CN117821412A - 一种dCE-KOD DNA聚合酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种dCE‑KOD DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述dCE‑KOD DNA聚合酶通过在KOD DNA聚合酶蛋白序列N端融合表达大肠杆菌素CE的突变体dCE得到，其中dCE为dCE2、dCE7、dCE8和dCE9中任一。相较于天然KOD DNA聚合酶，dCE‑KOD DNA聚合酶的持续合成能力得到有效提高且对模板具有更高的敏感性，故本发明提供的dCE‑KOD DNA聚合酶在基因克隆、长片段的高保真性扩增以及PCR诊断中有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和蛋白质工程领域，具体涉及一种dCE-KOD DNA聚合酶及其制备方法和应用。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)是近几十年来普及最迅速，应用最广泛的分子生物学技术。PCR是一种体外模拟体内的DNA复制过程，从而大量扩增特定DNA片段的基因操作技术。在模板DNA、引物、dNTP存在的条件下，DNA聚合酶利用反应温度的循环变化，能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。PCR技术广泛应用于分子克隆、基因组测序、法医学鉴定以及遗传病、传染病的诊断等方面，推动了精准医疗领域的发展，加速了基因与遗传病相关性的研究。但PCR技术也面临很多方面的局限性，例如血液和组织样本不能直接用于PCR，需要进一步提取DNA作为扩增模板，同时PCR扩增的长度和扩增速度方面也有待进一步提高，这些需求驱使人们不断发现和改造DNA聚合酶。
1988年，Rand K Saiki首次将从栖热水生菌(Thermus aquaticus YT-1)来源的耐高温Taq DNA聚合酶应用于PCR，改变了以往在PCR循环过程中不断补加聚合酶的繁琐步骤，大大简化了PCR流程。但由于Taq DNA聚合酶缺乏3’-5’的核酸外切酶活性，在DNA的体外合成的过程中无法及时校正错配的单核苷酸，导致PCR产物的忠实性较低。研究人员又陆续发现了Tgo、Vent、Deep、Pfu以及KOD1等一系列具有校正功能的耐热DNA聚合酶，显著提高了PCR扩增的保真性。但是，总的来说目前PCR常用的DNA聚合酶在其天然宿主中的作用主要是进行DNA损伤修复以及协助完成基因的重组等，因而它们的进行性和延伸速率都较低。随着医学检测和生命科学技术的不断进步，急需在保证PCR扩增灵敏性、特异性及忠实性的前提下，提高耐热DNA聚合酶的延伸活性和延伸速度的策略。KOD1 DNA聚合酶来源于嗜热菌Thermococcus kodakarensisKOD1，因其良好的耐热性、高保真性和较高的进行性成为较关注的改造对象，发明人期望通过基因工程改造的手段进一步改善其酶学性质。
大肠杆菌产生的大肠杆菌素(colicin)是一种由质粒编码的蛋白质毒素，其中大肠杆菌素E家族的DNA酶包括CE2、CE7、CE8和CE9，是一类结构高度保守的非专一性核酸内切酶。有报道表明，4种CE的DNA酶结构域位于蛋白质分子的C端，约15kDa，可以进行截短表达。与此同时，将CE的C端DNA酶结构域中参与DNA切割的氨基酸进行突变后获得的dCE蛋白仍保留强的非特异性DNA结合活性，但不会对DNA进行切割。同时，发明人团队的前期工作发现dCE具有很好热稳定性。
发明内容
有鉴于此，本发明尝试将dCE蛋白与KOD DNA聚合酶融合表达后，首次发现dCE能够显著提高KOD DNA聚合酶的特异性扩增效率，为耐高温DNA聚合酶持续合成能力不高的问题提供了一种解决途径。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种dCE-KOD DNA聚合酶，具体为：在KOD DNA聚合酶蛋白序列N端融合表达大肠杆菌素CE的突变体dCE，且所述dCE的核酸序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。
本发明通过在KOD DNA聚合酶中引入了一种非特异性DNA结合蛋白dCE，从而显著提高了KOD DNA聚合酶的特异性扩增效率，其中dCE是由大肠杆菌素的C端DNA酶结构域(CE2、CE7、CE8、CE9)改造而成，且分别命名为dCE2、dCE7、dCE8、dCE9，故发明人将融合KODDNA聚合酶后所得的融合蛋白命名为dCE-KOD DNA聚合酶。
优选地，在上述dCE-KOD DNA聚合酶中，所述KOD DNA聚合酶蛋白序列来源于Thermococcus kodakarensis KOD1菌株，其编码基因如SEQ ID NO.9所示。
更为优选地，在上述dCE-KOD DNA聚合酶中，所述dCE-KOD DNA聚合酶为以下任一：
