JP2003534796A - 改良された核酸修飾酵素 - Google Patents
改良された核酸修飾酵素Info
- Publication number
- JP2003534796A JP2003534796A JP2002500693A JP2002500693A JP2003534796A JP 2003534796 A JP2003534796 A JP 2003534796A JP 2002500693 A JP2002500693 A JP 2002500693A JP 2002500693 A JP2002500693 A JP 2002500693A JP 2003534796 A JP2003534796 A JP 2003534796A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- protein
- domain
- sequence
- binding domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 163
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 154
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 116
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 175
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 157
- 101000844752 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) DNA-binding protein 7d Proteins 0.000 claims description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 80
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 60
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 51
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 claims description 14
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 13
- 101000844753 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) DNA-binding protein 7d Proteins 0.000 claims description 13
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 13
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 10
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 claims description 10
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 claims description 9
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 claims description 9
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- -1 gyrase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims 4
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 claims 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 45
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 97
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 63
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 61
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 46
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 29
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 20
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 19
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 11
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 9
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 ZRPAUEVGEGEPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 4
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102220504264 Endogenous retrovirus group K member 104 Rec protein_L71F_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220644177 Serum paraoxonase/arylesterase 2_L71R_mutation Human genes 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVKRKMWZYMKVTQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C=NN(C=1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JVKRKMWZYMKVTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205101 Sulfolobus Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 102000022788 double-stranded DNA binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700027842 Bacteriophage lambda DNA replication complex Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001323873 Brockia Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010071146 DNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 102000007528 DNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710149498 Double-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710135007 Histone-like protein p6 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 241000408495 Iton Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000202997 Methanothermus Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100030477 Plectin Human genes 0.000 description 1
- 108010054050 Plectin Proteins 0.000 description 1
- 101150076840 PolI gene Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091013637 double-stranded DNA binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013260 porous coordination network Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001447 template-directed synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical group 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
記核酸を結合し、そして触媒的に修飾する酵素の能力を増強する態様での、前記
酵素への配列−非特異的核酸結合ドメインの結合である。
た生成物の量は、修飾酵素/核酸複合体の安定性を高めることによって増強され
得る。従来技術は、核酸修飾酵素への高い確立の結合部位、例えば正に荷電され
た結合末端の結合が、前記修飾酵素が前記核酸と相互作用する頻度を高めること
ができることを示している(例えば、アメリカ特許第5,474,911号を参照のこと
)。
率が、配列―非特異的二本鎖核酸結合ドメインを酵素又はその触媒部位に結合す
ることによって高められる新規修飾酵素を提供する。プロセッシング特性である
修飾タンパク質は、酵素のみに比較して、結合ドメインに結合される場合、高め
られたプロセッシング性を示す。さらに、プロセッシング性及び非プロセッシン
グ性修飾酵素の両者は、本明細書に記載される典型的な結合ドメインに結合され
る場合、高い温度での高められた効率を示す。
kb又はそれ以上の長さの配列の増幅性を提供する融合ポリメラーゼを提供する。
長いPCRを行うためのポリメラーゼ混合物は、当業界において知られている。そ
のような混合物に関する1つの困難性は、長い延長時間が予測される生成物の最
適な収率のために必要とされることである。従来の推薦は、kb当たり1分の延長
時間を可能にすることである。10kbの生成物に関して、及び40サイクルの増幅を
用いて、PCRは約7時間を要する。
て、長いPCRを行う増強された能力を示す修飾されたポリメラーゼ酵素が本明細
書において記載される。それらの修飾された酵素、例えばPfu−Sso7dは、誤差−
補正活性及び配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを有するポリメラーゼを組
み込み、そして従って、ポリメラーゼ混合物を提供する。さらに、そのような修
飾された酵素は、従来のポリメラーゼ酵素により必要とされるよりも短い延長時
間を用いて所定のフラグメントを効果的に増幅することができる。従って、従来
の混合物の代わりに本明細書に記載されるハイブリッドポリメラーゼの使用は、
大きなフラグメントを増幅するために必要とされる反応時間を、例えば約7時間
から約2時間に低めることができる。
ロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合さ
れている少なくとも2種の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前
記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非
特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸修飾ドメ
インのプロセッシング特性を増強することを特徴とする。本発明の1つの観点に
おいては、核酸修飾ドメインは、熱安定性であるポリメラーゼ活性、例えばサー
マスポリメラーゼドメインを有する。他の態様においては、前記触媒ドメインは
、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ
、ジャイレース又はトポイソメラーゼである。
、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特
異的に結合する。他方では、前記配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dに
対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含むことができる
。核酸結合ドメインはまた、Sso7dでもあり得る。 もう1つの態様においては、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して
生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合するか、又はピロコーカス
・フルオサスのPCNA相同体である配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインを含む
。
、触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合されている少なくとも2種
の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前記配列−非特異的二本鎖
核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメイン
を有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少な
くとも1℃安定化することを特徴とする。そのようなタンパク質の核酸修飾ドメ
インは、熱安定性であり得るポリメラーゼ活性を有することができる。前記核酸
修飾ドメインは、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキ
ソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する。
はSso7dのいずれか、時折Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して
特異的に結合し、又はSso7dに対して50%のアミノ酸類似性を有する50個のアミ
ノ酸副配列を含む。しばしば、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dであ
る。 本発明のタンパク質は、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカ
ス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特
異的に結合するタンパク質であり;しばしば前記結合ドメインはピロコーカス・
フルオサスのPCNA相同体である。
法を提供する。1つの態様は、(i)前記核酸と少なくとも2種の異種ドメイン
を含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合
ドメインである第1ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ド
メインである第2ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメ
インが、a. 二本鎖核酸に結合し、そして b. それに融合される配列−非特異的
核酸結合ドメインを有さない同一の酵素と比較して、前記酵素のプロセッシング
性を増強し、そしてここで前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を
可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そし
てその組成のものであり;そして(ii)前記溶液における核酸の前記触媒ドメイ
ンによる修飾を可能にすることを含んで成る、水溶液における核酸を修飾するた
めの方法である。
種ドメインを有するタンパク質を含む水溶液とを接触せしめ、ここで配列−非特
異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインで
ある第2ドメインに結合され、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存
在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない他の同一の
タンパク質に比較して、二本鎖核酸の形成を安定化し、そして前記溶液が、前記
結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機
能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり;そして(ii)前記
溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る
、核酸を修飾するための方法を提供する。核酸の修飾方法は、本明細書に記載さ
れるタンパク質態様のいずれかを使用することができる。
ける標的核酸の5kb又はそれよりも長い副配列を増幅するための方法を提供し、
ここで前記方法は、(i)前記標的核酸と少なくとも2種の異種ドメインを含ん
で成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイ
ンである第1ドメインが、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第
2ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二
本鎖核酸に結合し、そして(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメイ
ンを有さない同一のポリメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシン
グ性を増強し、そして、前記溶液が、結合ドメインによる前記標的核酸への結合
を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記
ポリメラーゼドメインによる5kb又はそれ以上の長さへの延長を可能にする組成
のものであり;(ii)前記5kb又はそれ以上の長さの副配列を増幅するポリメラ
ーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含ん
で成る。
ゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼド
メインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合
ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体
を特異的に結合し、Sso7dに対して50%アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副
配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結
合する。もう1つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7
dである。
おける標的核酸の副配列を増幅するための方法を提供し、ここで前記方法は、(
i)前記標的核酸と少なくとも2種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを
接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメイン
が、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第2ドメインに結合され
ており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二本鎖核酸に結合し、そ
して(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のポ
リメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシング性を増強し、そして
、前記溶液が、標的核酸1ml当たり105又はそれよりも少ないコピーを含んで成
り、そして結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標
的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによ
る延長を可能にする組成のものであり;(ii)前記副配列を増幅するポリメラー
ゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで
成る。
ゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼド
メインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合
ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体
を特異的に結合し、Sso7dに対して50%アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副
配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結
合する。もう1つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7
dである。
−結合タンパク質、例えばスルホロバス・スルファタリカス(Sulfolobus sulfa
taricus)からのSso-7dに対して50%相同体を有するか、又は天然の小さな塩基
性DNA−結合タンパク質に対して生成される抗体に対して結合する、50〜75個の
アミノ酸のタンパク質を言及する。
長さに沿ってスライドする能力を有する酵素として遂行し、そしてその構造を反
復して化学的に変更するタンパク質配列又は副配列を言及する。触媒ドメインは
、完全な酵素、その副配列を包含することができるか、又は天然において見出さ
れるような酵素又は副配列に結合されない追加のアミノ酸配列を包含することが
できる。
のポリペプチド配列を含んで成る、タンパク質又はタンパク質複合体の定義され
