸之间形成磷酸二酯键，其中包括3’羟基部分(3’端)的核苷酸可以形成已有的核苷酸聚合物的一部分，已有的核苷酸聚合物即核酸。通常地，使核酸退火或杂交于互补的核酸分子，所述核酸分子的作用是模板化(即模板核酸)具有游离3’端的核酸的延伸。随后，与模板核酸上的下一个核苷酸互补的具有游离5’磷酸酯部分的游离核苷酸连接于具有游离3’端的核酸以使其延伸，并重复该过程，例如，直至到达模板的末端。可以采用如上定义的任何便利的聚合酶。用于本发明方法的特别优选的聚合酶包括Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶以及它们的突变体和/或衍生物，例如其序列-修饰的衍生物，如上定义。突变体和衍生物可以包括具有或不具有3’核酸外切酶活性的聚合酶，并且，修饰具有3’核酸外切酶活性的聚合酶以去除、灭活或抑制多肽的3’核酸外切酶部分在本领域是常规的。某些RNA聚合酶也可用于本发明的方法中。
当通过无3’核酸外切酶活性的聚合酶，例如Pfu(外切-)DNA聚合酶、Pwo(外切-)DNA聚合酶等，来实施延伸步骤时，包含3’核酸外切酶的组分，例如核酸外切酶，可在聚合酶之前或与之同时被加入。可采用任何方便的3’核酸外切酶，例如核酸外切酶I。本发明的方法还可采用某些RNA核酸外切酶。
在该延伸步骤中，如上定义的合适的聚合酶，如果需要的话和另外的3’核酸外切酶，和需要的和/或希望的任何试剂与反应混合物组合并维持在足以使杂交的核酸结构域发生延伸的条件。如果具有3’核酸外切酶活性的组分存在与反应混合物中，那么所述条件还应该足以使未结合的邻近探针的核酸结构域发生降解。聚合酶和核酸外切酶反应条件对本领域技术人员而言是已知的且如上所述。在延伸和/或降解过程中，某些具体实施方式中的反应混合物可保持在约4℃至约80℃，诸如约20℃至约75℃，约30℃至约60℃，例如约45℃至约55℃或者约20℃至约37℃的温度下(取决于分析中所用的聚合酶和/或核酸外切酶的最适条件)约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时的一段时间。在其它具体实施方式中，反应混合物可保持在如下的温度保持一段时间，其中，所述温度是约35℃至约45℃的范围，诸如约37℃至约42℃，例如约38℃、39℃、40℃或41℃，或者约40℃至约80℃范围，诸如45℃至约75℃，例如约46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃，所述一段时间是约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时，包括约2分钟至约8小时。反应组分和条件的代表性具体实施方式在实施例中进行了描述。
延伸之后，将延伸产物(例如，第一和第二探针的延伸的核酸结构域)作为指示样品中的分析物的存在或作为度量样品中分析物的量和其任意的位置来扩增和检测。如上所述，延伸的产物可以包括单链或双链核酸分子。单链核酸分子可以由夹板寡核苷酸的延伸而产生，所述夹板寡核苷酸可以从第一和第二邻近探针的核酸或在分析物结合结构域中的每个末端封端的第一和第二探针的两个邻近核酸结构域的缀合产物上解离。
延伸步骤之后，方法的下一步是确定反应混合物中延伸产物的存在，以便检测样品中的靶标分析物。换言之，筛选(即，分析、评估、评价、测试等)反应混合物中任何生成的延伸产物的存在，以便检测被分析样品中靶标分析物的存在。根据本发明，检测步骤涉及扩增步骤以生成被检测的扩增产物，通常扩增延伸产物的全部或一部分。
有上述方法产生的延伸产物，或更具体地扩增产物，在最广泛的意义上使用任何便捷的方法进行检测。具体的检测方法可以根据所要求的灵敏度和实施方法的应用而变化。在本文所述的本发明的方法中，检测方法可以包括扩增组分，其中延伸产物核酸(或其部分)的拷贝数升高，例如，以提高具体分析的灵敏度。然而，可能的是，在其它方法中可以无需任何扩增而直接检测延伸产物。
虽然这不是本发明方法的优选具体实施方式，其中无需扩增的检测是可实施的，可以以许多不同的方式检测核酸延伸产物。例如，一种或多种延伸产物可以是直接标记的，例如通过荧光，或通过分光光度法标记，或通过放射性同位素标记或使用任何产生信号的标记，以直接标记延伸产物。在这些具体实施方式中，直接标记的延伸产物可以从剩余反应混合物中按大小分离，包括以未延伸的寡核苷酸(即，核酸结构域寡核苷酸或夹板寡核苷酸)中分离，以检测延伸的核酸。可选地，可以采用构象选择的探针，例如分子信标(如以下更详细地描述)来检测延伸产物的存在，其中这些探针针对仅存在于延伸的核酸产物中的序列。
如上所述，在本发明方法的优选具体实施方式中，检测步骤包括扩增步骤，其中增加延伸核酸或其部分的拷贝数，例如，以提高分析的灵敏度。根据需要，扩增可以是线性的或指数的，其中令人感兴趣的代表性扩增方案包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)；等温扩增，滚环扩增等。在本发明一个特别优选的具体实施方式中，扩增方法是定量PCR(qPCR)或实时PCR。
例如美国专利US6,558,928所描述的锁式探针，或实际上使用任意环状核酸分子作为模板的滚环扩增，也可以用于扩增现有的“信号”核酸分子或其部分，例如，由邻近延伸分析生成的延伸产物。因此，在方法优选的方面，延伸产物(或其部分)可以通过滚环扩增来扩增。在一个具体实施方式中，使用锁式探针进行RCA。在另一个具体实施方式中，使用环状模板(环状寡核苷酸)进行RCA。
当检测步骤包括扩增步骤(更具体地，体外扩增延伸产物或其部分的步骤)，可以检测扩增的产物(或扩增产物)以检测分析物。
聚合酶链式反应(PCR)在本领域是已知的，在美国专利第4,683,202号、地4,683,195号；第4,800,159号；第4,965,188号和第5,512,462号中进行了描述，这些专利通过引用整体并入本文。在代表性的PCR扩增反应中，将包括以上延伸的核酸或延伸产物(也可是为扩增反应中的模板核酸)的反应混合物与在引物延伸反应中采用的一种或多种引物组合，所述引物例如PCR引物(如在几何(或指数)扩增中采用的正向和反向引物，或在线性扩增中采用的单一引物)。与模板核酸(以下为方便起见称为模板DNA)接触的寡核苷酸引物具有足够的长度以提供在退化条件下的与互补模板DNA的杂交(以下更详细地描述)。引物通常为至少10bp的长度，通常为至少15bp的长度，更通常为至少16bp的长度，可以是长达30bp的长度或更长，其中引物的长度一般地为18至50bp的长度，通常为约20至35bp。根据是否需要引物延伸、模板DNA的线性或指数扩增，可以将模板DNA与单一引物或一组两个的引物(正向引物和反向引物)接触。
如上所讨论的，可以在加入聚合酶之前将引物加入到样品中，也可以与聚合酶同时或在加入聚合酶之后将引物加入到样品中。在包含具有3’核酸外切酶活性的方法的具体实施方式中，除非在3’核酸外切酶组分已经灭活之后加入引物，否则可以对所述引物进行修饰以抗3’核酸外切酶活性，例如，修饰3’端。此外，引物也可以是热起始引物，如上所述。
除了上述组分，本发明方法中产生的反应混合物通常包括聚合酶和脱氧核苷三磷酸(dNTP)。可以由一种或多种不同的聚合酶来提供所需的聚合酶活性。在优选的具体实施方式中，用于本发明方法的延伸步骤的聚合酶也用于扩增步骤。
然而，在一些具体实施方式中，含有延伸产物的等分反应混合物可以被转移到单独的反应容器中进行扩增和检测步骤。单独的反应容器可以含有扩增反应混合物，其包括至少一种家族A聚合酶，其中，令人感兴趣的代表性家族A聚合酶包括但不限于：水生栖热菌(Thermus aquaticus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶(Taq)及其衍生物和其同源物，诸如克莱因taq(如Barnes等人,美国科学院院刊(1994)91:2216-2220(Barnes et al,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1994)91:2216-2220)中描述的)或iTaq(美国伯乐公司)(BioRad)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)聚合酶，包括天然存在的聚合酶(Tth)及其衍生物和其同源物，以及诸如此类。在进行的扩增反应是高保真反应的某些具体实施方式中，反应混合物可进一步包括具有3’-5’核酸外切酶活性的聚合酶，例如可由家族B聚合酶提供，其中令人感兴趣的家族B聚合酶包括但不限于：如Perler等人,美国科学院院刊(1992)89:5577-5581所描述的嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)；火球菌(Pyrococcus)种GB-D(深Vent)；如Lundberg等人,基因(1991)108:1-6(Lundberg et al.,Gene(1991)108:1-6)所描述的强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)，以及诸如此类。当反应混合物包括家族A和家族B聚合酶时，家族A聚合酶可以以大于家族B聚合酶的量存在于反应混合物中，其中活性的差异通常是至少10倍，且更通常是至少约100倍。
