JP2017178804A - 融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸増幅反応において、使用できるバッファー組成を拡張させ、従来のポリメラーゼ活性を有するタンパク質よりも塩抵抗性を向上させることができるような、新規核酸合成酵素を提供する。【解決手段】ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質（例えばＡｌｂａ；Acetylation Lower Binding Affinity）と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質。【選択図】なし

Description

本発明は、新規核酸合成酵素に関する。さらに詳しくは、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質に関する。

ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。

核酸増幅法は現在までに様々な方法が開発されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。

中でも、ＤＮＡの特異的配列の増幅に用いられるＰＣＲ法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、ＰＣＲ法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。

上記のＰＣＲ法の性能および精度を向上させる手段として、ＤＮＡポリメラーゼの改変および反応バッファーの改良が行われてきた。

ＤＮＡポリメラーゼの改変の一つの手法として融合ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。融合ポリメラーゼは、所望の活性をもつタンパク質とＤＮＡポリメラーゼを組み合わせることでＤＮＡポリメラーゼの性能を野生型よりも向上させることができる。

融合タンパク質における所望の活性をもつタンパク質の一つとして、プロセッシビリティや伸長性を向上させるＤＮＡ結合タンパク質が使用されてきた。具体的には、スルホロブス・ソファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来であるＳｓｏ７ｄ、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来であるＳａｃ７ｄ、ピュロバクルム・アエロフィラム（Pyrobaculum aerophilum）由来であるＰａｅ３１９２が用いられてきた（特許文献１、特許文献２）。

それらの中で、代表的な融合ＤＮＡポリメラーゼとしては、スルホロブス・ソファタリカス由来である配列非特異的二本鎖核酸結合タンパク質（Ｓｓｏ７ｄ）とパイロコッカス・フリオサス由来であるＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）を組み合わせたＳｓｏ７ｄ−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおける伸長性やプロセッシビリティを野生型よりも向上させた。

これらの既存のＤＮＡ結合タンパク質に対して、ＡｌｂａはこれらのＤＮＡ結合性タンパク質と相同性が低く、二本鎖ＤＮＡだけでなくＲＮＡにも結合できるといった新しい特徴を有する。Ａｌｂａの詳細な機構や性質が判明したのは近年に至ってからのことであり、ＡｌｂａとＤＮＡポリメラーゼとの融合タンパク質について実際に研究がなされた例はなかった。

特許第４４０５７２５号公報 米国特許出願公開第２０１１/００８６４０６号明細書

Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２８９巻、第３号、ｐ.１４７８−１４９０（２０１４年） ＰＬＯＳ ＯＮＥ 第８巻、第２号、ｐ.ｅ５８２３７（２０１３年）. Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻、第３号、ｐ.３５２−３６３（２００５年）

本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質を提供することにある。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質が、従来は使用できなかった各種バッファー組成へも応用できることを見出した。さらには、従来の融合タンパク質よりも塩抵抗性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質とが融合されてなることを特徴とする融合タンパク質。
項２．前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡポリメラーゼである項１に記載の融合タンパク質。
項３．前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が逆転写酵素である項１に記載の融合タンパク質。
項４．前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、５０℃以上の活性最適温度である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである項２に記載の融合タンパク質。
項５．前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、６０℃、３０分の熱処理により９０％以上の残存活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである項２に記載の融合タンパク質。
項６．前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである項２に記載の融合タンパク質。
項７．前記ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質がＡｌｂａ（Acetylation Lower Binding Affinity）である項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
項８．前記Ａｌｂａがサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）由来である項７に記載の融合タンパク質。

本発明によって、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質によって、使用できるバッファー組成を拡張させ、従来のポリメラーゼ活性を有するタンパク質よりも塩抵抗性を向上させることができる。そのため、阻害物による影響を受けにくくなり、サンプルに含有する塩の影響に左右されにくいため、臨床検体などの検体間の差が大きいサンプルに対しても有用である。

各種バッファーに対してＡｌｂａ−ＴａｑとＴａｑを評価した図である。 ＮａＣｌに対する耐性についてＢｌｅｎｄＴａｑ（ＴＯＹＯＢＯ）添付バッファーを使用し、Ａｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−ＴａｑおよびＴａｑを評価した図である。 ＮａＣｌに対する耐性についてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）添付バッファーを使用し、Ａｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑを評価した図である。 ＮａＣｌに対する耐性についてＡｌｂａ−Ｔｔｈ、Ｓｓｏ７ｄ−ＴｔｈおよびＴｔｈを評価した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質である。

本発明において、ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質とは二本鎖構造に非特異的にＤＮＡおよびＲＮＡの両方に対する結合ドメインを有するタンパク質を意味する。