る機能を有する単位を言及する。前記機能は、広く定義されることが理解されて
おり、そしてリガンド結合触媒活性であり得るか、又はタンパク質の構造に対し
て安定化効果を有することができる。
能を行う酵素の能力を言及する。典型的には、“効率”とは、本明細書において
定義される場合、核酸への結合当たり修飾酵素により生成される修飾された塩基
の量により示される。 酵素における“増強する”とは、酵素の活性の改良、すなわち単位酵素及び単
位時間当たりの生成物の量上昇を言及する。 “融合された”とは、共有結合による結合を言及する。
性質的にお互いに対して同じ関係で見出されない複数のドメインを含んで成るこ
とを示す。そのようなタンパク質、例えば融合タンパク質は、新規の機能的タン
パク質を製造するために配置される関連しないタンパク質からの複数のドメイン
を含む。 “連結する”とは、タンパク質ドメインを機能的に結合するための当業界にお
いて知られているいずれかの方法、例えば介在性ドメインを有するか又は有さな
い組換え融合、イントロン−介在性融合、非共有結合及び共有結合、例えばジス
ルフィド結合;水素結合;静電結合;及びコンホメーション結合、例えば抗体―
抗原及びビオチン−アビジン結合を言及する。
ことができる酵素を言及する。 “ヌクレアーゼ”とは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステ
ル結合を分解できる酵素を言及する。 “核酸修飾酵素”とは、核酸を共有的に変更する酵素を言及する。 “ポリメラーゼ”とは、ポリヌクレオチドの鋳型−指図された合成を行う酵素
を言及する。
的核酸ポリメラーゼの3’→5’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を
言及し、それにより、鋳型と共にワトソン−クリック型塩基対を形成しないヌク
レオチドが、1つのオリゴヌクレオチド、すなわち鋳型から合成される鎖の3’
末端から、連続態様で除去される。誤差補正活性を有するポリメラーゼの例は、
ピロコーカス・フリオサス、サーモコーカス・リトラリス及びサーモコーカス・
マリチマからのポリメラーゼを包含する。
数の修飾反応を行う核酸修飾酵素の能力を言及する。典型的には、“プロセッシ
ング性”とは、核酸の比較的長い路を修飾する能力を言及する。 “制限エンドヌクレアーゼ”とは、特定の塩基配列でDNAの分子を内部的に分
解する、細菌により生成される酵素グループのいずれかを言及する。 “配列−非特異的核酸結合ドメイン”とは、核酸に有意な親和性を伴なって結
合するタンパク質ドメインを言及し、このためには、同じヌクレオチド組成であ
るが、しかし異なったヌクレオチド配列を有するもう1つの核酸よりも100倍以
上高い親和性を伴なってタンパク質ドメインに結語する既知の核酸は存在しない
。
てDNA又はRNAを用いてのヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の付加によりポリ
ヌクレオチド合成を触媒し、そして45℃以上の温度で最適活性を有するいずれか
の酵素を言及する。 “サーマスポリメラーゼ”とは、いずれかのサーマス種、例えばサーマス・ア
クアチカス(Thermus aquaticus)、サーマス・ブロキアヌス(Thermus brockia
nus) 及びサーマス・サーモフィラス(Thermus themophilus)から単離された
ファミリーA DNAポリメラーゼ;遺伝的修飾又は化学的修飾、又は当業界におい
て知られている他の方法により誘導されていてもいずれにせよ、サーマス種に起
因するいずれかの組換え酵素、及びそのいずれかの機能的誘導体を言及する。
又は副配列が幾何学的進行で増幅される方法を言及する。PCRは、当業者に良く
知られている;例えばアメリカ特許第4,683,195号及び第4,683,202号;及びPCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisなど., eds, 1990を
参照のこと。 “長いPCR”とは、5kb又はそれよりも長いDNAフラグメントの増幅を言及する
。長いPCRは典型的には、短い生成物を増幅するために従来使用されるポリメラ
ーゼとは異なる特別に適合されたポリメラーゼ又はポリメラーゼ混合物を用いて
行われる(例えば、アメリカ特許第5,436,149号及び第5,512,462号を参照のこと
)。
の開始点として作用するポリヌクレオチド配列を言及する。プライマーは、種々
の長さのものであり得、そしてしばしば50個よりも短い長さのヌクレオチド、例
えば12〜25個の長さのヌクレオチドである。PCRへの使用のためのプライマーの
長さ及び配列は、当業者に知られている原理に基づいて企画され得、例えばInni
sなど., 前記を参照のこと。
の温度及び時間の長さを言及する。PCR反応のための温度プロフィールは典型的
には、類似するか又は同一の短い温度プロフィールの10〜60回の反復からなり;
それらの短いプロフィールの個々は典型的には、2段階又は3段階PCR反応を定
義する。“温度プロフィール”の選択は、当業者に知られている種々の考慮に基
づかれている;例えばInnisなど., 前記を参照のこと。本明細書に記載されるよ
うな長いPCR反応においては、5kb又はそれよりも長い増幅生成物を得るために必
要とされる延長時間は、従来のポリメラーゼ混合物に比較して、減じられる。
る。“低コピー数”とは、増幅される核酸サンプルにおける標的配列の105、し
ばしば104, 103, 102又はそれ以下のコピーを意味する。 “鋳型”とは、プライマーハイブリダイゼーション部位を両端に有する、増幅
されるポリヌクレオチドを含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド配列を言及する。
従って、“標的鋳型”は、5’プライマー及び3’プライマーのためのハイブリダ
イゼーション部位を端に有する標的ポリヌクレオチド配列を含んで成る。
ロセッシング性質を増強するために触媒性核酸修飾タンパク質に結合され得る発
見である。従来技術は、核酸結合タンパク質が核酸への酵素の結合親和性を高め
ることができることを教授するが、酵素のプロセッシング性質を増強する能力を
有する結合タンパク質のグループは特定の価値のものである。
遅い速度で二本鎖核酸から解離する。従って、それらは、酵素−核酸複合体を安
定化することによって結合される修飾酵素のプロセッシング性及び/又は効率を
高める。従って、本発明は、DNA−結合ドメインが、核酸の二本鎖コンホメーシ
ョンを安定化し、そして二本鎖基質を必要とする触媒ドメインの効率を高めるこ
とができる発現を包含する。触媒性核酸修飾酵素の触媒及び/又はプロセッシン
グ性質の改良性を容易に決定するための例及び単純なアッセイが本明細書に記載
される。
触媒性核酸修飾ドメインは、プロセッシング性、例えばポリメラーゼ、エクソヌ
クレアーゼ、等であるか、又は非プロセッシング性、例えばリガーゼ、制限エン
ドヌクレアーゼ、等であり得る。
ド付加又はメチル化を合成するか又は行う核酸修飾酵素の能力に影響を及ぼす。
本発明のプロセッシングタンパク質は、プロセッシング性修飾酵素(又は修飾酵
素の酵素ドメイン)に結合される配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインの存在
のために増強されたプロセッシング性を示し、それにより、核酸/酵素複合体を
安定化するために結合ドメインを提供する。しばしば、結合ドメインは、熱安定
性生物からであり、そしてより高い温度、例えば45℃以上の温度で増強された活
性を提供する。プロセッシング修飾酵素の例は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラ
ーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース
及びトポイソメラーゼを包含する。
ラーゼ及びRNA依存性ポリメラーゼ、例えば逆転写酵素を包含する。少なくとも
5種のファミリーのDNA依存性DNAポリメラーゼが知られているが、但しほとんど
はファミリーA、B及びCに分類される。ほとんどのファミリーAのポリメラーゼは
、ポリメラーゼ、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレア
ーゼ活性を包含する複数の酵素機能を含むことができる一本鎖タンパク質である
。
ヌクレアーゼ活性、並びにアクセラリー因子を有する単一の触媒ドメインを有す
る。ファミリーCのポリメラーゼは典型的には、重合、及び3’−5’エキソヌク
レアーゼ活性を有する複数サブユニットのタンパク質である。E.コリにおいては
、3種のタイプのDNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼI(ファミリーA)、
II(ファミリーB)及びIII(ファミリーC)が見出されている。真核細胞におい
ては、3種の異なったファミリーBのポリメラーゼ、すなわちDNAポリメラーゼα
、δ及びεが核複製に関与し、そしてファミリーAのポリメラーゼ、すなわちポ
リメラーゼγは、ミトコンドリアDNA複製のために使用される。他のタイプのDNA
ポリメラーゼは、ファージポリメラーゼを包含する。
及び細菌RNAポリメラーゼ、並びにファージ及びウィルスポリメラーゼを包含す
る。RNAポリメラーゼは、DNA依存性及びRNA依存性であり得る。
れる改良されたポリメラーゼの触媒ドメインとして使用される。それらのポリメ
ラーゼは、長い、すなわち5kb、しばしば10kb、又はそれ以上の長さのPCR生成物
を得るために使用され得る。それらの改良されたポリメラーゼを用いての“長い
PCR”は、従来技術の“長いPCR”ポリメラーゼ及び/又はポリメラーゼ混合物に
比較して、減じられる延長時間を用いて行われ得る。1kb当たり30秒以下の延長
時間、しばしば1kb当たり15秒が、改良されたポリメラーゼを用いてPCR反応にお
いて長い生成物を増幅するために使用され得る。さらに、それらの修飾されたポ
リメラーゼはまた、高められた感受性も示す。
入力コピー濃度、例えば極端には、1ml当たり10のコピーからDNAを増幅すること
ができる。しかしながら、そのようなポリメラーゼの低い適合性のために、その
ような増幅からクローン化された生成物は、導入された突然変異をたぶん含む。
コピーDNAは、低入力コピー濃度からDNAを増幅することはできない。そのような
失敗についての最も適切な説明は、それらの酵素の非常に低いプロセッシング性
である。本発明のハイブリッド誤差補正ポリメラーゼは、誤差補正活性を保持し
ながら、より高いプロセッシング性を示し、そしてそれにより、増幅反応におい
て感受性及び適合性の両者を提供する。
スーパーコイル化において役割を演じる。DNAジャイレースは、負のスーパーコ
イルを導入する。原核生物においては、AサブユニットはDNA切断及び再結合を担
当し、そしてBサブユニットはATP−加水分解性を含む。DNAジャイレースは、ス
ーパーコイル化をプロセッシング的に及び触媒的に導入し、典型的には、DNAジ
ャイレースの分子及び分当たり100までのスーパーコリルを導入する。ATPの不在
下で、ジャイレースは負のスーパーコイルをゆっくり弛緩する。
、それにより、結合数の変化を引き起こす、原核及び真核生物に見出される酵素
である。トポイソメラーゼは、DNAから負又は正のスーパーコイルを除去するこ
とができ、又は負のスーパーコイルを導入することができる。 種々のメチラーゼ及び3’又は5’エキソヌクレアーゼ、例えば細菌、原核、真
核及びファージ酵素はまた、当業界において記載されている。典型的には、エキ
ソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼ、及びいくつかのメチラーゼもま
た、プロセッシング性である。
され得る。例えば、プロセッシング酵素活性、例えばポリメラーゼ活性は、反応
、例えばポリメラーゼ鎖反応において合成される核酸の量を決定することによっ
て測定され得る。酵素の相対的効率の決定においては、本発明の修飾酵素、例え
ば配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを含むポリメラーゼにより得られる生
成物の量が、下記及び例において、より詳細に記載されるであろう通常の修飾酵
素により得られる生成物の量と比較され得る。
めに二本鎖核酸に結合する。触媒活性は典型的には、特定のアッセイ条件下で生
成される修飾された生成物の量を決定することによって測定される。例えば、リ
ガーゼ活性は、アリコート連結反応により得られる形質転換体の数を定量化する
ことによって、インキュベーションに続く連結反応において適合できる末端を生
成するために制限エンドヌクレアーゼにより前もって消化された、環化されたプ
ラスミドの量を決定することによってアッセイされ得る。制限エンドヌクレアー
ゼの活性は、標的DNAの消化の程度をアッセイすることによって、例えばゲル上
のDNAの消化の程度を分析することによって決定され得る。
飾ドメイン、例えばTaqポリメラーゼ又はポリメラーゼ活性を有するTaqのドメイ
ンであり得る。触媒ドメインは、追加のアミノ酸を含むことができ、そして/又
はアミノ酸置換、欠失又は付加を含むが、しかし酵素活性を保持する変異体であ
り得る。
合するタンパク質又はタンパク質の定義された領域であり、すなわち結合は特定
の配列のために著しい選択を示さない。典型的には、二本鎖核酸結合タンパク質
は、二本鎖核酸対一本鎖核酸に関して、10倍又はそれよりも高い親和性を示す。
本発明の特定の態様における二本鎖核酸結合タンパク質は好ましくは、熱安定性
である。そのようなタンパク質の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけ
には限定されない:
iochemicaet Biophysica Acta 950: 193-203, 1988; Baumann など., Structura
l Biol. 1: 808-819, 1994; 及びCaoなど., Nature Struct. Biol. 5: 782-786,
1998を参照のこと)、原始的HMf−様タンパク質(例えば、Strichなど., J. Mo
lec. Biol. 255: 187-203, 1996; Sandman など., Gene 150: 207-208, 1994を
参照のこと)、及びPCNA相同体(例えば、Cannなど., J. Bacteriology 181: 65
91-6599, 1999; Shamoo and steitz, Cell: 99, 155-166, 1999; De Felice な
ど., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999; 及びZhangなど., Biochemistry 34:
10703-10712, 1995を参照のこと)。
ファタリカス(Sulfolobus solfataricus)及びスルホロバス・アシドカルダリ
ウス(Sulfolobus acidocaldarius)からの小さな(約7.000kdのMW)塩基性染色
体タンパク質である。それらのタンパク質はリシンに富んでおり、そして高い熱
、酸及び化学物質安定性を有する。それらは、配列独立的態様でDNAを結合し、
そして結合される場合、同じ条件下で40℃までDNAのTMを高める(McAfeeなど.,
Biochemistry 34: 10063-10077, 1995)。それらのタンパク質及びそれらの相同
体は典型的には、高温でのゲノムDNAの安定化に関与すると思われる。
性を共有する原始ヒストンである。HMfファミリーのタンパク質は溶液において
安定したダイマーを形成し、そしていくつかのHMf相同体は熱安定性種(例えば
、メタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fevidus)及びピロコーカス
株GB−3a)から同定されている。HMfファミリーのタンパク質は、Taq DNAポリメ
ラーゼ又は低い内因性プロセッシング性を有するいずれかのDNA修飾酵素に連結
されると、DNA基質に沿っての酵素のスライドする能力を増強し、そして従って
そのプロセッシング性を高める。例えば、ダイマー性HMf様タンパク質は、例え
ば化学的修飾を通して、Taq DNAポリメラーゼのN末端に共有結合され得、そして
従って、ポリメラーゼのプロセッシング性を改良する。
性DNA合成を達成するためにアクセサリータンパク質と相互作用する。特に重要
な種類のアクセサリータンパク質は、スライドするクランプとして言及される。
いくつかの特徴化されたスライドするクランプは、溶液においてトリマーとして
存在し、そして二本鎖DNAを収容することができる中心通路を有する環状構造を
形成することができる。
の特定の相互作用を形成し、そして複製の間、DNA鋳型にそれらのポリメラーゼ
を結合する。真核生物におけるスライド性クランプは増殖性細胞核抗原(PCNA)
として言及され、そして他のドメインにおける類似するタンパク質はしばしば、
PCNA相同体として言及される。それらの相同体は著しい構造的類似性を有するが
、しかし制限された配列類似性を有する。
ス、ピロコーカス・フリオサス、等)から同定されている。古細菌におけるいく
つかのファミリーBのポリメラーゼは、コンセンサスPCNA−相互作用アミノ酸配
列を含むC末端を有し、そしてプロセッシング性因子としてPCNA相同体を用いる
ことができる(例えば、Cannなど., J. Bacteriol. 181: 6591-6599, 1999及びD
e Feliceなど., J. Mol. Biol. 291: 47-57, 1999を参照のこと)。それらのPCN
A相同体は、本発明のための有用な配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインである
。
作用しないポリメラーゼに結合され、それにより、ポリメラーゼのためのプロセ
ッシング性因子としてのPCNA相同体の作用を可能にする。例示手段によれば、ピ
ロコーカス・フリオサスPol II (2種のファミリーB様ポリペプチドを含むヘテ
ロダイマーDNAポリメラーゼ)からのPCNA−相互作用配列は、ピロコーカス・フリ
オサスpol II(PCNA相同体と通常、相互作用しないモノマーファミリーBのポリ
メラーゼ)に共通結合され得る。次に、得られる融合タンパク質は、修飾されて
いないピロコーカス・フリオサスPol IIに関して高められたプロセッシング性を
有する新規異種タンパク質を生成するために、ピロコーカス・フリオサスPCNA相
同体との非共有結合を可能にされ得る。
異的二本鎖DNA結合タンパク質との相同性により及び/又は抗体交差反応性により
同定され得るか、又は生化学的アッセイにより見出され得る。 相同性に基づいての核酸結合ドメインの同定:
タンパク質の長さの比較窓にわたって、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タ
ンパク質に対して、約50%のアミノ酸配列同一性、任意には、約60%、75%、80
%、85%、90%又は95〜98%のアミノ酸配列同一性を有するドメインが、本発明
において使用され得る。配列が比較され、そして比較窓、又は次の配列比較アル
ゴリズムの1つを用いて、又は手動的一列整列及び視覚的調査により測定される
ような企画された領域にわたって最大の対応性について一列配列され得る。本発
明のためには、%アミノ酸同一性は、BLASTのデフォールトパラメーターにより
決定される。
配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び対照配列が
コンピューターに入力され、副配列座標が、必要により企画され、そして配列ア
ルゴリズムプログラムパラメーターが企画される。デフォールトプログラムパラ
メーターが使用され、又は他のパラメーターが企画され得る。次に、配列比較ア
ルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、対照配列に対しての試験配
列について%配列同一性を計算する。
適に列挙整列された後、同じ数の連続位置の対照配列に比較される、200〜600、
通常約50〜約200、より通常には約100〜約150から成る群から選択された連続位
置の数のいずれか1つのセグメントに対する参照を包含する。比較のための配列
の一列整列方法は、当業界において良く知られている。
ath. 2: 482 (1981)の局部相同アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J.
Mol. Biol. 48: 443 (1970) の相同一列整列アルゴリズムにより、Pearson & Li
pman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性方法についての
調査により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施(Wisconsi
n Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., M
adison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)により、又は手動一列整
列及び可視的調査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausube
l など., eds. 1995 supplement))により行われ得る。
同一性を示すために、前進性対−様一列整列を用いて、一群の関連する配列から
の複数の配列整列を創造する。それはまた、一列整列を創造するために使用され
るクラスター関係を示す樹状図又は系統樹をプロットする。PILEUPは、Feng & D
ollittle, J. Mol. Evol. 36: 351-360 (1987) の前進性一列整列方法の単純化
を用いる。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989) に
より記載される方法に類似する。
はアミノ酸)を一列整列することができる。複数の一列整列方法は、一群の2種
の一列整列された配列を生成する、2種の最も類似する配列の対−様一列整列に
より開始する。次に、この一群が次の最も関連する配列又は一列整列された配列
の一群に対して一列整列される。2種の配列群が2種の個々の配列の対−様一列
整列の単純な延長により一列整列される。最終一列整列は、一連の前進性対−様
一列整列により達成される。
はヌクレオチド座標を企画することによって、及びプログラムパラメーターを企
画することによって実施される。PILEUPを用いて、対照配列が、次のパラメータ
ーを用いて%配列同一性関係を決定するために他の試験配列に比較される:デフ
ォールトギャップ重量(3.00)、デフォールトギャップ長重量(0.10)及び計量
された末端ギャップ。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば
バージョン7.0から得られる(Devereauxなど., Nuc. Acid Res. 12: 307-395 (1
984).