通常，扩增步骤的反应混合物将包括4种不同类型的dNTP，这对应于4种天然存在碱基，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本发明的方法中，每种dNTP通常以约10至5000μM，通常约20至1000μM的量存在。
本发明方法的该检测步骤中制备的反应混合物可以进一步包括水性缓冲液介质，所述水性缓冲液介质包括单价离子源，二价阳离子源和缓冲剂。可以采用单价离子的任何便利来源，诸如KCl、K-醋酸、NH4-醋酸、K-谷氨酸、NH4Cl、硫酸铵，等等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中阳离子可以通常是镁。可以采用任何镁离子的便利来源，包括MgCl2、Mg-醋酸，等等。存在于缓冲液中的Mg2+的量可以是0.5至10mM，但优选是3至6mM，且理想地是约5mM。可能存在于缓冲液中的代表性的缓冲剂或盐包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸(Tricine)、HEPES、MOPS，等等，其中缓冲剂量的范围通常为约5至150mM，通常为约10至100mM，且更通常为约20至50mM，其中在某些优选的具体实施方式中，缓冲剂将以足够的量存在以提供约6.0至9.5的pH值，其中最优选的是在约72℃下约7.3的pH值。其它可能存在于缓冲介质中的试剂包括螯合剂，诸如EDTA、EGTA等。
在本发明方法制备该步骤的反应混合物时，各种组成组分可以按照任何方便的顺序合并。例如，缓冲液可以与引物、聚合酶结合、然后与模板DNA结合，或所有各种组成组分可以同时结合以产生反应混合物。在特别优选的具体实施方式中，将扩增反应物与用于延伸和降解反应的组分结合。在这方面，反应的组分优选适合反应的所有酶组分的活性，即，适合于产生延伸产物的“第一”聚合酶和可选地适合于扩增步骤的“第二”聚合酶，和如果具有3’核酸外切酶活性的组分，其中“第二”聚合酶可不同于“第一”聚合酶(例如，如果扩增反应发生在单独的反应容器中)。在优选的具体实施方式中，“第一”和“第二”聚合酶是相同的，即聚合酶能够延伸邻近探针的核酸结构域并扩增延伸的结构域的至少一部分。在其它具体实施方式中，聚合酶可具有3’核酸外切酶活性。例如，Pfu DNA聚合酶可用于采用PCR检测延伸反应产物的具体实施方式中，即Pfu DNA聚合酶能够被用作延伸组分、扩增组分和3’核酸外切酶组分，如果存在。
扩增反应的扩增产物可以使用任何便利的方法检测，其中采用的具体方法可以非特异性地或特异性地检测扩增产物，如以下更详细地描述的。令人感兴趣的代表性非特异性检测方法包括采用信号生成系统的方法，所述信号生成系统例如通过嵌入选择性地检测双链DNA产物。用于这样的具体实施方式中的代表性可检测分子包括荧光核酸染色剂，诸如菲啶(phenanthridinium)类的染料，包括其单体或同二聚体或异二聚体，当其与核酸复合时会产生增强的荧光。菲啶染料的例子包括乙啡啶同二聚体、溴化乙啡锭、碘化丙锭和其它烷基取代的菲啶染料。在本发明的另一个具体实施方式中，核酸染色剂是吖啶染料或包括吖啶染料，或其同二聚体或异二聚体，诸如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙啡锭-吖啶异二聚体，或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本发明的另一个具体实施方式中，核酸染色剂是吲哚或咪唑染料，诸如赫克斯特33258(Hoechst33258)、赫克斯特33342(Hoechst33342)、赫克斯特34580(Hoechst34580)(生物探针34，分子探针公司，尤金，俄勒冈州，(2000年5月))(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(May2000))、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许的核酸染色剂包括但不限于7-氨基放线菌素D、羟基司替巴脒、LDS751、选择的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属复合物如钌复合物，和过渡金属复合物(例如，包括Tb3+和Eu3+)。在本发明某些具体实施方式中，核酸染色剂是花青染料或花青染料的同二聚体或异二聚体，当其与核酸连接时会产生增强的荧光。可以使用如下专利文献中所描述的任何染料：Lee的美国专利第4,883,867号(1989)、Yue等人的美国专利第5,582,977号(1996)、Yue等人的美国专利第5,321,130号(1994)和Yue等人的美国专利第5,410,030号(1995)(这四篇专利通过引用整体并入本文)，包括购自分子探针公司，尤金，俄勒冈州(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg)的商标为TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO的市售核酸染色剂。可以使用如下专利文献中所描述的任何染料：Haugland等人的美国专利第5,436,134号(1995)、Yue等人的美国专利第5,658,751号(1997)和Haugland等人的美国专利第5,863,753号(1999)(这三篇专利通过引用整体并入本文)，包括购自分子探针公司，尤金，俄勒冈州(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg)的商标为SYBR Green、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN的市售核酸染色剂。在本发明其它具体实施方式中，核酸染色剂是是单体的、同二聚体的或异二聚体的花青染料，它们包括氮杂苯并唑杂环或聚氮杂苯并唑杂环，诸如氮杂苯并恶唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑，当与核酸结合时它们会产生增强的荧光，包括购自分子探针公司，尤金，俄勒冈州(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg)的商标为SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO的市售核酸染色剂。可用于本发明方法的其它嵌入染料是购自Biotium公司的EvaGreenTM染料。
在本发明特别优选的具体实施方式中，延伸产物通过PCR扩增，其中PCR是定量PCR，且使用嵌入染料对扩增的核酸分子进行定量。在优选的具体实施方式中，嵌入染料选自SYBR和EvaGreenTM。
在特别优选的具体实施方式中，当样品是血浆或血清时，定量PCR被用于本发明方法的扩增和检测步骤。用于血浆或血清的特别有用的嵌入染料可选自SYBR和EvaGreenTM。