dCE2-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示或在SEQ ID NO.5所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE7-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或在SEQ ID NO.6所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE8-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或在SEQ ID NO.7所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE9-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或在SEQ ID NO.8所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明实施例中提供的dCE2-KOD、dCE7-KOD、dCE8-KOD和dCE9-KOD的氨基酸序列中均带有纯化标签，需要说明的是，在具体实施过程中，根据实际需求对标签序列进行更换或修改后得到的与本发明dCE-KOD DNA聚合酶功能相同的融合蛋白仍属于本发明的保护范围。
本发明第二方面提供了与本发明所述dCE-KOD DNA聚合酶相关的生物材料，包括但不限于以下材料：
a)编码本发明所述dCE-KOD DNA聚合酶的基因；
b)含有a)所述基因的重组表达载体；
c)含有a)所述基因或b)所述重组表达载体的重组细胞。
本发明第三方面提供了一种本发明所述dCE-KOD DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、根据KOD DNA聚合酶和dCE蛋白的基因序列信息设计并合成引物，通过Overlapping PCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的dCE-KOD DNA聚合酶基因编码序列；
S2、将步骤S1得到的dCE-KOD DNA聚合酶基因片段克隆至表达载体pET23a中构建重组表达载体pET23a-dCE-KOD；
S3、将重组表达载体pET23a-dCE-KOD转化大肠杆菌，诱导表达得到目的蛋白。
优选地，步骤S1所述KOD DNA聚合酶基因编码序列如SEQ ID NO.9所示，所述dCE蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。
本发明第四方面提供了本发明所述dCE-KOD DNA聚合酶在DNA复制中的应用，本发明的实验数据表明，相对于天然的KOD DNA聚合酶，dCE-KOD DNA聚合酶的延伸速率提高了一倍，且对模板的浓度的要求降低了一倍。
本发明第五方面提供了本发明所述dCE-KOD DNA聚合酶在制备PCR扩增试剂或试剂盒中的应用。
在上述PCR扩增试剂或试剂盒中，还可以包括其他用于PCR扩增的试剂和/或耗材。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明对核酸扩增技术中的DNA聚合酶进行了分子生物学改造，改造后聚合酶的持续合成能力得到有效提高，并且在重组酶介导的核酸扩增反应中对模板的敏感性有所提高，同时扩增速率也提高了一倍。
(2)目前血液或组织样品常常由于样品DNA模板浓度太低而很难直接用于PCR检测，通常需要抽提纯的DNA样品，而本发明改造后的DNA聚合酶对模板具有更高的敏感性，能够显著提高重组酶介导的核酸扩增技术的DNA扩增效果，因此有望实现血液或组织样品的直接检测。
(3)本发明还提供了改造后聚合酶的具体制备方法和应用方法，为dCE-KOD DNA聚合酶的实际应用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例中重组质粒pET23a-dCE7-KOD的结构示意图；
图2为本发明实施例中dCE7-KOD重组表达及纯化过程中样品的SDS-PAGE图，图中，泳道M为Marker，泳道1为破菌总蛋白上清，泳道2为破菌沉淀，泳道3为破菌上清，泳道4为热处理后的上清，泳道5为目的蛋白(约106kDa)；
图3为本发明实施例2中所用PCR程序的示意图；
图4是本发明实施例中KOD DNA聚合酶和dCE-KOD DNA聚合酶扩增速率的对比结果图，图中，泳道M为DNAMarker，泳道2为2kb片段，泳道4为4kb片段，泳道6为6kb片段，泳道8为8kb片段，泳道10为10kb片段；
图5是本发明实施例中KOD DNA聚合酶和dCE-KOD DNA聚合酶对模板敏感度的对比结果图，图中，泳道M为DNA Marker，泳道1-12分别为不同模板浓度的PCR结果(泳道1-2为0.125ng，泳道3-4为0.25ng，泳道5-6为0.5ng，泳道7-8为1ng，泳道9-10为2ng，泳道11-12为4ng)。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”以及它的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
为了解决现有技术中KOD DNA聚合酶延伸活性和延伸速度都较低的问题，本发明提供了一种新的解决思路，具体为：在天然KOD DNA聚合酶蛋白序列N端融合表达dCE，其中dCE具体为：dCE2(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)、dCE7(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)、dCE8(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)和dCE9(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
以下实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例所用大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司，所用引物委托中国生工生物工程有限公司合成，含有dCE基因的质粒pET23a-dCE委托中国金开瑞生物科技有限公司合成，所用载体pET23a购自Novagen公司。
实施例1dCE-KODDNA聚合酶的制备
本例以dCE7-KOD为例，详细说明了dCE-KODDNA聚合酶的制备过程。
(1)重组质粒pET23a-dCE7-KOD的构建。
通过金开瑞公司合成KOD DNA聚合酶基因序列，其编码蛋白质的N端附加6×His亲和标签。利用引物对KOD-his-F和KOD-R进行PCR扩增目的基因并克隆到pET23a载体上，从而构建重组载体。重组载体经测序验证后命名为pET23a-KOD。根据dCE7的氨基酸序列合成对应的基因片段，利用引物对dCE7-F/dCE7-R和KOD-his-F/KOD-R分别扩增KOD和dCE7基因片段，并通过片段两端所带的同源臂进行T5核酸外切酶介导的基因克隆，从而将dCE7编码序列连接到KOD的编码序列5’端，重组质粒经DNA测序验证后命名为pET23a-dCE7-KOD(见图1)。
表1构建重组质粒pET23a-dCE7-KO所用的引物信息
(2)dCE7-KOD的大肠杆菌重组表达和纯化，具体步骤如下：
①将经过测序验证的重组表达质粒pET23a-dCE7-KOD转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm过夜培养。
②将菌液以1/100的比例接种至400mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600值达到0.6时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5mM进行诱导。同时设置表达载体对照组，18℃低温诱导表达16h后取菌液，6000rpm离心10min，去上清。
③Ni-NTA上样缓冲液(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑,pH 7.9)重悬菌沉淀，超声破碎后，14000rpm离心30min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE。
④将上清置于75℃热水浴30min后，14000rpm离心30min，然后在上清中加入DNA酶和RNA酶，于37℃孵育30min，去除内源核酸。再置于75℃水浴15min，14000rpm离心30min，去掉沉淀。
⑤利用AKTA蛋白纯化系统，Ni Sepharose 6Fast Flow亲和层析柱，对目的蛋白进行亲和纯化，上样缓冲液(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑,pH 7.9)，洗脱缓冲液(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,200mM咪唑,pH 7.9)。收集蛋白洗脱峰样品并对蛋白样品进行4℃超滤，并储存在Buffer A(20mM Tris-HClpH 7.9,100mM谷氨酸钾,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.05％(v/v)NonidetP40,0.05％(v/v)Tween20)中，分装后经液氮速冻储存在-80℃。
dCE7-KOD蛋白纯化过程中各部分样品的电泳结果如图2所示，从图可知，本发明成功制备了dCE7-KOD。
实施例2dCE-KODDNA聚合酶的扩增速率检测
本例以dCE7-KOD为例，对蛋白改造之前的KOD DNA聚合酶和改造之后的dCE-KODDNA聚合酶的扩增速率进行了比较。
以pRGEB32质粒为模板，分别用1U的KODDNA聚合酶和dCE-KOD DNA聚合酶扩增2kb、4kb、6kb、8kb和10kb片段，且所用引物见表2。
表2扩增pRGEB32质粒所用的引物信息
按照图3所示设置PCR程序。
待反应结束后取4μL样品在浓度为0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，结果见图4。电泳结果显示，dCE7-KOD比KOD DNA聚合酶的延伸速率更快，dCE7-KOD在60秒内可扩增长度为10kb的片段，而KOD DNA聚合酶只能扩增长度为6kb的片段。由此可见，dCE蛋白与KOD DNA聚合酶的融合使其延伸速率提高了一倍。
实施例3dCE-KODDNA聚合酶的扩增敏感性检测
本例以dCE7-KOD为例，对蛋白改造之前的KOD DNA聚合酶和改造之后的dCE-KODDNA聚合酶的模板浓度进行了比较。
以pRGEB32质粒为模板，PCR扩增产物大小为2kb(所用引物同实施例2)。该反应是在降低模板剂浓度(连续2倍稀释梯度)的条件下进行的。且PCR程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，68℃延伸1min，循环30次；最后68℃延伸7min，4℃保存。
待反应结束后，取4μL样品在浓度为0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，结果如图5。电泳结果显示，当质粒DNA的浓度为1ng时，融合dCE的KOD DNA聚合酶可扩增目的片段，而KOD聚合酶需要2ng的质粒DNA，且扩增产量远不如dCE-KOD DNA聚合酶。由此可见，融合dCE的KOD DNA聚合酶比天然的KOD DNA聚合酶对模板的浓度的要求降低了一倍。
综上所述，本发明通过在KOD DNA聚合酶蛋白序列N端融合表达dCE，有效提高了改造后的DNA聚合酶的延伸速率和对模板的敏感性，为解决耐热DNA聚合酶延伸活性和延伸速度较低的问题提高了新的途径。
需要说明的是，以上实施例仅是本发明一部分实施例而不是全部的实施例，仅用以说明本发明的技术方案而非限制；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种dCE-KOD DNA聚合酶，其特征在于，在KOD DNA聚合酶蛋白序列N端融合表达大肠杆菌素CE的突变体dCE，所述dCE的基因序列如SEQ ID NO.1～4任一所示。
2.根据权利要求1所述的dCE-KOD DNA聚合酶，其特征在于，所述KOD DNA聚合酶来源于Thermococcus kodakarensis KOD1菌株。
3.根据权利要求2所述的dCE-KOD DNA聚合酶，其特征在于，所述dCE-KOD DNA聚合酶为以下任一：
dCE2-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示或在SEQ ID NO.5所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE7-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或在SEQ ID NO.6所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE8-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或在SEQ ID NO.7所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；或
dCE9-KOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或在SEQ ID NO.8所示序列上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
4.编码权利要求1～3任一项所述dCE-KOD DNA聚合酶的基因。
5.含有权利要求4所述基因的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述基因或权利要求5所述重组表达载体的重组细胞。
7.一种权利要求1～3任一项所述dCE-KOD DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、根据KOD DNA聚合酶和dCE蛋白的基因序列信息设计并合成引物，通过OverlappingPCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的dCE-KOD DNA聚合酶基因编码序列；
S2、将步骤S1得到的dCE-KOD DNA聚合酶基因片段克隆至表达载体pET23a中构建重组表达载体pET23a-dCE-KOD；
S3、将重组表达载体pET23a-dCE-KOD转化大肠杆菌，诱导表达得到目的蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述KOD DNA聚合酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
9.如权利要求1～3任一项所述的dCE-KOD DNA聚合酶在DNA复制中的应用。
10.如权利要求1～3任一项所述的dCE-KOD DNA聚合酶在制备PCR扩增试剂或试剂盒中的应用。
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