つの例は、それぞれ、Altschulなど., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)
及びAltschulなど., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載される、BLAST
及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、Na
tional Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov
/) を通して入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ
長さのワードと整列される場合、いくつかの陽性−値の限界評点Tと適合するか
又はそれを満たす、問題の配列における長さWの短いワードを同定することによ
って、高い評点の配列対(HSP)を同定することを包含する。Tは、隣接ワード評
点限界として言及される(Altschulなど., 前記)。
を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累計整列評点が高め
られる限り、個々の配列にそって両方向に延長される。累計評点は、ヌクレオチ
ド配列に関しては、パラメーターM(適合する残基の対についてのリワード評点
;常に>0)及びN(ミスマッチ残基についてのペナルティー評点;常に<0)を
用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累計評点を
計算するために使用される。
が、達成される最大値から量X、低下する場合;累計評点が、1又は複数の負の
評点残基整列の蓄積のために、ゼロ又はそれ以下になる場合;又はいずれかの配
列の終結に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW, T及びXが、一列整
列の感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列についての
)は、デフォールトとして、11のワードレングス(wordlength)(W), 10の期待
値(E)、M=5,N=4,及び両鎖の比較を決定する。アミノ酸配列に関しては、B
LASTPプログラムは、デフォールトとして、3のワードレングス及び10の期待値
(E)を使用し、そしてBLOSUM62評点マトリックス(Henikoff & Henikoff, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) を参照のこと)は、50の一列整列(
B)、10の期待値(E)、M=5,N=4及び両鎖の比較を使用する。
えば、Karline Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)
を参照のこと)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は、
2種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間での適合性が偶然に生じる確立の表示を
提供する最少合計確立(P(N))である。例えば、核酸は、対照核酸に対する試験
核酸の比較における最少合計確立が約0.2以下、より好ましくは約0.01以下、及
び最も好ましくは約0.001以下である場合、対照配列に類似すると思われる。
好ましくは既知の核酸結合ドメインに結合するポリクローナル抗体を用いて、交
差反応性により同定され得る。ポリクローナル抗体は、当業者に良く知られてい
る方法を用いて生成される(例えば、Coligan, Current Protocols in Immunolo
gy (1991); Harlow & Lane , Antibodies, A Laboratory Manual (1988) を参照
のこと)。次に、免疫学的に交差反応性の結合タンパク質であるそれらのタンパ
ク質は、種々のアッセイ方法により検出され得る。使用され得る種々の型及び条
件の記載については、例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Bi
ology, Volume 37 (Asai, など., 1993), Colligan, 前記、及びHarlow & Lane,
前記を参照のこと。
るアッセイを包含する。例えば、交差反応性結合タンパク質は、イムノブロット
分析、例えばウェスターンブロットを用いて同定され得る。ウェスターンブロッ
ト技法は一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を
分離し、分離されたタンパク質を適切な固体支持体(例えば、ニトロセルロース
フィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化されたナイロンフィルター)に
移行し、そしてサンプルを、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに結合され
る抗体と共にインキュベートすることを含んで成る。
抗体は、直接的にラベルされ得るか、又は他方では、続いて、抗結合ドメイン抗
体に対して特異的に結合するラベルされた抗体(例えば、ラベルされた羊抗−マ
ウス抗体)を用いて、検出され得る。他のイムノブロットアッセイ、例えば組換
えタンパク質ライブラリーの分析はまた、本発明への使用のために適切なタンパ
ク質の同定のためにも有用である。
の少なくとも2倍又はそれ以上、典型的にはバックグラウンドの10倍以上、特定
の抗体に結合し、そしてサンプルに存在する有意な量の他のタンパク質に実質的
ン結合しない免疫学的交差反応性タンパク質が同定され得る。
得る。例えば、ポリクローナル抗血清は、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合
ドメインタンパク質、例えばピロコーカス・フリオサス(Pfu)PCNAに生成され
る。次に、標的抗原が固体支持体に固定され得る。マイナーな交差反応性を有す
る非標的抗原(それらが存在するなら)は、血清の選択性を改良するためにアッ
セイに添加され得る。
パク質の能力が、それ自体と競争する結合ドメインタンパク質、この例において
はPfu PCNAの能力と比較される。上記タンパク質についての%交差反応性は、標
準の計算を用いて計算される。添加されたタンパク質との10%以下の交差反応性
を有するそれらの抗血清が選択され、そしてプールされる。非標的抗原に対する
交差反応性抗体は、非標的抗原による免疫吸収により、プールされた抗血清から
除去される。本発明の特定の核酸結合ドメインに対して特異的に結合する抗体が
また、この方法論を用いて製造され得る。
ぶん対立遺伝子、多形変異体又は相同体、例えばもう1つのピロコーカス.,spで
あると思われる第2タンパク質を、免疫原タンパク質に比較するために、上記の
ような競争結合イムノアッセイに使用される。この比較を行うためには、2種の
タンパク質が広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク
質への抗血清の結合を50%阻害するために必要とされる個々のタンパク質の量が
決定される。結合の50%を阻害するのに必要とされる核酸結合ドメインの量が、
結合の50%を阻害するのに必要とされる、第2タンパク質の量の10倍以下である
場合、前記第2タンパク質は、核酸結合ドメインに対して生成されるポリクロー
ナル抗体に対して特異的に結合すると言われる。
価され得る。適切な結合ドメインは、二本鎖核酸対一本鎖核酸について著しい性
能を示す。
を用いて試験され得る。それらは、フィルター結合アッセイ又はゲル−シフトア
ッセイのようなアッセイを包含する。例えば、フィルター結合アッセイにおいて
は、二本鎖DNAへの結合活性について評価されるポリペプチドが、適切な緩衝液
において、二本鎖又は一本鎖の放射性ラベルされたDNAと共にプレ−混合される
。混合物が、タンパク質及びタンパク質−DNA複合体を保持する膜(例えば、ニ
トロセルロース)を通して濾過される。フィルター上に保持されるDNAの量は、
タンパク質に結合される量の表示である。
により競争される競争分析により定量化される。一本鎖DNAよりも10倍又はそれ
以上の親和性で二本鎖DNAを結合するポリペプチドは、二本鎖DNA結合タンパク質
として本明細書において定義される。他方では、結合活性は、放射性ラベルされ
たDNAが試験ポリペプチドと共にインキュベートされるゲルシフトアッセイによ
り評価され得る。タンパク質−DNA複合体は、結合されていないDNAよりもゲルを
通してゆっくりと移動し、シフトされたバンドをもたらす。結合の量は、上昇す
る量の二本鎖又は一本鎖のラベルされていないDNAと共にサンプルをインキュベ
ートし、そしてシフトされたバンドにおける放射能の量を定量化することによっ
て評価される。
に結合し、すなわち本発明の結合ドメインは、有意な親和性を伴なって二本鎖核
酸を結合するが、しかし同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配
列を有するもう1つの核酸よりも100倍以上の親和性を伴なってドメインに結合
する既知の核酸は存在しない。非特異的結合は、二本鎖対一本鎖核酸結合を決定
するために記載される方法論に類似する方法論を用いてアッセイされ得る。フィ
ルター結合アッセイ又はゲル移動シフトアッセイは、結合の特異性を決定するた
めに、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配列である競争DNA
を用いて、上記のようにして行われ得る。
ば修飾酵素のプロセッシング性又は効率を高めるために、又は少なくとも1℃、
核酸重複体の安定性を高めるために、二本鎖結合ドメインの能力をアッセイする
ことによって、評価され得る。それらの技法は、核酸修飾酵素の増強された効率
についての分析を記載する下記セクションに論じられている。
ようなドメインの能力の直接的な評価により同定され得る。例えば、プライマー
鋳型構造体の溶融曲線が、260nmでDNAのUV吸光度をモニターすることによって、
タンパク質の存在又は不在下で得られる。二本鎖基質のTMは、その溶融曲線の中
点から決定され得る。次に、TMに対する配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク
質の効果が、修飾されていない酵素の存在下でのTMと修飾された酵素の存在下で
得られたTMとを比較することによって決定され得る。(タンパク質は、それがDN
Aよりも260nmでより低い消衰係数を有するので、UV吸光度に有意に寄与しない)
。次に、TMを1°、しばしば5°、10°又はそれ以上、高めるドメインが、本発明
への使用のために選択され得る。
結合活性を利用することにより、例えばDNA−セルロースカラム上での精製によ
り単離され得る。次に単離されたタンパク質はさらに、従来の手段により精製さ
れ、配列決定され、そして遺伝子がPCRを通して従来の手段によりクローン化さ
れ得る。次に、それらのクローンから過剰発現されるタンパク質が、上記手段の
いずれかにより試験され得る。
法により連結され得る。それらの方法は、化学的及び組換え手段を包含する。 異種ドメインを連結する化学的手段は、例えばBioconjugate Techniques, Her
manson, Ed., Academic Press (1996) に記載されている。それらは、例えばタ
ンパク質化学の業界において良く知られている方法により、直接的に又は連結化
合物を通して、成分をお互い連結するための誘導体化を包含する。例えば、1つ
の化学的接合態様においては、触媒性ドメイン及び核酸結合ドメインを連結する
手段は、2種の成分の分子間ジスルフィド結合の形成に究極的に寄与する異種二
官能価カップリング試薬を含んで成る。
、例えばアメリカ特許第4,545,985号に記載されている。他方では、分子間ジス
ルフィドは、天然において存在するか、又は遺伝子工学により挿入される、個々
の成分におけるシステム間に便利には形成され得る。成分を連結する手段はまた
、異種二官能価架橋試薬又は特定の低pH分解性架橋剤又は特定のプロテアーゼ分
解性リンカー間のチオエーテル連鎖、又は他の分解性又は非分解性化学連鎖を用
いることができる。
は組換え手段により別々に合成される成分間で形成されるペプチジル結合を含ん
で成ることができる。タンパク質自体はまた、完全に又は一部、アミノ酸配列を
合成するために化学的方法を用いて生成され得る。例えば、ペプチドは、固相技
法、例えばアミノ酸が成長するアミノ酸鎖に連続的に付加されるMerrifield固相
合成方法により合成され得る(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 214
9-2146を参照のこと)。
市販され、そして一般的に、その製造業者の説明書に従って操作され得る。次に
、合成されたペプチドは樹脂から分解され、そして例えば分離用高性能液体クロ
マトグラフィーにより精製され得る(Creighton, Proteins Structures and mol
ecular Principles, 50-60 (1983)を参照のこと)。合成ポリペプチド又はポリ
ペプチドのサブフラグメントの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確かめ
られ得る(例えば、エドマン分解方法;Creighton, Proteins, Structures and
Molecular Principles, pp. 34-49 (1983) を参照のこと)。
配列中に導入され得る。非従来のアミノ酸は、次のものを包含するが、但しそれ
らだけには限定されない:通常のアミノ酸のD−異性体、α−アミノイソ酪酸、
4−アミノ酪酸、Abu, 2−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、6−アミノヘキサ
ノン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノピオン酸、オルニチン、ノルロ
イシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイ
ン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘ
キシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例
えばβ−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、Na−メチルアミノ酸、及びア
ミノ酸類似体。さらに、アミノ酸は、D(右旋性)又はL(左旋性)であり得る。
Taqポリメラーゼは、連続基を通して結合される。連結基は、化学的交差剤、例
えばスクシンイミジル−(N−アレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カル
ボキシレート(SMCC)であり得る。連結基はまた、追加のアミノ酸配列、例えば
ポリアラニン、ポリグリシン又は同様の連結基であり得る。
配列は、ペプチド結合を通して、いずれかの順序で、それらのアミノ−又はカル
ボキシ−末端で直接的に連結される。他方では、アミノ酸リンカー配列は、個々
のポリペプチドがその二次及び三次構造に折りたたむことを確保するのに十分な
距離、第1及び第2ポリペプチド成分を分離するために使用され得る。そのよう
なアミノ酸リンカー配列は、当業界において良く知られている標準技法を用いて
融合タンパク質中に組み込まれる。
軟な延長されたコンホメーションを採用するそれらの能力;(2)第1及び第2
ポリペプチド上の機能的エピトープと相互反応する二次構造を採用するそれらの
無能性;及びポリペプチド官能エピトープと反応する疎水性又は電荷された残基
の欠失。典型的なペプチドリンカー配列は、Gly、Val及びThr残基を含む。他の
近い天然のアミノ酸、例えばSer及びAlaがまた、リンカー配列に使用され得る。
40: 39-46; Murphyなど. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262;
アメリカ特許第4,935,233号及び第4,751,180号に開示されるそれらを包含する
。リンカー配列は、一般的に1〜約50個の長さのアミノ酸、例えば3,4,6又
は10個の長さのアミノ酸であるが、しかし100又は200個の長さのアミノ酸でもあ
り得る。リンカー配列は、第1及び第2ポリペプチドが、機能的ドメインを分離
し、そして立体的障害を妨げるために使用され得る非必須N−末端アミノ酸領域
を有する場合、必要とされ得ない。
ポリエーテルリンカー、例えばPEG、等を包含する。例えば、ポリ(エチレング
リコール)リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから
入手できる。それらのリンカーは任意には、アミド結合、スルフィドリル結合又
は異種官能結合を有する。
結合、及び抗体及びストレプタビジン−ビオチン相互作用を通しての間接的結合
を包含する(例えば、Bioconjugate Techniques, 前記を参照のこと)。ドメイ
ンはまた、中間体相互作用配列を通して一緒に連結され得る。例えば、コンセン
サスPCNA−相互作用配列は、PCNA相同体と天然において相互作用しないポリメラ
ーゼに連結され得る。次に、得られる融合タンパク質は、高められたプロセッシ
ング性を有する新規の異種タンパク質を生成するために、PCNA相同体との非共有
結合を可能にされ得る。
前記タンパク質をコードする核酸の組換え発現により生成される。そのような融
合生成物は、正しいコード枠において、当業界において知られている方法により
、所望するアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列をお互い連結し、そして当
業界において知られている方法により生成物を発現することによって製造され得
る。
遺伝学の分野における通常の技法を用いて得られる。本発明への使用のための一
般的方法を開示する基本テキストは、Sambrookなど., Molecular Cloning, A La
boratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression:
A Laboratory Manual (1990); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (
Ausubel など., eds., 1994) を包含する。
配列相同体は、プローブとのハイブリダイゼーションによりcDNA及びゲノムDNA
ライブラリーからクローン化されるか、又はオリゴヌクレオチドプライマーによ
り増幅技法を用いて単離される。増幅技法は、DNA又はRNAからの配列を増幅し、
そして単離するために使用され得る(例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Pr
imers: A Laboratory Manual (1995) を参照のこと)。他方では、オーバーラッ
プするオリゴヌクレオチドが合成的に生成され、そして1又は複数のドメインを
生成するために連結され得る。触媒又は二本鎖核酸結合ドメインをコードする核
酸はまた、プローブとして抗体を用いて、発現ライブラリーから単離され得る。
においては、核酸配列又は副配列が、1つの制限部位を含むセンスプライマー及
びもう1つの制限部位を含むアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅される
。これは、所望するドメイン配列又は副配列をコードし、そして末端制限部位を
有する核酸を生成するであろう。次に、この核酸は、第2ドメインをコードする
核酸を含み、そして適切な対応する制限部位を有するベクター中に容易に連結さ
れ得る。
により分離され得る。適切なPCRプライマーは、GenBank又は他の源から提供され
る配列情報を用いて、当業者により決定され得る。適切な制限部位はまた、特定
部位の突然変異誘発により、タンパク質又はタンパク質副配列をコードする核酸
に付加され得る。ドメイン−コードのヌクレオチド配列又は副配列を含むプラス
ミドは適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断され、そして次に、標準方法に
従って増幅及び/又は発現のための適切なベクター中に連結される。
見出される:Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis など., (198
7) アメリカ特許第4,683,292号; PCR Protocols A Guide to Methods and Appli
cations (Innis など., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Inn
is); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH
Research (1991) 3:81-94; (Kwoh. など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 1173; Guatelli など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lo
mell など. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren など., (1988) Scie
nce 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wa
llace (1989) Gene 4: 560; 及びBarringerなど. (1990) Gene 89: 117。
ためのもう1つの方法を提供するために、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合
タンパク質又は核酸修飾酵素触媒ドメインの性質に比較され得る。
領域をコードするポリペプチドを修飾することが所望される。当業者は、所定の
核酸構造体における変更を生成する多くの手段を認識するであろう。そのような
良く知られている方法は、特定部位の突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを
用いてのPCR増幅、突然変異誘発剤又は放射線への核酸を含む細胞の暴露、所望
するオリゴヌクレオチドの化学的合成(例えば、大きな核酸を生成するために連
結及び/又はクローニングに関して)及び他の良く知られている技法を包含する
。例えば、Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97; Robertsなど. (1987) Nat
ure 238: 732-734を参照のこと。
ードするポリヌクレオチドを得るために、2種のドメインの連結を促進するよう
修飾され得る。そのような方法により修飾される触媒ドメイン及び結合ドメイン
はまた、本発明の一部である。例えば、システム残基のためのコドンは、ドメイ
ンのいずれかの末端で配置され、その結果、前記ドメインは例えば、スルフィド
結合により連結され得る。増幅は、組換え又は化学的方法のいずれかを用いて行
われ得る(例えば、Pierce Chemical Co. カタログ、Rockford ILを参照のこと
)。
、通常、約200個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、1〜100個のアミノ酸が
典型であるポリペプチド配列、例えば上記のそれらのものにより連結される。い
くつかの態様においては、プロリン残基が、リンカーによる有意な二次構造要素
の形成を妨げるためにリンカー中に導入される。リンカーはしばしば、組換え融
合タンパク質の一部として合成される柔軟アミノ酸副配列であり得る。そのよう
な柔軟リンカーは、当業者に知られている。
選択された生物(例えば、酵母;好ましいコドンが酵母における発現のためのコ
ードを核酸中に置換される)において核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提
供するよう修飾される。
ステムが存在する(例えば、Gene Expression Systems, Fernandex and Hoeffle
r, Eds, Academic Press, 1999を参照のこと)。典型的には、融合ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、所望する宿主細胞において機能的であるプロ
モーターの制御下に配置される。典型的な広範囲の種類のプロモーターが入手で
き、そして特定の用途に依存して、本発明の発現ベクターに使用され得る。通常
、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性的であるべきである細胞に依
存する。他の発現制御配列、例えばリボソーム結合部位、転写終結部位及び同様
のものがまた、任意には包含される。1又は複数のそれらの制御配列を含む構造
体は、“発現カセット”と呼ばれる。従って、連結されたポリペプチドをコード
する核酸は、所望する宿主細胞において高レベル発現のために組み込まれる。
のおいて発現される遺伝子をクローニングすることによって得られる。リボソー
ム結合部位配列にそって、任意には、オペレーターと共に、転写開始のためのプ
ロモーターを包含するよう本明細書において定義される、通常使用される原核制
御配列は、通常使用されるプロモーター、例えばβ−ラクタマーゼ(ペニシリナ
ーゼ)及びラクトース(lac)プロモーターシステム(Changeなど., Nature (19
79) 198: 1056)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddelなど.
, Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057), tacプロモーター(DeBoer、など., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21-25)、及びλ−由来のPLプロモータ
ー及びN−遺伝子リボソーム結合部位(Shimatakeなど., Nature (1981) 292:128
)を包含する。
いて機能するいずれかの入手できるプロモーターが使用され得る。標準の細菌発
生ベクターは、プラスミド、例えばpBR322に基づくプラスミド、例えばpBLUESCR
IPTTM, pSKF, pET23D, λ−ファージ由来のベクター及び融合発現システム、例
えばGST及びLacZを包含する。エピトープ標識、例えばc-myc, HA−標識、6−Hi
g標識、マルトース結合タンパク質、VSV−G標識、抗−DYKDDDDK標識、又はその
多数が当業者に良く知られているいずれかのそのような標識は、便利な単離方法
を提供するために組換えタンパク質に付加され得る。
原核種において機能するプロモーターが必要とされる。そのようなプロモーター
は、前記種からクローン化されている遺伝子から得られるか、又は異種プロモー
ターが使用され得る。例えば、ハイブリッドtrp−lacプロモーターは、E.コリ
の他にバチルスにおいて機能する。それらの及び他の適切な細菌プロモーターは
当業界によく知られており、そして例えば、Sambrookなど. 及びAusubelなどに
記載されている。本発明のタンパク質を発現するための細菌発現システムは、E
.コリ、バチルスsp., 及びサルモネラにおいて利用できる(Palvaなど., Gene
22: 229-235 (1983); Mosbachなど., Nature 302: 543-545 (1983))。そのよう
な発現システムのためのキットは市販されている。
良く知られており、そしてまた、市販されている。酵母においては、ベクターは
、酵母組み込みプラスミド(たとえば、YIp 5)及び酵母複製プラスミド(YRpシ
リーズプラスミド)並びにpGPD−2を包含する。真核ウィルスからの調節要素を
含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、乳頭
腫ウィルスベクター、及びEpstein−Barrウィルスに由来するベクターにおいて
使用される。
キュロウィルスpDSVE, 及びCMVプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウィルスプロモータ
ー、Rous肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞
における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指図
下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターを包含する。
れたプロモーターは、その宿主細胞が、融合ポリペプチドの発現が誘発される前
、高い密度に増殖され得るので、好都合である。異種タンパク質の高レベル発現
は、いくつかの情況下での細胞増殖を遅延する。誘発性プロモーターは、発現の
レベルが環境又は成長因子、例えば温度、pH、嫌気性又は好気性条件、光、転写
因子及び化学物質により変更できる遺伝子の発現を方向づけるプロモーターであ
る。
知られている。それらは、例えばlacプロモーター、バクテリオファージλPLプ
ロモーター、ハイブリッドtrp−lacプロモーター(Amannなど. (1983) Gene 25:
167; de Boer など. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21)、及びバク
テリオファージT7プロモーター(Studierなど. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor
など. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1074-8)を包含する。それらの
プロモーター及びそれらの使用は、Sambrookなど., 前記に論じられている。
らは、例えばメタロチオネインプロモーター、熱ショックタンパク質、及び多く
の他のものを包含する。
モーターの下流に配置される、翻訳システムからの高く発現された遺伝子に由来
する短い上流の読み取り枠、及びリボソーム結合部位、続いて少数のアミノ酸コ
ドン、その後終結コドンを用いる。終結コドンの直前に、第2のリボソーム結合
部位が存在し、そして終結コドンに続いて、翻訳の開始のための開始コドンが存
在する。そのシステムはRNAにおける二次構造体を分解し、翻訳の効果的な開始
を可能にする。Squiresなど. (1988) J. Biol. Chem. 263: 16297-16302を参照
のこと。
の使用を必要とする。そのようなベクターは通常、当業界において使用される。
多数のキットが、細菌からのプラスミドの精製のために市販されている(例えば
、Pharmacia BiotechからのEasyPrepJ, Flexi PrepJ; StratageneからのStrataC
leanJ; 及びQIAexpress Expression System, Qiagen)。次に、単離され、そし
て精製されたプラスミドがさらに、他のプラスミドを生成するあめに操作され、
そして形質転換するために使用され得る。
発現はしばしば、高い収率をもたらす。必要なら、可溶性活性融合ポリペプチド
の量は、再折りたたみ方法を行うことによって高められ得る(例えば、Sambrook
など., Bio/Technology (1985) 3: 151を参照のこと)。本発明の融合ポリペプ
チドは、種々の宿主細胞、例えばE.コリ、他の細胞宿主、酵母、及び種々の高
等真核細胞、例えばCOS, CHO及びHeLa細胞系及び骨髄腫細胞系において発現され
得る。宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞又は微生物、例えば酵母細胞、細菌細
胞又は菌類細胞であり得る。
ウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び同様の
ものに従って精製され得る(一般的には、R. Scopes, Protein Purification, S
pringer-Verlag, NY (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Gu
ide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990) を参照のこと
)。少なくとも約90〜95%の均質性の実質的に純粋な組織物が好ましく、そして
98〜99%又はそれ以上の均質性が最も好ましい。所望のように部分的に又は均質
的に精製されると、そのポリペプチドが使用され得る(例えば、抗体生成のため
の免疫原として)。
をコードする核酸はまた、親和性結合試薬が利用できる、エピトープ又は“標識
”のためのコード配列を含むことができる。適切なエピトープの例は、myc及びV
-5レポーター遺伝子を包含し;それらのエピトープを有する融合ポリペプチドの
組換え生成のために有用な発現ベクターは市販されている(例えば、Invitrogen
(Corlsbad CA) ベクターpcDNA3.1/Myc-His及びpcDNA3.1/V5-Hisが哺乳類細胞に
おける発現のための適切である)。本発明の融合タンパク質に標識を結合するた
めに適切な追加の発現ベクター及び対応する検出システムは、当業者に知られて
おり、そしてそのいくつかは市販されている(例えば、FLAG (Kodak, Rochester
MY)。
ヒスチジン配列である。典型的には、6個の隣接するヒスチジンが使用され得る
が、6個よりも多いか又は少ないヒスチジンも使用できる。ポリヒスチジン標識
のための結合成分として作用することができる適切な金属キレート親和性リガン
ドは、ニトリロ−トリ−酢酸(NTA)を包含する(Hochuli, E. (1990) “Purifi
cation of recombinant proteins with metal chelating adsorbents” In Gene
tic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press,
NY; Qiagen (Santa Clarita, CA) から市販されている)。
的二本鎖核酸結合ドメインに対して行われ得ることを認識する。いくらかの修飾
が、クローニング、発現又は融合タンパク質中へのドメインの組み込みを促進す
るために行われ得る。そのような修飾は、当業者によく知られており、そして例
えば、開始部位、又は便利に位置する制御部位又は終結コドン又は精製配列を創
造するために、いずれかの末端上に配置される追加のアミノ酸(例えば、ポリHi
s)を供給するためにアミノ酸末端で付加されるメチオニンを供給するために結
合ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端でのコドンの付加を
包含する。
される修飾タンパク質のプロセッシング性又は修飾活性を比較するために使用さ
れ得る種々のアッセイを用いて測定され得る。活性の改良性は、高められたプロ
セッシング性及び高められた効率の両者を包含する。 プロセッシング修飾酵素の改良された活性: ポリメラーゼプロセッシング性は、当業者に知られている種々の方法により測
定され得る。ポリメラーゼプロセッシング性は一般的に、プライムされた鋳型へ
の修飾酵素の1回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数として定義さ
れる。
ために環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングされる。プロセッシ
ング性の測定の場合、プライムされた鋳型は通常、アッセイされるべき酵素又は
触媒ドメインに対して有意なモル過剰で存在し、その結果、ポリメラーゼによる
1回以上、延長されるいずれかのプライムされた鋳型の機会が最少にされる。従
って、プライムされた鋳型は、緩衝液及びdNTPの不在下で、一定の比、例えば約
4000:1(プライムされたDNA:DNAポリメラーゼ)でアッセイされるポリメラー
ゼ触媒ドメインと共に混合される。
の時間で急冷され、そして配列決定ゲル上で分析される。生成物のメジアン長は
時間又はポリメラーゼ濃度と共に変化しないポリメラーゼ濃度で、その長さは酵
素のプロセッシング性に対応する。本発明のタンパク質、すなわちプロセッシン
グ核酸修飾酵素、例えばポリメラーゼの触媒ドメインに融合される配列−非特異
的二本鎖核酸結合ドメインを含むタンパク質のプロセッシング性が、結合ドメイ
ンを有さない酵素のプロセッシング性に比較される。
とによって示され得る。そのような分析は、反応において得られる生成物の量を
決定することによって間接的に、二本鎖核酸複合体の安定性を測定する。例えば
、PCRアッセイは、高温、例えば50℃でアニーリングされた、短い、例えば12個
の長さのヌクレオチドのプライマーにより得られたPCR生成物の量を測定するた
めに使用され得る。このアッセイにおいては、増強された効率は、Taqポリメラ
ーゼよりも本発明の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイン、例えばSso7dに連
結される場合、50℃でアニーリングされた、12個のヌクレオチドのプライマーを
用いて、PCR反応においてより生成物を生成するポリメラーゼ、例えばTaqポリメ
ラーゼの能力により示される。対照的に、一連の荷電された残基、例えばリシン
である結合路は、ポリメラーゼに連結される場合、プロセッシング性を増強しな
い。
ース、トポイソメラーゼ又はエキソヌクレアーゼである場合、改良されたプロセ
ッシング性について試験するために使用され得る。それらの分析においては、プ
ロセッシング性は、鋳型又は基質に結合されたまま存続し、そして複数の修飾反
応を行う酵素の能力として測定される。核酸:酵素のモル比は、平均して、1つ
の酵素分子のみが基質核酸当たり結合されるよう十分に高い。例えば、プロセッ
シングエキソヌクレアーゼ、すなわちλエキソヌクレアーゼの活性は、公開され
た方法を用いてアッセイされ得る(例えば、Mitsis and Kwagh, Nucleic Acid R
esearch, 27: 3057-3063, 1999を参照のこと)。
化されたプライマーを、及び逆方向プライマーとして5’リン酸化されたプライ
マーを用いて、DNA鋳型から増幅され得る。放射性ラベルされたdATPは、λエキ
ソヌクレアーゼのための基質として作用するPCRフラグメントを内部的にラベル
するために使用される。精製された内部的にラベルされた基質は、平均して、1
つのエキソヌクレアーゼ分子のみが基質DNA当たりに結合されることを確保する
ために、DNA:酵素の十分に高いモル比で酵素と共に混合される。サンプルのア
リコートが時間と共に除かれ、そしてゲル電気泳動により、又は酸可溶性放射性
ラベルの形成をモニターすることによってアッセイされ得る。
使用され得る。そのような修飾酵素の例は、リガーゼ及び制限エンドヌクレオチ
ドを包含する。しばしば、触媒ドメインは、熱安定性サーマス又はピロコーカス
種から得られる。改良された活性を決定するためには、酵素機能は、種々の条件
、しばしば高められた反応温度、例えば45℃又はそれ以上で分析され得、そして
修飾されていない酵素活性に比較される。
種の隣接するオリゴヌクレオチドの並置された5’リン酸末端と3’ヒドロキシル
末端との間でのホスホジエステル結合の形成を触媒する。酵素は45℃〜65℃で活
性的である。連結された生成物の収率は、DNAの相補的鎖が酵素のための基質を
形成するためにいかに効率良くアニーリングされるかに依存する。本発明の結合
ドメイン、例えばSso7d−様タンパク質はリガーゼに結合される場合、その溶融
温度を高めることによってDNA重複体を安定化することができ、その結果、高め
られた反応温度が、塩基対合相互作用を妨げないで、酵素の活性を最大にするた
めに使用され得る。
ない酵素との連結効率を比較することによって分析され得る。2種のDNAフラグ
メントの連結効率は、アガロースゲル電気泳動によりモニターされ、そして線状
化されたプラスミドの環状プラスミドへの転換の連結効率は、DNA形質転換によ
りモニターされ得る。
ンは、最適な活性を達成するために高められた反応温度を必要とする好熱性種か
ら単離される制限酵素からであり得る。例えば、制限酵素認識部位がDNAフラグ
メントの末端に非常に接近して又は重複オリゴヌクレオチドに位置する場合、よ
り高い温度が重複構造体を不安定化することができる。より高い反応温度、例え
ば45℃又はそれ以上で、本発明の結合ドメイン、例えば制限エンドヌクレアーゼ
に連結されるSso7d−様タンパク質の存在のために、改良された活性を有する制
限酵素は、制限酵素単独よりも、高い量の生成物、すなわち消化されたDNAを生
成することができる。特定の反応からの生成物の収率は、ゲル上での可視化によ
り、又は形質転換効率により評価され得る。
定の修飾酵素の酵素活性の標準アッセイを用いて、当業者により決定され得る。
従って、プロセッシング性修飾酵素、例えば逆転写酵素、メチラーゼ、ジャイレ
ース、及びトポイソメラーゼ、並びに他の非プロセッシング性修飾酵素は、配列
−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに連結されるタンパク質、又は触媒ドメイン
、及びタンパク質自体の活性を比較することによって同様にして分析され得る。
は特許出願が特異的に及び個々に、引用により組み込まれることを示されたかの
ように、引用により本明細書に込みこまれる。 前述の発明はより明白な理解のために、例示的及び例的にいくらか詳細に記載
されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業
者に明らかであろう。
的に類似する結果を生成するために変更されるか又は修飾され得る種々の非決定
的パラメーターを容易に認識するであろう。
成を例示し、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質Sso7dは、289個の
アミノ酸(ΔTaq)によりN末端で欠失されているサーマス・アクアチカスPol DN
Aポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼとして知られているファミリーAポリメラー
ゼ)に融合されている。
sco7dをコードする合成遺伝子を構成することに使用した。オリゴヌクレオチド
をアニーリングし、そしてT4 DNAリガーゼを用いて連結した。最終の連結された
生成物を、十分な長さの遺伝子を増幅するためにプライマーとして2種の末端オ
リゴヌクレオチドを用いてPCR反応において鋳型として使用した。企画によれば
、得られるPCRフラグメントは、5’末端でユニークEcoRI部位及び3’末端でユニ
ークBstXI部位を含む。Sso7dタンパク質のコードの他に、上記PCRフラグメント
はまた、Sso7dタンパク質はまた、Sso7dタンパク質のC末端で位置するGly−Gly
−Val−Thrのアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。Sso7dの合
成遺伝子は、配列番号1に示されるDNA配列を有し、そしてそれは、配列番号2
に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ミノ酸を置換している融合タンパク質を生成した。Sso7dをコードするフラグメ
ントを、Taqポリメラーゼをコードするプラスミド中にサブクローン化し、次の
通りに融合タンパク質を生成した。手短には、合成Sso7d遺伝子を含むDNAフラグ
メントを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBstXIにより消化し、そしてTaqを
コードするプラスミドのその対応する部位中に連結した。結果として、Taqの最
初の289個のアミノ酸をコードする領域を、Sso7dの合成遺伝子により置換する。
このプラスミド(pYW1)は、Gly−Gly−Val−Thrから構成される合成リンカーを
通してΔTaqのN末端に融合されるSso7dを含む単一のポリペプチドの発現を可能
にする。融合タンパク質(Sso7d−ΔTaq)をコードするDNA配列及びそのタンパ
ク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3及び4に示されている。
ラーゼの最初の336個のアミノ酸をコードする1kbのPCRフラグメントを、2種の
プライマーを用いて生成した。5’プライマーは、SpeI部位をPCRフラグメントの
5’末端中に導入し、そして3’プライマーはTaq遺伝子のヌクレオチド1008−102
6にハイブリダイズする。フラグメントをSpeI及びBstXIにより消化し、Taqポリ
メラーゼの最初の289個のアミノ酸をコードする0.9kbのフラグメントを開放する
。
stXI部位でプラスミドpYW1中に連結した。得られるプラスミド(pYWZ)は、Sso7
d−ΔTaqにおけるのと同じ、Gly−Gly−Val−Thrから成るリンカーを通して十分
な長さのTaq DNAポリメラーゼのN末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一
のポリペプチドの発現を可能にする。Sso7d−Taq融合タンパク質をコードするDN
A配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号5及び6で示さ
れる。
Aポリメラーゼ)のC末端にSso7dを連結する第3の融合タンパク質を構造した。P
fu DNAポリメラーゼ遺伝子を担持するpETに基づくプラスミドを修飾し、その結
果、ユニークKpnI部位及びユニークSpeI部位を、停止コドンの前のPfu遺伝子の3
’末端で導入する。得られるプラスミド(pPFKS)は、そのC末端で追加のアミノ
酸(Gly−Thr−His)を有するPfuポリメラーゼを発現する。
及びSso7d遺伝子を両端に有するNheI部位を導入した。5’プライマーをまた、Ss
o7dタンパク質のN末端でリンカーとして作用する6個の追加のアミノ酸(Gly−T
hr−Gly−Gly−Gly)を導入する。KpnI及びNheIによる消化に基づいて、PCRフラ
グメントを、その対応する部位でpPFKS中に連結した。得られるプラスミド(pPF
S)は、ペプチドリンカー(Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly)を通してPfuポリメ
ラーゼのC末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一のポリペプチドの発現を
可能にする。融合タンパク質(Pfu−Sso7d)をコードするDNA配列及び融合タン
パク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号7及び8に示される。
ク質を連結する第4の融合タンパク質を構成した。2種のプライマーを用いて、
スルホロバス・アシドカルダリウムのゲノムDNAからのSac7d遺伝子をPCR増幅し
た。前記プライマーは、それぞれ5’及び3’末端でPCRフラグメントにユニークE
coRI部位及びユニークSpeI部位を導入した。EcoRI及びSpeIによる制限消化に基
づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpYW1 (上記に記載される)中に
連結した。得られるプラスミドは、Sso7d−ΔTaqに使用されるのと同じリンカー
を通してΔTaqのN末端に融合されるSac7dタンパク質を含む単一のポリペプチド
を発現する。融合タンパク質(Sac7d−ΔTaq)のDNA配列及び前記タンパク質の
アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号9及び10で示される。
プチドをΔTaqのN末端に連結する。ポリリシン(PL)−ΔTaq融合タンパク質を
生成するために、2種の67ntのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、EcoRI部
位を適合する5’突出末端及びSpeI部位と適合する3’突出末端を有する重複DNA
フラグメントを形成した。前記DNAフラグメントは、次の組成のリシンに富んで
いるペプチドをコードする:NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT。
同一である。このDNAフラグメントをpYW1中の連結し、EcoRI及びSpeIにより予備
消化し、Sso7dをコードする領域を置換した。得られるプラスミド(pLST)は、
ΔTaqのN末端に融合されるリシンに富んでいるペプチドを含む単一のポリペプチ
ドを発現する。融合タンパク質(PL−ΔTaq)をコードするDNA配列及び前記タン
パク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11及び12に示される。