在其它具体实施方式中，可以采用对扩增产物而非一般的双链分子具有特异性的信号产生系统来检测扩增。在这些具体实施方式中，信号产生系统可以包括探针核酸，该探针核酸特异性结合于扩增产物中发现的序列，其中，所述探针核酸可以用直接或间接可检测的标记物进行标记。直接可检测的标记物是可以直接被检测而无需使用另外的试剂的标记物，而间接可检测的标记物是通过采用一种或多种另外的试剂才可检测的标记物，例如，其中标记物是由两种或多种组分构成的信号产生系统的成员。在很多具体实施方式中，标记是直接可检测的标记，其中令人感兴趣的直接可检测的标记包括但不限于：荧光标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。在很多具体实施方式中，标记物是荧光标记，其中在这样的具体实施方式中采用的标记试剂是荧光标记的核苷酸，例如荧光标记的CTP(诸如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可以用于标记核酸以产生标记的探针核酸的荧光部分包括但不限于：荧光素，花青染料如Cy3、Cy5、Alexa555、Bodipy630/650，等。其它标记，如上所述的那些，是本领域已知的，因此也可被采用。
在某些具体实施方式中，特异性标记的探针核酸是使用“能量转移”标记进行标记的。如本文所用，“能量转移”是指荧光基团的荧光发射被荧光修饰基团转变的过程。如果荧光修饰基团是淬灭基团，那么来自荧光基团的荧光发射减弱(淬灭)。能量转移可以通过荧光共振能量转移，或通过直接能量转移而发生。在这两种情况下确切的能量转移机制是不同的。应当理解的是，在本申请中所提到的任何能量转移包括所有这些在机制上不同的现象。如本文所用，“能量转移对”是指参与能量转移的任意两个分子。通常地，一个分子充当荧光基团，另一个充当荧光修饰基团。“能量转移对”用来指形成单一复合物的分子的基团，在所述复合物中发生能量转移。这样的复合物可以包括，例如，彼此不同的两个荧光基团和一个淬灭基团，两个淬灭基团和一个荧光基团，或包括多个荧光基团和多个淬灭基团。在有多个荧光基团和/或多个淬灭基团的情况下，单个基团可以彼此不同。如本文所用，“荧光共振能量转移”或“FRET”是指能量转移现象，其中由激发荧光基团发射的光至少部分地被荧光修饰基团吸收。如果荧光修饰基团是淬灭基团，那么基团可以作为不同波长的光发出吸收光，或可以作为热散失。FRET取决于荧光基团的发射光谱和淬灭基团的吸收光谱之间的重叠。FRET还取决于淬灭基团和荧光基团之间的距离。超过一定的临界距离后，淬灭基团不能吸收由荧光基团发射的光，或仅能很差地吸收。如本文所用，“直接能量转移”是指荧光转移机制，其中荧光基团和荧光修饰基团之间的光子未发生传递。不被单一的机理束缚，可以认为在直接能量转移中，荧光基团和荧光修饰基团干扰彼此的电子结构。如果荧光修饰基团是淬灭基团，这将导致淬灭基团甚至阻止荧光基团发射光。
能量转移标记探针核酸，例如，寡核苷酸，可以按照各种不同的方式构成，只要它包括供体、受体和靶标核酸结合结构域。因此，在本方法的这些具体实施方式中采用的能量转移标记寡核苷酸是核酸检测器，所述核酸检测器包括荧光团结构域，其中放置了荧光能量供体，即供体，并放置了荧光能量受体，即受体。如上所述，供体结构域包括供体荧光团。供体荧光团可以位于核酸检测器的任意部位，但是通常存在于检测器的5’端。受体结构域包括荧光能量受体。受体可以放置在核酸检测器受体结构域的任意部位，但通常存在于核酸检测器或探针的3’端。
除了荧光团和受体结构域，能量转移标记的探针寡核苷酸还包括靶标核酸结合结构域，所述结构域结合于令人感兴趣的扩增产物中所发现的靶标核酸序列(如上所述)，所述的结合例如是在严格的杂交条件下结合(如上所述)。这样的靶标结合结构域的长度通常是约10至约60个核苷酸，通常为约15至约30nt。根据寡核苷酸和分析本身的性质，靶标结合结构域可以杂交于模板核酸的区域或引物延伸产物的区域。例如，当分析是5’核酸酶分析时，例如当采用型寡核苷酸探针时，靶标结合结构域在严格的条件下杂交于模板核酸的靶标结合位点，所述结合位点是引物结合位点的下游或3’端。在可选的具体实施方式中，例如，在分子信标型分析中，靶标结合结构域杂交到引物延伸产物的结构域。在这些具体实施方式中采用的包括上述所有三个结构域的能量转移标记寡核苷酸的总长度，通常是约10至约60个核苷酸，通常是约15至约30个核苷酸。
在某些具体实施方式中，当能量转移标记寡核苷酸不杂交于靶标核酸时，对能量转移标记的寡核苷酸进行构造以使荧光团激发后在荧光团和能量转移标记的寡核苷酸探针的受体之间发生能量转移。
在某些具体实施方式中，寡核苷酸是不形成分子内结构的单链分子，并且由于供体和受体的间距使得能按照单链线性形式进行能量转移，因此其中发生能量转移。在这些具体实施方式中，当标记的寡核苷酸探针杂交于靶标核酸时，能量转移也在荧光团和标记的寡核苷酸探针的受体之间在荧光团激发时发生。这样的标记寡核苷酸探针的具体例子包括型探针，如美国专利第6,248,526号所描述，其公开的内容通过引用整体并入本文(以及Held等人,基因组研究(1996)6:986-994(Held et al.,Genome Res.(1996)6:986-994)；Holland等人,美国科学院院刊(1991)88:7276-7280(Holland et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA(1991)88:7276-7280)；和Lee等人,核酸研究(1993)21:3761-3766(Lee et al.,Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766))。在许多这些具体实施方式中，靶标核酸结合结构域是与模板核酸的序列杂交的结构域，也即与其互补的结构域，即靶标核酸结合结构域的靶标核酸是存在于模板核酸中的序列(即，伪靶标或替代核酸)。
在其它具体实施方式中，当能量转移标记寡核苷酸探针杂交于靶标核酸时，对探针寡核苷酸进行构造以使在荧光团激发时在荧光团和能量转移标记的寡核苷酸探针的受体之间不发生能量转移。这些类型的探针结构的例子包括：蝎形探针(Scorpion probe)(描述于Whitcombe等人,自然生物技术(1999)17:804-807(Whitcombe et al.,NatureBiotechnology(1999)17:804-807)；美国专利第6,326,145号，其公开的内容通过引用整体并入本文)，日出探针(Sunrise probe)(描述于Nazarenko等人,核酸研究(1997)25:2516-2521(Nazarenko et al.,Nuc.Acids Res.(1997)25:2516-2521)；美国专利第6,117,635号，其公开的内容通过引用整体并入本文)，分子信标(Tyagi等人,自然生物技术(1996)14:303-308(Tyagi et al.,Nature Biotechnology(1996)14:303-308)；美国专利第5,989,823号，其公开的内容通过引用整体并入本文)，和构象辅助探针(描述于临时申请第60/138,376号，其公开的内容通过引用整体并入本文)。在许多的这些具体实施方式中，靶标结合序列或结构域包括与扩增反应的引物延伸产物的序列互补的杂交结构域，而不是与伪靶标核酸中发现的序列互补的序列。
本发明方法的下一步是由令人感兴趣的标记的扩增产物进行的信号检测，其中信号检测可以根据所采用的具体的信号产生系统而变化。在某些具体实施方式中，仅例如荧光的可检测信号的存在与否在所述分析中被测定和使用，以便通过确定伪靶标核酸和/或其扩增产物来测定或识别靶标核酸是否存在。根据所采用的具体标记，信号的检测可以指示靶标核酸的存在或不存在。
在信号产生系统是荧光信号产生系统的那些具体实施方式中，信号检测通常包括检测来自反应混合物的荧光信号的变化以获得分析结果。换言之，评估了由反应混合物生成的荧光信号的任何调节。根据采用的标记的性质，变化可以是荧光的增强或减弱，但在某些具体实施方式中是荧光的增强。可以使用任何便捷的方法针对荧光的增强对样品进行分析，所述方法的装置例如是合适的荧光计，诸如热稳定的比色皿或板式阅读荧光计。使用已知的荧光计对荧光进行合适地监测。来自这些装置的信号，例如光电倍增管电压形式的信号，被发送到数据处理器板并转化成与每种样品管相关的光谱。可以同时评估多个管，例如96个管。
当检测方法是实时方法时，例如，如在实时PCR或定量PCR方法中所采用的，在整个反应中可以在频繁的间隔下以这种方式收集数据，例如每3分钟一次。通过监测在每个循环的过程中来自样品的反应性分子的荧光，可以按照各种方式来监测扩增反应的进展。例如，可以通过计算解链峰下面积和根据循环数绘制的这些数据来分析由解链峰提供的数据。在本发明的优选具体实施方式中，使用嵌入双链核酸分子的染料来实现荧光信号，优选地，其中嵌入染料选自SYBR和EvaGreenTM。