ポリメラーゼ活性とは、単体のヌクレオチドを重合させてポリヌクレオチドを合成する活性を意味する。

本発明において、ポリメラーゼとはポリメラーゼ活性を有する酵素を意味する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。

融合タンパク質とは、主に人工的に（
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的な手法によって）作られた
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で、２個以上のタンパク質
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が一体となって転写・発現し、一個のタンパク質を形成している状態のタンパク質である。

ＤＮＡポリメラーゼとは、１本鎖の
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を鋳型として、それに相補的な
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を持つＤＮＡ鎖を合成することができる
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を意味する。

本発明において、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡポリメラーゼである場合には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、５０℃以上、より好ましくは６０℃以上、さらに好ましくは６５℃以上の活性最適温度である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるものが好ましい。また、６０℃、３０分の熱処理により９０％以上、より好ましくは９５％以上の残存活性を有するものであってもよい。

本発明における熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）から単離されたＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。好ましくはサーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（配列番号１）またはサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）（配列番号３）であるが、これらに限定されない。

本発明において、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が逆転写酵素である場合には、レトロウイルスの逆転写酵素、レトロトランスポゾンの逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明におけるＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質としては、特に限定されるものではないが、Ａｌｂａ（Acetylation Lower Binding Affinity）、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Double Stranded RNA Binding protein）などが挙げられる。なかでも、Ａｌｂａが特に好ましい。

ＡｌｂａはＤＮＡ又はＲＮＡの２本鎖構造に配列非特異的に結合するタンパク質である（非特許文献１、非特許文献２）。スルホロブス・ソファタリカス由来のＳｓｏ１０ｂ及びスルホロブス・アシドカルダリウス由来のＳａｃ１０ｂもリシン残基のアセチル化によりＤＮＡに対する結合力が低下するため、Ａｌｂａとして言及される。

Ａｌｂａに関して核酸との結合に関与するアミノ残基は知られており（非特許文献１）、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されることで、ＤＮＡとの結合を弱めたＡｌｂａを使用してもよい。例えば、非特許文献１より、配列番号５における１６番目のリシン残基、１７番目のリシン残基、２２番目のチロシン残基、もしくは４４番目のアルギニン残基をアラニン残基に置換することが挙げられるが、これに限定されない。

本願明細書において、配列番号５示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号５上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号５の当該位置と対応する位置とする。

Ａｌｂａは濃度依存的に２量体もしくは多量体を形成するため、変異を導入して、単量体を形成しやすくしてもよい。例えば、非特許文献１より、配列番号５における６０番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基に置換することが挙げられるが、これに限定されない。

上記変異箇所に対してＡｌｂａのアミノ酸配列はアーキア（archaea）で高度に保存されており（非特許文献１）、アミノ酸配列の一次構造を比較（アラインメント）することにより、その位置を高い蓋然性で予測し確認することができる。

前記Ａｌｂａの由来としては、アーキアであるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｋｏｄ）、スルホロブス・ソファタリカス（Ｓｓｏ）、スルホロブス・シバタエ（Ｓｓｈ）及びスルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓａｃ）などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくはサーモコッカス・コダカラエンシス由来（配列番号６）である。

ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質はＮ末端にＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質を配置し、Ｃ末端にポリメラーゼ部分を配置するのが好ましいが、特にこの態様に限定されるわけではない。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関して、ポリメラーゼ部分の上流の５’側にＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質部分を配置するのが好ましいが特に限定されるわけではない。これらの２つの部分は、各々が直接的に結合していてもよく、あるいはペプチドリンカーにより離れていてもよい。当該ペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０若しくは５０又はそれ以上のアミノ酸長であってもよい。好ましくは５程度のアミノ酸長であるが、特には限定されない。

本発明において使用するベクターは、融合タンパク質のクローニング及び発現を可能とするものであれば、いかなるものでもよく、例えばファージ及びプラスミドが挙げられる。プラスミドとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、別なプラスミドの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＳＰ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ２１ｂなどがある。ファージとしては、たとえばλｇｔ１１、λＤＡＳＨ、λＺａｐＩＩなどが挙げられる。本発明において使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げられる。大腸菌としては、例えばＪＭ１０９、１０１、ＸＬ１、ＰＲ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳなどが挙げられる。本発明では上記融合タンパク質をコードする遺伝子を上記ベクターに挿入して組換え発現ベクターとし、更に、この組換え発現ベクターにて宿主細胞を形質転換する。

本発明における融合タンパク質を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。一例として、上記組換え宿主細胞を培養して、融合タンパク質遺伝子を発現させる。例えば大腸菌を宿主として、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３０℃〜３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を７０℃、１時間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパク質の発現を確認することができる。

上記方法により選抜された菌株から精製融合タンパク質を取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。すなわち、栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば７０℃、１時間処理し、その後硫安沈殿により融合タンパク質画分を回収する。この粗酵素液を透析等の方法により脱塩を行った後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
Ａｌｂａ−Ｔａｑのプラスミド作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＡｌｂａ遺伝子（配列番号６）とサーマス・アクアチクス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号１）を融合させたプラスミドを作製した。融合したＡｌｂａ−Ｔａｑの核酸配列を配列番号１０に示す。

サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＡｌｂａ遺伝子は非特許文献３に記載の情報を参考にし、人工合成にて作製した。人工合成した核酸を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流にコドンフレームを合わせた状態でｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングした。Ａｌｂａ領域とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ領域の間にペプチドリンカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒを介在させた。得られたプラスミドを、ヒートショック法にてエシェリシア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）へ形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地プレート上で１６時間培養した。形質転換で得られたシングルコロニーを酵素調製に用いた。

（実施例２）
Ａｌｂａ−Ｔａｑの作製
実施例２で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３０℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ａｌｂａ−Ｔａｑを得た。

（実施例３）
Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑのプラスミド作製
後述の実施例におけるＤＮＡポリメラーゼの評価に用いるために、スルホロバス・ソルファタリカス由来の二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子（Ｓｓｏ７ｄ）（配列番号８）とサーマス・アクアチクス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号１）を融合させたプラスミドを作製した。融合したＳｓｏ７ｄ−Ｔａｑの核酸配列を配列番号１２に示す。

スルホロバス・ソルファタリカス由来の二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子（Ｓｓｏ７ｄ）は特許文献１に記載の情報を参考にし、人工合成にて作製した。人工合成した核酸を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流にコドンフレームを合わせた状態でｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングした。Ｓｓｏ７ｄ領域とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ領域の間にペプチドリンカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒを介在させた。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を、実施例１と同様にして形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例４）
Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑの作製
実施例３で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３０℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑを得た。

（実施例５）
Ｔａｑのプラスミド作製
後述の実施例におけるＤＮＡポリメラーゼの評価に用いるために、サーマス・アクアチクス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号１）を含有するプラスミドを作製した。サーマス・アクアチクス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、プラスミドとして構築した。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を、実施例１と同様にして形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例６）
Ｔａｑの作製
実施例５で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３０℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３０℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｔａｑを得た。

（実施例７）
Ａｌｂａ−Ｔｔｈのプラスミド作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＡｌｂａ遺伝子（配列番号６）とサーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号３）を融合させたプラスミドを作製した。融合したＡｌｂａ−Ｔｔｈの核酸配列を配列番号１４に示す。

サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＡｌｂａ遺伝子は非特許文献３に記載の情報を参考にし、人工合成にて作製した。人工合成した核酸を、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流にコドンフレームを合わせた状態でｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングした。Ａｌｂａ領域とＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ領域の間にペプチドリンカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒを介在させた。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を、実施例１と同様にして形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例８）
Ａｌｂａ−Ｔｔｈの作製
実施例７で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ａｌｂａ−Ｔｔｈを得た。

（実施例９）
Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈのプラスミド作製
後述の実施例におけるＤＮＡポリメラーゼの評価に用いるために、スルホロバス・ソルファタリカス由来の二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子（Ｓｓｏ７ｄ）（配列番号８）とサーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号３）を融合させたプラスミドを作製した。融合したＳｓｏ７ｄ−Ｔｔｈの核酸配列を配列番号１６に示す。

スルホロバス・ソルファタリカス由来の二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質遺伝子（Ｓｓｏ７ｄ）は特許文献１に記載の情報を参考にし、人工合成にて作製した。人工合成した核酸を、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流にコドンフレームを合わせた状態でｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングした。Ｓｓｏ７ｄ領域とＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ領域の間にペプチドリンカーとしてＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒを介在させた。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を、実施例１と同様にして形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例１０）
Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈの作製
実施例９で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、１５ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈを得た。

（実施例１１）
Ｔｔｈのプラスミド作製
後述の実施例におけるＤＮＡポリメラーゼの評価に用いるために、サーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）遺伝子（配列番号３）を含有するプラスミドを作製した。サーマス・サーモフィルス由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）（配列番号）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、プラスミドとして構築した。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を、実施例１と同様にして形質転換し、酵素調製に用いた。

（実施例１２）
Ｔｔｈの作製
実施例１１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を７０℃にて１時間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ 塩化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、Ｔｔｈを得た。

（実施例１３）
各種バッファーへの適用
以下に記載される様々なバッファー組成を使用し、Ａｌｂａ−Ｔａｑ、Ｔａｑの増幅量について比較を実施した。比較として、５０μｌ反応系あたり１００ｎｇのＡｌｂａ−Ｔａｑ、Ｔａｑを使用した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ ＦＸ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

ＰＣＲの反応組成の一つとして、ＫＯＤ −Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（登録商標）（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１８、１９）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。

上記反応液に対する反応は９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

結果を図１に示す。Ｔａｑでは８種類のバッファーのうち、１種類のみ増幅が確認されたことに対して、Ａｌｂａ−Ｔａｑは８種類のバッファーのうち、８種類のみ増幅が確認された。これはバッファー成分の塩に対して優れた抵抗性を有するためと考えられる。

（実施例１４）
塩抵抗性−１
Ａｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑ、Ｔａｑの塩抵抗性（ＮａＣｌ：５０ｍＭ〜２００ｍＭ）について増幅量の比較を実施した。比較として、５０μｌ反応系あたり２５ｎｇのＡｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑ、Ｔａｑを使用した。

ＰＣＲは、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２０、２１）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ、および各酵素２５ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

結果を図２に示す。Ａｌｂａ−Ｔａｑは１５０ｍＭ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑは１２５ｍＭ、そしてＴａｑは５０ｍＭまで増幅が確認された。Ａｌｂａ−Ｔａｑは最も高い塩耐性を示した。Ａｌｂａ−Ｔａｑはサンプルに含有する塩の影響に左右されにくいため、臨床検体などの検体間の差が大きいサンプルに対して効果的である。

（実施例１５）
塩抵抗性−２
Ａｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑの塩抵抗性（ＮａＣｌ：５０ｍＭ〜２００ｍＭ）について増幅量の比較を実施した。比較として、５０μｌ反応系あたり２５ｎｇのＡｌｂａ−Ｔａｑ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑを使用した。

ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２０、２１）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素２５ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

結果を図３に示す。Ａｌｂａ−Ｔａｑは１００ｍＭ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔａｑは５０ｍＭまで増幅が確認された。Ａｌｂａ−Ｔａｑは、ＢｌｅｎｄＴａｑ添付のバッファーと同様に高い塩耐性を示した。

（実施例１６）
塩抵抗性−３
Ａｌｂａ−Ｔｔｈ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈ、Ｔｔｈの塩抵抗性（ＮａＣｌ：５０ｍＭ〜２００ｍＭ）について増幅量の比較を実施した。比較として、５０μｌ反応系あたり１００ｎｇのＡｌｂａ−Ｔｔｈ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈ、Ｔｔｈを使用した。

ＰＣＲは、ＫＯＤ ＦＸ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付のＢｕｆｆｅｒ用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、各１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２０、２１）、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）５０ｎｇ及び各酵素１００ｎｇを含む５０μｌの反応液を調製した。反応は９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

結果を図４に示す。Ａｌｂａ−Ｔｔｈは１２５ｍＭ、Ｓｓｏ７ｄ−Ｔｔｈは０ｍＭ、そしてＴｔｈは５０ｍＭまで増幅が確認された。Ａｌｂａ−ＴｔｈはＡｌｂａ−Ｔａｑと同様に高い塩耐性を示した。ＡｌｂａをＴａｑもしくはＴｔｈと融合させることで、Ｔａｑ及びＳｓｏ７ｄ−Ｔａｑよりも高い塩耐性を示した。

本発明はＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質との融合タンパク質によって、使用できるバッファー組成を拡張させ、従来のポリメラーゼ活性を有するタンパク質よりも塩抵抗性を向上させることができる。そのため、サンプルに含有する塩の影響に左右されにくいため、臨床検体などの検体間の差が大きい遺伝子診断等の分野において、広く利用することができる。

Claims (8)

1. ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質と、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質とが融合されてなることを特徴とする融合タンパク質。
2. 前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質がＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が逆転写酵素である請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、５０℃以上の活性最適温度である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項２に記載の融合タンパク質。
5. 前記ポリメラーゼ活性を有するタンパク質が、６０℃、３０分の熱処理により９０％以上の残存活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項２に記載の融合タンパク質。
6. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである請求項２に記載の融合タンパク質。
7. 前記ＤＮＡ/ＲＮＡ結合タンパク質がＡｌｂａ（Acetylation Lower Binding Affinity）である請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
8. 前記Ａｌｂａがサーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）由来である請求項７に記載の融合タンパク質。