性の増強を示す。 ポリメラーゼ単位定義アッセイ: 次のアッセイを用いて、ポリメラーゼ単位を定義した。オリゴヌクレオチドを
、Mg2+−フリー反応緩衝液及びdNTPの存在下でssM13mp18 DNAにプレアニーリン
グした。興味あるDNAポリメラーゼを、プライムされたDNA混合物に添加した。Mg
Cl2を添加し、72℃でのDNA合成を開始した。サンプルを種々の時点で採取し、そ
してPicoGreen(Molecular Probes, Eugene Oregon)を含むTE緩衝液に添加した
。合成されるDNAの量を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。興味あるD
NAポリメラーゼの単位活性を、その初期割合と対照DNAポリメラーゼ(例えば、
既知の単位濃度の市販のポリメラーゼ)のその割合とを比較することによって決
定した。
の間に組み込まれるヌクレオチドの数を決定することによって測定した。 手短には、40nMの5’FAM−ラベルされたプライマー(34ntの長さ)を、80nMの
環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングし、プライムされた鋳型を
形成した。プライムされた鋳型を、標準のPCR緩衝液(Mg2+を有さない)及び200
μMの個々のdNTPの存在下で、興味あるDNAポリメラーゼと共に、約4000:1のモ
ル比(プライムされたDNA:DNAポリメラーゼ)で混合した。
時間で、サンプルを、配列決定負荷色素含有の99%ホルムアミドにより急冷し、
そして配列決定ゲル上で分析した。等量の生成物が存在する、上記又は下記生成
物の長さとして定義される生成物のメジアン長を、すべての検出できる生成物ピ
ークの統合に基づいて決定した。生成物のメジアン長が時間又はポリメラーゼ濃
度と共に変化するポリメラーゼ濃度で、その長さは酵素のプロセッシング性に対
応する。表Iに示される範囲は、アッセイのいくつかの反復体において得られる
値の範囲を表す。
、ΔTaqは2〜6個のヌクレオチドのプロセッシング性を有し、そしてSso7d−Δ
Taq融合体は39〜58個のヌクレオチドのプロセッシング性を示した(表I)。十分
な長さのTaqは、130〜160個のヌクレオチドのプロセッシング性を有するSso7d−
Faq融合体のプロセッシング性よりも有意に低い15〜20個のヌクレオチドのプロ
セッシング性を有した。それらの結果は、Taqポリメラーゼに連結されるSso7dが
ポリメラーゼのプロセッシング性を増強したことを示す。
fuは、DNA合成の間、高い適合性の維持を可能にする3’−5’エキソヌクレアー
ゼ活性を有する。Sso7dが十分な長さのPfuポリメラーゼのC末端に融合されてい
る修飾されたPfuポリメラーゼ、及び修飾されていないPfuポリメラーゼを、上記
プロセッシング性アッセイにおいて分析した。表Iに示されるように、Pfuポリメ
ラーゼは2〜3ntのプロセッシング性を示し、そしてPfu−Sso7d融合タンパク質
は35〜39ntのプロセッシング性を有した。従って、PfuのC末端へのSso7dの融合
は、修飾されていない酵素に対するプロセッシング性の10倍以上の増強性をもた
らした。
の能力をまた、評価した。PL−ΔTaqのプロセッシングを、上記方法を用いて測
定し、そして修飾されていないタンパク質ΔTaqのプロセッシング性に比較した
。表Iに示されるように、ポリリシン路の存在はΔTaqのプロセッシング性を増強
しなかった。従って、核酸結合タンパク質へのリシンに富んでいるペプチドの付
加は従来技術に開示されるようにその基質への酵素の会合速度を高めることがで
きるが、プロセッシング性は高められない。
を生成するために、Taqに比較して、Sso7d−ΔTaq融合タンパク質の高められた
効率を示す。 2種のプライマー、すなわちプライマー1008(19マー、TM=56.4℃)及び2180R
(20マー、TM=56.9℃)を用いて、Taq pol遺伝子の1kbフラグメント(1008−21
80)を増幅した。グラジエント熱サイクラー(MJ Research, Waltham MA)を用
いて、PCRサイクリングプログラムにおいて50℃から72℃にアニーリング温度を
変えた。同一数の単位のSso7d−ΔTaq及びTaqを用いて生成されるPCR生成物の量
を、定量化し、そして比較した。結果は表IIに示される。Sso7d−ΔTaq融合タン
パク質は、高いアニーリング温度での十分な長さのTaqよりも有意に高い効率を
示した。従って、シスでのSso7dの存在は、鋳型上でのプライマーの溶融温度を
高める。
ーのアニーリング温度に対していずれかの効果を有するかどうかを調べた。表II
に示されるように、増幅された生成物は、アニーリング温度が63℃又はそれ以上
である場合、ほとんど又はまったく観察されなかった。
果的なPCR増幅を達成するために、Taqによってではなく、Sso7d−ΔTaqにより使
用され得ることを予測する。この分析は、Sso7d−ΔTaqが、Taqに比較して、よ
り短いプライマーを用いてアッセイにおいてより効果的であることを示す。
率を比較した。その結果は、表III及び図1A−1Cに示される。2種の長さのプ
ライマー、すなわち57F(22マー、TM=58℃)及び732R(24マー、TM=57℃)が
使用される場合、低又は高アニーリング温度でSso7d−ΔTaqとTaqとの間で有意
な差異は観察されなかった。中位の長さのプライマー、すなわち57F15(152マー
、TM=35℃)及び732R16(16マー、TM=35℃)が使用される場合、Sso7d−ΔTaq
は、特にアリーリング温度が高い場合、Taqよりもより効果的であった。2種の
酵素間の最も著しい差異が短いプライマー、すなわち57F12(12マー)及び732R1
6(16マー)により観察され、ここでSso7d−ΔTaqは、低及び高アニーリング温
度でTaqよりも10倍、高く生成物を生成した。
応における修飾されていない十分な長さのTaqに対するSac7d−ΔTaqの効率を比
較した。結果は図2に示される。Sso7d−ΔTaqに類似して、Sac7d−ΔTaqは、短
いプライマーを用いての増強において、Taqよりも有意により効果的である。 プライマー長アッセイを用いて、PCR増幅における短いプライマーを用いるPL
−ΔTaqの能力を決定した。長いプライマー(57F及び732F)が使用され得る場合
、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物
の約50%である。短いプライマー(57F12及び732R16)が使用される場合、PL−
ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の20%
以下である。
種々の修飾反応の実施において高められた効率を提供する。例えば、ポリメラー
ゼ融合タンパク質は、PCR反応においてより効果的な増幅を提供することができ
る。多くの因子が、PCR反応の結果、例えばプライマー特異性、ポリメラーゼの
効率、鋳型の量及びGC−含有率、アンプリコンの長さ、等に影響を及ぼす。例5
〜8は、熱安定性ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインに連結される二本鎖配
列−非特異的核酸結合ドメイン、例えばSso7dを包含する融合タンパク質が、PCR
増幅において、修飾されていない酵素に対していくつかの好都合な特徴を有する
ことを示す。
そして高い濃度でより弱い、静電相互作用のために反応緩衝液のイオン強度に対
して敏感である。融合ポリメラーゼタンパク質におけるSso7dの存在は、DNA鋳型
へのポリメラーゼの結合相互作用を安定化する。この例は、Sso7d融合タンパク
質が、高められたKCl濃度を包含するPCR反応において改良された性能を表すこと
を示す。
した。KClの濃度を10mMから150mMに変え、そして反応緩衝液中のすべての他の生
成は変更されなかった。PCR反応を、94℃で30分、94℃で30秒、55℃で30秒、及
び72℃で30秒(20サイクル)、続いて72℃で10分のサイクリングプログラムを用
いて行った。反応の完結後、5μlのPCR反応物を除き、そしてTE中、PicoGreenの
1:400希釈溶液195μlと共に混合し、生成されるアンプリコンの量を定量化し
た。PCR反応生成物をまた、アガロースゲル上で同時に分析し、予測される長さ
のアンプリコンが生成されたことを確かめた(データは示されていない)。
度の効果が表IVに示されている。修飾されていない酵素、すなわちΔTaq及びPfu
は、最大活性の80%を維持するために、それぞれ25mM及び40mM以下のKCl濃度に
ついての選択性を示した。対照的に、融合タンパク質Sso7d−ΔTaq及びPfu−Sso
7dは、それぞれ30〜100mM及び60〜100mMのKClにおいて最大活性の80%を維持す
る。従って、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分に比
較して、高められたKCl濃度に耐性であった。ハイブリッドポリメラーゼのこの
特徴は、低量のDNA鋳型、例えば血液、食物及び植物源(但し、それらだけには
限定されない)から調製されたDNAサンプルからのPCR増幅を実質的に可能にする
であろう。
。例えば、低いプロセッシング性を有するポリメラーゼは、より頻繁に解離し、
そしてプライムされた鋳型に再結合するのにより時間を必要とし、ところが高い
プロセッシング性を有するポリメラーゼは完全な鋳型の複製を完結するためによ
り少ない結合現象を必要とする。例2に示されるように、Sso7d融合タンパク質
は、それらの修飾されていない対抗部分よりも有意に高いプロセッシング性を有
する。
果的であるべきである。本明細書において、本発明者は、Sso7d融合ポリメラー
ゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、PCRの間、大きなフラグメン
トを増幅するために短い延長時間を必要とすることを示す例を提供する。さらに
、本発明者は、単一の酵素融合ポリメラーゼが、大きなフラグメントの増幅のた
めに当業界において現在使用される酵素混合物(DyNAzyme EXT)に比較して、限
定された時間で、大きなDNAフラグメントを増幅する増強された能力を示すこと
を示す。
L71F(5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)及びL71R(5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGG
A−3’)、L18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’)及びL23474R(5’−G
AAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’)、及びL18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCA
G−3’)及びL29930R(5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’)を、それぞれ、0.9
kb、5.5kb、及び11.9kbのサイズのDNAフラグメントを増幅するために使用した。
個々の反応は40単位/mlのポリメラーゼ(前記単位は、例2に記載のように定義
された)、及び0.36mMの個々の4種のdNTPを含んだ。
Cl(pH8.8)、2mMのMgSO4、10mM のKCl、10mMの (NH4)2SO4、0.1%のTritonX−
100及び0.1mg/mlのBSAを含んだ。Pfu−Sso7d、Taq及びSso7d−Taqのための反応
緩衝液は、追加の40cmのKClを含む上記緩衝液であった。1分又は5分の延長時
間を有する2つのサイクリングプログラムを、PCR増幅のために使用した。個々
のサイクリングプログラムは、94℃で20秒、ポリメラーゼの添加による80℃での
熱開始、94℃で10秒、72℃で1又は5分、及び72℃で5分(20サイクル)から構
成された。
のフラグメントを増幅することができ、そして5分の延長時間を用いて、10kbの
フラグメントを増幅することができた。対照的に、Pfuポリメラーゼは、1分又
は5分の延長時間を用いて、1kbのフラグメントのみを増幅した。同様に、Sso7d
−Taq融合タンパク質は、1分の延長時間を用いて、1kbのフラグメントを増幅
し、そして5分の延長時間を用いて、1kb及び5kbのフラグメントを増幅し、そ
してTaqポリメラーゼは、5分の延長時間により、1kbのフラグメントのみを増
幅した。 従って、融合タンパク質におけるSso7dの存在は、修飾されていないタンパク
質に比較して、PCR反応において短い延長時間をもたらす。
がすぐれている: 現在、長いDNAフラグメントのPCR増幅は、非プル−フリーディングポリメラー
ゼ(例えば、Taq又はDyNAyme II)及び少量のプルーフリーディングポリメラー
ゼ(例えば、Pfu又はDeep Vent)の両者を含む酵素混合物の使用を必要とする。
本発明者は、長いPCRにおいて1つの高性能の長いPCR酵素DyNAzyme EXT (Finnzy
mesからの) に単一の融合酵素Pfu−Sso7dを比較し、そしてPfu−Sso7dが、特に
制限された延長時間を伴なって、DyNAzyme EX7より性能がすぐれていることを示
した。
1F(5’− CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)及び171R(5’− GCACAGCGGCTGGCTGAGG
A−3’)、L30350F(5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)及びL35121R(5’−CAC
ATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’)、L2089F(5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’)
及びL7112R(5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’)、及びL30350F(5’−CCTGC
CTGCCGCTTCACGC−3’)及びL40547R(5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’)を用
いて、それぞれ、0.9kb, 4.8kb、5.0kb及び10.2kbのサイズのDNAフラグメントを
増幅した。
を用い、そして2種の濃度(20単位/ml及び40単位/ml)のDyNAzymeEXTを使用し
た。個々の反応は、0.36mMの個々の4種のdNTPを含んだ。Pfu−Sso7dのための反
応緩衝液は、例6−1に記載される通りであった。DyNAzyme EXTのための反応緩
衝液は、20mMのトリス(pH9.0)、2mMのMgCl2、15mMの (NH4)2SO4及び0.1%のTr
iton X-100 (Finnzymesにより提供される) を含んだ。すべての反応成分をまず
、氷上で混合し、そしてサンプルプレートを、90℃以上に予備加熱された熱サイ
クラー(MJ Research)中に配置することによって、反応を開始した。PCRサイク
リングプログラムは、95℃での20秒、94℃での10秒及び70℃で1又は1.5分(20
サイクル)、及び72℃で10分(1サイクル)から成る。
及び80単位/mlのポリメラーゼの存在下で、有意な量の0.9kbの生成物を生成した
。4.8kb及び5.0kbの生成物を生成したが、但し、40及び80単位/mlのポリメラー
ゼの存在下で、低レベルで生成された。1.5分の延長時間を用いて、4.8kb及び5.
0kbの生成物を、10単位/ml又はそれよりも高いPfu−Sso7dにより生成し、そして
10.2kbのフラグメントを、40及び80単位/mlのPfu−Sso7dにより有意な量で生成
した。対照的に、DyNAzyme EXTが使用される場合、1kb及び4.8kbの生成物のみが
、40単位/mlのポリメラーゼの存在下で、1.5分の延長時間を用いて生成され、そ
して10kbの生成物は検出されなかった。 従って、融合ポリメラーゼPfu−Sso7dは、長いPCRにおいて、酵素混合物、例
えばDyNAzyme EXTよりも単一の酵素として著しくより効果的である。
較して、低コピー数で存在する標的物を増幅できることを示す。プラスミドDNA
を、PCR鋳型として使用し、そしてT3及びT7を、500bpのフラグメントを増幅する
プライマーとして使用した。プラスミドDNAの量は変化し、その結果、PCR反応に
存在するDNA鋳型のコピー数は108〜1の範囲であった。サイクリングプログラム
は、99℃で3分、96℃で1秒、50℃で15秒、及び68℃で30秒(25又は35サイクル
)、続いて68℃で5分(1サイクル)であった。104〜108の鋳型コピー数(25μ
lの反応当たり)に関しては、25サイクルの増幅が行われ;1〜104の鋳型コピー
数(25μlの反応数当たり)に関しては、35サイクルの増幅が行われた。
の必要な条件下で修飾されていないポリメラーゼに比較した。表Vに表されるよ
うに、Pfu−Sso7dはDNAの少数のコピーを増幅するその能力においてPfuよりもよ
り有意に敏感であり、このことは、本発明の融合ポリメラーゼがPCR反応の感受
性を5倍ほど高めることができることをしめす。
いアニーリング温度及び/又は短いプライマーを可能にするその能力により表さ
れるように、プライマー鋳型相互作用を安定化する。融合タンパク質のこの性質
がPCRにおいて非特異的増幅をもたらすかどうかを評価するために、複合DNA鋳型
(例えばヒトゲノムDNA)を、標的鋳型として使用した。次の2種の例は、Pfu−
Sso7dを用いて達成される増幅の特異性が最も通常に使用されるPCR酵素であるTa
qほどであることを示す。
を鋳型として使用した。プライマーH−Amelo−Y(5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3
’)及びH−Amelo−YR(5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’)を用いて、X染色
体からの212bpのアンプリコン及びY染色体からの218bpのアンプリコンを増幅し
た。単一の212bpのフラグメントは、雌型DNAから増幅され、そして3種のフラグ
メント(212bp、218bp及び212bp/218bpのヘテロ接合体)は雄型DNAから予測され
た。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の4種のdNTPを
含んだ。
7dのための反応緩衝液は、DyNAzyme EXT緩衝液(例6−2を参照のこと)及び追
加の40mMのKClを含んだ。すべての反応成分を氷上で混合し、そして反応を、65
℃以上に予備加熱された熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始
した。サイクリングプログラムは、95℃で2分、94℃で5秒、64℃で10秒、及び7
2℃10秒(30サイクル)、続いて72℃で7分(1サイクル)から成った。予測さ
れるサイズの特異的アンプリコンを、Pfu−Sso7d及びTaqポリメラーゼの両者に
より増幅した。
した。3種のプライマー対、すなわちBglbn536F(5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
−3’)及びBglbn536R(5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’)、Bglbn536F及びBgl
bn1083R、及びBglbn536及びBglbn1408R(5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’
)を用いて、それぞれ0.5、1.1及び1.4kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した
。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の4種のdNTDを含
んだ。Tgq及びPfu−Sso7dのための反応緩衝液は例8−1に記載されている。
熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始した。サイクリングプロ
グラムは、95℃で2分、94℃で45秒、64℃で45秒、及び72℃1分(30サイクル)
、続いて72℃で7分(1サイクル)から成った。使用される3種のプライマー対
の個々により、予測されるサイズの増幅された生成物を、Pfu−Sso7dを用いて生
成した。それらの結果は、Pfu−Sso7dを用いることによって達成される増幅の特
異性がTaqポリメラーゼによるその特異性に等しいか又はそれよりも良好である
ことを示す。
長さのポリメラーゼの効率とを比較するために、異なった長さのプライマーを用
いて行われるPCR増幅反応の結果を示す。
ために、12ntの前方向プライマーを用いてのPCR増幅反応の結果を示す。
ことを示すPCR増幅反応の結果を示す。
いて機能するいずれかの入手できるプロモーターが使用され得る。標準の細菌発
生ベクターは、プラスミド、例えばpBR322に基づくプラスミド、例えばpBLUESCR
IPTTM, pSKF, pET23D, λ−ファージ由来のベクター及び融合発現システム、例
えばGST及びLacZを包含する。エピトープ標識、例えばc-myc, HA−標識、6−Hi
s(配列番号30)標識、マルトース結合タンパク質、VSV−G標識、抗−DYKDDDDK
(配列番号31)標識、又はその多数が当業者に良く知られているいずれかのその
ような標識は、便利な単離方法を提供するために組換えタンパク質に付加され得
る。
sco7dをコードする合成遺伝子を構成することに使用した。オリゴヌクレオチド
をアニーリングし、そしてT4 DNAリガーゼを用いて連結した。最終の連結された
生成物を、十分な長さの遺伝子を増幅するためにプライマーとして2種の末端オ
リゴヌクレオチドを用いてPCR反応において鋳型として使用した。企画によれば
、得られるPCRフラグメントは、5’末端でユニークEcoRI部位及び3’末端でユニ
ークBstXI部位を含む。Sso7dタンパク質のコードの他に、上記PCRフラグメント
はまた、Sso7dタンパク質はまた、Sso7dタンパク質のC末端で位置するGly−Gly
−Val−Thr(配列番号32)のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードす
る。Sso7dの合成遺伝子は、配列番号1に示されるDNA配列を有し、そしてそれは
、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
ミノ酸を置換している融合タンパク質を生成した。Sso7dをコードするフラグメ
ントを、Taqポリメラーゼをコードするプラスミド中にサブクローン化し、次の
通りに融合タンパク質を生成した。手短には、合成Sso7d遺伝子を含むDNAフラグ
メントを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBstXIにより消化し、そしてTaqを
コードするプラスミドのその対応する部位中に連結した。結果として、Taqの最
初の289個のアミノ酸をコードする領域を、Sso7dの合成遺伝子により置換する。