以这种方式生成的光谱能够被分辨，例如，使用预先选择的荧光部分如染料的“拟合”，以形成代表每个信号部分(即荧光团)的峰。可以测定峰下的面积，所述峰下的面积代表每个信号的强度值，如果需要则将其表达为彼此的商数quotients。信号强度和/或比率的微分将使得能够在整个反应中或在不同反应条件下记录标记探针变化，所述反应条件例如是温度。这种变化涉及寡核苷酸探针和靶标序列之间的结合现象或者结合于靶标序列的寡核苷酸探针的降解。微分峰下的面积的积分将使得能够计算出标记影响的强度值。
根据在引物延伸反应末，例如在扩增反应的每个循环后(例如，如在实时PCR监测中所做的)，样品是否被筛选了一次或多次，针对荧光变化对混合物进行的筛选提供了一个或多个分析结果。
如上所述生成的数据可以按照多种方式进行解释。在其最简单的形式中，在扩增反应的过程中或末期，来自样品的荧光的增强或减弱指示着样品中存在的靶标分析物的量增加，例如，如与反应混合物检测中所检测的扩增产物的量相关，表明扩增反应已进行并且因此靶标分析物确实存在于初始样品中的事实。通过在整个扩增过程中监测扩增反应也可能进行定量。如上所述的定量也可以包括分析反应混合物中的一种或多种核酸对照。
以这种方式，可以容易地针对靶标分析物的存在来筛选(或者评估或者分析等)反应混合物。该方法适合用于检测单一靶标分析物以及多重分析，其中在样品中分析两种或多种不同的靶标分析物。在这些后者的多重分析的情况下，可以采用的不同组的探针数目通常是约2至约20或更多，例如高达100或更多，1000或更多，等等。
采用本文描述的方法而获得的提高了的特异性和灵敏性使如下分析成为可能：许多分析物同时并且使用几种不同的邻近探针组(多重)在单一反应中进行的分析。可以对每个探针组进行设计以产生独特的延伸产物，所述延伸产物可以用于确定探针组所探测的分析物的存在或不存在，量和/或部位。可以直接检测延伸产物，或者优选地在扩增后使用任意已经建立的用于分析核酸分子的方法来检测延伸产物，所述方法从文献中是已知的，包括液相色谱法、电泳法、质谱法、显微镜法、实时PCR(定量PCR)、荧光探针等。本发明方法优选的具体实施方式利用定量或实时PCR。特别令人感兴趣的是本发明的方法与“DNA阵列”读出形式的结合。来自本文所述的多重邻近延伸分析的几种独特延伸产物可以杂交至标准化的DNA阵列，所述DNA阵列携带许多与延伸产物序列互补的寡核苷酸序列(标记)。杂交于阵列的每种延伸产物可以通过其在DNA阵列上的位置确定，并且在给定的杂交斑点中的检测的强度将表明特异性延伸产物的量，从而也表明产生该延伸产物的分析物的量。可以通过光谱法、荧光、放射性同位素等来检测延伸产物。可以在扩增反应(PCR)中使用荧光标记的引物或荧光标记的核苷酸将荧光部分方便地引入到延伸产物中。DNA阵列可以是含有少量斑点的膜上的简单的点印迹阵列，或携带成百上千的斑点的高密度阵列。
可以对本发明的方法进行修饰以进一步降低与非特异性核酸杂交事件相关的背景。这样的修饰包括对降低任何非特异性核酸杂交事件的方法所进行的调整。在一些具体实施方式中，可以将蛋白质加入含有样品和邻近探针的混合物中以减少弱的和非特异性的DNA杂交事件。例如，已将大肠杆菌单链DNA结合蛋白用于提高引物延伸反应和PCR反应的产率和特异性(美国专利第5,449,603号和第5,534,407号)。噬菌体T4的基因32蛋白(单链DNA结合蛋白)明显提高了扩增更大的DNA片段的能力(Schwartz等人,核酸研究18:1079(1990))(Schwartz,et al.,Nucl.Acids Res.18:1079(1990))，并提高了DNA聚合酶的保真度(Huang,DNA和细胞生物学15:589-594(1996))(Huang,DNA Cell.Biol.15:589-594(1996))。当采用时，这样的蛋白质将用于在反应混合物中达到的浓度范围是约0.01ng/μL至约1μg/μL，如约0.1ng/μL至约100ng/μL，包括约1ng/μL至约10ng/μL。
在一些具体实施方式中，可以通过在分析中加入聚-A RNA(poly-A RNA)和/或主体RNA来降低背景。主体RNA也称总RNA，即，主体RNA仅仅是从例如细胞的样品中提取的总RNA，包括存在于所述样品中一种以上的形式的RNA，优选是所有不同形式的RNA，例如，mRNA,、rRNA、微小RNA等。
在其它具体实施方式中，部分双链的核酸可以用作第一和第二邻近探针的核酸结构域以降低弱的和非特异性的DNA杂交事件。
如上所述，对本发明的方法进行设计，以使第一和第二探针的核酸结构域之间的相互作用只有在探针结合于分析物时才发生。然而，在该类型的所有分析的情况下，不能总是保证这一点，并且如果探针在溶液中随机地邻近时，那么可能有核酸结构域的一些背景相互作用(该可能性在如下具体实施方式中会降低：需要探针的核酸结构域借助夹板彼此杂交以发生此类相互作用；与双探针分析相比，所有三种结构域随机邻近的机会降低，然而这仍然可以在某些情况下发生)。为了使由于未结合的(即未反应的)探针导致的背景的可能性降低或最小化，除了上述的和本领域已知的任意其它封闭试剂以外，可以使用封闭寡核苷酸。在优选的具体实施方式中，样品可以在加入邻近探针之前与一种或多种封闭试剂一起培养，所述封闭试剂是BSA等，如国际专利WO2012/007511等所描述的封闭试剂。
封闭寡核苷酸结合(即，杂交或退火)于第一和第二邻近探针的核酸结构域的游离端。因此，封闭寡核苷酸可以结合于5’邻近探针的核酸结构域的游离3’OH端和3’邻近探针的核酸结构域的5’磷酸酯端。封闭寡核苷酸的结合在高的局部浓度的夹板寡核苷酸存在下可以具有更高的竞争力，如本发明的一些具体实施方式中所发生的。以这种方式，在不存在分析物结合时，封闭寡核苷酸可以阻止第一和第二结构域杂交至夹板。在其它具体实施方式中，一种或多种特异性“竞争”寡核苷酸可以加入分析中，例如在邻近探针与靶标分析物相连之后，以使封闭寡核苷酸从探针的核酸结构域的末端解离，从而使得邻近探针的结构域能相互作用。因此，可以阻止5’和/或3’探针的游离端相互作用，直到它们结合于分析物之后。在夹板寡核苷酸被使用并形成第三邻近探针的核酸结构域的具体实施方式中，当所有三种探针结合于分析物时，夹板的局部浓度足以超过封闭寡核苷酸；第一和第二结构域杂交于夹板并且封闭寡核苷酸被取代。
因此，封闭寡核苷酸使得能够使用基于竞争的策略以降低背景，并从而提高分析的灵敏度。
封闭寡核苷酸的长度范围是约4-100个核苷酸，例如6-75个或10-50个。它们可以杂交至第一或第二探针的核酸结构域的游离端或游离端附近(“附近”的意思是游离3’或5’端的1-20个或1-10个核苷酸以内，例如1-6个核苷酸)。杂交区域的长度可以是3-15个核苷酸，例如3-12、3-10、3-8、4-8、3-6、4-6。
封闭寡核苷酸通常相对于各探针过量使用，例如，过量2-1000倍，例如，20-500、50-300、100-500或100-300倍，例如，20、200或300倍。
竞争寡核苷酸通常相对于封闭寡核苷酸过量使用，例如，过量2-1000倍，例如，20-500、50-300、100-500或100-300倍，例如，20、200或300倍。
在使用具有低亲和力和缓慢的结合动力学的邻近探针来检测分析物的情况下，与邻近探针在足够高的浓度下进行预培养的步骤促进了邻近探针与分析物的结合。该预培养步骤可以快速在大体积的冷缓冲液中稀释(例如，不包括分析物或邻近探针的缓冲液)，和随后将部分该稀释液加入延伸反应混合物中。低温使得存在的邻近探针分析物复合物的解离最小化，而大量稀释导致未结合邻近探针的浓度降低，从而降低其反应性和背景信号的最小化，所述低温例如是约0℃至约20℃，包括约4℃至约10℃。
在这样的具体实施方式中，通过使用如下小的培养体积的样品和邻近探针来实施分析：约1μl至约20μl，诸如约1μl，或约2μl，或约3μl，或约4μl，或约5μl或约6μl。因此，邻近探针在最终培养体积中的有效浓度是被稀释的，降低了背景，同时维持了信号，这是由于在第一和第二核酸结构域被延伸之前没有时间解离探针和分析之间的结合从而维持了信号。只要延伸产物可以由较大的体积来浓缩，诸如100μl以上或更多，并且随后检测邻近依赖相互作用，那么该方法能够具有极高的灵敏度。在这样的具体实施方式中，通过使用单链结合蛋白能够减少探针-探针相互作用。