このプラスミド(pYW1)は、Gly−Gly−Val−Thr(配列番号32)から構成される
合成リンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSso7dを含む単一のポリペプチ
ドの発現を可能にする。融合タンパク質(Sso7d−ΔTaq)をコードするDNA配列
及びそのタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3及び4に示されてい
る。
stXI部位でプラスミドpYW1中に連結した。得られるプラスミド(pYWZ)は、Sso7
d−ΔTaqにおけるのと同じ、Gly−Gly−Val−Thr(配列番号32)から成るリンカ
ーを通して十分な長さのTaq DNAポリメラーゼのN末端に融合されるSso7dタンパ
ク質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。Sso7d−Taq融合タンパク質
をコードするDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号
5及び6で示される。
及びSso7d遺伝子を両端に有するNheI部位を導入した。5’プライマーをまた、Ss
o7dタンパク質のN末端でリンカーとして作用する6個の追加のアミノ酸(Gly−T
hr−Gly−Gly−Gly−Gly)(配列番号33)を導入する。KpnI及びNheIによる消化
に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpPFKS中に連結した。得ら
れるプラスミド(pPFS)は、ペプチドリンカー(Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly
)(配列番号33)を通してPfuポリメラーゼのC末端に融合されるSso7dタンパク
質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。融合タンパク質(Pfu−Sso7d
)をコードするDNA配列及び融合タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番
号7及び8に示される。
プチドをΔTaqのN末端に連結する。ポリリシン(PL)−ΔTaq融合タンパク質を
生成するために、2種の67ntのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、EcoRI部
位を適合する5’突出末端及びSpeI部位と適合する3’突出末端を有する重複DNA
フラグメントを形成した。前記DNAフラグメントは、次の組成のリシンに富んで
いるペプチドをコードする:NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT(配列番号34)。
L71F(5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)(配列番号13)及びL71R(5’−GCACA
GCGGCTGGCTGAGGA−3’)(配列番号14)、L18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGC
AG−3’)(配列番号15)及びL23474R(5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’
)(配列番号16)、及びL18015F(5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’)(配列
番号17)及びL29930R(5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’)(配列番号18)を
、それぞれ、0.9kb、5.5kb、及び11.9kbのサイズのDNAフラグメントを増幅する
ために使用した。個々の反応は40単位/mlのポリメラーゼ(前記単位は、例2に
記載のように定義された)、及び0.36mMの個々の4種のdNTPを含んだ。
(5’− CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’)(配列番号13)及びL71R(5’− GCACAGC
GGCTGGCTGAGGA−3’)(配列番号14)、L30350F(5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−
3’)(配列番号19)及びL35121R(5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’)(配列
番号20)、L2089F(5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’)(配列番号21)及びL
7112R(5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’)(配列番号22)、及びL30350F(5
’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’)(配列番号23)及びL40547R(5’−CCAATACCCG
TTTCATCGCGGC−3’)(配列番号24)を用いて、それぞれ、0.9kb, 4.8kb、5.0kb
及び10.2kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。
を鋳型として使用した。プライマーH−Amelo−Y(5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3
’)(配列番号25)及びH−Amelo−YR(5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’)(
配列番号26)を用いて、X染色体からの212bpのアンプリコン及びY染色体からの2
18bpのアンプリコンを増幅した。単一の212bpのフラグメントは、雌型DNAから増
幅され、そして3種のフラグメント(212bp、218bp及び212bp/218bpのヘテロ接
合体)は雄型DNAから予測された。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び
0.36mMの個々の4種のdNTPを含んだ。
した。3種のプライマー対、すなわちBglbn536F(5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG
−3’)(配列番号27)及びBglbn536R(5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’)(配
列番号28)、Bglbn536F及びBglbn1083R、及びBglbn536及びBglbn1408R(5’−GA
TTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’)(配列番号29)を用いて、それぞれ0.5、1.1及
び1.4kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。個々の反応は、20単位/mlのポ
リメラーゼ及び0.36mMの個々の4種のdNTDを含んだ。Tgq及びPfu−Sso7dのため
の反応緩衝液は例8−1に記載されている。
Claims (44)
- 【請求項1】 配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメイン
が、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに
結合されている少なくとも2種の異種ドメインから成るタンパク質であって、前
記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非
特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸修飾ドメ
インのプロセッシング性質を増強することを特徴とするタンパク質。 - 【請求項2】 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求項
1記載のタンパク質。 - 【請求項3】 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有す
る請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項4】 前記核酸修飾ドメインが、サーマス(Thermus)ポリメラー
ゼドメインを含んで成る請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項5】 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカス(Pyrococcus)ポリ
メラーゼドメインを含んで成る請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項6】 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、
メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラー
ゼ活性を有する請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項7】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7dの
いずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求
項1記載のタンパク質。 - 【請求項8】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して50
%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項1記載のタンパ
ク質。 - 【請求項9】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して生
成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項1記載のタンパク
質。 - 【請求項10】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請
求項1記載のタンパク質。 - 【請求項11】 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカスポリメラーゼドメ
インを含んで成る請求項10記載のタンパク質。 - 【請求項12】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・
フリオサス(Pyrococcus furiosus)のPCNA相同体に対して生成されるポリクロ
ーナル抗体に対して特異的に結合する請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項13】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・
フルオサスのPCNA相同体である請求項1記載のタンパク質。 - 【請求項14】 配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメイ
ンが、触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合されている少なくとも
2種の異種ドメインから成るタンパク質であって、前記配列−非特異的二本鎖核
酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを
有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なく
とも1℃安定化することを特徴とするタンパク質。 - 【請求項15】 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求
項14記載のタンパク質。 - 【請求項16】 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有
する請求項14記載のタンパク質。 - 【請求項17】 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素
、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラ
ーゼ活性を有する請求項14記載のタンパク質。 - 【請求項18】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7d
のいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請
求項14記載のタンパク質。 - 【請求項19】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して5
0%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項14記載のタン
パク質。 - 【請求項20】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して
生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項14記載のタンパ
ク質。 - 【請求項21】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請
求項14記載のタンパク質。 - 【請求項22】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・
フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的
に結合する請求項14記載のタンパク質。 - 【請求項23】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・
フルオサスのPCNA相同体である請求項14記載のタンパク質。 - 【請求項24】 水溶液中の核酸を修飾するための方法であって、 (i)前記核酸と少なくとも2種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを
接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1ドメイン
が、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに
結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、 a. 二本鎖核酸に結合し、そして b. それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一の酵
素と比較して、前記酵素のプロセッシング性を増強し、そして ここで前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして
前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のもの
であり;そして (ii)前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすること
を含んで成る方法。 - 【請求項25】 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求
項24記載のタンパク質。 - 【請求項26】 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有
する請求項24記載のタンパク質。 - 【請求項27】 前記核酸修飾ドメインが、サーマスポリメラーゼドメイン
を含んで成る請求項26記載のタンパク質。 - 【請求項28】 前記核酸修飾ドメインが、ピロコーカスポリメラーゼドメ
インを含んで成る請求項26記載のタンパク質。 - 【請求項29】 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素
、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼ、又は核
酸と相互反応する他のプロセッシング酵素活性を有する請求項24記載のタンパク
質。 - 【請求項30】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7d
のいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請
求項24記載のタンパク質。 - 【請求項31】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して5
0%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項24記載のタン
パク質。 - 【請求項32】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して
生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項24記載のタンパ
ク質。 - 【請求項33】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請
求項24記載のタンパク質。 - 【請求項34】 核酸を修飾するための方法であって、 (i)前記核酸と少なくとも2種の異種ドメインを有するタンパク質を含む水
溶液とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第1
ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第2ドメインに結合され、前記配列
−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的
核酸結合ドメインを有さない他の同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コ
ンホメーションを少なくとも1℃安定化し、そして前記溶液が、前記結合ドメイ
ンの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能に
する温度で存在し、そしてその組成のものであり;そして (ii)前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすること
を含んで成る方法。 - 【請求項35】 前記核酸修飾ドメインが、ポリメラーゼ活性を有する請求
項34記載のタンパク質。 - 【請求項36】 前記核酸修飾ドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有
する請求項34記載のタンパク質。 - 【請求項37】 前記核酸修飾ドメインが、サーマスポリメラーゼドメイン
を含んで成る請求項36記載のタンパク質。 - 【請求項38】 前記核酸修飾ドメインが、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素
、メチラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を
有する請求項34記載のタンパク質。 - 【請求項39】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sac7d又はSso7d
のいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請
求項34記載のタンパク質。 - 【請求項40】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して5
0%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項34記載のタン
パク質。 - 【請求項41】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して7
5%のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む請求項34記載のタン
パク質。 - 【請求項42】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dに対して
生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する請求項34記載のタンパ
ク質。 - 【請求項43】 前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、Sso7dである請
求項34記載のタンパク質。 - 【請求項44】 ポリメラーゼ鎖反応を用いての標的核酸の副配列の修飾方
法であって、 (i)水溶液における前記標記核酸と請求項1又は14記載のタンパク質とを接
触せしめ、ここで前記水溶液は、結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可
能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリ
メラーゼドメインによる拡張を可能にする組成のものであり; (ii)前記副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前
記溶液をインキュベートすることを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20756700P | 2000-05-26 | 2000-05-26 | |
US60/207,567 | 2000-05-26 | ||
US09/640,958 US6627424B1 (en) | 2000-05-26 | 2000-08-16 | Nucleic acid modifying enzymes |
US09/640,958 | 2000-08-16 | ||
PCT/US2001/017492 WO2001092501A1 (en) | 2000-05-26 | 2001-05-29 | Improved nucleic acid modifying enzymes |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009203587A Division JP2010000089A (ja) | 2000-05-26 | 2009-09-03 | 改良された核酸修飾酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003534796A true JP2003534796A (ja) | 2003-11-25 |
JP4405725B2 JP4405725B2 (ja) | 2010-01-27 |
Family
ID=26902363