与复杂样品相关的问题可以通过在分析之前先稀释复杂样品来解决。这极大地减少了可非特异性结合探针的蛋白质的量，从而降低了所需探针的浓度。虽然样品还将被稀释，但是高敏感性的邻近探测将提供良好的检测和定量。
可如上所述均质地(即在溶液中)或者可选地异质地使用固相来采用本发明的方法，所述使用固相例如是其中结合的分析物固定在固相上，允许使用洗涤步骤。固相分析的使用提供了优点，特别是对困难样品的检测提供了优点：洗涤步骤可以有助于除去抑制性组分，并且可以从不需要的大的样品体积中富集分析物。由于未结合的分析物和探针可以通过洗涤而除去，因此可以使用较高浓度和较大量的邻近探针。通过洗涤除去未结合的或未缀合的探针的能力也意味着固相分析与均质分析相比可耐受更低纯度的邻近探针。
将分析物固定在固相上可以采用多种方式来实现。因此，本发明固相分析的几种具体实施方式被考虑。在一种这样的具体实施方式中，一个(或多个)第一或第二(或第三邻近探针，如果使用)可以被(或者能够被)固定在固相(或者固体支持物)上。分析物可以首先被一个(或多个)固定的(或可固定的)探针捕获，其次再被随后加入的探针结合。在这样的方案中，前述的亲和力效果可不存在于结合步骤中，但是与洗涤步骤相关。优选地，在将非固定的/不可固定的探针加入反应混合物的同时，使分析物与固相结合的(即，固定的，或可固定的)探针接触，使得亲和力效果也有助于检测(结合)步骤。
固定化的邻近探针可以被固定，即，以任何方便的方式结合于支持物。因此，固定的方式或手段和固体支持物可以选择，根据选择需要，选自本领域众所周知且在文献中描述的任何数量的固定装置和固体支持物。因此，探针可以直接结合于支持物，例如通过分析物结合结构域(例如，化学交联的)，它也可以借助连接基团或通过中间结合基团间接地结合(例如，通过接触生物素-链酶亲和素相互作用)。因此，邻近探针可以具有用于固定在支持物上的装置(例如，能够结合于其结合伴侣的亲和结合伴侣，例如生物素或半抗原，所述结合伴侣即同源结合伴侣，例如链霉素或抗体)。探针可以在结合于分析物之前或之后固定。此外，这样的“可固定的”探针可以与支持物一起接触样品。
固体支持物可以是目前广泛使用的或建议用于固定、分离等的任何众所周知的支持物或基质。这些可以呈现颗粒(例如，磁性或非磁性珠)、片、凝胶、滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、板或孔等的形式。
支持物可以由玻璃、硅胶、乳胶或聚合材料制成。适合的材料是具有结合分析物的高表面积的材料。这样的支持物可以具有不规则的表面并且可以是例如多孔的或颗粒状的，例如，颗粒、纤维、纤网、烧结物或筛。颗粒材料，例如珠，由于其较高的结合能力从而是有用的，特别是聚合珠。
便利地，根据本发明所使用的颗粒固体支持物将包括球形珠。珠的尺寸并不是关键的，但是它们的直径至少是1μm且优选至少是2μm，并且最大直径优选不超过10μm，例如不超过6μm。
单分散颗粒，即尺寸基本均匀的颗粒(例如，具有小于5％的直径标准偏差的尺寸)，具有提供非常均匀的反应重现性的优点。代表性的单分散聚合物可以通过在US-A-4336173中描述的技术产生。
然而，为了帮助操作和分离，磁性的珠是有利的。如本文所用的术语“磁性的”是指当置于磁场中时能够被赋予磁矩的支持物，例如，支持物可以是顺磁性的，因此支持物在该场的作用下可以移动。换言之，包括磁性颗粒的支持物可以容易地通过磁聚集而除去，所述磁聚集在分析物结合步骤之后提供了快速、简单和有效的分离颗粒的方式。
在另一个具体实施方式中，除了均质分析的非固定的邻近探针以外，可以使用仅包括结合结构域(即，分析物捕获探针)的固定化的(或可固定的)分析物特异性探针。因此，在这样的具体实施方式中，分析物首先被固定的或可固定的捕获探针所捕获，所述捕获探针仅用于将分析物固定在固相上，随后固定的分析物与邻近探针培养。在这样的具体实施方式中，捕获探针可以是能够直接或间接结合分析物的任何结合伴侣(例如，如以上就邻近探针的分析物结合结构域所讨论的)。更具体地，这样的捕获探针特异性结合于分析物。由于该方法的这种具体实施方式需要至少三种探针(结合结构域)同时结合于分析物或分析物复合物，因此可能能够探测至少三种不同的表位，使分析具有高特异性。
在进一步的具体实施方式中，分析物本身可以通过例如非特异性吸附来固定(或可固定)在固相上。在具体的这样的具体实施方式中，分析物可以存在于细胞内，可选地被固定和/或渗透，所述细胞(能够)连接于固体支持物。
上述方法提供对存在于反应混合物的夹板介导的邻近依赖性相互作用的检测，其反过来提供了对被分析的样品中的靶标分析物的量的测量。所述测量可以是定性或定量的。
因此，上述检测一种或多种靶标分析物存在的复杂样品的方法可用于多种不同的应用。
本发明的方法可以用于针对样品中一种或多种靶标分析物的存在或不存在来筛选样品。如上所述，本发明提供了对检测样品中一种或多种靶标分析物的存在或者对样品中一种或多种靶标分析物的量进行定量的方法。
本发明的方法可以用于检测多种不同类型的样品中一种或多种靶标分析物的存在，包括具有大量非靶标实体的复杂样品，其中本发明的方法提供对靶标分析物的高灵敏度检测。因此，本发明的方法是检测简单样品中或复杂样品中的一种或多种靶标分析物的高灵敏度方法。在很多具体实施方式中，本发明的方法所分析的样品是生理来源的，如上更详细地描述的。
除了检测多种分析物，本发明的方法还用于筛选化合物，所述化合物是用于调节具有分析物结合区域的邻近探针的分析物结合结构域之间的相互作用，即，分析物结合结构域与分析物的结合。术语调节包括降低(例如抑制)和增强两个分子之间的相互作用。筛选方法可以是体外或体内形式，其中两种形式均容易由本领域技术人员研发。
多种不同的候选试剂可以通过上述方法筛选。候选试剂包括大量的化学种类，但是它们通常是有机分子，优选分子量大于50且小于2500道尔顿的小有机化合物。候选试剂包括与蛋白质结构相互作用所必须的官能团，所述相互作用特别是氢键，并且一般包括至少氨基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。候选试剂通常包括被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香或聚芳香结构。候选试剂还可以是生物分子，包括肽，糖类，脂肪酸，甾体，嘌呤，嘧啶，它们的衍生物，结构类似物或组合。
候选试剂由多种来源获得，所述来源包括合成或天然化合物的库。例如，许多方法可以用于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括寡核苷酸和寡肽的随机化制备。可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可得的或容易制备的。此外，天然或合成制备的库和化合物容易通过传统的化学、物理和生物化学手段被修饰，并且可以用于制备组合库。已知的药物试剂可以进行定向或随机化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
在上述筛选分析中确定的试剂在多种方法中是有用的，包括调节靶标分析物活性的方法，和与其存在和/或活性相关的条件。
本发明还提供了用于实施如上所述方法的试剂盒。例如，在一些具体实施方式中，用于实施本发明方法的试剂盒包括至少一组邻近探针，所述邻近探针各自包括如上所述的分析物结合结构域和核酸结构域。如上所述，某些方案将采用两个或多个不同的这样的探针组，以同时检测样品中的两种或多种分析物，例如，以多重和/或高通量形式。因此，在某些具体实施方式中，试剂盒将包括两个或多个不同的邻近探针组。此外，在使用试剂盒组分来实施的方案中可以存在需要或希望的其它试剂，所述其它试剂包括但不限于：一种或多种如上所述的室温下无活性或具有最小活性的聚合酶，具有3’核酸外切酶活性的组分，夹板寡核苷酸(任选地以第三邻近探针的形式)，封闭寡核苷酸，竞争寡核苷酸，用于固定探针、结合结构域或分析物的固体支持物，用于固定探针、结合结构域或分析物的装置，扩增和检测装置，例如荧光标记的核苷酸或寡核苷酸或嵌入染料(例如，SYBR和/或EvaGreenTM)，补充核酸对，单链结合蛋白，和PCR扩增试剂(例如，核苷酸、缓冲液、阳离子等)等。在某些具体实施方式中，试剂盒可以包括用于降低如上所述的培养混合物的有效体积的元件，例如，体积排阻剂。试剂盒组分可以存在于单独的容器中，或一种或多种组分可以存在于相同的容器中，其中所述容器可以是储存容器和/或在针对设计的分析过程的试剂盒中采用的容器。
除了上述组分，本发明试剂盒可以进一步包括用于实施本发明方法的说明。这些说明可以按照多种形式存在于本发明试剂盒中，所述一种或多种说明可以存在于试剂盒中。这些说明可能存在的一种形式是作为在适合的介质或基材上的印刷的信息，所述介质或基材例如是印刷了信息的一张或多张纸，在试剂盒的包装中，在包装说明书中等。另一种装置可以是记录了信息的电脑可读的介质，例如，磁盘、CD、闪存盘等。可以存在的又一种装置是网址，所述网址可以通过互联网使用，以访问远离的站点的信息。任何便利的装置都可以存在于试剂盒中。
因此，在另一方面，本发明提供了一种用于检测样品中分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)至少第一和第二邻近探针的至少一组，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域并且能够同时结合至分析物，优选地，其中一个或多个所述邻近探针的核酸结构域包括发夹结构；和
(b)聚合酶，其特征在于，其在40℃的活性小于其最大酶活性的20％，其中所述聚合酶最大活性的最适温度大于40℃；和
(c)可选地，具有3’核酸外切酶活性的组分；和
(d)可选地，用于扩增和检测所述延伸产物的装置。
如上所述，除了聚合酶，试剂盒还可包括延伸核酸结构域的装置，这样的装置可选地可以进一步包括聚合酶反应所必须的试剂(例如核苷酸等)。用于扩增和检测延伸产物的装置，可以是上述在分析方法部分所讨论的任何装置，例如，扩增装置和检测其扩增产物的装置，例如，用于PCR反应的试剂(例如，扩增引物，和可选地聚合酶和/或核苷酸等)和用于检测PCR扩增子等的试剂(例如探针，嵌入染料，诸如SYBR和/或EvaGreenTM，等等)。
试剂盒可进一步可选地包括针对第一和第二探针的夹板寡核苷酸和/或封闭寡核苷酸。
试剂盒可进一步可选地包括针对分析物的固定化的捕获探针，或装备有用于固定的装置的捕获探针。可选地，试剂盒可以包括用于捕获或结合于分析物的固相，或一种或多种所述第一或第二邻近探针可以固定或装备有用于固定的装置。
参照以下附图以及以下非限制性实施例对本发明作进一步描述，其中：
图1显示了五个不同版本的邻近延伸分析的示意图。
图2显示的条形图是描绘使用本发明方法检测白细胞介素-8(100pM)所用各种超嗜热聚合酶和嗜热聚合酶的活性的，这些酶中的一些具有3’核酸外切酶活性，在所述检测过程中，延伸反应在室温(实验室温度)、37℃或45℃进行。Pfu-具有3’核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；TLA-具有3’核酸外切酶活性的超嗜热古细菌(Thermococcus onnurineus)NA1DNA聚合酶；超超新星(Hypernova)-具有3’核酸外切酶活性的Pwo DNA聚合酶的变体(突变体)；德尔塔3(Delta3)-具有降低的3’核酸外切酶活性的Pwo DNA聚合酶的变体(突变体)；KOD外切+(KOD exo+)-具有3’核酸外切酶活性的超嗜热始原菌(Thermococcuskodakaraensis)DNA聚合酶；KOD外切-(KOD exo-)-不具有3’核酸外切酶活性的超嗜热始原菌(Thermococcus kodakaraensis)DNA聚合酶；梦Taq(DreamTaq)-不具有3’核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶的变体。
图3显示的条形图是描绘使用本发明方法检测白细胞介素-8(100pM)所用不同超嗜热聚合酶的活性的。Pfu-具有3’核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；Pfu外切-(Pfuexo-)-不具有3’核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；超超新星(Hypernova)-具有3’核酸外切酶活性的Pwo DNA聚合酶的变体(突变体)。
图4显示的条形图是使用本发明方法检测白细胞介素-8(100pM)所用不同嗜热聚合酶的活性进行比较的条形图，其中包括聚合酶在内的用于反应的延伸步骤的组分在室温被加入。Pfu-具有3’核酸外切酶活性的Pfu DNA聚合酶；T4-具有3’核酸外切酶活性的T4DNA聚合酶。
图5显示了条形图描绘了使用本发明方法检测白细胞介素-8(IL8)或神经胶质细胞-衍生的神经营养因子(GDNF)时所用的Pfu DNA聚合酶活性，其中延伸反应在45℃或50℃进行。被延伸以形成延伸产物的邻近探针的核酸结构域是线性的(原始Hyb)(Hyb Orig)或包括发夹结构(Hyb#3或Hyb#5)。
图6是显示在本发明方法中使用Pwo DNA聚合酶来检测样品中不同浓度的分析物所产生的信号的折线图。该图显示了使用偶联至线性核酸结构域(VEGF org)的邻近探针与偶联至包含发夹结构的核酸结构域(VEGF HP5)的邻近探针的分析之间的区别。
图7显示了偶联至具有如下结构的核酸结构域的邻近探针的比较：线性结构(1)，封闭构象的发夹结构(2)和开放构象的发夹结构(3)。
图8显示了针对血浆样品，PEA的不同定量PCR分析的比较。
实施例
邻近-探针的制备
使用三份(batch)多克隆抗体(IL8(针对白细胞介素-8)：RnD系统、AF-208-NA；VEGF(针对血管内皮生长因子)：AF-193-NA；GDNF(针对神经胶质细胞系-衍生的神经营养因子)：AF-212-NA)。使用Innovas Lightning-Link缀合技术将每一批多克隆抗体偶联至两条不同的ssDNA链。每条链通过5’端偶联至抗体：
A-缀合物(参见图7)
5’TCACGGTAGCATAAGGTGCAGTATGAGAACTTCGCTACAG-3’(SEQ ID NO:3)；
B-缀合物(参见图7)
5’-GGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGATGAGACTGGATGAA-3’(SEQ ID NO:4)。
被称为“延伸寡核苷酸”的第三寡核苷酸以4:1(寡核苷酸：缀合物)的比值杂交至A-缀合物。
对三种不同的“延伸寡核苷酸”进行了测试，其中它们中的两种已被设计为在低温形成发夹环。
原始的(线性寡核苷酸)：
5’-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCAGTCT-3’(SEQ IDNO:5)；
HP3(发夹寡核苷酸)：
5’-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGACTGAATCCAGTCT-3’(SEQ IDNO:6)；
HP5(发夹寡核苷酸)：
5’-CTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCACCTTATGCTACCGTGAAGGCTGAATCCAGTCT-3’(SEQ IDNO:7)
以粗体加下划线来标出发夹寡核苷酸中的互补核苷酸。
邻近延伸分析(PEA)中测试不同的聚合酶
使用下面描述的方案来测试不同聚合酶以测定它们在邻近延伸分析中的效率。结果显示在图2中，图2证实超嗜热聚合酶，例如Pfu和Pwo(超超新星和德尔塔3)，能够在室温下被加入到包含邻近探针和靶标分析物的样品中，当与不含酶的分析比较时，它们在PEA中不会产生显著的信号。这表明这些酶在室温下是无聚合酶活性或只具有聚合酶最小活性的。对于Pfu和Pwo而言，在37℃和45℃培养的PEA中产生的信号能够清楚地区别于室温下培养的PEA中产生的信号。相反，在上述三个测试温度中任一温度下，使用嗜热聚合酶的分析中产生的信号不容易被区别开，即，这些聚合酶在PEA中显示高背景活性。
方案#1
将1μL样品(PBS+0.1％BSA缓冲液，来自RnD系统的抗原标准品(IL-8：208-IL-010/CF；VEGF：293-VE-010/CF；GDNF：212-GD-010/CF)，EDTA血浆)与4μL含有如下物质的pH为6.7的分析溶液进行混合：0.084mg/ml山羊IgG(西格玛奥德里奇I9140)(Sigma AldrichI9140)，50μg/ml单链鲑鱼精子DNA(西格玛奥德里奇D7656)(Sigma Aldrich D7656)，0.05％鱼胶(西格玛G7765)(Sigma G7765)，0.1％BSA，4mM EDTA，0.1％Triton-X100，1μM封闭缀合物(Olink AB，国际专利WO2012/007511)和133pM的每种PEA缀合物(邻近探针，如上所述)。将反应混合物在37℃培养1小时。
在25℃，将96μL含有如下物质的稀释混合物加入到培养的样品中：67.7mM Tris-HCl pH8.8，17mM硫酸铵，2.1mM MgCl2，1.0mM二硫苏糖醇，31.3μM(每种)的dNTP和0.5单位的DNA聚合物(Pfu(富酶泰斯，EP0572)(Fermentas，EP0572)，TLA(柏业，E-3200)(Bioneer，E-3200)，超超新星(DNA格旦斯克，RP23)(DNA Gdansk，RP23)，德尔塔3(DNA格旦斯克，RP22)(DNA Gdansk，RP22)，KOD(东洋纺，KOD-101)(Toyobo，KOD-101)，KOD外切-(东洋纺)(Toyobo)，梦Taq(富酶泰斯，EP0703)(Fermentas，EP0703))。反应板在PCR仪中在25℃培养10分钟，随后在25℃、37℃或45℃培养20分钟，之后在80℃培养10分钟。
对于延伸产物的qPCR检测，将4μL延伸产物转移到qPCR板中，并且与6μL qPCR混合物(25mM Tris-HCl pH8.2，11.3mM氯化镁，50mM氯化钾，8.3mM硫酸铵，8.3％海藻糖(阿克罗斯有机，182550250)(Acros Organics，182550250)，333μM(每种)dNTP，1.67mM二硫苏糖醇，833nM的每种引物(正向：5’-TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3’(SEQ ID NO:8)，反向：5’-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3’(SEQ ID NO:9))，0.25X SYBR Green(GTF费舍尔科技，307104406)(GTF Fisher Scientific，307104406)，0.25U白金Taq(英骏，300100338)(Invitrogen，300100338)和2μM ROX参比物(GTF费舍尔科技，307101211)(GTF FisherScientific,307101211))进行混合。两步qPCR在如下条件下运行：起始的变性步骤在95℃进行5分钟，随后是45个循环的变性，每次是95℃变性15秒，之后是在60℃结合的退火和延伸进行1分钟。
邻近延伸分析(PEA)中测试不同的邻近探针核酸结构域的结构
使用下面描述的方案来测试不同邻近探针核酸结构域以测定它们在邻近延伸分析中的效率。结果显示在图5中，图5证实展开邻近探针，即偶联至含有发夹结构的核酸结构域的邻近探针对于改善在PEA中信号：噪音比是有用的。
PEA方案#2
将1μL样品(PBS+0.1％BSA缓冲液，来自RnD系统208-IL-010的IL-8抗原标准品，EDTA血浆)与4μL含有如下物质的pH为6.7的分析溶液进行混合：0.084mg/ml山羊IgG(西格玛奥德里奇I9140)(Sigma Aldrich I9140)，50μg/ml单链鲑鱼精子DNA(西格玛奥德里奇D7656)(Sigma Aldrich D7656)，0.05％鱼胶(西格玛G7765)(Sigma G7765)，0.1％BSA，4mMEDTA，0.1％Triton-X100，1μM封闭缀合物(Olink AB，国际专利WO2012/007511)和133pM的每种PEA缀合物(邻近探针，如上所述)。反应混合物在37℃培养1小时。
在25℃，将96μL含有如下物质的稀释混合物加入到培养的样品中：67.7mM Tris-HCl pH8.8，17mM硫酸铵，2.1mM MgCl2，1.0mM二硫苏糖醇和31.3μM(每种)的dNTP。然后，反应板在45℃或50℃培养30分钟。
对于延伸产物的qPCR检测，将4μL延伸产物转移到qPCR板中，并且与6μL qPCR混合物(25mM Tris-HCl pH8.2，11.3mM氯化镁，50mM氯化钾，8.3mM硫酸铵，8.3％海藻糖(阿克罗斯有机，182550250)(Acros Organics，182550250)，333μM(每种)dNTP，1.67mM二硫苏糖醇，833nM的每种引物(正向：5’-TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3’(SEQ ID NO:10)，反向：5’-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3’(SEQ ID NO:11)，Biomers公司)，0.25X SYBRGreen(GTF费舍尔科技，307104406)(GTF Fisher Scientific，307104406)，0.25U白金Taq(英骏，300100338)(Invitrogen，300100338)和2μM ROX参比物(GTF费舍尔科技，307101211)(GTF Fisher Scientific,307101211))进行混合。两步qPCR在如下条件下运行：起始的变性步骤在95℃进行5分钟，随后是45个循环的变性，每次是95℃变性15秒，之后是在60℃结合的退火和延伸进行1分钟。
图6显示来自与上述方案等同分析的结果，其中，使用线性杂交寡核苷酸和一种发夹寡核苷酸对检测不同浓度VEGF进行了测定。结果清楚地表明使用本发明方法中的发夹寡核苷酸可进一步改善信号：噪音比。
在邻近延伸分析(PEA)中超嗜热聚合酶和非耐热聚合酶的比较
使用下面描述的方案对两种聚合酶，即Pfu和T4DNA聚合酶，进行比较以测定它们在邻近延伸分析中的效率。结果显示于图4中，图4证实与室温下具有高活性的酶例如T4DNA聚合酶相比，室温下无活性或具有最小活性的酶，例如Pfu，显示了改善的信号：噪音比。
PEA方案#3
将1μL样品(PBS+0.1％BSA缓冲液，来自RnD系统208-IL-010的IL-8抗原标准品，EDTA血浆)与4μL含有如下物质的pH为6.7的分析溶液进行混合：0.084mg/ml山羊IgG(西格玛奥德里奇I9140)(Sigma Aldrich I9140)，50μg/ml单链鲑鱼精子DNA(西格玛奥德里奇D7656)(Sigma Aldrich D7656)，0.05％鱼胶(西格玛G7765)(Sigma G7765)，0.1％BSA，4mMEDTA，0.1％Triton-X100，1μM封闭缀合物(Olink AB，国际专利WO2012/007511)和133pM的每种PEA缀合物(邻近探针，如上所述)。反应混合物在37℃培养1小时。
探针培养后，将样品转移至热循环仪，放置在37℃。将76μL含有如下物质的稀释混合物加入到培养的样品中：56.5mM Tris-HCl pH8.8，16.8mM硫酸铵，1.01mM氯化镁和1mM二硫苏糖醇。在37℃5分钟之后，第二次加入20μL延伸混合物(59.3mM Tris-HCl pH8.8，17.7mM硫酸铵，1.05mM二硫苏糖醇，1mM氯化镁，和1单位的T4DNA聚合酶(富酶泰斯，#EP0062)(Fermentas，#EP0062)或0.5单位的Pfu DNA聚合酶(富酶泰斯，EP0572)(Fermentas，EP0572))。延伸反应在25℃或37℃进行1或20分钟，然后在85℃加热灭活10分钟。
对于延伸产物的qPCR检测，将4μL延伸产物转移到qPCR板中，并且与6μL qPCR混合物(24.3mM Tris-HCl pH8.2，10.6mM氯化镁，48.3mM氯化钾，8.1mM硫酸铵，8.1％海藻糖(阿克罗斯有机，182550250)(Acros Organics，182550250)，333μM(每种)dNTP，1.62mM二硫苏糖醇，806nM的每种引物(正向：5’-TCGTGAGCCCAAGTGTTAATTTGCTTCACGA-3’(SEQ ID NO:12)，反向：5’-TGCAGTCTGTAGCGAAGTTCTCATACTGCA-3’(SEQ ID NO:13)，Biomers公司)，403nM分子信标(FAM-CCCGCTCGCTTATGCTACCGTGACCTGCGAATCCCGAGCGGG-DABSYL,(SEQ IDNO:14)Biomers公司)，白金Taq(英骏，300100338)(Invitrogen，300100338)和1.93μM ROX参比物(GTF费舍尔科技，307101211)(GTF Fisher Scientific,307101211))进行混合。两步qPCR在如下条件下运行：起始的变性步骤在95℃进行5分钟，随后是45个循环的变性，每次是95℃变性15秒，之后是在60℃结合的退火和延伸进行1分钟。
使用不同的实时(定量)PCR分析的邻近延伸分析的比较
图8说明了标准化的荧光信号，随和每次PCR循环(A-C)其是增加的。当使用分子信标时观察到了基线的明显不同，这在使用非序列特异性的嵌入染料时是不会观察到的，嵌入染料诸如是或EvaGreenTM(比较A与B，和A与C)。相比于等体积的含PBS的缓冲液，100μl的总反应体积中少至1μl的血浆或血清可提高基线。血浆样品中这种升高的基线会影响对数期曲线的斜率，使得难以正确设置阈值，从而导致Ct值的误算并经常导致回收率远超过100％。使用整合至双链DNA的或EvaGreenTM的分析看起来并没有受到1μl血浆或血清的影响，且更一致的给出了更接近约100％的回收率。
PEA方案#4
缀合于探针A或探针B(如上所述)的50pM的VEGF抗体的混合物与1μl缓冲液或者1μl人血浆(EDTA)或血清一起以4μl的总体积在37℃培养1小时。
培养后，将96μl延伸溶液与0.25μM分子信标、0.15x或0.125xEvaGreenTM加入到上述培养混合物(50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.75mM MgCl2，0.75mMDTT，12.5mM AmSO4，2mM Mg2SO4，0.15％曲通(Triton)，0.15％BSA，2.08％Trealos，0.1mM的每种dNTP，1μM正向引物和反向引物，0.6μM ROX，1U超超新星聚合酶(+1U猎豹Taq(CheetaTaq)，用于分子信标分析))。起始延伸步骤(50℃20分钟)之后进行预扩增步骤(对于分子信标，95℃，15秒；60℃，30秒；76℃，30秒；x10个循环，对于SybrGreen和EvaGreen，95℃，15秒；60℃，1分钟；x10个循环)。预扩增步骤之后，将20μl反应混合物转移到实时PCR板，并采用如下条件进行分析和扩增：分子信标(MB)：95℃，5分钟+(95℃，10秒；50℃，30秒；72℃，30秒)x40个循环；SybrGreen和EvaGreen(Sybr/EvaGreen)：95℃，5分钟+(95℃，15秒；60℃,1分钟)x40个循环)。
表1

Claims (27)

1.一种检测样品中分析物的非诊断目的的方法，包括：
(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；
(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；
(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应包括将分析的温度提高至至少30℃并使用聚合酶，所述聚合酶的特点是40℃时其具有小于或等于最大酶活性的20％的活性，且25℃时其具有小于或等于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃；和
(d)扩增和检测延伸产物；
其中，在步骤(c)中，所述聚合酶选自Pfu DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶，或者，所述聚合酶由SEQ ID NO:2的多肽序列构成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的特点是在40℃时，其具有小于或等于最大酶活性的15％的活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的特点是在40℃时，其具有小于或等于最大酶活性的10％的活性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是至少70℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少45℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少50℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少55℃。
10.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，邻近探针组中的至少一个邻近探针是展开邻近探针，包括偶联至具有至少一个发夹结构的核酸结构域的分析物结合结构域。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述展开邻近探针的核酸结构域的发夹结构包括核酸结构域的游离3’可延伸端。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，展开后，所述第一和第二邻近探针的核酸结构域互相互补，或者与通用模板互补。
13.根据权利要求1-9、11或12任一项所述的方法，其中，在所述样品与聚合酶接触之前，将步骤(d)扩增反应所用的一些或全部试剂加入到样品中，或者其中，所述一些或全部试剂与聚合酶同时接触样品。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤(b)和(c)之间加入所述试剂。
15.根据权利要求1-9、11、12或14任一项所述的方法，其中，步骤(d)包括聚合酶链式反应。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，聚合酶链式反应是定量聚合酶链式反应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，定量聚合酶链式反应使用插入核酸分子以提供检测信号的染料。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述检测信号是荧光信号。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，插入核酸分子以提供检测信号的染料是SYBR或EvaGreenTM。
20.根据权利要求1-9、11、12、14或16-18任一项所述的方法，其中，第一和第二邻近探针的一个或两个核酸结构域在步骤(c)被延伸。
21.根据权利要求1-9、11、12、14或16-18任一项所述的方法，其中，至少一个核酸结构域是部分双链的。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，部分双链的核酸结构域包括杂交至夹板寡核苷酸的单个单链核酸结构域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，步骤(a)之前，夹板寡核苷酸预杂交至所述邻近探针之一的核酸结构域。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，夹板寡核苷酸在步骤(c)被延伸以形成延伸产物。
25.根据权利要求22或23所述的方法，其中，夹板寡核苷酸作为游离核酸分子而被单独提供。
26.根据权利要求1-9、11、12、14、16-18、22或23任一项所述的方法，包括使用几组的至少第一和第二邻近探针的多重分析，其中每组产生唯一的延伸产物。
27.根据权利要求1-9、11、12、14、16-18、22或23任一项所述的方法，其中，所述至少第一和第二邻近探针中的至少一个的分析物结合结构域是抗体。
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