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002500693A Expired - Lifetime JP4405725B2 (ja) | 2000-05-26 | 2001-05-29 | 改良された核酸修飾酵素 |
JP2009203587A Pending JP2010000089A (ja) | 2000-05-26 | 2009-09-03 | 改良された核酸修飾酵素 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009203587A Pending JP2010000089A (ja) | 2000-05-26 | 2009-09-03 | 改良された核酸修飾酵素 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (10) | US6627424B1 (ja) |
EP (1) | EP1283875B1 (ja) |
JP (2) | JP4405725B2 (ja) |
AT (1) | ATE368104T1 (ja) |
AU (2) | AU7503901A (ja) |
CA (1) | CA2409417C (ja) |
DE (1) | DE60129549T2 (ja) |
DK (1) | DK1283875T3 (ja) |
ES (1) | ES2291322T3 (ja) |
WO (1) | WO2001092501A1 (ja) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005510235A (ja) * | 2001-11-28 | 2005-04-21 | エムジェイ バイオワークス インコーポレイテッド | 改良型ポリメラーゼの使用方法 |
JP2006521112A (ja) * | 2003-03-25 | 2006-09-21 | ストラタジーン カリフォルニア | Dnaポリメラーゼ融合物およびその使用 |
JP2009501530A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-22 | ストラタジーン カリフォルニア | Dna結合タンパク質−ポリメラーゼのキメラ |
JP2009521954A (ja) * | 2006-01-06 | 2009-06-11 | ストラタジーン カリフォルニア | 濃縮(packed)DNAポリメラーゼを含む核酸複製のための反応緩衝液組成物 |
JP2010104304A (ja) * | 2008-10-30 | 2010-05-13 | Hitachi Ltd | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
JP2012514473A (ja) * | 2009-01-08 | 2012-06-28 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | 核酸増幅反応の効率を改善するための方法および組成物 |
JP2013505016A (ja) * | 2009-09-16 | 2013-02-14 | マッシー ユニヴァーシティー | 融合ポリペプチドおよびその使用 |
JP2017178804A (ja) * | 2016-03-29 | 2017-10-05 | 東洋紡株式会社 | 融合タンパク質 |
Families Citing this family (110)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050123940A1 (en) * | 1999-10-29 | 2005-06-09 | Stratagene California | Compositions and methods for synthesizing cDNA |
US20030228616A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-12-11 | Stratagene | DNA polymerase mutants with reverse transcriptase activity |
US20040009486A1 (en) * | 1999-10-29 | 2004-01-15 | Sorge Joseph A. | Compositions and methods utilizing DNA polymerases |
US8268605B2 (en) | 1999-10-29 | 2012-09-18 | Agilent Technologies, Inc. | Compositions and methods utilizing DNA polymerases |
ATE395420T1 (de) * | 2000-02-17 | 2008-05-15 | Qiagen Gmbh | Thermostabile chimäre nucleinsäurepolymerasen und ihre verwendungen |
US6627424B1 (en) * | 2000-05-26 | 2003-09-30 | Mj Bioworks, Inc. | Nucleic acid modifying enzymes |
DE10049211A1 (de) * | 2000-10-05 | 2002-04-18 | Qiagen Gmbh | Thermostabile Polymerase aus Thermococcus pacificus |
WO2002044425A2 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
EP1456409B1 (en) * | 2001-11-28 | 2010-02-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction |
AU2003279696A1 (en) * | 2002-05-14 | 2004-02-23 | Fidelity Systems, Inc. | Helix-hairpin-helix motifs to manipulate properties of dna processing enzymes |
ATE486931T1 (de) * | 2002-07-25 | 2010-11-15 | Bio Rad Laboratories | Hybridpolymerase-verfahren und -zusammensetzungen |
US7560260B2 (en) * | 2002-07-25 | 2009-07-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions with polymerase activity |
US7666645B2 (en) | 2002-10-23 | 2010-02-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sso7-polymerase conjugate proteins |
US8283148B2 (en) | 2002-10-25 | 2012-10-09 | Agilent Technologies, Inc. | DNA polymerase compositions for quantitative PCR and methods thereof |
EP1578951A4 (en) * | 2002-10-25 | 2005-11-16 | Stratagene California | DNA POLYMERASE WITH REDUCED DETECTION ACTIVITY FOR BASE ANALOGS |
US7960157B2 (en) * | 2002-12-20 | 2011-06-14 | Agilent Technologies, Inc. | DNA polymerase blends and uses thereof |
US7417133B2 (en) * | 2004-02-27 | 2008-08-26 | Institut Pasteur | Methods for obtaining thermostable enzymes, DNA polymerase I variants from Thermus aquaticus having new catalytic activities, methods for obtaining the same, and applications of the same |
DK2332977T3 (en) * | 2004-07-23 | 2016-02-29 | Acceleron Pharma Inc | ActRII receptor polypeptides |
US20060105348A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Lee Jun E | Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
AU2006204006A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-13 | Applera Corporation | Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification |
DE602006018701D1 (de) * | 2005-01-06 | 2011-01-20 | Life Technologies Corp | Polypeptide mit nukleinsäurebindender aktivität |
WO2007050125A2 (en) * | 2005-05-27 | 2007-05-03 | William Marsh Rice University | High processivity polymerases |
WO2007008728A2 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Quanta Biosciences, Inc. | Compositions and methods for increasing amplification efficiency |
US20070059713A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
EP3811965A1 (en) | 2005-11-23 | 2021-04-28 | Acceleron Pharma, Inc. | Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth |
US8128933B2 (en) | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
US8568982B2 (en) | 2006-08-09 | 2013-10-29 | National University Of Singapore | Methods of nucleic acid synthesis using particular crowding agents and concentrations |
US8895016B2 (en) * | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
ES2415666T3 (es) | 2007-02-01 | 2013-07-26 | Acceleron Pharma, Inc. | Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIa para uso en la prevención o el tratamiento de metástasis de cáncer de mama o pérdida ósea relacionada con el cáncer de mama |
TW202104248A (zh) | 2007-02-02 | 2021-02-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
TW201934141A (zh) | 2007-02-09 | 2019-09-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 包含ActRIIa-Fc融合蛋白的醫藥組合物;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途;ActRIIa-Fc融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途 |
EP2207562B1 (en) | 2007-09-18 | 2017-05-31 | Acceleron Pharma, Inc. | Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion |
EP2212430B1 (en) * | 2007-11-27 | 2016-01-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Reduced inhibition of one-step rt-pcr |
US20110020877A1 (en) * | 2008-01-11 | 2011-01-27 | Genesys Limited | Cren7 chimeric protein |
GB0803628D0 (en) | 2008-02-28 | 2008-04-02 | Genesys Ltd | Enzyme |
GB0804721D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
GB0804722D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
PL2340031T4 (pl) | 2008-08-14 | 2020-12-28 | Acceleron Pharma Inc. | Zastosowanie pułapek GDF do leczenia niedokrwistości |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
JP2012507986A (ja) | 2008-11-03 | 2012-04-05 | カパバイオシステムズ | キメラdnaポリメラーゼ |
CA2742594C (en) | 2008-11-03 | 2020-03-24 | William Bourn | Modified type a dna polymerases |
EP3415621A1 (en) * | 2009-03-04 | 2018-12-19 | Board Of Regents The University Of Texas System | Stabilized reverse transcriptase fusion proteins |
US9778188B2 (en) | 2009-03-11 | 2017-10-03 | Industrial Technology Research Institute | Apparatus and method for detection and discrimination molecular object |
WO2010111686A2 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Life Technologies Corp | Labeled enzyme compositions, methods & systems |
US8535925B2 (en) | 2009-04-10 | 2013-09-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Modified DNase compositions and methods of use thereof |
MX355042B (es) | 2009-06-08 | 2018-04-02 | Acceleon Pharma Inc | Metodos para aumentar adipositos termogenicos. |
EP2440577A4 (en) | 2009-06-12 | 2013-01-23 | Acceleron Pharma Inc | SHORTEN ACTRIIB FC FUSION PROTEINS |
US8889394B2 (en) * | 2009-09-07 | 2014-11-18 | Empire Technology Development Llc | Multiple domain proteins |
ES2869580T3 (es) * | 2009-09-09 | 2021-10-25 | Acceleron Pharma Inc | Antagonistas de ActRIIB y dosificación y usos de los mismos para tratar obesidad o diabetes tipo 2 regulando el contenido de grasa corporal |
CA2781152A1 (en) | 2009-11-17 | 2011-05-26 | Acceleron Pharma Inc. | Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
EP3461889A1 (en) * | 2009-11-19 | 2019-04-03 | Solis Biodyne | Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods |
EP2539471B1 (en) | 2010-02-26 | 2014-08-06 | Life Technologies Corporation | Method for sequencing using a modified polymerase |
US9482615B2 (en) | 2010-03-15 | 2016-11-01 | Industrial Technology Research Institute | Single-molecule detection system and methods |
US9670243B2 (en) | 2010-06-02 | 2017-06-06 | Industrial Technology Research Institute | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
US8865078B2 (en) | 2010-06-11 | 2014-10-21 | Industrial Technology Research Institute | Apparatus for single-molecule detection |
JP5917519B2 (ja) | 2010-09-10 | 2016-05-18 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | クロマチン分析のためのdnaのサイズ選択 |
WO2012046140A1 (en) | 2010-10-05 | 2012-04-12 | Finnzymes Oy | Enzyme mixture |
WO2012064771A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Acceleron Pharma, Inc. | Actriia binding agents and uses thereof |
US9315787B2 (en) | 2011-01-14 | 2016-04-19 | Kapa Biosystems, Inc. | Modified DNA polymerases for improved amplification |
US9868945B2 (en) | 2011-02-08 | 2018-01-16 | Life Technologies Corporation | Linking methods, compositions, systems, kits and apparatuses |
WO2012112606A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detecting methylati0n in a subpopulation of genomic dna |
SG10201601853XA (en) | 2011-03-11 | 2016-04-28 | Univ Singapore | Pericyte progenitors from peripheral blood |
EP2694670B1 (en) | 2011-04-08 | 2017-07-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pcr reaction mixtures with decreased non-specific activity |
US8715987B2 (en) | 2011-05-02 | 2014-05-06 | New England Biolabs, Inc. | Solubilized phospholipids for stabilizing nucleic acid polymerases |
US8921044B2 (en) | 2011-05-11 | 2014-12-30 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerase variants with reduced exonuclease activity and uses thereof |
US8921043B2 (en) | 2011-05-11 | 2014-12-30 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerase variants with reduced exonuclease activity and uses thereof |
US8470573B2 (en) * | 2011-06-21 | 2013-06-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hybrid polymerases having the ability to produce long amplicons |
WO2013019960A1 (en) | 2011-08-03 | 2013-02-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Filtering small nucleic acids using permeabilized cells |
ES2884095T3 (es) | 2012-11-02 | 2021-12-10 | Celgene Corp | Antagonistas de activina-actrii y usos para el tratamiento de trastornos óseos y otros trastornos |
WO2015085230A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fusion polymerases |
CN114699529A (zh) | 2014-06-13 | 2022-07-05 | 阿塞勒隆制药公司 | 用于治疗溃疡的方法和组合物 |
CN107075544B (zh) | 2014-07-22 | 2021-01-29 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 与聚合酶联用的缓冲液 |
WO2016028671A1 (en) * | 2014-08-19 | 2016-02-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Rna amplification methods |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
WO2016077795A1 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Illumina, Inc. | Polymerases |
US10053676B2 (en) | 2014-11-25 | 2018-08-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Arginine improves polymerase storage stability |
SI3227675T1 (sl) | 2014-12-03 | 2023-07-31 | Celgene Corporation | Antagonisti aktivin-actrii in uporaba za zdravljenje mielodisplastičnega sindroma |
EP3712261A1 (en) | 2015-02-02 | 2020-09-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Polymerase variants and uses thereof |
WO2016134059A1 (en) | 2015-02-17 | 2016-08-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Small nucleic acid quantification using split cycle amplification |
WO2017050723A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Genia Technologies, Inc. | Pol7 polymerase variants |
US20190055527A1 (en) * | 2015-11-27 | 2019-02-21 | Kyushu University, National University Corporation | Dna polymerase variant |
CN116144626A (zh) | 2016-01-13 | 2023-05-23 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
EP3402880B1 (en) | 2016-01-15 | 2024-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics UAB | Thermophilic dna polymerase mutants |
US10273530B2 (en) | 2016-01-15 | 2019-04-30 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Antibodies that bind thermophilic DNA polymerases |
WO2017148860A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-09-08 | Genia Technologies, Inc. | Polymerase-template complexes for nanopore sequencing |
ES2880331T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-11-24 | Genia Tech Inc | Variantes de polimerasa |
WO2017148861A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-09-08 | Genia Technologies, Inc. | Exonuclease deficient polymerases |
JP7157048B2 (ja) | 2016-09-22 | 2022-10-19 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | Pol6ポリメラーゼバリアント |
US11618891B2 (en) * | 2017-06-26 | 2023-04-04 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic DNA polymerase mutants |
CN111556900A (zh) | 2017-12-22 | 2020-08-18 | 赛默飞世尔科技波罗的海封闭股份公司 | 包括胺的聚合酶链反应组合物 |
US11136565B2 (en) | 2018-09-11 | 2021-10-05 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified archaeal family B polymerases |
CN109266628B (zh) * | 2018-10-09 | 2020-04-14 | 南京市胸科医院 | 一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用 |
US10934533B1 (en) | 2018-10-10 | 2021-03-02 | New England Biolabs, Inc. | Variant DNA polymerases having improved properties and method for improved isothermal amplification of a target DNA |
CN109679932B (zh) * | 2018-12-05 | 2020-03-17 | 广州奇辉生物科技有限公司 | 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用 |
CN112175091A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 赛纳生物科技(北京)有限公司 | 通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法及应用 |
US11512295B2 (en) | 2019-09-12 | 2022-11-29 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified thermoccocus polymerases |
EP4103702A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | New England Biolabs, Inc. | Variant family d dna polymerases |
EP4103701A1 (en) | 2020-02-13 | 2022-12-21 | New England Biolabs, Inc. | Variant family d dna polymerases |
US11034942B1 (en) | 2020-02-27 | 2021-06-15 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified pyrococcus polymerases and uses thereof |
CN111518873B (zh) * | 2020-05-11 | 2024-07-09 | 上海羿鸣生物科技有限公司 | 一种优化的扩增目标核酸的方法及应用 |
PL241698B1 (pl) * | 2021-01-27 | 2022-11-21 | Inst Biotechnologii I Medycyny Molekularnej | Polimeraza Pwo-NeqSSB, sposób jej otrzymywania, plazmid rekombinantowy, startery oraz zastosowanie polimerazy |
US11486001B2 (en) | 2021-02-08 | 2022-11-01 | Singular Genomics Systems, Inc. | Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides |
EP4347804A1 (en) | 2021-05-27 | 2024-04-10 | New England Biolabs, Inc. | Dnase i variants, compositions, methods, and kits |
EP4095254A3 (en) | 2021-05-27 | 2022-12-14 | New England Biolabs, Inc. | Fragmentation of dna |
US11993792B2 (en) | 2021-05-27 | 2024-05-28 | New England Biolabs, Inc. | DNase I variants, compositions, methods, and kits |
WO2022249133A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Erebus Enzymes Inc. | Ultra-processive, stutter-resistant polymerase system |
EP4399292A2 (en) | 2021-09-08 | 2024-07-17 | Flagship Pioneering Innovations VI, LLC | Methods and compositions for modulating a genome |
WO2023089175A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable polymerase variants |
WO2023146243A1 (ko) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | 주식회사 씨젠 | 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법 |
US20240263158A1 (en) | 2023-02-01 | 2024-08-08 | New England Biolabs, Inc. | Duplex-specific dnases |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2069948A1 (en) | 1989-12-01 | 1991-06-02 | Brian Wylie Pontius | Promotion of high specificity molecular assembly |
US5747911A (en) | 1994-09-30 | 1998-05-05 | Itt Automotive Electrical Systems, Inc. | Brush holder |
US5972603A (en) * | 1996-02-09 | 1999-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | DNA polymerase with modified processivity |
US6228628B1 (en) | 1997-07-09 | 2001-05-08 | Roche Molecular Systems | Mutant chimeric DNA polymerase |
DE19810879A1 (de) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymerasenchimären |
DE19840771A1 (de) * | 1998-08-06 | 2000-02-10 | Lion Bioscience Ag | Thermostabiler in vitro-Komplex mit Polymeraseaktivität |
WO2000008164A2 (de) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Lion Bioscience Ag | Thermostabiler in vitro-komplex mit polymeraseaktivität |
ATE395420T1 (de) | 2000-02-17 | 2008-05-15 | Qiagen Gmbh | Thermostabile chimäre nucleinsäurepolymerasen und ihre verwendungen |
US6627424B1 (en) * | 2000-05-26 | 2003-09-30 | Mj Bioworks, Inc. | Nucleic acid modifying enzymes |
-
2000
- 2000-08-16 US US09/640,958 patent/US6627424B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-05-29 WO PCT/US2001/017492 patent/WO2001092501A1/en active IP Right Grant
- 2001-05-29 DE DE60129549T patent/DE60129549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 AU AU7503901A patent/AU7503901A/xx active Pending
- 2001-05-29 AU AU2001275039A patent/AU2001275039B2/en not_active Expired
- 2001-05-29 AT AT01941707T patent/ATE368104T1/de active
- 2001-05-29 ES ES01941707T patent/ES2291322T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 DK DK01941707T patent/DK1283875T3/da active
- 2001-05-29 JP JP2002500693A patent/JP4405725B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 EP EP01941707A patent/EP1283875B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-29 CA CA2409417A patent/CA2409417C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-30 US US09/870,353 patent/US7541170B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-27 US US10/256,705 patent/US7919296B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-04-09 US US10/821,583 patent/US7670808B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-09-03 JP JP2009203587A patent/JP2010000089A/ja active Pending
-
2011
- 2011-03-14 US US13/047,638 patent/US8415129B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-03-25 US US13/850,048 patent/US8895283B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2013-10-18 US US14/058,044 patent/US8900846B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-11-17 US US14/543,625 patent/US9453208B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2016
- 2016-09-13 US US15/264,345 patent/US10066218B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2018
- 2018-08-13 US US16/101,895 patent/US10954495B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005510235A (ja) * | 2001-11-28 | 2005-04-21 | エムジェイ バイオワークス インコーポレイテッド | 改良型ポリメラーゼの使用方法 |
JP4689163B2 (ja) * | 2001-11-28 | 2011-05-25 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | 改良型ポリメラーゼの使用方法 |
JP2006521112A (ja) * | 2003-03-25 | 2006-09-21 | ストラタジーン カリフォルニア | Dnaポリメラーゼ融合物およびその使用 |
JP4722035B2 (ja) * | 2003-03-25 | 2011-07-13 | アジレント・テクノロジーズ・インク | Dnaポリメラーゼ融合物およびその使用 |
JP2009501530A (ja) * | 2005-07-15 | 2009-01-22 | ストラタジーン カリフォルニア | Dna結合タンパク質−ポリメラーゼのキメラ |
JP2009521954A (ja) * | 2006-01-06 | 2009-06-11 | ストラタジーン カリフォルニア | 濃縮(packed)DNAポリメラーゼを含む核酸複製のための反応緩衝液組成物 |
JP2010104304A (ja) * | 2008-10-30 | 2010-05-13 | Hitachi Ltd | エキソヌクレアーゼ活性増強dnaポリメラーゼ変異体 |
JP2012514473A (ja) * | 2009-01-08 | 2012-06-28 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | 核酸増幅反応の効率を改善するための方法および組成物 |
JP2013505016A (ja) * | 2009-09-16 | 2013-02-14 | マッシー ユニヴァーシティー | 融合ポリペプチドおよびその使用 |
JP2017178804A (ja) * | 2016-03-29 | 2017-10-05 | 東洋紡株式会社 | 融合タンパク質 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4405725B2 (ja) | 改良された核酸修飾酵素 | |
AU2001275039A1 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes | |
JP4505331B2 (ja) | 改良型Sso7−ポリメラーゼ複合体タンパク質 | |
EP2723880B1 (en) | Hybrid polymerases having the ability to produce long amplicons | |
US20040219558A1 (en) | Novel compositions with polymerase activity | |
EP1832652B1 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes | |
WO2024138762A1 (zh) | 重组蛋白及其应用 | |
AU2006228065A8 (en) | Improved nucleic acid modifying enzymes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050414 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061106 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080805 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081104 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081111 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090303 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090601 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090903 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091006 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091105 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121113 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4405725 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121113 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131113 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |