JP4405725B2 - 改良された核酸修飾酵素 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野：
本発明は、新規核酸修飾酵素の改良された生成を提供する。前記改良点は、前記核酸を結合し、そして触媒的に修飾する酵素の能力を増強する態様での、前記酵素への配列−非特異的核酸結合ドメインの結合である。
【０００２】
発明の背景：
核酸修飾酵素の効率、すなわち結合現象当たり酵素により生成される修飾された生成物の量は、修飾酵素/核酸複合体の安定性を高めることによって増強され得る。従来技術は、核酸修飾酵素への高い確立の結合部位、例えば正に荷電された結合末端の結合が、前記修飾酵素が前記核酸と相互作用する頻度を高めることができることを示している（例えば、アメリカ特許第5,474,911号を参照のこと）。
【０００３】
本発明は現在、核酸の二本鎖コンホメーションが安定化され、そして酵素の効率が、配列―非特異的二本鎖核酸結合ドメインを酵素又はその触媒部位に結合することによって高められる新規修飾酵素を提供する。プロセッシング特性である修飾タンパク質は、酵素のみに比較して、結合ドメインに結合される場合、高められたプロセッシング性を示す。さらに、プロセッシング性及び非プロセッシング性修飾酵素の両者は、本明細書に記載される典型的な結合ドメインに結合される場合、高い温度での高められた効率を示す。
【０００４】
１つの観点においては、本発明は、長いPCRを行う増強された能力、すなわち5kb又はそれ以上の長さの配列の増幅性を提供する融合ポリメラーゼを提供する。長いPCRを行うためのポリメラーゼ混合物は、当業界において知られている。そのような混合物に関する１つの困難性は、長い延長時間が予測される生成物の最適な収率のために必要とされることである。従来の推薦は、kb当たり１分の延長時間を可能にすることである。10kbの生成物に関して、及び40サイクルの増幅を用いて、PCRは約７時間を要する。
【０００５】
現在入手できるそれらのポリメラーゼ及び/又はポリメラーゼ混合物に比較して、長いPCRを行う増強された能力を示す修飾されたポリメラーゼ酵素が本明細書において記載される。それらの修飾された酵素、例えばPfu−Sso7dは、誤差−補正活性及び配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを有するポリメラーゼを組み込み、そして従って、ポリメラーゼ混合物を提供する。さらに、そのような修飾された酵素は、従来のポリメラーゼ酵素により必要とされるよりも短い延長時間を用いて所定のフラグメントを効果的に増幅することができる。従って、従来の混合物の代わりに本明細書に記載されるハイブリッドポリメラーゼの使用は、大きなフラグメントを増幅するために必要とされる反応時間を、例えば約７時間から約２時間に低めることができる。
【０００６】
発明の要約：
本発明は、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されている少なくとも２種の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸修飾ドメインのプロセッシング特性を増強することを特徴とする。本発明の１つの観点においては、核酸修飾ドメインは、熱安定性であるポリメラーゼ活性、例えばサーマスポリメラーゼドメインを有する。他の態様においては、前記触媒ドメインは、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼである。
【０００７】
特定の態様においては、前記タンパク質の配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する。他方では、前記配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dに対して50％のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含むことができる。核酸結合ドメインはまた、Sso7dでもあり得る。
もう１つの態様においては、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合するか、又はピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインを含む。
【０００８】
本発明はまた、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されている少なくとも２種の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なくとも１℃安定化することを特徴とする。そのようなタンパク質の核酸修飾ドメインは、熱安定性であり得るポリメラーゼ活性を有することができる。前記核酸修飾ドメインは、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する。
【０００９】
さらなる態様においては、前記配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれか、時折Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合し、又はSso7dに対して50％のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む。しばしば、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
本発明のタンパク質は、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合するタンパク質であり；しばしば前記結合ドメインはピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である。
【００１０】
もう1つの観点においては、本発明は前記タンパク質を用いての核酸の修飾方法を提供する。１つの態様は、（ｉ）前記核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、a. 二本鎖核酸に結合し、そして b. それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一の酵素と比較して、前記酵素のプロセッシング性を増強し、そしてここで前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり；そして（ii）前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る、水溶液における核酸を修飾するための方法である。
【００１１】
もう１つの観点においては、本発明は、（ｉ）前記核酸と少なくとも２種の異種ドメインを有するタンパク質を含む水溶液とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合され、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない他の同一のタンパク質に比較して、二本鎖核酸の形成を安定化し、そして前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり；そして（ii）前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る、核酸を修飾するための方法を提供する。核酸の修飾方法は、本明細書に記載されるタンパク質態様のいずれかを使用することができる。
【００１２】
さらなる観点においては、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて水溶液における標的核酸の5kb又はそれよりも長い副配列を増幅するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）前記標的核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二本鎖核酸に結合し、そして(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のポリメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシング性を増強し、そして、前記溶液が、結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる５kb又はそれ以上の長さへの延長を可能にする組成のものであり；（ii）前記５kb又はそれ以上の長さの副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで成る。
【００１３】
前記方法の1つの態様においては、核酸−修飾ドメインは熱安定性ポリメラーゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体を特異的に結合し、Sso7dに対して50％アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結合する。もう１つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて水溶液における標的核酸の副配列を増幅するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）前記標的核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二本鎖核酸に結合し、そして(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のポリメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシング性を増強し、そして、前記溶液が、標的核酸１ml当たり105又はそれよりも少ないコピーを含んで成り、そして結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる延長を可能にする組成のものであり；（ii）前記副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで成る。
【００１５】
前記方法の1つの態様においては、核酸−修飾ドメインは熱安定性ポリメラーゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体を特異的に結合し、Sso7dに対して50％アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結合する。もう１つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
【００１６】
定義：
“原始的な小さな塩基性DNA−結合タンパク質”とは、天然の小さな塩基性DNA−結合タンパク質、例えばスルホロバス・スルファタリカス（Sulfolobus sulfataricus）からのSso-7dに対して50％相同体を有するか、又は天然の小さな塩基性DNA−結合タンパク質に対して生成される抗体に対して結合する、50〜75個のアミノ酸のタンパク質を言及する。
【００１７】
“プロセッシング特性”を有する触媒性核酸修飾ドメイン“とは、核酸分子の長さに沿ってスライドする能力を有する酵素として遂行し、そしてその構造を反復して化学的に変更するタンパク質配列又は副配列を言及する。触媒ドメインは、完全な酵素、その副配列を包含することができるか、又は天然において見出されるような酵素又は副配列に結合されない追加のアミノ酸配列を包含することができる。
【００１８】
“ドメイン”とは、ポリペプチド副配列、完全なポリペプチド配列、又は多くのポリペプチド配列を含んで成る、タンパク質又はタンパク質複合体の定義される機能を有する単位を言及する。前記機能は、広く定義されることが理解されており、そしてリガンド結合触媒活性であり得るか、又はタンパク質の構造に対して安定化効果を有することができる。
【００１９】
本発明の核酸修飾酵素における“効率”とは、特定の反応条件下でその触媒機能を行う酵素の能力を言及する。典型的には、“効率”とは、本明細書において定義される場合、核酸への結合当たり修飾酵素により生成される修飾された塩基の量により示される。
酵素における“増強する”とは、酵素の活性の改良、すなわち単位酵素及び単位時間当たりの生成物の量上昇を言及する。
“融合された”とは、共有結合による結合を言及する。
【００２０】
“異種”とは、タンパク質の一部に関して使用される場合、そのタンパク質が性質的にお互いに対して同じ関係で見出されない複数のドメインを含んで成ることを示す。そのようなタンパク質、例えば融合タンパク質は、新規の機能的タンパク質を製造するために配置される関連しないタンパク質からの複数のドメインを含む。
“連結する”とは、タンパク質ドメインを機能的に結合するための当業界において知られているいずれかの方法、例えば介在性ドメインを有するか又は有さない組換え融合、イントロン−介在性融合、非共有結合及び共有結合、例えばジスルフィド結合；水素結合；静電結合；及びコンホメーション結合、例えば抗体―抗原及びビオチン−アビジン結合を言及する。
【００２１】
“メチラーゼ”とは、ヌクレオチドへのメチル基の付加により核酸を修飾することができる酵素を言及する。
“ヌクレアーゼ”とは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を分解できる酵素を言及する。
“核酸修飾酵素”とは、核酸を共有的に変更する酵素を言及する。
“ポリメラーゼ”とは、ポリヌクレオチドの鋳型−指図された合成を行う酵素を言及する。
【００２２】
ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインの“誤差補正活性”とは、鋳型−特異的核酸ポリメラーゼの3’→5’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を言及し、それにより、鋳型と共にワトソン−クリック型塩基対を形成しないヌクレオチドが、１つのオリゴヌクレオチド、すなわち鋳型から合成される鎖の3’末端から、連続態様で除去される。誤差補正活性を有するポリメラーゼの例は、ピロコーカス・フリオサス、サーモコーカス・リトラリス及びサーモコーカス・マリチマからのポリメラーゼを包含する。
【００２３】
“プロセッシング性”とは、鋳型又は基質に結合されたまま存続し、そして複数の修飾反応を行う核酸修飾酵素の能力を言及する。典型的には、“プロセッシング性”とは、核酸の比較的長い路を修飾する能力を言及する。
“制限エンドヌクレアーゼ”とは、特定の塩基配列でDNAの分子を内部的に分解する、細菌により生成される酵素グループのいずれかを言及する。
“配列−非特異的核酸結合ドメイン”とは、核酸に有意な親和性を伴なって結合するタンパク質ドメインを言及し、このためには、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なったヌクレオチド配列を有するもう１つの核酸よりも100倍以上高い親和性を伴なってタンパク質ドメインに結語する既知の核酸は存在しない。
【００２４】
“熱安定性ポリメラーゼ”とは、本明細書において使用される場合、鋳型としてDNA又はRNAを用いてのヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の付加によりポリヌクレオチド合成を触媒し、そして45℃以上の温度で最適活性を有するいずれかの酵素を言及する。
“サーマスポリメラーゼ”とは、いずれかのサーマス種、例えばサーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・ブロキアヌス（Thermus brockianus） 及びサーマス・サーモフィラス（Thermus themophilus）から単離されたファミリーA DNAポリメラーゼ；遺伝的修飾又は化学的修飾、又は当業界において知られている他の方法により誘導されていてもいずれにせよ、サーマス種に起因するいずれかの組換え酵素、及びそのいずれかの機能的誘導体を言及する。
【００２５】
“ポリメラーゼ鎖反応”又は“PCR”とは、標的二本鎖DNAの特定のセグメント又は副配列が幾何学的進行で増幅される方法を言及する。PCRは、当業者に良く知られている；例えばアメリカ特許第4,683,195号及び第4,683,202号；及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisなど., eds, 1990を参照のこと。
“長いPCR”とは、5kb又はそれよりも長いDNAフラグメントの増幅を言及する。長いPCRは典型的には、短い生成物を増幅するために従来使用されるポリメラーゼとは異なる特別に適合されたポリメラーゼ又はポリメラーゼ混合物を用いて行われる（例えば、アメリカ特許第5,436,149号及び第5,512,462号を参照のこと）。
【００２６】
“プライマー”とは、標的核酸上の配列にハイブリダイズし、そして核酸合成の開始点として作用するポリヌクレオチド配列を言及する。プライマーは、種々の長さのものであり得、そしてしばしば50個よりも短い長さのヌクレオチド、例えば12〜25個の長さのヌクレオチドである。PCRへの使用のためのプライマーの長さ及び配列は、当業者に知られている原理に基づいて企画され得、例えばInnisなど., 前記を参照のこと。
【００２７】
“温度プロフィール”とは、PCR反応の変性、アニーリング及び/又は延長段階の温度及び時間の長さを言及する。PCR反応のための温度プロフィールは典型的には、類似するか又は同一の短い温度プロフィールの10〜60回の反復からなり；それらの短いプロフィールの個々は典型的には、２段階又は３段階PCR反応を定義する。“温度プロフィール”の選択は、当業者に知られている種々の考慮に基づかれている；例えばInnisなど., 前記を参照のこと。本明細書に記載されるような長いPCR反応においては、5kb又はそれよりも長い増幅生成物を得るために必要とされる延長時間は、従来のポリメラーゼ混合物に比較して、減じられる。
【００２８】
PCR“感受性”とは、低コピー数で存在する標的核酸を増幅する能力を言及する。“低コピー数”とは、増幅される核酸サンプルにおける標的配列の105、しばしば104, 103, 102又はそれ以下のコピーを意味する。
“鋳型”とは、プライマーハイブリダイゼーション部位を両端に有する、増幅されるポリヌクレオチドを含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド配列を言及する。従って、“標的鋳型”は、5’プライマー及び3’プライマーのためのハイブリダイゼーション部位を端に有する標的ポリヌクレオチド配列を含んで成る。
【００２９】
特定の記載：
序説：
本発明は、配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質が、触媒タンパク質のプロセッシング性質を増強するために触媒性核酸修飾タンパク質に結合され得る発見である。従来技術は、核酸結合タンパク質が核酸への酵素の結合親和性を高めることができることを教授するが、酵素のプロセッシング性質を増強する能力を有する結合タンパク質のグループは特定の価値のものである。
【００３０】
理論によっては結合されないが、本発明の結合ドメインは典型的には、非常に遅い速度で二本鎖核酸から解離する。従って、それらは、酵素−核酸複合体を安定化することによって結合される修飾酵素のプロセッシング性及び/又は効率を高める。従って、本発明は、DNA−結合ドメインが、核酸の二本鎖コンホメーションを安定化し、そして二本鎖基質を必要とする触媒ドメインの効率を高めることができる発現を包含する。触媒性核酸修飾酵素の触媒及び/又はプロセッシング性質の改良性を容易に決定するための例及び単純なアッセイが本明細書に記載される。
【００３１】
触媒性核酸修飾ドメイン：
触媒性核酸修飾ドメインは、酵素機能を行う修飾酵素の領域である。本発明の触媒性核酸修飾ドメインは、プロセッシング性、例えばポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼ、等であるか、又は非プロセッシング性、例えばリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、等であり得る。
【００３２】
プロセッシング性は、単一の結合現象において複数の修飾、例えばヌクレオチド付加又はメチル化を合成するか又は行う核酸修飾酵素の能力に影響を及ぼす。本発明のプロセッシングタンパク質は、プロセッシング性修飾酵素（又は修飾酵素の酵素ドメイン）に結合される配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインの存在のために増強されたプロセッシング性を示し、それにより、核酸/酵素複合体を安定化するために結合ドメインを提供する。しばしば、結合ドメインは、熱安定性生物からであり、そしてより高い温度、例えば45℃以上の温度で増強された活性を提供する。プロセッシング修飾酵素の例は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース及びトポイソメラーゼを包含する。
【００３３】
ポリメラーゼ：
DNAポリメラーゼは、当業者に良く知られている。それらは、DNA依存性ポリメラーゼ及びRNA依存性ポリメラーゼ、例えば逆転写酵素を包含する。少なくとも５種のファミリーのDNA依存性DNAポリメラーゼが知られているが、但しほとんどはファミリーA、B及びCに分類される。ほとんどのファミリーAのポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を包含する複数の酵素機能を含むことができる一本鎖タンパク質である。
【００３４】
ファミリーBのポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼ及び3’−5’エキソヌクレアーゼ活性、並びにアクセラリー因子を有する単一の触媒ドメインを有する。ファミリーCのポリメラーゼは典型的には、重合、及び3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する複数サブユニットのタンパク質である。E.コリにおいては、３種のタイプのDNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼI（ファミリーA）、II（ファミリーB）及びIII（ファミリーC）が見出されている。真核細胞においては、３種の異なったファミリーBのポリメラーゼ、すなわちDNAポリメラーゼα、δ及びεが核複製に関与し、そしてファミリーAのポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼγは、ミトコンドリアDNA複製のために使用される。他のタイプのDNAポリメラーゼは、ファージポリメラーゼを包含する。
【００３５】
同様に、RNAポリメラーゼは典型的には、真核RNAポリメラーゼI、II及びIII、及び細菌RNAポリメラーゼ、並びにファージ及びウィルスポリメラーゼを包含する。RNAポリメラーゼは、DNA依存性及びRNA依存性であり得る。
【００３６】
１つの態様においては、誤差補正を有するポリメラーゼは、本明細書に記載される改良されたポリメラーゼの触媒ドメインとして使用される。それらのポリメラーゼは、長い、すなわち5kb、しばしば10kb、又はそれ以上の長さのPCR生成物を得るために使用され得る。それらの改良されたポリメラーゼを用いての“長いPCR”は、従来技術の“長いPCR”ポリメラーゼ及び/又はポリメラーゼ混合物に比較して、減じられる延長時間を用いて行われ得る。1kb当たり30秒以下の延長時間、しばしば1kb当たり15秒が、改良されたポリメラーゼを用いてPCR反応において長い生成物を増幅するために使用され得る。さらに、それらの修飾されたポリメラーゼはまた、高められた感受性も示す。
【００３７】
従来技術の非誤差補正ポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼは、非常に低い入力コピー濃度、例えば極端には、1ml当たり10のコピーからDNAを増幅することができる。しかしながら、そのようなポリメラーゼの低い適合性のために、そのような増幅からクローン化された生成物は、導入された突然変異をたぶん含む。
【００３８】
従来の技術の誤差補正ポリメラーゼ、例えばTaqよりも高い適合性を有するPfuコピーDNAは、低入力コピー濃度からDNAを増幅することはできない。そのような失敗についての最も適切な説明は、それらの酵素の非常に低いプロセッシング性である。本発明のハイブリッド誤差補正ポリメラーゼは、誤差補正活性を保持しながら、より高いプロセッシング性を示し、そしてそれにより、増幅反応において感受性及び適合性の両者を提供する。
【００３９】
他の修飾酵素：
典型的には、DNAジャイレース及びトポイソメラーゼは、高次DNA構造、例えばスーパーコイル化において役割を演じる。DNAジャイレースは、負のスーパーコイルを導入する。原核生物においては、AサブユニットはDNA切断及び再結合を担当し、そしてBサブユニットはATP−加水分解性を含む。DNAジャイレースは、スーパーコイル化をプロセッシング的に及び触媒的に導入し、典型的には、DNAジャイレースの分子及び分当たり100までのスーパーコリルを導入する。ATPの不在下で、ジャイレースは負のスーパーコイルをゆっくり弛緩する。
【００４０】
トポイソメラーゼは、DNAの異なったトポロジカル異性体の相互転換を触媒し、それにより、結合数の変化を引き起こす、原核及び真核生物に見出される酵素である。トポイソメラーゼは、DNAから負又は正のスーパーコイルを除去することができ、又は負のスーパーコイルを導入することができる。
種々のメチラーゼ及び3’又は5’エキソヌクレアーゼ、例えば細菌、原核、真核及びファージ酵素はまた、当業界において記載されている。典型的には、エキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼ、及びいくつかのメチラーゼもまた、プロセッシング性である。
【００４１】
触媒サブユニットの活性は、当業者に良く知られているアッセイを用いて測定され得る。例えば、プロセッシング酵素活性、例えばポリメラーゼ活性は、反応、例えばポリメラーゼ鎖反応において合成される核酸の量を決定することによって測定され得る。酵素の相対的効率の決定においては、本発明の修飾酵素、例えば配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを含むポリメラーゼにより得られる生成物の量が、下記及び例において、より詳細に記載されるであろう通常の修飾酵素により得られる生成物の量と比較され得る。
【００４２】
修飾酵素、例えばリガーゼ又は制限エンドヌクレアーゼは、修飾機能を行うために二本鎖核酸に結合する。触媒活性は典型的には、特定のアッセイ条件下で生成される修飾された生成物の量を決定することによって測定される。例えば、リガーゼ活性は、アリコート連結反応により得られる形質転換体の数を定量化することによって、インキュベーションに続く連結反応において適合できる末端を生成するために制限エンドヌクレアーゼにより前もって消化された、環化されたプラスミドの量を決定することによってアッセイされ得る。制限エンドヌクレアーゼの活性は、標的DNAの消化の程度をアッセイすることによって、例えばゲル上のDNAの消化の程度を分析することによって決定され得る。
【００４３】
本発明への使用のために適切な触媒修飾ドメインは、修飾酵素自体又は触媒修飾ドメイン、例えばTaqポリメラーゼ又はポリメラーゼ活性を有するTaqのドメインであり得る。触媒ドメインは、追加のアミノ酸を含むことができ、そして/又はアミノ酸置換、欠失又は付加を含むが、しかし酵素活性を保持する変異体であり得る。
【００４４】
配列−非特異的核酸結合ドメイン：
二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメインは、配列独立性態様で二本鎖核酸に結合するタンパク質又はタンパク質の定義された領域であり、すなわち結合は特定の配列のために著しい選択を示さない。典型的には、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸対一本鎖核酸に関して、10倍又はそれよりも高い親和性を示す。本発明の特定の態様における二本鎖核酸結合タンパク質は好ましくは、熱安定性である。そのようなタンパク質の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【００４５】
原始的な小塩基性DNA結合タンパク質Sac7d及びSso7d（例えば、Choliなど., Biochemicaet Biophysica Acta 950: 193-203, 1988; Baumann など., Structural Biol. 1: 808-819, 1994; 及びCaoなど., Nature Struct. Biol. 5: 782-786, 1998を参照のこと）、原始的HMf−様タンパク質（例えば、Strichなど., J. Molec. Biol. 255: 187-203, 1996; Sandman など., Gene 150: 207-208, 1994を参照のこと）、及びPCNA相同体（例えば、Cannなど., J. Bacteriology 181: 6591-6599, 1999; Shamoo and steitz, Cell: 99, 155-166, 1999; De Felice など., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999; 及びZhangなど., Biochemistry 34: 10703-10712, 1995を参照のこと）。
【００４６】
Sso7d及びSac7d：
Sso7d及びSac7dは、それぞれ過好熱性アルキバクテリアのスルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）及びスルホロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）からの小さな（約7.000kdのMW）塩基性染色体タンパク質である。それらのタンパク質はリシンに富んでおり、そして高い熱、酸及び化学物質安定性を有する。それらは、配列独立的態様でDNAを結合し、そして結合される場合、同じ条件下で40℃までDNAのTMを高める（McAfeeなど., Biochemistry 34: 10063-10077, 1995）。それらのタンパク質及びそれらの相同体は典型的には、高温でのゲノムDNAの安定化に関与すると思われる。
【００４７】
HMf様タンパク質：
HMf様タンパク質は、真核H4ヒストンと、アミノ酸配列及び構造において相同性を共有する原始ヒストンである。HMfファミリーのタンパク質は溶液において安定したダイマーを形成し、そしていくつかのHMf相同体は熱安定性種（例えば、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fevidus）及びピロコーカス株GB−3a）から同定されている。HMfファミリーのタンパク質は、Taq DNAポリメラーゼ又は低い内因性プロセッシング性を有するいずれかのDNA修飾酵素に連結されると、DNA基質に沿っての酵素のスライドする能力を増強し、そして従ってそのプロセッシング性を高める。例えば、ダイマー性HMf様タンパク質は、例えば化学的修飾を通して、Taq DNAポリメラーゼのN末端に共有結合され得、そして従って、ポリメラーゼのプロセッシング性を改良する。
【００４８】
PCNA相同体：
すべてではないが、多くのファミリーBのDNAポリメラーゼは、プロセッシング性DNA合成を達成するためにアクセサリータンパク質と相互作用する。特に重要な種類のアクセサリータンパク質は、スライドするクランプとして言及される。いくつかの特徴化されたスライドするクランプは、溶液においてトリマーとして存在し、そして二本鎖DNAを収容することができる中心通路を有する環状構造を形成することができる。
【００４９】
スライド性クランプは、特定のDNAポリメラーゼのC末端に位置するアミノ酸との特定の相互作用を形成し、そして複製の間、DNA鋳型にそれらのポリメラーゼを結合する。真核生物におけるスライド性クランプは増殖性細胞核抗原（PCNA）として言及され、そして他のドメインにおける類似するタンパク質はしばしば、PCNA相同体として言及される。それらの相同体は著しい構造的類似性を有するが、しかし制限された配列類似性を有する。
【００５０】
最近、PCNA相同体は、好熱性古細菌（例えば、スルファロバス・ソファタリカス、ピロコーカス・フリオサス、等）から同定されている。古細菌におけるいくつかのファミリーBのポリメラーゼは、コンセンサスPCNA−相互作用アミノ酸配列を含むC末端を有し、そしてプロセッシング性因子としてPCNA相同体を用いることができる（例えば、Cannなど., J. Bacteriol. 181: 6591-6599, 1999及びDe Feliceなど., J. Mol. Biol. 291: 47-57, 1999を参照のこと）。それらのPCNA相同体は、本発明のための有用な配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインである。
【００５１】
例えば、コンセンサスPCNA−相互作用配列は、PCNA相同体と天然において相互作用しないポリメラーゼに結合され、それにより、ポリメラーゼのためのプロセッシング性因子としてのPCNA相同体の作用を可能にする。例示手段によれば、ピロコーカス・フリオサスPol II (２種のファミリーB様ポリペプチドを含むヘテロダイマーDNAポリメラーゼ)からのPCNA−相互作用配列は、ピロコーカス・フリオサスpol II（PCNA相同体と通常、相互作用しないモノマーファミリーBのポリメラーゼ）に共通結合され得る。次に、得られる融合タンパク質は、修飾されていないピロコーカス・フリオサスPol IIに関して高められたプロセッシング性を有する新規異種タンパク質を生成するために、ピロコーカス・フリオサスPCNA相同体との非共有結合を可能にされ得る。
【００５２】
他の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイン：
本発明への使用のために適切な追加の核酸結合ドメインは、既知の配列−非特異的二本鎖DNA結合タンパク質との相同性により及び/又は抗体交差反応性により同定され得るか、又は生化学的アッセイにより見出され得る。
相同性に基づいての核酸結合ドメインの同定：
【００５３】
典型的には、約25個のアミノ酸、任意には約50〜100個のアミノ酸又は完全なタンパク質の長さの比較窓にわたって、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質に対して、約50％のアミノ酸配列同一性、任意には、約60％、75％、80％、85％、90％又は95〜98％のアミノ酸配列同一性を有するドメインが、本発明において使用され得る。配列が比較され、そして比較窓、又は次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動的一列整列及び視覚的調査により測定されるような企画された領域にわたって最大の対応性について一列配列され得る。本発明のためには、％アミノ酸同一性は、BLASTのデフォールトパラメーターにより決定される。
【００５４】
配列比較のためには、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される対照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び対照配列がコンピューターに入力され、副配列座標が、必要により企画され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが企画される。デフォールトプログラムパラメーターが使用され、又は他のパラメーターが企画され得る。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、対照配列に対しての試験配列について％配列同一性を計算する。
【００５５】
“比較窓”とは、本明細書において使用される場合、配列が、２種の配列が最適に列挙整列された後、同じ数の連続位置の対照配列に比較される、200〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150から成る群から選択された連続位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を包含する。比較のための配列の一列整列方法は、当業界において良く知られている。
【００５６】
比較のための配列の最適一列整列は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局部相同アルゴリズムにより、Needleman ＆ Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) の相同一列整列アルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性方法についての調査により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）により、又は手動一列整列及び可視的調査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel など., eds. 1995 supplement)）により行われ得る。
【００５７】
有用なアルゴリズムの１つの例は、PILEUPである。PILEUPは、関係及び％配列同一性を示すために、前進性対−様一列整列を用いて、一群の関連する配列からの複数の配列整列を創造する。それはまた、一列整列を創造するために使用されるクラスター関係を示す樹状図又は系統樹をプロットする。PILEUPは、Feng & Dollittle, J. Mol. Evol. 36: 351-360 (1987) の前進性一列整列方法の単純化を用いる。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989) により記載される方法に類似する。
【００５８】
プログラムは、300までの配列（それぞれ、5,000個の最大長のヌクレオチド又はアミノ酸）を一列整列することができる。複数の一列整列方法は、一群の２種の一列整列された配列を生成する、２種の最も類似する配列の対−様一列整列により開始する。次に、この一群が次の最も関連する配列又は一列整列された配列の一群に対して一列整列される。２種の配列群が２種の個々の配列の対−様一列整列の単純な延長により一列整列される。最終一列整列は、一連の前進性対−様一列整列により達成される。
【００５９】
プログラムは、配列比較の領域についての特定の配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を企画することによって、及びプログラムパラメーターを企画することによって実施される。PILEUPを用いて、対照配列が、次のパラメーターを用いて％配列同一性関係を決定するために他の試験配列に比較される：デフォールトギャップ重量（3.00）、デフォールトギャップ長重量（0.10）及び計量された末端ギャップ。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン7.0から得られる（Devereauxなど., Nuc. Acid Res. 12: 307-395 (1984).
【００６０】
％配列同一及び配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムのもう１つの例は、それぞれ、Altschulなど., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) 及びAltschulなど., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載される、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) を通して入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの陽性−値の限界評点Tと適合するか又はそれを満たす、問題の配列における長さWの短いワードを同定することによって、高い評点の配列対（HSP）を同定することを包含する。Tは、隣接ワード評点限界として言及される（Altschulなど., 前記）。
【００６１】
それらの初期隣接ワードヒットは、それらを含む長いHSPを見出すために調査を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累計整列評点が高められる限り、個々の配列にそって両方向に延長される。累計評点は、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターM（適合する残基の対についてのリワード評点；常に＞0）及びN（ミスマッチ残基についてのペナルティー評点；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累計評点を計算するために使用される。
【００６２】
個々の方向へのワードヒットの延長は、次の場合、停止される：累計整列評点が、達成される最大値から量X、低下する場合；累計評点が、１又は複数の負の評点残基整列の蓄積のために、ゼロ又はそれ以下になる場合；又はいずれかの配列の終結に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW， T及びXが、一列整列の感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、デフォールトとして、11のワードレングス（wordlength）(W), 10の期待値（E）、M＝5，N＝4，及び両鎖の比較を決定する。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムは、デフォールトとして、３のワードレングス及び10の期待値（E）を使用し、そしてBLOSUM62評点マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) を参照のこと）は、50の一列整列（B）、10の期待値（E）、M＝5，N＝4及び両鎖の比較を使用する。
【００６３】
BLASTアルゴリズムはまた、２種の配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karline Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) を参照のこと）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間での適合性が偶然に生じる確立の表示を提供する最少合計確立（P(N)）である。例えば、核酸は、対照核酸に対する試験核酸の比較における最少合計確立が約0.2以下、より好ましくは約0.01以下、及び最も好ましくは約0.001以下である場合、対照配列に類似すると思われる。
【００６４】
抗体への交差反応結合：
本発明への使用のための配列−特異的二本鎖核酸結合ドメインはまた、抗体、好ましくは既知の核酸結合ドメインに結合するポリクローナル抗体を用いて、交差反応性により同定され得る。ポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて生成される（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane , Antibodies, A Laboratory Manual (1988) を参照のこと）。次に、免疫学的に交差反応性の結合タンパク質であるそれらのタンパク質は、種々のアッセイ方法により検出され得る。使用され得る種々の型及び条件の記載については、例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Volume 37 (Asai, など., 1993), Colligan, 前記、及びHarlow & Lane, 前記を参照のこと。
【００６５】
有用なイムノアッセイ型は、サンプルタンパク質が固体支持体に固定されているアッセイを包含する。例えば、交差反応性結合タンパク質は、イムノブロット分析、例えばウェスターンブロットを用いて同定され得る。ウェスターンブロット技法は一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化されたナイロンフィルター）に移行し、そしてサンプルを、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに結合される抗体と共にインキュベートすることを含んで成る。
【００６６】
抗体は、固体支持体上の交差反応性ポリペプチドに対して特異的に結合する。抗体は、直接的にラベルされ得るか、又は他方では、続いて、抗結合ドメイン抗体に対して特異的に結合するラベルされた抗体（例えば、ラベルされた羊抗−マウス抗体）を用いて、検出され得る。他のイムノブロットアッセイ、例えば組換えタンパク質ライブラリーの分析はまた、本発明への使用のために適切なタンパク質の同定のためにも有用である。
【００６７】
企画されたイムノアッセイ条件下でのこの方法論を用いて、バックグラウンドの少なくとも２倍又はそれ以上、典型的にはバックグラウンドの10倍以上、特定の抗体に結合し、そしてサンプルに存在する有意な量の他のタンパク質に実質的ン結合しない免疫学的交差反応性タンパク質が同定され得る。
【００６８】
競争結合型におけるイムノアッセイはまた、交差反応決定のためにも使用され得る。例えば、ポリクローナル抗血清は、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインタンパク質、例えばピロコーカス・フリオサス（Pfu）PCNAに生成される。次に、標的抗原が固体支持体に固定され得る。マイナーな交差反応性を有する非標的抗原（それらが存在するなら）は、血清の選択性を改良するためにアッセイに添加され得る。
【００６９】
固定されたタンパク質への抗血清の結合について競争する前記添加されたタンパク質の能力が、それ自体と競争する結合ドメインタンパク質、この例においてはPfu PCNAの能力と比較される。上記タンパク質についての％交差反応性は、標準の計算を用いて計算される。添加されたタンパク質との10％以下の交差反応性を有するそれらの抗血清が選択され、そしてプールされる。非標的抗原に対する交差反応性抗体は、非標的抗原による免疫吸収により、プールされた抗血清から除去される。本発明の特定の核酸結合ドメインに対して特異的に結合する抗体がまた、この方法論を用いて製造され得る。
【００７０】
次に、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清が、既知の結合ドメインのたぶん対立遺伝子、多形変異体又は相同体、例えばもう1つのピロコーカス.,spであると思われる第２タンパク質を、免疫原タンパク質に比較するために、上記のような競争結合イムノアッセイに使用される。この比較を行うためには、２種のタンパク質が広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質への抗血清の結合を50％阻害するために必要とされる個々のタンパク質の量が決定される。結合の50％を阻害するのに必要とされる核酸結合ドメインの量が、結合の50％を阻害するのに必要とされる、第２タンパク質の量の10倍以下である場合、前記第２タンパク質は、核酸結合ドメインに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合すると言われる。
【００７１】
配列−非特異的二本鎖核酸結合活性についてのアッセイ：
配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの活性は、種々のアッセイを用いて評価され得る。適切な結合ドメインは、二本鎖核酸対一本鎖核酸について著しい性能を示す。
【００７２】
二本鎖核酸に結合するための特異性は、当業者に知られている種々のアッセイを用いて試験され得る。それらは、フィルター結合アッセイ又はゲル−シフトアッセイのようなアッセイを包含する。例えば、フィルター結合アッセイにおいては、二本鎖DNAへの結合活性について評価されるポリペプチドが、適切な緩衝液において、二本鎖又は一本鎖の放射性ラベルされたDNAと共にプレ−混合される。混合物が、タンパク質及びタンパク質−DNA複合体を保持する膜（例えば、ニトロセルロース）を通して濾過される。フィルター上に保持されるDNAの量は、タンパク質に結合される量の表示である。
【００７３】
結合は、ラベルされたDNAの結合がラベルされていない上昇する量のDNAの添加により競争される競争分析により定量化される。一本鎖DNAよりも10倍又はそれ以上の親和性で二本鎖DNAを結合するポリペプチドは、二本鎖DNA結合タンパク質として本明細書において定義される。他方では、結合活性は、放射性ラベルされたDNAが試験ポリペプチドと共にインキュベートされるゲルシフトアッセイにより評価され得る。タンパク質−DNA複合体は、結合されていないDNAよりもゲルを通してゆっくりと移動し、シフトされたバンドをもたらす。結合の量は、上昇する量の二本鎖又は一本鎖のラベルされていないDNAと共にサンプルをインキュベートし、そしてシフトされたバンドにおける放射能の量を定量化することによって評価される。
【００７４】
本発明への使用のために適切な結合ドメインは、配列独立的態様で二本鎖核酸に結合し、すなわち本発明の結合ドメインは、有意な親和性を伴なって二本鎖核酸を結合するが、しかし同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配列を有するもう１つの核酸よりも100倍以上の親和性を伴なってドメインに結合する既知の核酸は存在しない。非特異的結合は、二本鎖対一本鎖核酸結合を決定するために記載される方法論に類似する方法論を用いてアッセイされ得る。フィルター結合アッセイ又はゲル移動シフトアッセイは、結合の特異性を決定するために、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配列である競争DNAを用いて、上記のようにして行われ得る。
【００７５】
本発明への使用のための配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインはまた、例えば修飾酵素のプロセッシング性又は効率を高めるために、又は少なくとも１℃、核酸重複体の安定性を高めるために、二本鎖結合ドメインの能力をアッセイすることによって、評価され得る。それらの技法は、核酸修飾酵素の増強された効率についての分析を記載する下記セクションに論じられている。
【００７６】
本発明の結合ドメインはまた、二本鎖核酸コンホメーションを安定化するそのようなドメインの能力の直接的な評価により同定され得る。例えば、プライマー鋳型構造体の溶融曲線が、260nmでDNAのUV吸光度をモニターすることによって、タンパク質の存在又は不在下で得られる。二本鎖基質のTMは、その溶融曲線の中点から決定され得る。次に、TMに対する配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質の効果が、修飾されていない酵素の存在下でのTMと修飾された酵素の存在下で得られたTMとを比較することによって決定され得る。（タンパク質は、それがDNAよりも260nmでより低い消衰係数を有するので、UV吸光度に有意に寄与しない）。次に、TMを1°、しばしば5°、10°又はそれ以上、高めるドメインが、本発明への使用のために選択され得る。
【００７７】
本発明の新規配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質はまた、それらのDNA結合活性を利用することにより、例えばDNA−セルロースカラム上での精製により単離され得る。次に単離されたタンパク質はさらに、従来の手段により精製され、配列決定され、そして遺伝子がPCRを通して従来の手段によりクローン化され得る。次に、それらのクローンから過剰発現されるタンパク質が、上記手段のいずれかにより試験され得る。
【００７８】
核酸結合ドメインと触媒性ドメインとの結合：
触媒性ドメイン及び二本鎖核酸結合ドメインは、当業者に良く知られている方法により連結され得る。それらの方法は、化学的及び組換え手段を包含する。
異種ドメインを連結する化学的手段は、例えばBioconjugate Techniques, Hermanson, Ed., Academic Press (1996) に記載されている。それらは、例えばタンパク質化学の業界において良く知られている方法により、直接的に又は連結化合物を通して、成分をお互い連結するための誘導体化を包含する。例えば、１つの化学的接合態様においては、触媒性ドメイン及び核酸結合ドメインを連結する手段は、２種の成分の分子間ジスルフィド結合の形成に究極的に寄与する異種二官能価カップリング試薬を含んで成る。
【００７９】
本発明のためのこの能力において有用である他のタイプのカップリング試薬は、例えばアメリカ特許第4,545,985号に記載されている。他方では、分子間ジスルフィドは、天然において存在するか、又は遺伝子工学により挿入される、個々の成分におけるシステム間に便利には形成され得る。成分を連結する手段はまた、異種二官能価架橋試薬又は特定の低pH分解性架橋剤又は特定のプロテアーゼ分解性リンカー間のチオエーテル連鎖、又は他の分解性又は非分解性化学連鎖を用いることができる。
【００８０】
タンパク質の異種ドメインを連結する手段はまた、標準のペプチド合成化学又は組換え手段により別々に合成される成分間で形成されるペプチジル結合を含んで成ることができる。タンパク質自体はまた、完全に又は一部、アミノ酸配列を合成するために化学的方法を用いて生成され得る。例えば、ペプチドは、固相技法、例えばアミノ酸が成長するアミノ酸鎖に連続的に付加されるMerrifield固相合成方法により合成され得る（Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2146を参照のこと）。
【００８１】
ポリペプチドの自動合成のための装置は、PE Corp. (Foster City, CA) から市販され、そして一般的に、その製造業者の説明書に従って操作され得る。次に、合成されたペプチドは樹脂から分解され、そして例えば分離用高性能液体クロマトグラフィーにより精製され得る（Creighton, Proteins Structures and molecular Principles, 50-60 (1983)を参照のこと）。合成ポリペプチド又はポリペプチドのサブフラグメントの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確かめられ得る（例えば、エドマン分解方法；Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, pp. 34-49 (1983) を参照のこと）。
【００８２】
さらに、非従来のアミノ酸又は化学的アミノ酸類似体は、置換又は付加として配列中に導入され得る。非従来のアミノ酸は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：通常のアミノ酸のD−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Abu, ２−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、６−アミノヘキサノン酸、Aib、２−アミノイソ酪酸、３−アミノピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、Na−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体。さらに、アミノ酸は、D（右旋性）又はL（左旋性）であり得る。
【００８３】
もう1つの態様においては、本発明のタンパク質のドメイン、例えばSso7d及びTaqポリメラーゼは、連続基を通して結合される。連結基は、化学的交差剤、例えばスクシンイミジル−（N−アレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）であり得る。連結基はまた、追加のアミノ酸配列、例えばポリアラニン、ポリグリシン又は同様の連結基であり得る。
【００８４】
特定の態様においては、融合タンパク質における個々のポリペプチドのコード配列は、ペプチド結合を通して、いずれかの順序で、それらのアミノ−又はカルボキシ−末端で直接的に連結される。他方では、アミノ酸リンカー配列は、個々のポリペプチドがその二次及び三次構造に折りたたむことを確保するのに十分な距離、第１及び第２ポリペプチド成分を分離するために使用され得る。そのようなアミノ酸リンカー配列は、当業界において良く知られている標準技法を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。
【００８５】
適切なペプチドリンカー配列は、次の要因に基づいて選択され得る：（１）柔軟な延長されたコンホメーションを採用するそれらの能力；（２）第１及び第２ポリペプチド上の機能的エピトープと相互反応する二次構造を採用するそれらの無能性；及びポリペプチド官能エピトープと反応する疎水性又は電荷された残基の欠失。典型的なペプチドリンカー配列は、Gly、Val及びThr残基を含む。他の近い天然のアミノ酸、例えばSer及びAlaがまた、リンカー配列に使用され得る。
【００８６】
リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列は、Marateaなど. (1985) Gene 40: 39-46; Murphyなど. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262; アメリカ特許第4,935,233号及び第4,751,180号に開示されるそれらを包含する。リンカー配列は、一般的に１〜約50個の長さのアミノ酸、例えば３，４，６又は10個の長さのアミノ酸であるが、しかし100又は200個の長さのアミノ酸でもあり得る。リンカー配列は、第１及び第２ポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、そして立体的障害を妨げるために使用され得る非必須N−末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされ得ない。
【００８７】
他の化学的リンカーは、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばPEG、等を包含する。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから入手できる。それらのリンカーは任意には、アミド結合、スルフィドリル結合又は異種官能結合を有する。
【００８８】
ドメインを連結する他の方法は、負及び正の末端を発現することによるイオン結合、及び抗体及びストレプタビジン−ビオチン相互作用を通しての間接的結合を包含する（例えば、Bioconjugate Techniques, 前記を参照のこと）。ドメインはまた、中間体相互作用配列を通して一緒に連結され得る。例えば、コンセンサスPCNA−相互作用配列は、PCNA相同体と天然において相互作用しないポリメラーゼに連結され得る。次に、得られる融合タンパク質は、高められたプロセッシング性を有する新規の異種タンパク質を生成するために、PCNA相同体との非共有結合を可能にされ得る。
【００８９】
組換え技法を用いての融合タンパク質の生成：
1つの態様においては、本発明のタンパク質は、当業界に良く知られている、前記タンパク質をコードする核酸の組換え発現により生成される。そのような融合生成物は、正しいコード枠において、当業界において知られている方法により、所望するアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列をお互い連結し、そして当業界において知られている方法により生成物を発現することによって製造され得る。
【００９０】
本発明の融合タンパク質中に導入されるドメインをコードする核酸は、組換え遺伝学の分野における通常の技法を用いて得られる。本発明への使用のための一般的方法を開示する基本テキストは、Sambrookなど., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel など., eds., 1994) を包含する。
【００９１】
しばしば、触媒又は核酸結合ドメインをコードする核酸配列又は関連する核酸配列相同体は、プローブとのハイブリダイゼーションによりcDNA及びゲノムDNAライブラリーからクローン化されるか、又はオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅技法を用いて単離される。増幅技法は、DNA又はRNAからの配列を増幅し、そして単離するために使用され得る（例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995) を参照のこと）。他方では、オーバーラップするオリゴヌクレオチドが合成的に生成され、そして１又は複数のドメインを生成するために連結され得る。触媒又は二本鎖核酸結合ドメインをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を用いて、発現ライブラリーから単離され得る。
【００９２】
PCRを用いて、触媒性又は核酸結合ドメインをコードする核酸を得るための例においては、核酸配列又は副配列が、１つの制限部位を含むセンスプライマー及びもう１つの制限部位を含むアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅される。これは、所望するドメイン配列又は副配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を生成するであろう。次に、この核酸は、第２ドメインをコードする核酸を含み、そして適切な対応する制限部位を有するベクター中に容易に連結され得る。
【００９３】
ドメインは直接的に連結され得るか、又はリンカー、又は他のタンパク質配列により分離され得る。適切なPCRプライマーは、GenBank又は他の源から提供される配列情報を用いて、当業者により決定され得る。適切な制限部位はまた、特定部位の突然変異誘発により、タンパク質又はタンパク質副配列をコードする核酸に付加され得る。ドメイン−コードのヌクレオチド配列又は副配列を含むプラスミドは適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断され、そして次に、標準方法に従って増幅及び/又は発現のための適切なベクター中に連結される。
【００９４】
インビトロ増幅方法を通して当業者を方向づける十分な技法の例は次の文献に見出される：Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis など., (1987) アメリカ特許第4,683,292号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis など., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh. など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell など. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren など., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; 及びBarringerなど. (1990) Gene 89: 117。
【００９５】
特定の核酸から発現されるポリペプチドの他の物性が、適切な核酸を同定するためのもう１つの方法を提供するために、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質又は核酸修飾酵素触媒ドメインの性質に比較され得る。
【００９６】
いくつかの態様においては、組換え融合タンパク質の触媒及び/又は核酸結合領域をコードするポリペプチドを修飾することが所望される。当業者は、所定の核酸構造体における変更を生成する多くの手段を認識するであろう。そのような良く知られている方法は、特定部位の突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用いてのPCR増幅、突然変異誘発剤又は放射線への核酸を含む細胞の暴露、所望するオリゴヌクレオチドの化学的合成（例えば、大きな核酸を生成するために連結及び/又はクローニングに関して）及び他の良く知られている技法を包含する。例えば、Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97; Robertsなど. (1987) Nature 238: 732-734を参照のこと。
【００９７】
例えば、触媒及び/又は核酸結合ドメインは、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、２種のドメインの連結を促進するよう修飾され得る。そのような方法により修飾される触媒ドメイン及び結合ドメインはまた、本発明の一部である。例えば、システム残基のためのコドンは、ドメインのいずれかの末端で配置され、その結果、前記ドメインは例えば、スルフィド結合により連結され得る。増幅は、組換え又は化学的方法のいずれかを用いて行われ得る（例えば、Pierce Chemical Co. カタログ、Rockford ILを参照のこと）。
【００９８】
組換え融合タンパク質の触媒及び結合ドメインはしばしば、リンカードメイン、通常、約200個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、１〜100個のアミノ酸が典型であるポリペプチド配列、例えば上記のそれらのものにより連結される。いくつかの態様においては、プロリン残基が、リンカーによる有意な二次構造要素の形成を妨げるためにリンカー中に導入される。リンカーはしばしば、組換え融合タンパク質の一部として合成される柔軟アミノ酸副配列であり得る。そのような柔軟リンカーは、当業者に知られている。
【００９９】
いくつかの態様においては、本発明のタンパク質をコードする組換え核酸は、選択された生物（例えば、酵母；好ましいコドンが酵母における発現のためのコードを核酸中に置換される）において核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するよう修飾される。
【０１００】
融合ポリペプチドを発現するための発現カセット及び宿主細胞：
当業者に良く知られている、融合ポリペプチドを生成するための多くの発現システムが存在する（例えば、Gene Expression Systems, Fernandex and Hoeffler, Eds, Academic Press, 1999を参照のこと）。典型的には、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望する宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に配置される。典型的な広範囲の種類のプロモーターが入手でき、そして特定の用途に依存して、本発明の発現ベクターに使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性的であるべきである細胞に依存する。他の発現制御配列、例えばリボソーム結合部位、転写終結部位及び同様のものがまた、任意には包含される。１又は複数のそれらの制御配列を含む構造体は、“発現カセット”と呼ばれる。従って、連結されたポリペプチドをコードする核酸は、所望する宿主細胞において高レベル発現のために組み込まれる。
【０１０１】
特定宿主細胞への使用のために適切である発現制御配列はしばしば、その細胞のおいて発現される遺伝子をクローニングすることによって得られる。リボソーム結合部位配列にそって、任意には、オペレーターと共に、転写開始のためのプロモーターを包含するよう本明細書において定義される、通常使用される原核制御配列は、通常使用されるプロモーター、例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（lac）プロモーターシステム（Changeなど., Nature (1979) 198: 1056）、トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddelなど., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057）, tacプロモーター（DeBoer、など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21-25）、及びλ−由来のPLプロモーター及びN−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeなど., Nature (1981) 292:128）を包含する。
【０１０２】
特定のプロモーターシステムは本発明に対して決定的ではなく、原核生物において機能するいずれかの入手できるプロモーターが使用され得る。標準の細菌発生ベクターは、プラスミド、例えばpBR322に基づくプラスミド、例えばpBLUESCRIPTTM, pSKF, pET23D, λ−ファージ由来のベクター及び融合発現システム、例えばGST及びLacZを包含する。エピトープ標識、例えばc-myc, HA−標識、６−His（配列番号30）標識、マルトース結合タンパク質、VSV−G標識、抗−DYKDDDDK（配列番号31）標識、又はその多数が当業者に良く知られているいずれかのそのような標識は、便利な単離方法を提供するために組換えタンパク質に付加され得る。
【０１０３】
E．コリ以外の原核細胞における融合ポリペプチドの発現のためには、特定の原核種において機能するプロモーターが必要とされる。そのようなプロモーターは、前記種からクローン化されている遺伝子から得られるか、又は異種プロモーターが使用され得る。例えば、ハイブリッドtrp−lacプロモーターは、E．コリの他にバチルスにおいて機能する。それらの及び他の適切な細菌プロモーターは当業界によく知られており、そして例えば、Sambrookなど. 及びAusubelなどに記載されている。本発明のタンパク質を発現するための細菌発現システムは、E．コリ、バチルスsp., 及びサルモネラにおいて利用できる（Palvaなど., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbachなど., Nature 302: 543-545 (1983)）。そのような発現システムのためのキットは市販されている。
【０１０４】
哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現システムは、当業界において良く知られており、そしてまた、市販されている。酵母においては、ベクターは、酵母組み込みプラスミド（たとえば、YIp 5）及び酵母複製プラスミド（YRpシリーズプラスミド）並びにpGPD−２を包含する。真核ウィルスからの調節要素を含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、乳頭腫ウィルスベクター、及びEpstein−Barrウィルスに由来するベクターにおいて使用される。
【０１０５】
他の典型的な真核ベクターは、pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, バキュロウィルスpDSVE, 及びCMVプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウィルスプロモーター、Rous肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指図下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターを包含する。
【０１０６】
構成的又は調節されたプロモーターは、本発明において使用され得る。調節されたプロモーターは、その宿主細胞が、融合ポリペプチドの発現が誘発される前、高い密度に増殖され得るので、好都合である。異種タンパク質の高レベル発現は、いくつかの情況下での細胞増殖を遅延する。誘発性プロモーターは、発現のレベルが環境又は成長因子、例えば温度、pH、嫌気性又は好気性条件、光、転写因子及び化学物質により変更できる遺伝子の発現を方向づけるプロモーターである。
【０１０７】
E．コリ及び他の細菌宿主細胞に関しては、誘発性プロモーターは、当業者に知られている。それらは、例えばlacプロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp−lacプロモーター（Amannなど. (1983) Gene 25: 167; de Boer など. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21）、及びバクテリオファージT7プロモーター（Studierなど. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor など. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1074-8）を包含する。それらのプロモーター及びそれらの使用は、Sambrookなど., 前記に論じられている。
【０１０８】
他の生物のための誘発性プロモーターもまた、当業者に良く知れている。それらは、例えばメタロチオネインプロモーター、熱ショックタンパク質、及び多くの他のものを包含する。
【０１０９】
翻訳カップリングは、発現を増強するために使用され得る。その方法は、プロモーターの下流に配置される、翻訳システムからの高く発現された遺伝子に由来する短い上流の読み取り枠、及びリボソーム結合部位、続いて少数のアミノ酸コドン、その後終結コドンを用いる。終結コドンの直前に、第２のリボソーム結合部位が存在し、そして終結コドンに続いて、翻訳の開始のための開始コドンが存在する。そのシステムはRNAにおける二次構造体を分解し、翻訳の効果的な開始を可能にする。Squiresなど. (1988) J. Biol. Chem. 263: 16297-16302を参照のこと。
【０１１０】
ポリヌクレオチド構造体の構成は一般的に、細菌において複製できるベクターの使用を必要とする。そのようなベクターは通常、当業界において使用される。多数のキットが、細菌からのプラスミドの精製のために市販されている（例えば、Pharmacia BiotechからのEasyPrepJ, Flexi PrepJ; StratageneからのStrataCleanJ; 及びQIAexpress Expression System, Qiagen）。次に、単離され、そして精製されたプラスミドがさらに、他のプラスミドを生成するあめに操作され、そして形質転換するために使用され得る。
【０１１１】
融合ポリペプチドは細胞内で発現され得、又は細胞から分泌され得る。細胞内発現はしばしば、高い収率をもたらす。必要なら、可溶性活性融合ポリペプチドの量は、再折りたたみ方法を行うことによって高められ得る（例えば、Sambrookなど., Bio/Technology (1985) 3: 151を参照のこと）。本発明の融合ポリペプチドは、種々の宿主細胞、例えばE．コリ、他の細胞宿主、酵母、及び種々の高等真核細胞、例えばCOS, CHO及びHeLa細胞系及び骨髄腫細胞系において発現され得る。宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞又は微生物、例えば酵母細胞、細菌細胞又は菌類細胞であり得る。
【０１１２】
発現されると、組換え融合ポリペプチドは、標準の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び同様のものに従って精製され得る（一般的には、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990) を参照のこと）。少なくとも約90〜95％の均質性の実質的に純粋な組織物が好ましく、そして98〜99％又はそれ以上の均質性が最も好ましい。所望のように部分的に又は均質的に精製されると、そのポリペプチドが使用され得る（例えば、抗体生成のための免疫原として）。
【０１１３】
本発明の融合ポリペプチドの精製を促進するためには、その融合ポリペプチドをコードする核酸はまた、親和性結合試薬が利用できる、エピトープ又は“標識”のためのコード配列を含むことができる。適切なエピトープの例は、myc及びV-5レポーター遺伝子を包含し；それらのエピトープを有する融合ポリペプチドの組換え生成のために有用な発現ベクターは市販されている（例えば、Invitrogen (Corlsbad CA) ベクターpcDNA3.1/Myc-His及びpcDNA3.1/V5-Hisが哺乳類細胞における発現のための適切である）。本発明の融合タンパク質に標識を結合するために適切な追加の発現ベクター及び対応する検出システムは、当業者に知られており、そしてそのいくつかは市販されている（例えば、FLAG (Kodak, Rochester MY)。
【０１１４】
適切な標識のもう1つの例は、金属キレート親和性リガンドに結合できるポリヒスチジン配列である。典型的には、６個の隣接するヒスチジンが使用され得るが、６個よりも多いか又は少ないヒスチジンも使用できる。ポリヒスチジン標識のための結合成分として作用することができる適切な金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ−トリ−酢酸（NTA）を包含する（Hochuli, E. (1990) “Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents” In Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen (Santa Clarita, CA) から市販されている）。
【０１１５】
当業者は、修飾がそれらの生物学的活性を低めないで、触媒及び配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに対して行われ得ることを認識する。いくらかの修飾が、クローニング、発現又は融合タンパク質中へのドメインの組み込みを促進するために行われ得る。そのような修飾は、当業者によく知られており、そして例えば、開始部位、又は便利に位置する制御部位又は終結コドン又は精製配列を創造するために、いずれかの末端上に配置される追加のアミノ酸（例えば、ポリHis）を供給するためにアミノ酸末端で付加されるメチオニンを供給するために結合ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端でのコドンの付加を包含する。
【０１１６】
触媒ドメインについての改良された活性を決定するためのアッセイ：
触媒ドメインの活性は、単独でのタンパク質に比較して、結合ドメインに連結される修飾タンパク質のプロセッシング性又は修飾活性を比較するために使用され得る種々のアッセイを用いて測定され得る。活性の改良性は、高められたプロセッシング性及び高められた効率の両者を包含する。
プロセッシング修飾酵素の改良された活性：
ポリメラーゼプロセッシング性は、当業者に知られている種々の方法により測定され得る。ポリメラーゼプロセッシング性は一般的に、プライムされた鋳型への修飾酵素の１回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数として定義される。
【０１１７】
例えば、5’FAM−ラベルされたプライマーは、プライムされた鋳型を形成するために環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングされる。プロセッシング性の測定の場合、プライムされた鋳型は通常、アッセイされるべき酵素又は触媒ドメインに対して有意なモル過剰で存在し、その結果、ポリメラーゼによる１回以上、延長されるいずれかのプライムされた鋳型の機会が最少にされる。従って、プライムされた鋳型は、緩衝液及びdNTPの不在下で、一定の比、例えば約4000：１（プライムされたDNA：DNAポリメラーゼ）でアッセイされるポリメラーゼ触媒ドメインと共に混合される。
【０１１８】
MgCl2が、DNA合成を開始するために添加される。サンプルが、開始の後、種々の時間で急冷され、そして配列決定ゲル上で分析される。生成物のメジアン長は時間又はポリメラーゼ濃度と共に変化しないポリメラーゼ濃度で、その長さは酵素のプロセッシング性に対応する。本発明のタンパク質、すなわちプロセッシング核酸修飾酵素、例えばポリメラーゼの触媒ドメインに融合される配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインを含むタンパク質のプロセッシング性が、結合ドメインを有さない酵素のプロセッシング性に比較される。
【０１１９】
増強された効率がまた、生成物を生成する酵素の高められた能力を測定することによって示され得る。そのような分析は、反応において得られる生成物の量を決定することによって間接的に、二本鎖核酸複合体の安定性を測定する。例えば、PCRアッセイは、高温、例えば50℃でアニーリングされた、短い、例えば12個の長さのヌクレオチドのプライマーにより得られたPCR生成物の量を測定するために使用され得る。このアッセイにおいては、増強された効率は、Taqポリメラーゼよりも本発明の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイン、例えばSso7dに連結される場合、50℃でアニーリングされた、12個のヌクレオチドのプライマーを用いて、PCR反応においてより生成物を生成するポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼの能力により示される。対照的に、一連の荷電された残基、例えばリシンである結合路は、ポリメラーゼに連結される場合、プロセッシング性を増強しない。
【０１２０】
類似するアッセイ条件は、触媒ドメインが逆転写酵素、メチラーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼ又はエキソヌクレアーゼである場合、改良されたプロセッシング性について試験するために使用され得る。それらの分析においては、プロセッシング性は、鋳型又は基質に結合されたまま存続し、そして複数の修飾反応を行う酵素の能力として測定される。核酸：酵素のモル比は、平均して、１つの酵素分子のみが基質核酸当たり結合されるよう十分に高い。例えば、プロセッシングエキソヌクレアーゼ、すなわちλエキソヌクレアーゼの活性は、公開された方法を用いてアッセイされ得る（例えば、Mitsis and Kwagh, Nucleic Acid Research, 27: 3057-3063, 1999を参照のこと）。
【０１２１】
手短には、長いDNA基質（0.5〜20kb）は、前方向プライマーとしてビオチニル化されたプライマーを、及び逆方向プライマーとして5’リン酸化されたプライマーを用いて、DNA鋳型から増幅され得る。放射性ラベルされたdATPは、λエキソヌクレアーゼのための基質として作用するPCRフラグメントを内部的にラベルするために使用される。精製された内部的にラベルされた基質は、平均して、１つのエキソヌクレアーゼ分子のみが基質DNA当たりに結合されることを確保するために、DNA：酵素の十分に高いモル比で酵素と共に混合される。サンプルのアリコートが時間と共に除かれ、そしてゲル電気泳動により、又は酸可溶性放射性ラベルの形成をモニターすることによってアッセイされ得る。
【０１２２】
非プロセッシング修飾酵素の増強された活性：
非プロセッシングDNA修飾酵素の触媒ドメイン又は酵素自体はまた、本発明に使用され得る。そのような修飾酵素の例は、リガーゼ及び制限エンドヌクレオチドを包含する。しばしば、触媒ドメインは、熱安定性サーマス又はピロコーカス種から得られる。改良された活性を決定するためには、酵素機能は、種々の条件、しばしば高められた反応温度、例えば45℃又はそれ以上で分析され得、そして修飾されていない酵素活性に比較される。
【０１２３】
例えば、Tgq DNAリガーゼは、相補的標的DNAに対してハイブリダイズされる２種の隣接するオリゴヌクレオチドの並置された5’リン酸末端と3’ヒドロキシル末端との間でのホスホジエステル結合の形成を触媒する。酵素は45℃〜65℃で活性的である。連結された生成物の収率は、DNAの相補的鎖が酵素のための基質を形成するためにいかに効率良くアニーリングされるかに依存する。本発明の結合ドメイン、例えばSso7d−様タンパク質はリガーゼに結合される場合、その溶融温度を高めることによってDNA重複体を安定化することができ、その結果、高められた反応温度が、塩基対合相互作用を妨げないで、酵素の活性を最大にするために使用され得る。
【０１２４】
リガーゼの活性に対するSso7d融合の効果は、修飾された酵素と修飾されていない酵素との連結効率を比較することによって分析され得る。２種のDNAフラグメントの連結効率は、アガロースゲル電気泳動によりモニターされ、そして線状化されたプラスミドの環状プラスミドへの転換の連結効率は、DNA形質転換によりモニターされ得る。
【０１２５】
もう１つの例においては、改良された活性を有する核酸修飾酵素の触媒ドメインは、最適な活性を達成するために高められた反応温度を必要とする好熱性種から単離される制限酵素からであり得る。例えば、制限酵素認識部位がDNAフラグメントの末端に非常に接近して又は重複オリゴヌクレオチドに位置する場合、より高い温度が重複構造体を不安定化することができる。より高い反応温度、例えば45℃又はそれ以上で、本発明の結合ドメイン、例えば制限エンドヌクレアーゼに連結されるSso7d−様タンパク質の存在のために、改良された活性を有する制限酵素は、制限酵素単独よりも、高い量の生成物、すなわち消化されたDNAを生成することができる。特定の反応からの生成物の収率は、ゲル上での可視化により、又は形質転換効率により評価され得る。
【０１２６】
本発明の改良された核酸修飾酵素の高められた効率を評価する他の方法は、所定の修飾酵素の酵素活性の標準アッセイを用いて、当業者により決定され得る。従って、プロセッシング性修飾酵素、例えば逆転写酵素、メチラーゼ、ジャイレース、及びトポイソメラーゼ、並びに他の非プロセッシング性修飾酵素は、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに連結されるタンパク質、又は触媒ドメイン、及びタンパク質自体の活性を比較することによって同様にして分析され得る。
【０１２７】
本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特異的に及び個々に、引用により組み込まれることを示されたかのように、引用により本明細書に込みこまれる。
前述の発明はより明白な理解のために、例示的及び例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【０１２８】
実施例
次の例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。当業者は、実質的に類似する結果を生成するために変更されるか又は修飾され得る種々の非決定的パラメーターを容易に認識するであろう。
【０１２９】
例１．融合タンパク質の構成：
Sso7d−ΔTaq融合体の構成：
次の例は、増強されたプロセッシング性を有するポリメラーゼタンパク質の構成を例示し、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質Sso7dは、289個のアミノ酸（ΔTaq）によりN末端で欠失されているサーマス・アクアチカスPol DNAポリメラーゼ（TaqDNAポリメラーゼとして知られているファミリーAポリメラーゼ）に融合されている。
【０１３０】
Sso7dの公開されたアミノ酸配列に基づいて、７種のオリゴヌクレオチドを、Ssco7dをコードする合成遺伝子を構成することに使用した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてT4 DNAリガーゼを用いて連結した。最終の連結された生成物を、十分な長さの遺伝子を増幅するためにプライマーとして２種の末端オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応において鋳型として使用した。企画によれば、得られるPCRフラグメントは、5’末端でユニークEcoRI部位及び3’末端でユニークBstXI部位を含む。Sso7dタンパク質のコードの他に、上記PCRフラグメントはまた、Sso7dタンパク質はまた、Sso7dタンパク質のC末端で位置するGly−Gly−Val−Thr（配列番号32）のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。Sso7dの合成遺伝子は、配列番号１に示されるDNA配列を有し、そしてそれは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１３１】
次に、Sso7dをコードする合成遺伝子を用いて、Sso7dがTaqの最初の289個のアミノ酸を置換している融合タンパク質を生成した。Sso7dをコードするフラグメントを、Taqポリメラーゼをコードするプラスミド中にサブクローン化し、次の通りに融合タンパク質を生成した。手短には、合成Sso7d遺伝子を含むDNAフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBstXIにより消化し、そしてTaqをコードするプラスミドのその対応する部位中に連結した。結果として、Taqの最初の289個のアミノ酸をコードする領域を、Sso7dの合成遺伝子により置換する。このプラスミド（pYW1）は、Gly−Gly−Val−Thr（配列番号32）から構成される合成リンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSso7dを含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。融合タンパク質（Sso7d−ΔTaq）をコードするDNA配列及びそのタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４に示されている。
【０１３２】
Sso7d−Taq融合体の構成：
Sso7d/十分な長さのTaq融合タンパク質をまた構成した。手短には、Taqポリメラーゼの最初の336個のアミノ酸をコードする1kbのPCRフラグメントを、２種のプライマーを用いて生成した。5’プライマーは、SpeI部位をPCRフラグメントの5’末端中に導入し、そして3’プライマーはTaq遺伝子のヌクレオチド1008−1026にハイブリダイズする。フラグメントをSpeI及びBstXIにより消化し、Taqポリメラーゼの最初の289個のアミノ酸をコードする0.9kbのフラグメントを開放する。
【０１３３】
0.9kbのフラグメントを、SpeI（リンカーをコードする領域に位置する）及びBstXI部位でプラスミドpYW1中に連結した。得られるプラスミド（pYWZ）は、Sso7d−ΔTaqにおけるのと同じ、Gly−Gly−Val−Thr（配列番号32）から成るリンカーを通して十分な長さのTaq DNAポリメラーゼのN末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。Sso7d−Taq融合タンパク質をコードするDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び６で示される。
【０１３４】
Pfu−Sso7d融合体の構成：
ピロコーカス・フリオサスDNA polI（Pfuとして知られているファミリーBのDNAポリメラーゼ）のC末端にSso7dを連結する第３の融合タンパク質を構造した。Pfu DNAポリメラーゼ遺伝子を担持するpETに基づくプラスミドを修飾し、その結果、ユニークKpnI部位及びユニークSpeI部位を、停止コドンの前のPfu遺伝子の3’末端で導入する。得られるプラスミド（pPFKS）は、そのC末端で追加のアミノ酸（Gly−Thr−His）を有するPfuポリメラーゼを発現する。
【０１３５】
２種のプライマーを用いて、上記の合成Sso7d遺伝子をPCR増幅し、KpnI部位、及びSso7d遺伝子を両端に有するNheI部位を導入した。5’プライマーをまた、Sso7dタンパク質のN末端でリンカーとして作用する６個の追加のアミノ酸（Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly）（配列番号33）を導入する。KpnI及びNheIによる消化に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpPFKS中に連結した。得られるプラスミド（pPFS）は、ペプチドリンカー（Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly）（配列番号33）を通してPfuポリメラーゼのC末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。融合タンパク質（Pfu−Sso7d）をコードするDNA配列及び融合タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７及び８に示される。
【０１３６】
Sac7d−ΔTaq融合体の構成：
異なった種からのタンパク質をΔTaqに結合する配列−非特異的DNA結合タンパク質を連結する第４の融合タンパク質を構成した。２種のプライマーを用いて、スルホロバス・アシドカルダリウムのゲノムDNAからのSac7d遺伝子をPCR増幅した。前記プライマーは、それぞれ5’及び3’末端でPCRフラグメントにユニークEcoRI部位及びユニークSpeI部位を導入した。EcoRI及びSpeIによる制限消化に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpYW1 (上記に記載される)中に連結した。得られるプラスミドは、Sso7d−ΔTaqに使用されるのと同じリンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSac7dタンパク質を含む単一のポリペプチドを発現する。融合タンパク質（Sac7d−ΔTaq）のDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９及び10で示される。
【０１３７】
PL−ΔTaq融合体の構成：
第５の融合タンパク質は、14個のリシン及び２個アルギニンから構成されるペプチドをΔTaqのN末端に連結する。ポリリシン（PL）−ΔTaq融合タンパク質を生成するために、２種の67ntのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、EcoRI部位を適合する5’突出末端及びSpeI部位と適合する3’突出末端を有する重複DNAフラグメントを形成した。前記DNAフラグメントは、次の組成のリシンに富んでいるペプチドをコードする：NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT（配列番号34）。
【０１３８】
このペプチドにおけるリシン及びアルギニンの数は、Sso7dにおけるその数に同一である。このDNAフラグメントをpYW1中の連結し、EcoRI及びSpeIにより予備消化し、Sso7dをコードする領域を置換した。得られるプラスミド（pLST）は、ΔTaqのN末端に融合されるリシンに富んでいるペプチドを含む単一のポリペプチドを発現する。融合タンパク質（PL−ΔTaq）をコードするDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11及び12に示される。
【０１３９】
例２．融合ポリメラーゼのプロセッシング性の評価：
この例は、例１において生成される本発明の融合タンパク質のプロセッシング性の増強を示す。
ポリメラーゼ単位定義アッセイ：
次のアッセイを用いて、ポリメラーゼ単位を定義した。オリゴヌクレオチドを、Mg2+−フリー反応緩衝液及びdNTPの存在下でssM13mp18 DNAにプレアニーリングした。興味あるDNAポリメラーゼを、プライムされたDNA混合物に添加した。MgCl2を添加し、72℃でのDNA合成を開始した。サンプルを種々の時点で採取し、そしてPicoGreen（Molecular Probes, Eugene Oregon）を含むTE緩衝液に添加した。合成されるDNAの量を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。興味あるDNAポリメラーゼの単位活性を、その初期割合と対照DNAポリメラーゼ（例えば、既知の単位濃度の市販のポリメラーゼ）のその割合とを比較することによって決定した。
【０１４０】
プロセッシング性アッセイ：
プロセッシング性を、プライムされた鋳型へのポリメラーゼの１回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数を決定することによって測定した。
手短には、40nMの5’FAM−ラベルされたプライマー（34ntの長さ）を、80nMの環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングし、プライムされた鋳型を形成した。プライムされた鋳型を、標準のPCR緩衝液（Mg2+を有さない）及び200μMの個々のdNTPの存在下で、興味あるDNAポリメラーゼと共に、約4000：１のモル比（プライムされたDNA：DNAポリメラーゼ）で混合した。
【０１４１】
MgCl2を添加し、2mMの最終濃度にし、DNA合成を開始した。開始の後、種々の時間で、サンプルを、配列決定負荷色素含有の99％ホルムアミドにより急冷し、そして配列決定ゲル上で分析した。等量の生成物が存在する、上記又は下記生成物の長さとして定義される生成物のメジアン長を、すべての検出できる生成物ピークの統合に基づいて決定した。生成物のメジアン長が時間又はポリメラーゼ濃度と共に変化するポリメラーゼ濃度で、その長さは酵素のプロセッシング性に対応する。表Iに示される範囲は、アッセイのいくつかの反復体において得られる値の範囲を表す。
【０１４２】
【表１】
【０１４３】
修飾されていない酵素に対する修飾された酵素のプロセッシングの比較の場合、ΔTaqは２〜６個のヌクレオチドのプロセッシング性を有し、そしてSso7d−ΔTaq融合体は39〜58個のヌクレオチドのプロセッシング性を示した（表I）。十分な長さのTaqは、130〜160個のヌクレオチドのプロセッシング性を有するSso7d−Faq融合体のプロセッシング性よりも有意に低い15〜20個のヌクレオチドのプロセッシング性を有した。それらの結果は、Taqポリメラーゼに連結されるSso7dがポリメラーゼのプロセッシング性を増強したことを示す。
【０１４４】
PfuはポリメラーゼのファミリーBに属する。Taqポリメラーゼとは異なって、Pfuは、DNA合成の間、高い適合性の維持を可能にする3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。Sso7dが十分な長さのPfuポリメラーゼのC末端に融合されている修飾されたPfuポリメラーゼ、及び修飾されていないPfuポリメラーゼを、上記プロセッシング性アッセイにおいて分析した。表Iに示されるように、Pfuポリメラーゼは２〜３ntのプロセッシング性を示し、そしてPfu−Sso7d融合タンパク質は35〜39ntのプロセッシング性を有した。従って、PfuのC末端へのSso7dの融合は、修飾されていない酵素に対するプロセッシング性の10倍以上の増強性をもたらした。
【０１４５】
Taqポリメラーゼのプロセッシング性を増強するリシンに富んでいるペプチドの能力をまた、評価した。PL−ΔTaqのプロセッシングを、上記方法を用いて測定し、そして修飾されていないタンパク質ΔTaqのプロセッシング性に比較した。表Iに示されるように、ポリリシン路の存在はΔTaqのプロセッシング性を増強しなかった。従って、核酸結合タンパク質へのリシンに富んでいるペプチドの付加は従来技術に開示されるようにその基質への酵素の会合速度を高めることができるが、プロセッシング性は高められない。
【０１４６】
例３．オリゴヌクレオチドアニーリング温度に対する融合タンパク質の効果：
この実験は、dsDNAを安定化することによって高いアニーリング温度で生成物を生成するために、Taqに比較して、Sso7d−ΔTaq融合タンパク質の高められた効率を示す。
2種のプライマー、すなわちプライマー1008（19マー、TM＝56.4℃）及び2180R（20マー、TM＝56.9℃）を用いて、Taq pol遺伝子の1kbフラグメント（1008−2180）を増幅した。グラジエント熱サイクラー（MJ Research, Waltham MA）を用いて、PCRサイクリングプログラムにおいて50℃から72℃にアニーリング温度を変えた。同一数の単位のSso7d−ΔTaq及びTaqを用いて生成されるPCR生成物の量を、定量化し、そして比較した。結果は表IIに示される。Sso7d−ΔTaq融合タンパク質は、高いアニーリング温度での十分な長さのTaqよりも有意に高い効率を示した。従って、シスでのSso7dの存在は、鋳型上でのプライマーの溶融温度を高める。
【０１４７】
上記アニーリング温度アッセイを用いて、PL−ΔTaqがPCR増幅の間、プライマーのアニーリング温度に対していずれかの効果を有するかどうかを調べた。表IIに示されるように、増幅された生成物は、アニーリング温度が63℃又はそれ以上である場合、ほとんど又はまったく観察されなかった。
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
例４．必要とされるプライマー長に対する融合タンパク質の効果：
プライマー（上記に示されるような）のTMの増強は、より短いプライマーが効果的なPCR増幅を達成するために、Taqによってではなく、Sso7d−ΔTaqにより使用され得ることを予測する。この分析は、Sso7d−ΔTaqが、Taqに比較して、より短いプライマーを用いてアッセイにおいてより効果的であることを示す。
【０１５０】
異なった長さのプライマーを用いて、Sso7d−ΔTaq及びTaqによるPCR増幅の効率を比較した。その結果は、表III及び図１A−１Cに示される。２種の長さのプライマー、すなわち57F（22マー、TM＝58℃）及び732R（24マー、TM＝57℃）が使用される場合、低又は高アニーリング温度でSso7d−ΔTaqとTaqとの間で有意な差異は観察されなかった。中位の長さのプライマー、すなわち57F15（152マー、TM＝35℃）及び732R16（16マー、TM＝35℃）が使用される場合、Sso7d−ΔTaqは、特にアリーリング温度が高い場合、Taqよりもより効果的であった。２種の酵素間の最も著しい差異が短いプライマー、すなわち57F12（12マー）及び732R16（16マー）により観察され、ここでSso7d−ΔTaqは、低及び高アニーリング温度でTaqよりも10倍、高く生成物を生成した。
【０１５１】
プライマー57F12（12nt）及び732R16（16nt）を用いてのPCRを用いて、PCR反応における修飾されていない十分な長さのTaqに対するSac7d−ΔTaqの効率を比較した。結果は図２に示される。Sso7d−ΔTaqに類似して、Sac7d−ΔTaqは、短いプライマーを用いての増強において、Taqよりも有意により効果的である。
プライマー長アッセイを用いて、PCR増幅における短いプライマーを用いるPL−ΔTaqの能力を決定した。長いプライマー（57F及び732F）が使用され得る場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の約50％である。短いプライマー（57F12及び732R16）が使用される場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の20％以下である。
【０１５２】
【表３】
【０１５３】
PCR 反応における融合ポリメラーゼの高められた性能：
本発明の融合タンパク質の高められた安定性及び/又はプロセッシング性は、種々の修飾反応の実施において高められた効率を提供する。例えば、ポリメラーゼ融合タンパク質は、PCR反応においてより効果的な増幅を提供することができる。多くの因子が、PCR反応の結果、例えばプライマー特異性、ポリメラーゼの効率、鋳型の量及びGC−含有率、アンプリコンの長さ、等に影響を及ぼす。例５〜８は、熱安定性ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインに連結される二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメイン、例えばSso7dを包含する融合タンパク質が、PCR増幅において、修飾されていない酵素に対していくつかの好都合な特徴を有することを示す。
【０１５４】
例５． Sso7d 融合タンパク質は PCR において高く且つ広い塩耐性を示す：
プライムされたDNA鋳型へのポリメラーゼの結合は、低い塩濃度でより強く、そして高い濃度でより弱い、静電相互作用のために反応緩衝液のイオン強度に対して敏感である。融合ポリメラーゼタンパク質におけるSso7dの存在は、DNA鋳型へのポリメラーゼの結合相互作用を安定化する。この例は、Sso7d融合タンパク質が、高められたKCl濃度を包含するPCR反応において改良された性能を表すことを示す。
【０１５５】
λDNA（2pM）を、プライマー57F及び732RとのPCR反応において鋳型として使用した。KClの濃度を10mMから150mMに変え、そして反応緩衝液中のすべての他の生成は変更されなかった。PCR反応を、94℃で30分、94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で30秒（20サイクル）、続いて72℃で10分のサイクリングプログラムを用いて行った。反応の完結後、5μlのPCR反応物を除き、そしてTE中、PicoGreenの１：400希釈溶液195μlと共に混合し、生成されるアンプリコンの量を定量化した。PCR反応生成物をまた、アガロースゲル上で同時に分析し、予測される長さのアンプリコンが生成されたことを確かめた（データは示されていない）。
【０１５６】
Sso7d−ΔTaqのPCR効率対ΔTaqのPCR効率及びPfu−Sso7d対Pfuに対するKCl濃度の効果が表IVに示されている。修飾されていない酵素、すなわちΔTaq及びPfuは、最大活性の80％を維持するために、それぞれ25mM及び40mM以下のKCl濃度についての選択性を示した。対照的に、融合タンパク質Sso7d−ΔTaq及びPfu−Sso7dは、それぞれ30〜100mM及び60〜100mMのKClにおいて最大活性の80％を維持する。従って、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分に比較して、高められたKCl濃度に耐性であった。ハイブリッドポリメラーゼのこの特徴は、低量のDNA鋳型、例えば血液、食物及び植物源（但し、それらだけには限定されない）から調製されたDNAサンプルからのPCR増幅を実質的に可能にするであろう。
【０１５７】
【表４】
【０１５８】
例６． Sso7d 融合ポリメラーゼは PCR において短い延長時間を必要とする：
ポリメラーゼのプロセッシング性は、重合段階の効率に直接的に影響を及ぼす。例えば、低いプロセッシング性を有するポリメラーゼは、より頻繁に解離し、そしてプライムされた鋳型に再結合するのにより時間を必要とし、ところが高いプロセッシング性を有するポリメラーゼは完全な鋳型の複製を完結するためにより少ない結合現象を必要とする。例２に示されるように、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分よりも有意に高いプロセッシング性を有する。
【０１５９】
従って、その融合タンパク質は、PCR反応のプライマー延長段階の間、より効果的であるべきである。本明細書において、本発明者は、Sso7d融合ポリメラーゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、PCRの間、大きなフラグメントを増幅するために短い延長時間を必要とすることを示す例を提供する。さらに、本発明者は、単一の酵素融合ポリメラーゼが、大きなフラグメントの増幅のために当業界において現在使用される酵素混合物（DyNAzyme EXT）に比較して、限定された時間で、大きなDNAフラグメントを増幅する増強された能力を示すことを示す。
【０１６０】
例６−１．Sso7d融合ポリメラーゼはPCRにおいて短い延長時間を必要とする：
λDNA（2.25pM）を、PCR鋳型として使用した。３種のプライマー対、すなわちL71F（5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号13）及びL71R（5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’）（配列番号14）、L18015F（5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’）（配列番号15）及びL23474R（5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’）（配列番号16）、及びL18015F（5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’）（配列番号17）及びL29930R（5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’）（配列番号18）を、それぞれ、0.9kb、5.5kb、及び11.9kbのサイズのDNAフラグメントを増幅するために使用した。個々の反応は40単位/mlのポリメラーゼ（前記単位は、例２に記載のように定義された）、及び0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。
【０１６１】
Pfu（Stratageneからの）のために使用される反応緩衝液は、20Mmのトリス−HCl（pH8.8）、2mMのMgSO4、10mM のKCｌ、10mMの (NH4)2SO4、0.1％のTritonX−100及び0.1mg/mlのBSAを含んだ。Pfu−Sso7d、Taq及びSso7d−Taqのための反応緩衝液は、追加の40cmのKClを含む上記緩衝液であった。１分又は５分の延長時間を有する２つのサイクリングプログラムを、PCR増幅のために使用した。個々のサイクリングプログラムは、94℃で20秒、ポリメラーゼの添加による80℃での熱開始、94℃で10秒、72℃で１又は５分、及び72℃で５分（20サイクル）から構成された。
【０１６２】
結果は、Pfu−Sso7d融合タンパク質が１分の延長時間を用いて、１kb及び5kbのフラグメントを増幅することができ、そして５分の延長時間を用いて、10kbのフラグメントを増幅することができた。対照的に、Pfuポリメラーゼは、１分又は５分の延長時間を用いて、1kbのフラグメントのみを増幅した。同様に、Sso7d−Taq融合タンパク質は、１分の延長時間を用いて、１kbのフラグメントを増幅し、そして５分の延長時間を用いて、１kb及び5kbのフラグメントを増幅し、そしてTaqポリメラーゼは、５分の延長時間により、１kbのフラグメントのみを増幅した。
従って、融合タンパク質におけるSso7dの存在は、修飾されていないタンパク質に比較して、PCR反応において短い延長時間をもたらす。
【０１６３】
例６−２．Pfu−Sso7d融合ポリメラーゼは存在する長いPCR酵素混合物より性能がすぐれている：
現在、長いDNAフラグメントのPCR増幅は、非プル−フリーディングポリメラーゼ（例えば、Taq又はDyNAyme II）及び少量のプルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、Pfu又はDeep Vent）の両者を含む酵素混合物の使用を必要とする。本発明者は、長いPCRにおいて１つの高性能の長いPCR酵素DyNAzyme EXT (Finnzymesからの) に単一の融合酵素Pfu−Sso7dを比較し、そしてPfu−Sso7dが、特に制限された延長時間を伴なって、DyNAzyme EX7より性能がすぐれていることを示した。
【０１６４】
λDNA（2.25pM）をPCR鋳型として使用した。４対のプライマー、すなわちL71F（5’− CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号13）及びL71R（5’− GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’）（配列番号14）、L30350F（5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号19）及びL35121R（5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’）（配列番号20）、L2089F（5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’）（配列番号21）及びL7112R（5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’）（配列番号22）、及びL30350F（5’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号23）及びL40547R（5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’）（配列番号24）を用いて、それぞれ、0.9kb, 4.8kb、5.0kb及び10.2kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。
【０１６５】
４種の濃度（10単位/ml、20単位/ml、40単位/ml及び80単位/ml）のPfu−Sso7dを用い、そして２種の濃度（20単位/ml及び40単位/ml）のDyNAzymeEXTを使用した。個々の反応は、0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。Pfu−Sso7dのための反応緩衝液は、例６−１に記載される通りであった。DyNAzyme EXTのための反応緩衝液は、20mMのトリス（pH9.0）、2mMのMgCl2、15mMの (NH4)2SO4及び0.1％のTriton X-100 (Finnzymesにより提供される) を含んだ。すべての反応成分をまず、氷上で混合し、そしてサンプルプレートを、90℃以上に予備加熱された熱サイクラー（MJ Research）中に配置することによって、反応を開始した。PCRサイクリングプログラムは、95℃での20秒、94℃での10秒及び70℃で１又は1.5分（20サイクル）、及び72℃で10分（１サイクル）から成る。
【０１６６】
図３に示されるように、Pfu−Ssoudを用いて１分間の延長時間は、10, 20, 40及び80単位/mlのポリメラーゼの存在下で、有意な量の0.9kbの生成物を生成した。4.8kb及び5.0kbの生成物を生成したが、但し、40及び80単位/mlのポリメラーゼの存在下で、低レベルで生成された。1.5分の延長時間を用いて、4.8kb及び5.0kbの生成物を、10単位/ml又はそれよりも高いPfu−Sso7dにより生成し、そして10.2kbのフラグメントを、40及び80単位/mlのPfu−Sso7dにより有意な量で生成した。対照的に、DyNAzyme EXTが使用される場合、1kb及び4.8kbの生成物のみが、40単位/mlのポリメラーゼの存在下で、1.5分の延長時間を用いて生成され、そして10kbの生成物は検出されなかった。
従って、融合ポリメラーゼPfu−Sso7dは、長いPCRにおいて、酵素混合物、例えばDyNAzyme EXTよりも単一の酵素として著しくより効果的である。
【０１６７】
例７． Sso7d 融合タンパク質は PCR 増幅においてより感受性である：
この例は、Sso7dの融合ポリメラーゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、低コピー数で存在する標的物を増幅できることを示す。プラスミドDNAを、PCR鋳型として使用し、そしてT3及びT7を、500bpのフラグメントを増幅するプライマーとして使用した。プラスミドDNAの量は変化し、その結果、PCR反応に存在するDNA鋳型のコピー数は108〜１の範囲であった。サイクリングプログラムは、99℃で３分、96℃で１秒、50℃で15秒、及び68℃で30秒（25又は35サイクル）、続いて68℃で５分（１サイクル）であった。104〜108の鋳型コピー数（25μlの反応当たり）に関しては、25サイクルの増幅が行われ；１〜104の鋳型コピー数（25μlの反応数当たり）に関しては、35サイクルの増幅が行われた。
【０１６８】
Sso7d融合ポリメラーゼを、効果的な増幅のための鋳型の最少コピー数のための必要な条件下で修飾されていないポリメラーゼに比較した。表Vに表されるように、Pfu−Sso7dはDNAの少数のコピーを増幅するその能力においてPfuよりもより有意に敏感であり、このことは、本発明の融合ポリメラーゼがPCR反応の感受性を５倍ほど高めることができることをしめす。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
例８． Sso7d 融合ポリメラーゼは PCR 反応において高い特異性を維持する：
例３に示されるように、Sso7d−Δtaq融合タンパク質は、PCR増幅において高いアニーリング温度及び/又は短いプライマーを可能にするその能力により表されるように、プライマー鋳型相互作用を安定化する。融合タンパク質のこの性質がPCRにおいて非特異的増幅をもたらすかどうかを評価するために、複合DNA鋳型（例えばヒトゲノムDNA）を、標的鋳型として使用した。次の２種の例は、Pfu−Sso7dを用いて達成される増幅の特異性が最も通常に使用されるPCR酵素であるTaqほどであることを示す。
【０１７１】
例８−１．Pfu−Sso7dを用いてのヒトDNAからの性−特異的マーカーの増幅：
胎盤又は絨毛膜組織（Sigmaからの）からのヒト雌又は雄型DNA（濃度、１fM）を鋳型として使用した。プライマーH−Amelo−Y（5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’）（配列番号25）及びH−Amelo−YR（5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’）（配列番号26）を用いて、X染色体からの212bpのアンプリコン及びY染色体からの218bpのアンプリコンを増幅した。単一の212bpのフラグメントは、雌型DNAから増幅され、そして３種のフラグメント（212bp、218bp及び212bp/218bpのヘテロ接合体）は雄型DNAから予測された。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。
【０１７２】
Taqのための反応緩衝液は、10mMのトリス（pH8.8）、50mMのKCl，1.5mMのMgCl2及び0.1％のTriton−X−100（Amershamにより提供される）を含んだ。Pfu−Sso7dのための反応緩衝液は、DyNAzyme EXT緩衝液（例６−２を参照のこと）及び追加の40mMのKClを含んだ。すべての反応成分を氷上で混合し、そして反応を、65℃以上に予備加熱された熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始した。サイクリングプログラムは、95℃で２分、94℃で5秒、64℃で10秒、及び72℃10秒（30サイクル）、続いて72℃で７分（１サイクル）から成った。予測されるサイズの特異的アンプリコンを、Pfu−Sso7d及びTaqポリメラーゼの両者により増幅した。
【０１７３】
例８−２．Pfu−Sso7dを用いてのヒトDNAからのβ−グロビン遺伝子の増幅：
胎盤又は絨毛膜組織（Sigmaからの）からのヒトDNA（1fM）を鋳型として使用した。３種のプライマー対、すなわちBglbn536F（5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’）（配列番号27）及びBglbn536R（5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’）（配列番号28）、Bglbn536F及びBglbn1083R、及びBglbn536及びBglbn1408R（5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’）（配列番号29）を用いて、それぞれ0.5、1.1及び1.4kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の４種のｄNTDを含んだ。Tgq及びPfu−Sso7dのための反応緩衝液は例８−１に記載されている。
【０１７４】
すべての反応成分を氷上で混合し、そして反応を、65℃以上に予備加熱された熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始した。サイクリングプログラムは、95℃で２分、94℃で45秒、64℃で45秒、及び72℃１分（30サイクル）、続いて72℃で７分（１サイクル）から成った。使用される３種のプライマー対の個々により、予測されるサイズの増幅された生成物を、Pfu−Sso7dを用いて生成した。それらの結果は、Pfu−Sso7dを用いることによって達成される増幅の特異性がTaqポリメラーゼによるその特異性に等しいか又はそれよりも良好であることを示す。
【０１７５】
配列表：
配列番号１：合成Sso7d遺伝子：
【化１】
【０１７６】
配列番号２：Sso7dのアミノ酸配列：
【化２】
【０１７７】
配列番号３：Sso7d−ΔTaq融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化３】
【０１７８】
【化４】
【０１７９】
配列番号４：Sso7d−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化５】
配列番号５：Sso7d−Taq融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化６】
【０１８０】
【化７】
【０１８１】
【化８】
【０１８２】
【化９】
【０１８３】
配列番号６：Sso7d−Taq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１０】
【０１８４】
配列番号７：Pfu−Sso7融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化１１】
【０１８５】
【化１２】
【０１８６】
【化１３】
【０１８７】
配列番号８：Pfu−Sso7d融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１４】
配列番号９：Sac7d−ΔTaq融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化１５】
【０１８８】
【化１６】
【０１８９】
【化１７】
【０１９０】
配列番号10：Sac7d−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１８】
【０１９１】
配列番号11：PL−ΔTaq融合タンパク質をコードするDNA配列；
【化１９】
【０１９２】
【化２０】
【０１９３】
【化２１】
【０１９４】
配列番号12：PL−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化２２】
配列番号13：プライマーL71F：
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号14：プライマーL71R：
5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’
配列番号15：プライマーL18015F：
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
配列番号16：プライマーL2347R：
5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’
配列番号17：プライマーL18015F：
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
【０１９５】
配列番号18：プライマーL29930R：
5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’
配列番号19：プライマーL30350F：
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号20：プライマーL35121R：
5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’
配列番号21：プライマーL2089F：
5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’
配列番号22：プライマーL7112R：
5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’
配列番号23：プライマーL30350F：
5’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’
【０１９６】
配列番号24：プライマーL40547R：
5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’
配列番号25：プライマーH-Amelo-Y：
5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’
配列番号26 ：プライマーH-Amelo-YR：
5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’
配列番号27 ：ヒトβ−グロビンプライマー536F：
5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’
配列番号28 ：ヒトβ−グロビンプライマー536R：
5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’
配列番号29 ：ヒトβ−グロビンプライマー1408R：
5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１a-cは、Sso7d−修飾されたポリメラーゼの効率と修飾されていない十分な長さのポリメラーゼの効率とを比較するために、異なった長さのプライマーを用いて行われるPCR増幅反応の結果を示す。
【図２】 図２は、Taqに比較してSac7d−ΔTaqを用いて生成されるPCR生成物を評価するために、12ntの前方向プライマーを用いてのPCR増幅反応の結果を示す。
【図３】 図３は、Pfu−Sso7dが長いPCRにおいてDyNAzyme EXTよりもより効果的であることを示すPCR増幅反応の結果を示す。
発明の分野：
本発明は、新規核酸修飾酵素の改良された生成を提供する。前記改良点は、前記核酸を結合し、そして触媒的に修飾する酵素の能力を増強する態様での、前記酵素への配列−非特異的核酸結合ドメインの結合である。
【０００２】
発明の背景：
核酸修飾酵素の効率、すなわち結合現象当たり酵素により生成される修飾された生成物の量は、修飾酵素/核酸複合体の安定性を高めることによって増強され得る。従来技術は、核酸修飾酵素への高い確立の結合部位、例えば正に荷電された結合末端の結合が、前記修飾酵素が前記核酸と相互作用する頻度を高めることができることを示している（例えば、アメリカ特許第5,474,911号を参照のこと）。
【０００３】
本発明は現在、核酸の二本鎖コンホメーションが安定化され、そして酵素の効率が、配列―非特異的二本鎖核酸結合ドメインを酵素又はその触媒部位に結合することによって高められる新規修飾酵素を提供する。プロセッシング特性である修飾タンパク質は、酵素のみに比較して、結合ドメインに結合される場合、高められたプロセッシング性を示す。さらに、プロセッシング性及び非プロセッシング性修飾酵素の両者は、本明細書に記載される典型的な結合ドメインに結合される場合、高い温度での高められた効率を示す。
【０００４】
１つの観点においては、本発明は、長いPCRを行う増強された能力、すなわち5kb又はそれ以上の長さの配列の増幅性を提供する融合ポリメラーゼを提供する。長いPCRを行うためのポリメラーゼ混合物は、当業界において知られている。そのような混合物に関する１つの困難性は、長い延長時間が予測される生成物の最適な収率のために必要とされることである。従来の推薦は、kb当たり１分の延長時間を可能にすることである。10kbの生成物に関して、及び40サイクルの増幅を用いて、PCRは約７時間を要する。
【０００５】
現在入手できるそれらのポリメラーゼ及び/又はポリメラーゼ混合物に比較して、長いPCRを行う増強された能力を示す修飾されたポリメラーゼ酵素が本明細書において記載される。それらの修飾された酵素、例えばPfu−Sso7dは、誤差−補正活性及び配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを有するポリメラーゼを組み込み、そして従って、ポリメラーゼ混合物を提供する。さらに、そのような修飾された酵素は、従来のポリメラーゼ酵素により必要とされるよりも短い延長時間を用いて所定のフラグメントを効果的に増幅することができる。従って、従来の混合物の代わりに本明細書に記載されるハイブリッドポリメラーゼの使用は、大きなフラグメントを増幅するために必要とされる反応時間を、例えば約７時間から約２時間に低めることができる。
【０００６】
発明の要約：
本発明は、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されている少なくとも２種の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸修飾ドメインのプロセッシング特性を増強することを特徴とする。本発明の１つの観点においては、核酸修飾ドメインは、熱安定性であるポリメラーゼ活性、例えばサーマスポリメラーゼドメインを有する。他の態様においては、前記触媒ドメインは、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼである。
【０００７】
特定の態様においては、前記タンパク質の配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する。他方では、前記配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dに対して50％のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含むことができる。核酸結合ドメインはまた、Sso7dでもあり得る。
もう１つの態様においては、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合するか、又はピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインを含む。
【０００８】
本発明はまた、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されている少なくとも２種の異種ドメインから成るタンパク質を提供し、ここで前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なくとも１℃安定化することを特徴とする。そのようなタンパク質の核酸修飾ドメインは、熱安定性であり得るポリメラーゼ活性を有することができる。前記核酸修飾ドメインは、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース又はトポイソメラーゼ活性を有する。
【０００９】
さらなる態様においては、前記配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれか、時折Sso7dに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合し、又はSso7dに対して50％のアミノ酸類似性を有する50個のアミノ酸副配列を含む。しばしば、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
本発明のタンパク質は、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、ピロコーカス・フリオサスのPCNA相同体に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合するタンパク質であり；しばしば前記結合ドメインはピロコーカス・フルオサスのPCNA相同体である。
【００１０】
もう1つの観点においては、本発明は前記タンパク質を用いての核酸の修飾方法を提供する。１つの態様は、（ｉ）前記核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、プロセッシング特性を有する触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、a. 二本鎖核酸に結合し、そして b. それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一の酵素と比較して、前記酵素のプロセッシング性を増強し、そしてここで前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり；そして（ii）前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る、水溶液における核酸を修飾するための方法である。
【００１１】
もう１つの観点においては、本発明は、（ｉ）前記核酸と少なくとも２種の異種ドメインを有するタンパク質を含む水溶液とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、触媒性核酸修飾ドメインである第２ドメインに結合され、前記配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの存在が、それに結合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない他の同一のタンパク質に比較して、二本鎖核酸の形成を安定化し、そして前記溶液が、前記結合ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記酵素の触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり；そして（ii）前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にすることを含んで成る、核酸を修飾するための方法を提供する。核酸の修飾方法は、本明細書に記載されるタンパク質態様のいずれかを使用することができる。
【００１２】
さらなる観点においては、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて水溶液における標的核酸の5kb又はそれよりも長い副配列を増幅するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）前記標的核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二本鎖核酸に結合し、そして(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のポリメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシング性を増強し、そして、前記溶液が、結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる５kb又はそれ以上の長さへの延長を可能にする組成のものであり；（ii）前記５kb又はそれ以上の長さの副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで成る。
【００１３】
前記方法の1つの態様においては、核酸−修飾ドメインは熱安定性ポリメラーゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体を特異的に結合し、Sso7dに対して50％アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結合する。もう１つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて水溶液における標的核酸の副配列を増幅するための方法を提供し、ここで前記方法は、（ｉ）前記標的核酸と少なくとも２種の異種ドメインを含んで成るタンパク質とを接触せしめ、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインである第１ドメインが、誤差補正活性を有するポリメラーゼドメインである第２ドメインに結合されており、前記配列−非特異的核酸結合ドメインが、(a) 二本鎖核酸に結合し、そして(b) それに融合される配列−非特異的核酸結合ドメインを有さない同一のポリメラーゼと比較して、前記ポリメラーゼのプロセッシング性を増強し、そして、前記溶液が、標的核酸１ml当たり105又はそれよりも少ないコピーを含んで成り、そして結合ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる延長を可能にする組成のものであり；（ii）前記副配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートすることを含んで成る。
【００１５】
前記方法の1つの態様においては、核酸−修飾ドメインは熱安定性ポリメラーゼ活性を有する。しばしば、核酸修飾ドメインは、ピロコーカスポリメラーゼドメインを含んで成る。前記方法の他の態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sac7d又はSso7dのいずれかに対して生成されるポリクローナル抗体を特異的に結合し、Sso7dに対して50％アミノ酸類似性を含む50個のアミノ酸副配列を含むか、又はSso7dに対して生成されたポリクローナル抗体を特異的に結合する。もう１つの態様においては、配列−非特異的核酸結合ドメインは、Sso7dである。
【００１６】
定義：
“原始的な小さな塩基性DNA−結合タンパク質”とは、天然の小さな塩基性DNA−結合タンパク質、例えばスルホロバス・スルファタリカス（Sulfolobus sulfataricus）からのSso-7dに対して50％相同体を有するか、又は天然の小さな塩基性DNA−結合タンパク質に対して生成される抗体に対して結合する、50〜75個のアミノ酸のタンパク質を言及する。
【００１７】
“プロセッシング特性”を有する触媒性核酸修飾ドメイン“とは、核酸分子の長さに沿ってスライドする能力を有する酵素として遂行し、そしてその構造を反復して化学的に変更するタンパク質配列又は副配列を言及する。触媒ドメインは、完全な酵素、その副配列を包含することができるか、又は天然において見出されるような酵素又は副配列に結合されない追加のアミノ酸配列を包含することができる。
【００１８】
“ドメイン”とは、ポリペプチド副配列、完全なポリペプチド配列、又は多くのポリペプチド配列を含んで成る、タンパク質又はタンパク質複合体の定義される機能を有する単位を言及する。前記機能は、広く定義されることが理解されており、そしてリガンド結合触媒活性であり得るか、又はタンパク質の構造に対して安定化効果を有することができる。
【００１９】
本発明の核酸修飾酵素における“効率”とは、特定の反応条件下でその触媒機能を行う酵素の能力を言及する。典型的には、“効率”とは、本明細書において定義される場合、核酸への結合当たり修飾酵素により生成される修飾された塩基の量により示される。
酵素における“増強する”とは、酵素の活性の改良、すなわち単位酵素及び単位時間当たりの生成物の量上昇を言及する。
“融合された”とは、共有結合による結合を言及する。
【００２０】
“異種”とは、タンパク質の一部に関して使用される場合、そのタンパク質が性質的にお互いに対して同じ関係で見出されない複数のドメインを含んで成ることを示す。そのようなタンパク質、例えば融合タンパク質は、新規の機能的タンパク質を製造するために配置される関連しないタンパク質からの複数のドメインを含む。
“連結する”とは、タンパク質ドメインを機能的に結合するための当業界において知られているいずれかの方法、例えば介在性ドメインを有するか又は有さない組換え融合、イントロン−介在性融合、非共有結合及び共有結合、例えばジスルフィド結合；水素結合；静電結合；及びコンホメーション結合、例えば抗体―抗原及びビオチン−アビジン結合を言及する。
【００２１】
“メチラーゼ”とは、ヌクレオチドへのメチル基の付加により核酸を修飾することができる酵素を言及する。
“ヌクレアーゼ”とは、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を分解できる酵素を言及する。
“核酸修飾酵素”とは、核酸を共有的に変更する酵素を言及する。
“ポリメラーゼ”とは、ポリヌクレオチドの鋳型−指図された合成を行う酵素を言及する。
【００２２】
ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインの“誤差補正活性”とは、鋳型−特異的核酸ポリメラーゼの3’→5’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を言及し、それにより、鋳型と共にワトソン−クリック型塩基対を形成しないヌクレオチドが、１つのオリゴヌクレオチド、すなわち鋳型から合成される鎖の3’末端から、連続態様で除去される。誤差補正活性を有するポリメラーゼの例は、ピロコーカス・フリオサス、サーモコーカス・リトラリス及びサーモコーカス・マリチマからのポリメラーゼを包含する。
【００２３】
“プロセッシング性”とは、鋳型又は基質に結合されたまま存続し、そして複数の修飾反応を行う核酸修飾酵素の能力を言及する。典型的には、“プロセッシング性”とは、核酸の比較的長い路を修飾する能力を言及する。
“制限エンドヌクレアーゼ”とは、特定の塩基配列でDNAの分子を内部的に分解する、細菌により生成される酵素グループのいずれかを言及する。
“配列−非特異的核酸結合ドメイン”とは、核酸に有意な親和性を伴なって結合するタンパク質ドメインを言及し、このためには、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なったヌクレオチド配列を有するもう１つの核酸よりも100倍以上高い親和性を伴なってタンパク質ドメインに結語する既知の核酸は存在しない。
【００２４】
“熱安定性ポリメラーゼ”とは、本明細書において使用される場合、鋳型としてDNA又はRNAを用いてのヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単位の付加によりポリヌクレオチド合成を触媒し、そして45℃以上の温度で最適活性を有するいずれかの酵素を言及する。
“サーマスポリメラーゼ”とは、いずれかのサーマス種、例えばサーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・ブロキアヌス（Thermus brockianus） 及びサーマス・サーモフィラス（Thermus themophilus）から単離されたファミリーA DNAポリメラーゼ；遺伝的修飾又は化学的修飾、又は当業界において知られている他の方法により誘導されていてもいずれにせよ、サーマス種に起因するいずれかの組換え酵素、及びそのいずれかの機能的誘導体を言及する。
【００２５】
“ポリメラーゼ鎖反応”又は“PCR”とは、標的二本鎖DNAの特定のセグメント又は副配列が幾何学的進行で増幅される方法を言及する。PCRは、当業者に良く知られている；例えばアメリカ特許第4,683,195号及び第4,683,202号；及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisなど., eds, 1990を参照のこと。
“長いPCR”とは、5kb又はそれよりも長いDNAフラグメントの増幅を言及する。長いPCRは典型的には、短い生成物を増幅するために従来使用されるポリメラーゼとは異なる特別に適合されたポリメラーゼ又はポリメラーゼ混合物を用いて行われる（例えば、アメリカ特許第5,436,149号及び第5,512,462号を参照のこと）。
【００２６】
“プライマー”とは、標的核酸上の配列にハイブリダイズし、そして核酸合成の開始点として作用するポリヌクレオチド配列を言及する。プライマーは、種々の長さのものであり得、そしてしばしば50個よりも短い長さのヌクレオチド、例えば12〜25個の長さのヌクレオチドである。PCRへの使用のためのプライマーの長さ及び配列は、当業者に知られている原理に基づいて企画され得、例えばInnisなど., 前記を参照のこと。
【００２７】
“温度プロフィール”とは、PCR反応の変性、アニーリング及び/又は延長段階の温度及び時間の長さを言及する。PCR反応のための温度プロフィールは典型的には、類似するか又は同一の短い温度プロフィールの10〜60回の反復からなり；それらの短いプロフィールの個々は典型的には、２段階又は３段階PCR反応を定義する。“温度プロフィール”の選択は、当業者に知られている種々の考慮に基づかれている；例えばInnisなど., 前記を参照のこと。本明細書に記載されるような長いPCR反応においては、5kb又はそれよりも長い増幅生成物を得るために必要とされる延長時間は、従来のポリメラーゼ混合物に比較して、減じられる。
【００２８】
PCR“感受性”とは、低コピー数で存在する標的核酸を増幅する能力を言及する。“低コピー数”とは、増幅される核酸サンプルにおける標的配列の105、しばしば104, 103, 102又はそれ以下のコピーを意味する。
“鋳型”とは、プライマーハイブリダイゼーション部位を両端に有する、増幅されるポリヌクレオチドを含んで成る二本鎖ポリヌクレオチド配列を言及する。従って、“標的鋳型”は、5’プライマー及び3’プライマーのためのハイブリダイゼーション部位を端に有する標的ポリヌクレオチド配列を含んで成る。
【００２９】
特定の記載：
序説：
本発明は、配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質が、触媒タンパク質のプロセッシング性質を増強するために触媒性核酸修飾タンパク質に結合され得る発見である。従来技術は、核酸結合タンパク質が核酸への酵素の結合親和性を高めることができることを教授するが、酵素のプロセッシング性質を増強する能力を有する結合タンパク質のグループは特定の価値のものである。
【００３０】
理論によっては結合されないが、本発明の結合ドメインは典型的には、非常に遅い速度で二本鎖核酸から解離する。従って、それらは、酵素−核酸複合体を安定化することによって結合される修飾酵素のプロセッシング性及び/又は効率を高める。従って、本発明は、DNA−結合ドメインが、核酸の二本鎖コンホメーションを安定化し、そして二本鎖基質を必要とする触媒ドメインの効率を高めることができる発現を包含する。触媒性核酸修飾酵素の触媒及び/又はプロセッシング性質の改良性を容易に決定するための例及び単純なアッセイが本明細書に記載される。
【００３１】
触媒性核酸修飾ドメイン：
触媒性核酸修飾ドメインは、酵素機能を行う修飾酵素の領域である。本発明の触媒性核酸修飾ドメインは、プロセッシング性、例えばポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼ、等であるか、又は非プロセッシング性、例えばリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、等であり得る。
【００３２】
プロセッシング性は、単一の結合現象において複数の修飾、例えばヌクレオチド付加又はメチル化を合成するか又は行う核酸修飾酵素の能力に影響を及ぼす。本発明のプロセッシングタンパク質は、プロセッシング性修飾酵素（又は修飾酵素の酵素ドメイン）に結合される配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインの存在のために増強されたプロセッシング性を示し、それにより、核酸/酵素複合体を安定化するために結合ドメインを提供する。しばしば、結合ドメインは、熱安定性生物からであり、そしてより高い温度、例えば45℃以上の温度で増強された活性を提供する。プロセッシング修飾酵素の例は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、メチラーゼ、3’又は5’エキソヌクレアーゼ、ジャイレース及びトポイソメラーゼを包含する。
【００３３】
ポリメラーゼ：
DNAポリメラーゼは、当業者に良く知られている。それらは、DNA依存性ポリメラーゼ及びRNA依存性ポリメラーゼ、例えば逆転写酵素を包含する。少なくとも５種のファミリーのDNA依存性DNAポリメラーゼが知られているが、但しほとんどはファミリーA、B及びCに分類される。ほとんどのファミリーAのポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を包含する複数の酵素機能を含むことができる一本鎖タンパク質である。
【００３４】
ファミリーBのポリメラーゼは典型的には、ポリメラーゼ及び3’−5’エキソヌクレアーゼ活性、並びにアクセラリー因子を有する単一の触媒ドメインを有する。ファミリーCのポリメラーゼは典型的には、重合、及び3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する複数サブユニットのタンパク質である。E.コリにおいては、３種のタイプのDNAポリメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼI（ファミリーA）、II（ファミリーB）及びIII（ファミリーC）が見出されている。真核細胞においては、３種の異なったファミリーBのポリメラーゼ、すなわちDNAポリメラーゼα、δ及びεが核複製に関与し、そしてファミリーAのポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼγは、ミトコンドリアDNA複製のために使用される。他のタイプのDNAポリメラーゼは、ファージポリメラーゼを包含する。
【００３５】
同様に、RNAポリメラーゼは典型的には、真核RNAポリメラーゼI、II及びIII、及び細菌RNAポリメラーゼ、並びにファージ及びウィルスポリメラーゼを包含する。RNAポリメラーゼは、DNA依存性及びRNA依存性であり得る。
【００３６】
１つの態様においては、誤差補正を有するポリメラーゼは、本明細書に記載される改良されたポリメラーゼの触媒ドメインとして使用される。それらのポリメラーゼは、長い、すなわち5kb、しばしば10kb、又はそれ以上の長さのPCR生成物を得るために使用され得る。それらの改良されたポリメラーゼを用いての“長いPCR”は、従来技術の“長いPCR”ポリメラーゼ及び/又はポリメラーゼ混合物に比較して、減じられる延長時間を用いて行われ得る。1kb当たり30秒以下の延長時間、しばしば1kb当たり15秒が、改良されたポリメラーゼを用いてPCR反応において長い生成物を増幅するために使用され得る。さらに、それらの修飾されたポリメラーゼはまた、高められた感受性も示す。
【００３７】
従来技術の非誤差補正ポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼは、非常に低い入力コピー濃度、例えば極端には、1ml当たり10のコピーからDNAを増幅することができる。しかしながら、そのようなポリメラーゼの低い適合性のために、そのような増幅からクローン化された生成物は、導入された突然変異をたぶん含む。
【００３８】
従来の技術の誤差補正ポリメラーゼ、例えばTaqよりも高い適合性を有するPfuコピーDNAは、低入力コピー濃度からDNAを増幅することはできない。そのような失敗についての最も適切な説明は、それらの酵素の非常に低いプロセッシング性である。本発明のハイブリッド誤差補正ポリメラーゼは、誤差補正活性を保持しながら、より高いプロセッシング性を示し、そしてそれにより、増幅反応において感受性及び適合性の両者を提供する。
【００３９】
他の修飾酵素：
典型的には、DNAジャイレース及びトポイソメラーゼは、高次DNA構造、例えばスーパーコイル化において役割を演じる。DNAジャイレースは、負のスーパーコイルを導入する。原核生物においては、AサブユニットはDNA切断及び再結合を担当し、そしてBサブユニットはATP−加水分解性を含む。DNAジャイレースは、スーパーコイル化をプロセッシング的に及び触媒的に導入し、典型的には、DNAジャイレースの分子及び分当たり100までのスーパーコリルを導入する。ATPの不在下で、ジャイレースは負のスーパーコイルをゆっくり弛緩する。
【００４０】
トポイソメラーゼは、DNAの異なったトポロジカル異性体の相互転換を触媒し、それにより、結合数の変化を引き起こす、原核及び真核生物に見出される酵素である。トポイソメラーゼは、DNAから負又は正のスーパーコイルを除去することができ、又は負のスーパーコイルを導入することができる。
種々のメチラーゼ及び3’又は5’エキソヌクレアーゼ、例えば細菌、原核、真核及びファージ酵素はまた、当業界において記載されている。典型的には、エキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌクレアーゼ、及びいくつかのメチラーゼもまた、プロセッシング性である。
【００４１】
触媒サブユニットの活性は、当業者に良く知られているアッセイを用いて測定され得る。例えば、プロセッシング酵素活性、例えばポリメラーゼ活性は、反応、例えばポリメラーゼ鎖反応において合成される核酸の量を決定することによって測定され得る。酵素の相対的効率の決定においては、本発明の修飾酵素、例えば配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインを含むポリメラーゼにより得られる生成物の量が、下記及び例において、より詳細に記載されるであろう通常の修飾酵素により得られる生成物の量と比較され得る。
【００４２】
修飾酵素、例えばリガーゼ又は制限エンドヌクレアーゼは、修飾機能を行うために二本鎖核酸に結合する。触媒活性は典型的には、特定のアッセイ条件下で生成される修飾された生成物の量を決定することによって測定される。例えば、リガーゼ活性は、アリコート連結反応により得られる形質転換体の数を定量化することによって、インキュベーションに続く連結反応において適合できる末端を生成するために制限エンドヌクレアーゼにより前もって消化された、環化されたプラスミドの量を決定することによってアッセイされ得る。制限エンドヌクレアーゼの活性は、標的DNAの消化の程度をアッセイすることによって、例えばゲル上のDNAの消化の程度を分析することによって決定され得る。
【００４３】
本発明への使用のために適切な触媒修飾ドメインは、修飾酵素自体又は触媒修飾ドメイン、例えばTaqポリメラーゼ又はポリメラーゼ活性を有するTaqのドメインであり得る。触媒ドメインは、追加のアミノ酸を含むことができ、そして/又はアミノ酸置換、欠失又は付加を含むが、しかし酵素活性を保持する変異体であり得る。
【００４４】
配列−非特異的核酸結合ドメイン：
二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメインは、配列独立性態様で二本鎖核酸に結合するタンパク質又はタンパク質の定義された領域であり、すなわち結合は特定の配列のために著しい選択を示さない。典型的には、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸対一本鎖核酸に関して、10倍又はそれよりも高い親和性を示す。本発明の特定の態様における二本鎖核酸結合タンパク質は好ましくは、熱安定性である。そのようなタンパク質の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【００４５】
原始的な小塩基性DNA結合タンパク質Sac7d及びSso7d（例えば、Choliなど., Biochemicaet Biophysica Acta 950: 193-203, 1988; Baumann など., Structural Biol. 1: 808-819, 1994; 及びCaoなど., Nature Struct. Biol. 5: 782-786, 1998を参照のこと）、原始的HMf−様タンパク質（例えば、Strichなど., J. Molec. Biol. 255: 187-203, 1996; Sandman など., Gene 150: 207-208, 1994を参照のこと）、及びPCNA相同体（例えば、Cannなど., J. Bacteriology 181: 6591-6599, 1999; Shamoo and steitz, Cell: 99, 155-166, 1999; De Felice など., J. Molec. Biol. 291, 47-57, 1999; 及びZhangなど., Biochemistry 34: 10703-10712, 1995を参照のこと）。
【００４６】
Sso7d及びSac7d：
Sso7d及びSac7dは、それぞれ過好熱性アルキバクテリアのスルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）及びスルホロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）からの小さな（約7.000kdのMW）塩基性染色体タンパク質である。それらのタンパク質はリシンに富んでおり、そして高い熱、酸及び化学物質安定性を有する。それらは、配列独立的態様でDNAを結合し、そして結合される場合、同じ条件下で40℃までDNAのTMを高める（McAfeeなど., Biochemistry 34: 10063-10077, 1995）。それらのタンパク質及びそれらの相同体は典型的には、高温でのゲノムDNAの安定化に関与すると思われる。
【００４７】
HMf様タンパク質：
HMf様タンパク質は、真核H4ヒストンと、アミノ酸配列及び構造において相同性を共有する原始ヒストンである。HMfファミリーのタンパク質は溶液において安定したダイマーを形成し、そしていくつかのHMf相同体は熱安定性種（例えば、メタノサーマス・フェルビダス（Methanothermus fevidus）及びピロコーカス株GB−3a）から同定されている。HMfファミリーのタンパク質は、Taq DNAポリメラーゼ又は低い内因性プロセッシング性を有するいずれかのDNA修飾酵素に連結されると、DNA基質に沿っての酵素のスライドする能力を増強し、そして従ってそのプロセッシング性を高める。例えば、ダイマー性HMf様タンパク質は、例えば化学的修飾を通して、Taq DNAポリメラーゼのN末端に共有結合され得、そして従って、ポリメラーゼのプロセッシング性を改良する。
【００４８】
PCNA相同体：
すべてではないが、多くのファミリーBのDNAポリメラーゼは、プロセッシング性DNA合成を達成するためにアクセサリータンパク質と相互作用する。特に重要な種類のアクセサリータンパク質は、スライドするクランプとして言及される。いくつかの特徴化されたスライドするクランプは、溶液においてトリマーとして存在し、そして二本鎖DNAを収容することができる中心通路を有する環状構造を形成することができる。
【００４９】
スライド性クランプは、特定のDNAポリメラーゼのC末端に位置するアミノ酸との特定の相互作用を形成し、そして複製の間、DNA鋳型にそれらのポリメラーゼを結合する。真核生物におけるスライド性クランプは増殖性細胞核抗原（PCNA）として言及され、そして他のドメインにおける類似するタンパク質はしばしば、PCNA相同体として言及される。それらの相同体は著しい構造的類似性を有するが、しかし制限された配列類似性を有する。
【００５０】
最近、PCNA相同体は、好熱性古細菌（例えば、スルファロバス・ソファタリカス、ピロコーカス・フリオサス、等）から同定されている。古細菌におけるいくつかのファミリーBのポリメラーゼは、コンセンサスPCNA−相互作用アミノ酸配列を含むC末端を有し、そしてプロセッシング性因子としてPCNA相同体を用いることができる（例えば、Cannなど., J. Bacteriol. 181: 6591-6599, 1999及びDe Feliceなど., J. Mol. Biol. 291: 47-57, 1999を参照のこと）。それらのPCNA相同体は、本発明のための有用な配列−非特異的二本鎖DNA結合ドメインである。
【００５１】
例えば、コンセンサスPCNA−相互作用配列は、PCNA相同体と天然において相互作用しないポリメラーゼに結合され、それにより、ポリメラーゼのためのプロセッシング性因子としてのPCNA相同体の作用を可能にする。例示手段によれば、ピロコーカス・フリオサスPol II (２種のファミリーB様ポリペプチドを含むヘテロダイマーDNAポリメラーゼ)からのPCNA−相互作用配列は、ピロコーカス・フリオサスpol II（PCNA相同体と通常、相互作用しないモノマーファミリーBのポリメラーゼ）に共通結合され得る。次に、得られる融合タンパク質は、修飾されていないピロコーカス・フリオサスPol IIに関して高められたプロセッシング性を有する新規異種タンパク質を生成するために、ピロコーカス・フリオサスPCNA相同体との非共有結合を可能にされ得る。
【００５２】
他の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイン：
本発明への使用のために適切な追加の核酸結合ドメインは、既知の配列−非特異的二本鎖DNA結合タンパク質との相同性により及び/又は抗体交差反応性により同定され得るか、又は生化学的アッセイにより見出され得る。
相同性に基づいての核酸結合ドメインの同定：
【００５３】
典型的には、約25個のアミノ酸、任意には約50〜100個のアミノ酸又は完全なタンパク質の長さの比較窓にわたって、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質に対して、約50％のアミノ酸配列同一性、任意には、約60％、75％、80％、85％、90％又は95〜98％のアミノ酸配列同一性を有するドメインが、本発明において使用され得る。配列が比較され、そして比較窓、又は次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動的一列整列及び視覚的調査により測定されるような企画された領域にわたって最大の対応性について一列配列され得る。本発明のためには、％アミノ酸同一性は、BLASTのデフォールトパラメーターにより決定される。
【００５４】
配列比較のためには、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される対照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び対照配列がコンピューターに入力され、副配列座標が、必要により企画され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが企画される。デフォールトプログラムパラメーターが使用され、又は他のパラメーターが企画され得る。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、対照配列に対しての試験配列について％配列同一性を計算する。
【００５５】
“比較窓”とは、本明細書において使用される場合、配列が、２種の配列が最適に列挙整列された後、同じ数の連続位置の対照配列に比較される、200〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150から成る群から選択された連続位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を包含する。比較のための配列の一列整列方法は、当業界において良く知られている。
【００５６】
比較のための配列の最適一列整列は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局部相同アルゴリズムにより、Needleman ＆ Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) の相同一列整列アルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性方法についての調査により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI におけるGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）により、又は手動一列整列及び可視的調査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel など., eds. 1995 supplement)）により行われ得る。
【００５７】
有用なアルゴリズムの１つの例は、PILEUPである。PILEUPは、関係及び％配列同一性を示すために、前進性対−様一列整列を用いて、一群の関連する配列からの複数の配列整列を創造する。それはまた、一列整列を創造するために使用されるクラスター関係を示す樹状図又は系統樹をプロットする。PILEUPは、Feng & Dollittle, J. Mol. Evol. 36: 351-360 (1987) の前進性一列整列方法の単純化を用いる。使用される方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989) により記載される方法に類似する。
【００５８】
プログラムは、300までの配列（それぞれ、5,000個の最大長のヌクレオチド又はアミノ酸）を一列整列することができる。複数の一列整列方法は、一群の２種の一列整列された配列を生成する、２種の最も類似する配列の対−様一列整列により開始する。次に、この一群が次の最も関連する配列又は一列整列された配列の一群に対して一列整列される。２種の配列群が２種の個々の配列の対−様一列整列の単純な延長により一列整列される。最終一列整列は、一連の前進性対−様一列整列により達成される。
【００５９】
プログラムは、配列比較の領域についての特定の配列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を企画することによって、及びプログラムパラメーターを企画することによって実施される。PILEUPを用いて、対照配列が、次のパラメーターを用いて％配列同一性関係を決定するために他の試験配列に比較される：デフォールトギャップ重量（3.00）、デフォールトギャップ長重量（0.10）及び計量された末端ギャップ。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン7.0から得られる（Devereauxなど., Nuc. Acid Res. 12: 307-395 (1984).
【００６０】
％配列同一及び配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムのもう１つの例は、それぞれ、Altschulなど., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) 及びAltschulなど., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載される、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) を通して入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの陽性−値の限界評点Tと適合するか又はそれを満たす、問題の配列における長さWの短いワードを同定することによって、高い評点の配列対（HSP）を同定することを包含する。Tは、隣接ワード評点限界として言及される（Altschulなど., 前記）。
【００６１】
それらの初期隣接ワードヒットは、それらを含む長いHSPを見出すために調査を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累計整列評点が高められる限り、個々の配列にそって両方向に延長される。累計評点は、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターM（適合する残基の対についてのリワード評点；常に＞0）及びN（ミスマッチ残基についてのペナルティー評点；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累計評点を計算するために使用される。
【００６２】
個々の方向へのワードヒットの延長は、次の場合、停止される：累計整列評点が、達成される最大値から量X、低下する場合；累計評点が、１又は複数の負の評点残基整列の蓄積のために、ゼロ又はそれ以下になる場合；又はいずれかの配列の終結に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW， T及びXが、一列整列の感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、デフォールトとして、11のワードレングス（wordlength）(W), 10の期待値（E）、M＝5，N＝4，及び両鎖の比較を決定する。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムは、デフォールトとして、３のワードレングス及び10の期待値（E）を使用し、そしてBLOSUM62評点マトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989) を参照のこと）は、50の一列整列（B）、10の期待値（E）、M＝5，N＝4及び両鎖の比較を使用する。
【００６３】
BLASTアルゴリズムはまた、２種の配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karline Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) を参照のこと）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間での適合性が偶然に生じる確立の表示を提供する最少合計確立（P(N)）である。例えば、核酸は、対照核酸に対する試験核酸の比較における最少合計確立が約0.2以下、より好ましくは約0.01以下、及び最も好ましくは約0.001以下である場合、対照配列に類似すると思われる。
【００６４】
抗体への交差反応結合：
本発明への使用のための配列−特異的二本鎖核酸結合ドメインはまた、抗体、好ましくは既知の核酸結合ドメインに結合するポリクローナル抗体を用いて、交差反応性により同定され得る。ポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて生成される（例えば、Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane , Antibodies, A Laboratory Manual (1988) を参照のこと）。次に、免疫学的に交差反応性の結合タンパク質であるそれらのタンパク質は、種々のアッセイ方法により検出され得る。使用され得る種々の型及び条件の記載については、例えばMethods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Volume 37 (Asai, など., 1993), Colligan, 前記、及びHarlow & Lane, 前記を参照のこと。
【００６５】
有用なイムノアッセイ型は、サンプルタンパク質が固体支持体に固定されているアッセイを包含する。例えば、交差反応性結合タンパク質は、イムノブロット分析、例えばウェスターンブロットを用いて同定され得る。ウェスターンブロット技法は一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化されたナイロンフィルター）に移行し、そしてサンプルを、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに結合される抗体と共にインキュベートすることを含んで成る。
【００６６】
抗体は、固体支持体上の交差反応性ポリペプチドに対して特異的に結合する。抗体は、直接的にラベルされ得るか、又は他方では、続いて、抗結合ドメイン抗体に対して特異的に結合するラベルされた抗体（例えば、ラベルされた羊抗−マウス抗体）を用いて、検出され得る。他のイムノブロットアッセイ、例えば組換えタンパク質ライブラリーの分析はまた、本発明への使用のために適切なタンパク質の同定のためにも有用である。
【００６７】
企画されたイムノアッセイ条件下でのこの方法論を用いて、バックグラウンドの少なくとも２倍又はそれ以上、典型的にはバックグラウンドの10倍以上、特定の抗体に結合し、そしてサンプルに存在する有意な量の他のタンパク質に実質的ン結合しない免疫学的交差反応性タンパク質が同定され得る。
【００６８】
競争結合型におけるイムノアッセイはまた、交差反応決定のためにも使用され得る。例えば、ポリクローナル抗血清は、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインタンパク質、例えばピロコーカス・フリオサス（Pfu）PCNAに生成される。次に、標的抗原が固体支持体に固定され得る。マイナーな交差反応性を有する非標的抗原（それらが存在するなら）は、血清の選択性を改良するためにアッセイに添加され得る。
【００６９】
固定されたタンパク質への抗血清の結合について競争する前記添加されたタンパク質の能力が、それ自体と競争する結合ドメインタンパク質、この例においてはPfu PCNAの能力と比較される。上記タンパク質についての％交差反応性は、標準の計算を用いて計算される。添加されたタンパク質との10％以下の交差反応性を有するそれらの抗血清が選択され、そしてプールされる。非標的抗原に対する交差反応性抗体は、非標的抗原による免疫吸収により、プールされた抗血清から除去される。本発明の特定の核酸結合ドメインに対して特異的に結合する抗体がまた、この方法論を用いて製造され得る。
【００７０】
次に、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清が、既知の結合ドメインのたぶん対立遺伝子、多形変異体又は相同体、例えばもう1つのピロコーカス.,spであると思われる第２タンパク質を、免疫原タンパク質に比較するために、上記のような競争結合イムノアッセイに使用される。この比較を行うためには、２種のタンパク質が広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質への抗血清の結合を50％阻害するために必要とされる個々のタンパク質の量が決定される。結合の50％を阻害するのに必要とされる核酸結合ドメインの量が、結合の50％を阻害するのに必要とされる、第２タンパク質の量の10倍以下である場合、前記第２タンパク質は、核酸結合ドメインに対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合すると言われる。
【００７１】
配列−非特異的二本鎖核酸結合活性についてのアッセイ：
配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインの活性は、種々のアッセイを用いて評価され得る。適切な結合ドメインは、二本鎖核酸対一本鎖核酸について著しい性能を示す。
【００７２】
二本鎖核酸に結合するための特異性は、当業者に知られている種々のアッセイを用いて試験され得る。それらは、フィルター結合アッセイ又はゲル−シフトアッセイのようなアッセイを包含する。例えば、フィルター結合アッセイにおいては、二本鎖DNAへの結合活性について評価されるポリペプチドが、適切な緩衝液において、二本鎖又は一本鎖の放射性ラベルされたDNAと共にプレ−混合される。混合物が、タンパク質及びタンパク質−DNA複合体を保持する膜（例えば、ニトロセルロース）を通して濾過される。フィルター上に保持されるDNAの量は、タンパク質に結合される量の表示である。
【００７３】
結合は、ラベルされたDNAの結合がラベルされていない上昇する量のDNAの添加により競争される競争分析により定量化される。一本鎖DNAよりも10倍又はそれ以上の親和性で二本鎖DNAを結合するポリペプチドは、二本鎖DNA結合タンパク質として本明細書において定義される。他方では、結合活性は、放射性ラベルされたDNAが試験ポリペプチドと共にインキュベートされるゲルシフトアッセイにより評価され得る。タンパク質−DNA複合体は、結合されていないDNAよりもゲルを通してゆっくりと移動し、シフトされたバンドをもたらす。結合の量は、上昇する量の二本鎖又は一本鎖のラベルされていないDNAと共にサンプルをインキュベートし、そしてシフトされたバンドにおける放射能の量を定量化することによって評価される。
【００７４】
本発明への使用のために適切な結合ドメインは、配列独立的態様で二本鎖核酸に結合し、すなわち本発明の結合ドメインは、有意な親和性を伴なって二本鎖核酸を結合するが、しかし同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配列を有するもう１つの核酸よりも100倍以上の親和性を伴なってドメインに結合する既知の核酸は存在しない。非特異的結合は、二本鎖対一本鎖核酸結合を決定するために記載される方法論に類似する方法論を用いてアッセイされ得る。フィルター結合アッセイ又はゲル移動シフトアッセイは、結合の特異性を決定するために、同じヌクレオチド組成であるが、しかし異なった核酸配列である競争DNAを用いて、上記のようにして行われ得る。
【００７５】
本発明への使用のための配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインはまた、例えば修飾酵素のプロセッシング性又は効率を高めるために、又は少なくとも１℃、核酸重複体の安定性を高めるために、二本鎖結合ドメインの能力をアッセイすることによって、評価され得る。それらの技法は、核酸修飾酵素の増強された効率についての分析を記載する下記セクションに論じられている。
【００７６】
本発明の結合ドメインはまた、二本鎖核酸コンホメーションを安定化するそのようなドメインの能力の直接的な評価により同定され得る。例えば、プライマー鋳型構造体の溶融曲線が、260nmでDNAのUV吸光度をモニターすることによって、タンパク質の存在又は不在下で得られる。二本鎖基質のTMは、その溶融曲線の中点から決定され得る。次に、TMに対する配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質の効果が、修飾されていない酵素の存在下でのTMと修飾された酵素の存在下で得られたTMとを比較することによって決定され得る。（タンパク質は、それがDNAよりも260nmでより低い消衰係数を有するので、UV吸光度に有意に寄与しない）。次に、TMを1°、しばしば5°、10°又はそれ以上、高めるドメインが、本発明への使用のために選択され得る。
【００７７】
本発明の新規配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質はまた、それらのDNA結合活性を利用することにより、例えばDNA−セルロースカラム上での精製により単離され得る。次に単離されたタンパク質はさらに、従来の手段により精製され、配列決定され、そして遺伝子がPCRを通して従来の手段によりクローン化され得る。次に、それらのクローンから過剰発現されるタンパク質が、上記手段のいずれかにより試験され得る。
【００７８】
核酸結合ドメインと触媒性ドメインとの結合：
触媒性ドメイン及び二本鎖核酸結合ドメインは、当業者に良く知られている方法により連結され得る。それらの方法は、化学的及び組換え手段を包含する。
異種ドメインを連結する化学的手段は、例えばBioconjugate Techniques, Hermanson, Ed., Academic Press (1996) に記載されている。それらは、例えばタンパク質化学の業界において良く知られている方法により、直接的に又は連結化合物を通して、成分をお互い連結するための誘導体化を包含する。例えば、１つの化学的接合態様においては、触媒性ドメイン及び核酸結合ドメインを連結する手段は、２種の成分の分子間ジスルフィド結合の形成に究極的に寄与する異種二官能価カップリング試薬を含んで成る。
【００７９】
本発明のためのこの能力において有用である他のタイプのカップリング試薬は、例えばアメリカ特許第4,545,985号に記載されている。他方では、分子間ジスルフィドは、天然において存在するか、又は遺伝子工学により挿入される、個々の成分におけるシステム間に便利には形成され得る。成分を連結する手段はまた、異種二官能価架橋試薬又は特定の低pH分解性架橋剤又は特定のプロテアーゼ分解性リンカー間のチオエーテル連鎖、又は他の分解性又は非分解性化学連鎖を用いることができる。
【００８０】
タンパク質の異種ドメインを連結する手段はまた、標準のペプチド合成化学又は組換え手段により別々に合成される成分間で形成されるペプチジル結合を含んで成ることができる。タンパク質自体はまた、完全に又は一部、アミノ酸配列を合成するために化学的方法を用いて生成され得る。例えば、ペプチドは、固相技法、例えばアミノ酸が成長するアミノ酸鎖に連続的に付加されるMerrifield固相合成方法により合成され得る（Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2146を参照のこと）。
【００８１】
ポリペプチドの自動合成のための装置は、PE Corp. (Foster City, CA) から市販され、そして一般的に、その製造業者の説明書に従って操作され得る。次に、合成されたペプチドは樹脂から分解され、そして例えば分離用高性能液体クロマトグラフィーにより精製され得る（Creighton, Proteins Structures and molecular Principles, 50-60 (1983)を参照のこと）。合成ポリペプチド又はポリペプチドのサブフラグメントの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確かめられ得る（例えば、エドマン分解方法；Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, pp. 34-49 (1983) を参照のこと）。
【００８２】
さらに、非従来のアミノ酸又は化学的アミノ酸類似体は、置換又は付加として配列中に導入され得る。非従来のアミノ酸は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：通常のアミノ酸のD−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Abu, ２−アミノ酪酸、γ−Abu、ε−Ahx、６−アミノヘキサノン酸、Aib、２−アミノイソ酪酸、３−アミノピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、Na−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体。さらに、アミノ酸は、D（右旋性）又はL（左旋性）であり得る。
【００８３】
もう1つの態様においては、本発明のタンパク質のドメイン、例えばSso7d及びTaqポリメラーゼは、連続基を通して結合される。連結基は、化学的交差剤、例えばスクシンイミジル−（N−アレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）であり得る。連結基はまた、追加のアミノ酸配列、例えばポリアラニン、ポリグリシン又は同様の連結基であり得る。
【００８４】
特定の態様においては、融合タンパク質における個々のポリペプチドのコード配列は、ペプチド結合を通して、いずれかの順序で、それらのアミノ−又はカルボキシ−末端で直接的に連結される。他方では、アミノ酸リンカー配列は、個々のポリペプチドがその二次及び三次構造に折りたたむことを確保するのに十分な距離、第１及び第２ポリペプチド成分を分離するために使用され得る。そのようなアミノ酸リンカー配列は、当業界において良く知られている標準技法を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。
【００８５】
適切なペプチドリンカー配列は、次の要因に基づいて選択され得る：（１）柔軟な延長されたコンホメーションを採用するそれらの能力；（２）第１及び第２ポリペプチド上の機能的エピトープと相互反応する二次構造を採用するそれらの無能性；及びポリペプチド官能エピトープと反応する疎水性又は電荷された残基の欠失。典型的なペプチドリンカー配列は、Gly、Val及びThr残基を含む。他の近い天然のアミノ酸、例えばSer及びAlaがまた、リンカー配列に使用され得る。
【００８６】
リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列は、Marateaなど. (1985) Gene 40: 39-46; Murphyなど. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262; アメリカ特許第4,935,233号及び第4,751,180号に開示されるそれらを包含する。リンカー配列は、一般的に１〜約50個の長さのアミノ酸、例えば３，４，６又は10個の長さのアミノ酸であるが、しかし100又は200個の長さのアミノ酸でもあり得る。リンカー配列は、第１及び第２ポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、そして立体的障害を妨げるために使用され得る非必須N−末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされ得ない。
【００８７】
他の化学的リンカーは、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばPEG、等を包含する。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから入手できる。それらのリンカーは任意には、アミド結合、スルフィドリル結合又は異種官能結合を有する。
【００８８】
ドメインを連結する他の方法は、負及び正の末端を発現することによるイオン結合、及び抗体及びストレプタビジン−ビオチン相互作用を通しての間接的結合を包含する（例えば、Bioconjugate Techniques, 前記を参照のこと）。ドメインはまた、中間体相互作用配列を通して一緒に連結され得る。例えば、コンセンサスPCNA−相互作用配列は、PCNA相同体と天然において相互作用しないポリメラーゼに連結され得る。次に、得られる融合タンパク質は、高められたプロセッシング性を有する新規の異種タンパク質を生成するために、PCNA相同体との非共有結合を可能にされ得る。
【００８９】
組換え技法を用いての融合タンパク質の生成：
1つの態様においては、本発明のタンパク質は、当業界に良く知られている、前記タンパク質をコードする核酸の組換え発現により生成される。そのような融合生成物は、正しいコード枠において、当業界において知られている方法により、所望するアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列をお互い連結し、そして当業界において知られている方法により生成物を発現することによって製造され得る。
【００９０】
本発明の融合タンパク質中に導入されるドメインをコードする核酸は、組換え遺伝学の分野における通常の技法を用いて得られる。本発明への使用のための一般的方法を開示する基本テキストは、Sambrookなど., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel など., eds., 1994) を包含する。
【００９１】
しばしば、触媒又は核酸結合ドメインをコードする核酸配列又は関連する核酸配列相同体は、プローブとのハイブリダイゼーションによりcDNA及びゲノムDNAライブラリーからクローン化されるか、又はオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅技法を用いて単離される。増幅技法は、DNA又はRNAからの配列を増幅し、そして単離するために使用され得る（例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995) を参照のこと）。他方では、オーバーラップするオリゴヌクレオチドが合成的に生成され、そして１又は複数のドメインを生成するために連結され得る。触媒又は二本鎖核酸結合ドメインをコードする核酸はまた、プローブとして抗体を用いて、発現ライブラリーから単離され得る。
【００９２】
PCRを用いて、触媒性又は核酸結合ドメインをコードする核酸を得るための例においては、核酸配列又は副配列が、１つの制限部位を含むセンスプライマー及びもう１つの制限部位を含むアンチセンスプライマーを用いて、PCR増幅される。これは、所望するドメイン配列又は副配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を生成するであろう。次に、この核酸は、第２ドメインをコードする核酸を含み、そして適切な対応する制限部位を有するベクター中に容易に連結され得る。
【００９３】
ドメインは直接的に連結され得るか、又はリンカー、又は他のタンパク質配列により分離され得る。適切なPCRプライマーは、GenBank又は他の源から提供される配列情報を用いて、当業者により決定され得る。適切な制限部位はまた、特定部位の突然変異誘発により、タンパク質又はタンパク質副配列をコードする核酸に付加され得る。ドメイン−コードのヌクレオチド配列又は副配列を含むプラスミドは適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断され、そして次に、標準方法に従って増幅及び/又は発現のための適切なベクター中に連結される。
【００９４】
インビトロ増幅方法を通して当業者を方向づける十分な技法の例は次の文献に見出される：Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis など., (1987) アメリカ特許第4,683,292号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis など., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh. など. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell など. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren など., (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; 及びBarringerなど. (1990) Gene 89: 117。
【００９５】
特定の核酸から発現されるポリペプチドの他の物性が、適切な核酸を同定するためのもう１つの方法を提供するために、既知の配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質又は核酸修飾酵素触媒ドメインの性質に比較され得る。
【００９６】
いくつかの態様においては、組換え融合タンパク質の触媒及び/又は核酸結合領域をコードするポリペプチドを修飾することが所望される。当業者は、所定の核酸構造体における変更を生成する多くの手段を認識するであろう。そのような良く知られている方法は、特定部位の突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを用いてのPCR増幅、突然変異誘発剤又は放射線への核酸を含む細胞の暴露、所望するオリゴヌクレオチドの化学的合成（例えば、大きな核酸を生成するために連結及び/又はクローニングに関して）及び他の良く知られている技法を包含する。例えば、Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97; Robertsなど. (1987) Nature 238: 732-734を参照のこと。
【００９７】
例えば、触媒及び/又は核酸結合ドメインは、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、２種のドメインの連結を促進するよう修飾され得る。そのような方法により修飾される触媒ドメイン及び結合ドメインはまた、本発明の一部である。例えば、システム残基のためのコドンは、ドメインのいずれかの末端で配置され、その結果、前記ドメインは例えば、スルフィド結合により連結され得る。増幅は、組換え又は化学的方法のいずれかを用いて行われ得る（例えば、Pierce Chemical Co. カタログ、Rockford ILを参照のこと）。
【００９８】
組換え融合タンパク質の触媒及び結合ドメインはしばしば、リンカードメイン、通常、約200個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、１〜100個のアミノ酸が典型であるポリペプチド配列、例えば上記のそれらのものにより連結される。いくつかの態様においては、プロリン残基が、リンカーによる有意な二次構造要素の形成を妨げるためにリンカー中に導入される。リンカーはしばしば、組換え融合タンパク質の一部として合成される柔軟アミノ酸副配列であり得る。そのような柔軟リンカーは、当業者に知られている。
【００９９】
いくつかの態様においては、本発明のタンパク質をコードする組換え核酸は、選択された生物（例えば、酵母；好ましいコドンが酵母における発現のためのコードを核酸中に置換される）において核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するよう修飾される。
【０１００】
融合ポリペプチドを発現するための発現カセット及び宿主細胞：
当業者に良く知られている、融合ポリペプチドを生成するための多くの発現システムが存在する（例えば、Gene Expression Systems, Fernandex and Hoeffler, Eds, Academic Press, 1999を参照のこと）。典型的には、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望する宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に配置される。典型的な広範囲の種類のプロモーターが入手でき、そして特定の用途に依存して、本発明の発現ベクターに使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性的であるべきである細胞に依存する。他の発現制御配列、例えばリボソーム結合部位、転写終結部位及び同様のものがまた、任意には包含される。１又は複数のそれらの制御配列を含む構造体は、“発現カセット”と呼ばれる。従って、連結されたポリペプチドをコードする核酸は、所望する宿主細胞において高レベル発現のために組み込まれる。
【０１０１】
特定宿主細胞への使用のために適切である発現制御配列はしばしば、その細胞のおいて発現される遺伝子をクローニングすることによって得られる。リボソーム結合部位配列にそって、任意には、オペレーターと共に、転写開始のためのプロモーターを包含するよう本明細書において定義される、通常使用される原核制御配列は、通常使用されるプロモーター、例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（lac）プロモーターシステム（Changeなど., Nature (1979) 198: 1056）、トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddelなど., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057）, tacプロモーター（DeBoer、など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21-25）、及びλ−由来のPLプロモーター及びN−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeなど., Nature (1981) 292:128）を包含する。
【０１０２】
特定のプロモーターシステムは本発明に対して決定的ではなく、原核生物において機能するいずれかの入手できるプロモーターが使用され得る。標準の細菌発生ベクターは、プラスミド、例えばpBR322に基づくプラスミド、例えばpBLUESCRIPTTM, pSKF, pET23D, λ−ファージ由来のベクター及び融合発現システム、例えばGST及びLacZを包含する。エピトープ標識、例えばc-myc, HA−標識、６−His（配列番号30）標識、マルトース結合タンパク質、VSV−G標識、抗−DYKDDDDK（配列番号31）標識、又はその多数が当業者に良く知られているいずれかのそのような標識は、便利な単離方法を提供するために組換えタンパク質に付加され得る。
【０１０３】
E．コリ以外の原核細胞における融合ポリペプチドの発現のためには、特定の原核種において機能するプロモーターが必要とされる。そのようなプロモーターは、前記種からクローン化されている遺伝子から得られるか、又は異種プロモーターが使用され得る。例えば、ハイブリッドtrp−lacプロモーターは、E．コリの他にバチルスにおいて機能する。それらの及び他の適切な細菌プロモーターは当業界によく知られており、そして例えば、Sambrookなど. 及びAusubelなどに記載されている。本発明のタンパク質を発現するための細菌発現システムは、E．コリ、バチルスsp., 及びサルモネラにおいて利用できる（Palvaなど., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbachなど., Nature 302: 543-545 (1983)）。そのような発現システムのためのキットは市販されている。
【０１０４】
哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現システムは、当業界において良く知られており、そしてまた、市販されている。酵母においては、ベクターは、酵母組み込みプラスミド（たとえば、YIp 5）及び酵母複製プラスミド（YRpシリーズプラスミド）並びにpGPD−２を包含する。真核ウィルスからの調節要素を含む発現ベクターは典型的には、真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、乳頭腫ウィルスベクター、及びEpstein−Barrウィルスに由来するベクターにおいて使用される。
【０１０５】
他の典型的な真核ベクターは、pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, バキュロウィルスpDSVE, 及びCMVプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウィルスプロモーター、Rous肉腫ウィルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの指図下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターを包含する。
【０１０６】
構成的又は調節されたプロモーターは、本発明において使用され得る。調節されたプロモーターは、その宿主細胞が、融合ポリペプチドの発現が誘発される前、高い密度に増殖され得るので、好都合である。異種タンパク質の高レベル発現は、いくつかの情況下での細胞増殖を遅延する。誘発性プロモーターは、発現のレベルが環境又は成長因子、例えば温度、pH、嫌気性又は好気性条件、光、転写因子及び化学物質により変更できる遺伝子の発現を方向づけるプロモーターである。
【０１０７】
E．コリ及び他の細菌宿主細胞に関しては、誘発性プロモーターは、当業者に知られている。それらは、例えばlacプロモーター、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp−lacプロモーター（Amannなど. (1983) Gene 25: 167; de Boer など. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21）、及びバクテリオファージT7プロモーター（Studierなど. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor など. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1074-8）を包含する。それらのプロモーター及びそれらの使用は、Sambrookなど., 前記に論じられている。
【０１０８】
他の生物のための誘発性プロモーターもまた、当業者に良く知れている。それらは、例えばメタロチオネインプロモーター、熱ショックタンパク質、及び多くの他のものを包含する。
【０１０９】
翻訳カップリングは、発現を増強するために使用され得る。その方法は、プロモーターの下流に配置される、翻訳システムからの高く発現された遺伝子に由来する短い上流の読み取り枠、及びリボソーム結合部位、続いて少数のアミノ酸コドン、その後終結コドンを用いる。終結コドンの直前に、第２のリボソーム結合部位が存在し、そして終結コドンに続いて、翻訳の開始のための開始コドンが存在する。そのシステムはRNAにおける二次構造体を分解し、翻訳の効果的な開始を可能にする。Squiresなど. (1988) J. Biol. Chem. 263: 16297-16302を参照のこと。
【０１１０】
ポリヌクレオチド構造体の構成は一般的に、細菌において複製できるベクターの使用を必要とする。そのようなベクターは通常、当業界において使用される。多数のキットが、細菌からのプラスミドの精製のために市販されている（例えば、Pharmacia BiotechからのEasyPrepJ, Flexi PrepJ; StratageneからのStrataCleanJ; 及びQIAexpress Expression System, Qiagen）。次に、単離され、そして精製されたプラスミドがさらに、他のプラスミドを生成するあめに操作され、そして形質転換するために使用され得る。
【０１１１】
融合ポリペプチドは細胞内で発現され得、又は細胞から分泌され得る。細胞内発現はしばしば、高い収率をもたらす。必要なら、可溶性活性融合ポリペプチドの量は、再折りたたみ方法を行うことによって高められ得る（例えば、Sambrookなど., Bio/Technology (1985) 3: 151を参照のこと）。本発明の融合ポリペプチドは、種々の宿主細胞、例えばE．コリ、他の細胞宿主、酵母、及び種々の高等真核細胞、例えばCOS, CHO及びHeLa細胞系及び骨髄腫細胞系において発現され得る。宿主細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞又は微生物、例えば酵母細胞、細菌細胞又は菌類細胞であり得る。
【０１１２】
発現されると、組換え融合ポリペプチドは、標準の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び同様のものに従って精製され得る（一般的には、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY (1990) を参照のこと）。少なくとも約90〜95％の均質性の実質的に純粋な組織物が好ましく、そして98〜99％又はそれ以上の均質性が最も好ましい。所望のように部分的に又は均質的に精製されると、そのポリペプチドが使用され得る（例えば、抗体生成のための免疫原として）。
【０１１３】
本発明の融合ポリペプチドの精製を促進するためには、その融合ポリペプチドをコードする核酸はまた、親和性結合試薬が利用できる、エピトープ又は“標識”のためのコード配列を含むことができる。適切なエピトープの例は、myc及びV-5レポーター遺伝子を包含し；それらのエピトープを有する融合ポリペプチドの組換え生成のために有用な発現ベクターは市販されている（例えば、Invitrogen (Corlsbad CA) ベクターpcDNA3.1/Myc-His及びpcDNA3.1/V5-Hisが哺乳類細胞における発現のための適切である）。本発明の融合タンパク質に標識を結合するために適切な追加の発現ベクター及び対応する検出システムは、当業者に知られており、そしてそのいくつかは市販されている（例えば、FLAG (Kodak, Rochester MY)。
【０１１４】
適切な標識のもう1つの例は、金属キレート親和性リガンドに結合できるポリヒスチジン配列である。典型的には、６個の隣接するヒスチジンが使用され得るが、６個よりも多いか又は少ないヒスチジンも使用できる。ポリヒスチジン標識のための結合成分として作用することができる適切な金属キレート親和性リガンドは、ニトリロ−トリ−酢酸（NTA）を包含する（Hochuli, E. (1990) “Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents” In Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen (Santa Clarita, CA) から市販されている）。
【０１１５】
当業者は、修飾がそれらの生物学的活性を低めないで、触媒及び配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに対して行われ得ることを認識する。いくらかの修飾が、クローニング、発現又は融合タンパク質中へのドメインの組み込みを促進するために行われ得る。そのような修飾は、当業者によく知られており、そして例えば、開始部位、又は便利に位置する制御部位又は終結コドン又は精製配列を創造するために、いずれかの末端上に配置される追加のアミノ酸（例えば、ポリHis）を供給するためにアミノ酸末端で付加されるメチオニンを供給するために結合ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端でのコドンの付加を包含する。
【０１１６】
触媒ドメインについての改良された活性を決定するためのアッセイ：
触媒ドメインの活性は、単独でのタンパク質に比較して、結合ドメインに連結される修飾タンパク質のプロセッシング性又は修飾活性を比較するために使用され得る種々のアッセイを用いて測定され得る。活性の改良性は、高められたプロセッシング性及び高められた効率の両者を包含する。
プロセッシング修飾酵素の改良された活性：
ポリメラーゼプロセッシング性は、当業者に知られている種々の方法により測定され得る。ポリメラーゼプロセッシング性は一般的に、プライムされた鋳型への修飾酵素の１回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数として定義される。
【０１１７】
例えば、5’FAM−ラベルされたプライマーは、プライムされた鋳型を形成するために環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングされる。プロセッシング性の測定の場合、プライムされた鋳型は通常、アッセイされるべき酵素又は触媒ドメインに対して有意なモル過剰で存在し、その結果、ポリメラーゼによる１回以上、延長されるいずれかのプライムされた鋳型の機会が最少にされる。従って、プライムされた鋳型は、緩衝液及びdNTPの不在下で、一定の比、例えば約4000：１（プライムされたDNA：DNAポリメラーゼ）でアッセイされるポリメラーゼ触媒ドメインと共に混合される。
【０１１８】
MgCl2が、DNA合成を開始するために添加される。サンプルが、開始の後、種々の時間で急冷され、そして配列決定ゲル上で分析される。生成物のメジアン長は時間又はポリメラーゼ濃度と共に変化しないポリメラーゼ濃度で、その長さは酵素のプロセッシング性に対応する。本発明のタンパク質、すなわちプロセッシング核酸修飾酵素、例えばポリメラーゼの触媒ドメインに融合される配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインを含むタンパク質のプロセッシング性が、結合ドメインを有さない酵素のプロセッシング性に比較される。
【０１１９】
増強された効率がまた、生成物を生成する酵素の高められた能力を測定することによって示され得る。そのような分析は、反応において得られる生成物の量を決定することによって間接的に、二本鎖核酸複合体の安定性を測定する。例えば、PCRアッセイは、高温、例えば50℃でアニーリングされた、短い、例えば12個の長さのヌクレオチドのプライマーにより得られたPCR生成物の量を測定するために使用され得る。このアッセイにおいては、増強された効率は、Taqポリメラーゼよりも本発明の配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメイン、例えばSso7dに連結される場合、50℃でアニーリングされた、12個のヌクレオチドのプライマーを用いて、PCR反応においてより生成物を生成するポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼの能力により示される。対照的に、一連の荷電された残基、例えばリシンである結合路は、ポリメラーゼに連結される場合、プロセッシング性を増強しない。
【０１２０】
類似するアッセイ条件は、触媒ドメインが逆転写酵素、メチラーゼ、ジャイレース、トポイソメラーゼ又はエキソヌクレアーゼである場合、改良されたプロセッシング性について試験するために使用され得る。それらの分析においては、プロセッシング性は、鋳型又は基質に結合されたまま存続し、そして複数の修飾反応を行う酵素の能力として測定される。核酸：酵素のモル比は、平均して、１つの酵素分子のみが基質核酸当たり結合されるよう十分に高い。例えば、プロセッシングエキソヌクレアーゼ、すなわちλエキソヌクレアーゼの活性は、公開された方法を用いてアッセイされ得る（例えば、Mitsis and Kwagh, Nucleic Acid Research, 27: 3057-3063, 1999を参照のこと）。
【０１２１】
手短には、長いDNA基質（0.5〜20kb）は、前方向プライマーとしてビオチニル化されたプライマーを、及び逆方向プライマーとして5’リン酸化されたプライマーを用いて、DNA鋳型から増幅され得る。放射性ラベルされたdATPは、λエキソヌクレアーゼのための基質として作用するPCRフラグメントを内部的にラベルするために使用される。精製された内部的にラベルされた基質は、平均して、１つのエキソヌクレアーゼ分子のみが基質DNA当たりに結合されることを確保するために、DNA：酵素の十分に高いモル比で酵素と共に混合される。サンプルのアリコートが時間と共に除かれ、そしてゲル電気泳動により、又は酸可溶性放射性ラベルの形成をモニターすることによってアッセイされ得る。
【０１２２】
非プロセッシング修飾酵素の増強された活性：
非プロセッシングDNA修飾酵素の触媒ドメイン又は酵素自体はまた、本発明に使用され得る。そのような修飾酵素の例は、リガーゼ及び制限エンドヌクレオチドを包含する。しばしば、触媒ドメインは、熱安定性サーマス又はピロコーカス種から得られる。改良された活性を決定するためには、酵素機能は、種々の条件、しばしば高められた反応温度、例えば45℃又はそれ以上で分析され得、そして修飾されていない酵素活性に比較される。
【０１２３】
例えば、Tgq DNAリガーゼは、相補的標的DNAに対してハイブリダイズされる２種の隣接するオリゴヌクレオチドの並置された5’リン酸末端と3’ヒドロキシル末端との間でのホスホジエステル結合の形成を触媒する。酵素は45℃〜65℃で活性的である。連結された生成物の収率は、DNAの相補的鎖が酵素のための基質を形成するためにいかに効率良くアニーリングされるかに依存する。本発明の結合ドメイン、例えばSso7d−様タンパク質はリガーゼに結合される場合、その溶融温度を高めることによってDNA重複体を安定化することができ、その結果、高められた反応温度が、塩基対合相互作用を妨げないで、酵素の活性を最大にするために使用され得る。
【０１２４】
リガーゼの活性に対するSso7d融合の効果は、修飾された酵素と修飾されていない酵素との連結効率を比較することによって分析され得る。２種のDNAフラグメントの連結効率は、アガロースゲル電気泳動によりモニターされ、そして線状化されたプラスミドの環状プラスミドへの転換の連結効率は、DNA形質転換によりモニターされ得る。
【０１２５】
もう１つの例においては、改良された活性を有する核酸修飾酵素の触媒ドメインは、最適な活性を達成するために高められた反応温度を必要とする好熱性種から単離される制限酵素からであり得る。例えば、制限酵素認識部位がDNAフラグメントの末端に非常に接近して又は重複オリゴヌクレオチドに位置する場合、より高い温度が重複構造体を不安定化することができる。より高い反応温度、例えば45℃又はそれ以上で、本発明の結合ドメイン、例えば制限エンドヌクレアーゼに連結されるSso7d−様タンパク質の存在のために、改良された活性を有する制限酵素は、制限酵素単独よりも、高い量の生成物、すなわち消化されたDNAを生成することができる。特定の反応からの生成物の収率は、ゲル上での可視化により、又は形質転換効率により評価され得る。
【０１２６】
本発明の改良された核酸修飾酵素の高められた効率を評価する他の方法は、所定の修飾酵素の酵素活性の標準アッセイを用いて、当業者により決定され得る。従って、プロセッシング性修飾酵素、例えば逆転写酵素、メチラーゼ、ジャイレース、及びトポイソメラーゼ、並びに他の非プロセッシング性修飾酵素は、配列−非特異的二本鎖核酸結合ドメインに連結されるタンパク質、又は触媒ドメイン、及びタンパク質自体の活性を比較することによって同様にして分析され得る。
【０１２７】
本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が特異的に及び個々に、引用により組み込まれることを示されたかのように、引用により本明細書に込みこまれる。
前述の発明はより明白な理解のために、例示的及び例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【０１２８】
実施例
次の例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。当業者は、実質的に類似する結果を生成するために変更されるか又は修飾され得る種々の非決定的パラメーターを容易に認識するであろう。
【０１２９】
例１．融合タンパク質の構成：
Sso7d−ΔTaq融合体の構成：
次の例は、増強されたプロセッシング性を有するポリメラーゼタンパク質の構成を例示し、ここで配列−非特異的二本鎖核酸結合タンパク質Sso7dは、289個のアミノ酸（ΔTaq）によりN末端で欠失されているサーマス・アクアチカスPol DNAポリメラーゼ（TaqDNAポリメラーゼとして知られているファミリーAポリメラーゼ）に融合されている。
【０１３０】
Sso7dの公開されたアミノ酸配列に基づいて、７種のオリゴヌクレオチドを、Ssco7dをコードする合成遺伝子を構成することに使用した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてT4 DNAリガーゼを用いて連結した。最終の連結された生成物を、十分な長さの遺伝子を増幅するためにプライマーとして２種の末端オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応において鋳型として使用した。企画によれば、得られるPCRフラグメントは、5’末端でユニークEcoRI部位及び3’末端でユニークBstXI部位を含む。Sso7dタンパク質のコードの他に、上記PCRフラグメントはまた、Sso7dタンパク質はまた、Sso7dタンパク質のC末端で位置するGly−Gly−Val−Thr（配列番号32）のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。Sso7dの合成遺伝子は、配列番号１に示されるDNA配列を有し、そしてそれは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１３１】
次に、Sso7dをコードする合成遺伝子を用いて、Sso7dがTaqの最初の289個のアミノ酸を置換している融合タンパク質を生成した。Sso7dをコードするフラグメントを、Taqポリメラーゼをコードするプラスミド中にサブクローン化し、次の通りに融合タンパク質を生成した。手短には、合成Sso7d遺伝子を含むDNAフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBstXIにより消化し、そしてTaqをコードするプラスミドのその対応する部位中に連結した。結果として、Taqの最初の289個のアミノ酸をコードする領域を、Sso7dの合成遺伝子により置換する。このプラスミド（pYW1）は、Gly−Gly−Val−Thr（配列番号32）から構成される合成リンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSso7dを含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。融合タンパク質（Sso7d−ΔTaq）をコードするDNA配列及びそのタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４に示されている。
【０１３２】
Sso7d−Taq融合体の構成：
Sso7d/十分な長さのTaq融合タンパク質をまた構成した。手短には、Taqポリメラーゼの最初の336個のアミノ酸をコードする1kbのPCRフラグメントを、２種のプライマーを用いて生成した。5’プライマーは、SpeI部位をPCRフラグメントの5’末端中に導入し、そして3’プライマーはTaq遺伝子のヌクレオチド1008−1026にハイブリダイズする。フラグメントをSpeI及びBstXIにより消化し、Taqポリメラーゼの最初の289個のアミノ酸をコードする0.9kbのフラグメントを開放する。
【０１３３】
0.9kbのフラグメントを、SpeI（リンカーをコードする領域に位置する）及びBstXI部位でプラスミドpYW1中に連結した。得られるプラスミド（pYWZ）は、Sso7d−ΔTaqにおけるのと同じ、Gly−Gly−Val−Thr（配列番号32）から成るリンカーを通して十分な長さのTaq DNAポリメラーゼのN末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。Sso7d−Taq融合タンパク質をコードするDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５及び６で示される。
【０１３４】
Pfu−Sso7d融合体の構成：
ピロコーカス・フリオサスDNA polI（Pfuとして知られているファミリーBのDNAポリメラーゼ）のC末端にSso7dを連結する第３の融合タンパク質を構造した。Pfu DNAポリメラーゼ遺伝子を担持するpETに基づくプラスミドを修飾し、その結果、ユニークKpnI部位及びユニークSpeI部位を、停止コドンの前のPfu遺伝子の3’末端で導入する。得られるプラスミド（pPFKS）は、そのC末端で追加のアミノ酸（Gly−Thr−His）を有するPfuポリメラーゼを発現する。
【０１３５】
２種のプライマーを用いて、上記の合成Sso7d遺伝子をPCR増幅し、KpnI部位、及びSso7d遺伝子を両端に有するNheI部位を導入した。5’プライマーをまた、Sso7dタンパク質のN末端でリンカーとして作用する６個の追加のアミノ酸（Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly）（配列番号33）を導入する。KpnI及びNheIによる消化に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpPFKS中に連結した。得られるプラスミド（pPFS）は、ペプチドリンカー（Gly−Thr−Gly−Gly−Gly−Gly）（配列番号33）を通してPfuポリメラーゼのC末端に融合されるSso7dタンパク質を含む単一のポリペプチドの発現を可能にする。融合タンパク質（Pfu−Sso7d）をコードするDNA配列及び融合タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７及び８に示される。
【０１３６】
Sac7d−ΔTaq融合体の構成：
異なった種からのタンパク質をΔTaqに結合する配列−非特異的DNA結合タンパク質を連結する第４の融合タンパク質を構成した。２種のプライマーを用いて、スルホロバス・アシドカルダリウムのゲノムDNAからのSac7d遺伝子をPCR増幅した。前記プライマーは、それぞれ5’及び3’末端でPCRフラグメントにユニークEcoRI部位及びユニークSpeI部位を導入した。EcoRI及びSpeIによる制限消化に基づいて、PCRフラグメントを、その対応する部位でpYW1 (上記に記載される)中に連結した。得られるプラスミドは、Sso7d−ΔTaqに使用されるのと同じリンカーを通してΔTaqのN末端に融合されるSac7dタンパク質を含む単一のポリペプチドを発現する。融合タンパク質（Sac7d−ΔTaq）のDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号９及び10で示される。
【０１３７】
PL−ΔTaq融合体の構成：
第５の融合タンパク質は、14個のリシン及び２個アルギニンから構成されるペプチドをΔTaqのN末端に連結する。ポリリシン（PL）−ΔTaq融合タンパク質を生成するために、２種の67ntのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、EcoRI部位を適合する5’突出末端及びSpeI部位と適合する3’突出末端を有する重複DNAフラグメントを形成した。前記DNAフラグメントは、次の組成のリシンに富んでいるペプチドをコードする：NSKKKKKKKRKKRKKKGGGVT（配列番号34）。
【０１３８】
このペプチドにおけるリシン及びアルギニンの数は、Sso7dにおけるその数に同一である。このDNAフラグメントをpYW1中の連結し、EcoRI及びSpeIにより予備消化し、Sso7dをコードする領域を置換した。得られるプラスミド（pLST）は、ΔTaqのN末端に融合されるリシンに富んでいるペプチドを含む単一のポリペプチドを発現する。融合タンパク質（PL−ΔTaq）をコードするDNA配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号11及び12に示される。
【０１３９】
例２．融合ポリメラーゼのプロセッシング性の評価：
この例は、例１において生成される本発明の融合タンパク質のプロセッシング性の増強を示す。
ポリメラーゼ単位定義アッセイ：
次のアッセイを用いて、ポリメラーゼ単位を定義した。オリゴヌクレオチドを、Mg2+−フリー反応緩衝液及びdNTPの存在下でssM13mp18 DNAにプレアニーリングした。興味あるDNAポリメラーゼを、プライムされたDNA混合物に添加した。MgCl2を添加し、72℃でのDNA合成を開始した。サンプルを種々の時点で採取し、そしてPicoGreen（Molecular Probes, Eugene Oregon）を含むTE緩衝液に添加した。合成されるDNAの量を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。興味あるDNAポリメラーゼの単位活性を、その初期割合と対照DNAポリメラーゼ（例えば、既知の単位濃度の市販のポリメラーゼ）のその割合とを比較することによって決定した。
【０１４０】
プロセッシング性アッセイ：
プロセッシング性を、プライムされた鋳型へのポリメラーゼの１回の結合現象の間に組み込まれるヌクレオチドの数を決定することによって測定した。
手短には、40nMの5’FAM−ラベルされたプライマー（34ntの長さ）を、80nMの環状又は線状化されたssM13mp18 DNAにアニーリングし、プライムされた鋳型を形成した。プライムされた鋳型を、標準のPCR緩衝液（Mg2+を有さない）及び200μMの個々のdNTPの存在下で、興味あるDNAポリメラーゼと共に、約4000：１のモル比（プライムされたDNA：DNAポリメラーゼ）で混合した。
【０１４１】
MgCl2を添加し、2mMの最終濃度にし、DNA合成を開始した。開始の後、種々の時間で、サンプルを、配列決定負荷色素含有の99％ホルムアミドにより急冷し、そして配列決定ゲル上で分析した。等量の生成物が存在する、上記又は下記生成物の長さとして定義される生成物のメジアン長を、すべての検出できる生成物ピークの統合に基づいて決定した。生成物のメジアン長が時間又はポリメラーゼ濃度と共に変化するポリメラーゼ濃度で、その長さは酵素のプロセッシング性に対応する。表Iに示される範囲は、アッセイのいくつかの反復体において得られる値の範囲を表す。
【０１４２】
【表１】
修飾されていない酵素に対する修飾された酵素のプロセッシングの比較の場合、ΔTaqは２〜６個のヌクレオチドのプロセッシング性を有し、そしてSso7d−ΔTaq融合体は39〜58個のヌクレオチドのプロセッシング性を示した（表I）。十分な長さのTaqは、130〜160個のヌクレオチドのプロセッシング性を有するSso7d−Faq融合体のプロセッシング性よりも有意に低い15〜20個のヌクレオチドのプロセッシング性を有した。それらの結果は、Taqポリメラーゼに連結されるSso7dがポリメラーゼのプロセッシング性を増強したことを示す。
【０１４４】
PfuはポリメラーゼのファミリーBに属する。Taqポリメラーゼとは異なって、Pfuは、DNA合成の間、高い適合性の維持を可能にする3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。Sso7dが十分な長さのPfuポリメラーゼのC末端に融合されている修飾されたPfuポリメラーゼ、及び修飾されていないPfuポリメラーゼを、上記プロセッシング性アッセイにおいて分析した。表Iに示されるように、Pfuポリメラーゼは２〜３ntのプロセッシング性を示し、そしてPfu−Sso7d融合タンパク質は35〜39ntのプロセッシング性を有した。従って、PfuのC末端へのSso7dの融合は、修飾されていない酵素に対するプロセッシング性の10倍以上の増強性をもたらした。
【０１４５】
Taqポリメラーゼのプロセッシング性を増強するリシンに富んでいるペプチドの能力をまた、評価した。PL−ΔTaqのプロセッシングを、上記方法を用いて測定し、そして修飾されていないタンパク質ΔTaqのプロセッシング性に比較した。表Iに示されるように、ポリリシン路の存在はΔTaqのプロセッシング性を増強しなかった。従って、核酸結合タンパク質へのリシンに富んでいるペプチドの付加は従来技術に開示されるようにその基質への酵素の会合速度を高めることができるが、プロセッシング性は高められない。
【０１４６】
例３．オリゴヌクレオチドアニーリング温度に対する融合タンパク質の効果：
この実験は、dsDNAを安定化することによって高いアニーリング温度で生成物を生成するために、Taqに比較して、Sso7d−ΔTaq融合タンパク質の高められた効率を示す。
2種のプライマー、すなわちプライマー1008（19マー、TM＝56.4℃）及び2180R（20マー、TM＝56.9℃）を用いて、Taq pol遺伝子の1kbフラグメント（1008−2180）を増幅した。グラジエント熱サイクラー（MJ Research, Waltham MA）を用いて、PCRサイクリングプログラムにおいて50℃から72℃にアニーリング温度を変えた。同一数の単位のSso7d−ΔTaq及びTaqを用いて生成されるPCR生成物の量を、定量化し、そして比較した。結果は表IIに示される。Sso7d−ΔTaq融合タンパク質は、高いアニーリング温度での十分な長さのTaqよりも有意に高い効率を示した。従って、シスでのSso7dの存在は、鋳型上でのプライマーの溶融温度を高める。
【０１４７】
上記アニーリング温度アッセイを用いて、PL−ΔTaqがPCR増幅の間、プライマーのアニーリング温度に対していずれかの効果を有するかどうかを調べた。表IIに示されるように、増幅された生成物は、アニーリング温度が63℃又はそれ以上である場合、ほとんど又はまったく観察されなかった。
【０１４８】
【表２】
例４．必要とされるプライマー長に対する融合タンパク質の効果：
プライマー（上記に示されるような）のTMの増強は、より短いプライマーが効果的なPCR増幅を達成するために、Taqによってではなく、Sso7d−ΔTaqにより使用され得ることを予測する。この分析は、Sso7d−ΔTaqが、Taqに比較して、より短いプライマーを用いてアッセイにおいてより効果的であることを示す。
【０１５０】
異なった長さのプライマーを用いて、Sso7d−ΔTaq及びTaqによるPCR増幅の効率を比較した。その結果は、表III及び図１A−１Cに示される。２種の長さのプライマー、すなわち57F（22マー、TM＝58℃）及び732R（24マー、TM＝57℃）が使用される場合、低又は高アニーリング温度でSso7d−ΔTaqとTaqとの間で有意な差異は観察されなかった。中位の長さのプライマー、すなわち57F15（152マー、TM＝35℃）及び732R16（16マー、TM＝35℃）が使用される場合、Sso7d−ΔTaqは、特にアリーリング温度が高い場合、Taqよりもより効果的であった。２種の酵素間の最も著しい差異が短いプライマー、すなわち57F12（12マー）及び732R16（16マー）により観察され、ここでSso7d−ΔTaqは、低及び高アニーリング温度でTaqよりも10倍、高く生成物を生成した。
【０１５１】
プライマー57F12（12nt）及び732R16（16nt）を用いてのPCRを用いて、PCR反応における修飾されていない十分な長さのTaqに対するSac7d−ΔTaqの効率を比較した。結果は図２に示される。Sso7d−ΔTaqに類似して、Sac7d−ΔTaqは、短いプライマーを用いての増強において、Taqよりも有意により効果的である。
プライマー長アッセイを用いて、PCR増幅における短いプライマーを用いるPL−ΔTaqの能力を決定した。長いプライマー（57F及び732F）が使用され得る場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の約50％である。短いプライマー（57F12及び732R16）が使用される場合、PL−ΔTaqにより生成される増幅された生成物は、Sso7d−ΔTaqによる生成物の20％以下である。
【０１５２】
【表３】
PCR 反応における融合ポリメラーゼの高められた性能：
本発明の融合タンパク質の高められた安定性及び/又はプロセッシング性は、種々の修飾反応の実施において高められた効率を提供する。例えば、ポリメラーゼ融合タンパク質は、PCR反応においてより効果的な増幅を提供することができる。多くの因子が、PCR反応の結果、例えばプライマー特異性、ポリメラーゼの効率、鋳型の量及びGC−含有率、アンプリコンの長さ、等に影響を及ぼす。例５〜８は、熱安定性ポリメラーゼ又はポリメラーゼドメインに連結される二本鎖配列−非特異的核酸結合ドメイン、例えばSso7dを包含する融合タンパク質が、PCR増幅において、修飾されていない酵素に対していくつかの好都合な特徴を有することを示す。
【０１５４】
例５． Sso7d 融合タンパク質は PCR において高く且つ広い塩耐性を示す：
プライムされたDNA鋳型へのポリメラーゼの結合は、低い塩濃度でより強く、そして高い濃度でより弱い、静電相互作用のために反応緩衝液のイオン強度に対して敏感である。融合ポリメラーゼタンパク質におけるSso7dの存在は、DNA鋳型へのポリメラーゼの結合相互作用を安定化する。この例は、Sso7d融合タンパク質が、高められたKCl濃度を包含するPCR反応において改良された性能を表すことを示す。
【０１５５】
λDNA（2pM）を、プライマー57F及び732RとのPCR反応において鋳型として使用した。KClの濃度を10mMから150mMに変え、そして反応緩衝液中のすべての他の生成は変更されなかった。PCR反応を、94℃で30分、94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で30秒（20サイクル）、続いて72℃で10分のサイクリングプログラムを用いて行った。反応の完結後、5μlのPCR反応物を除き、そしてTE中、PicoGreenの１：400希釈溶液195μlと共に混合し、生成されるアンプリコンの量を定量化した。PCR反応生成物をまた、アガロースゲル上で同時に分析し、予測される長さのアンプリコンが生成されたことを確かめた（データは示されていない）。
【０１５６】
Sso7d−ΔTaqのPCR効率対ΔTaqのPCR効率及びPfu−Sso7d対Pfuに対するKCl濃度の効果が表IVに示されている。修飾されていない酵素、すなわちΔTaq及びPfuは、最大活性の80％を維持するために、それぞれ25mM及び40mM以下のKCl濃度についての選択性を示した。対照的に、融合タンパク質Sso7d−ΔTaq及びPfu−Sso7dは、それぞれ30〜100mM及び60〜100mMのKClにおいて最大活性の80％を維持する。従って、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分に比較して、高められたKCl濃度に耐性であった。ハイブリッドポリメラーゼのこの特徴は、低量のDNA鋳型、例えば血液、食物及び植物源（但し、それらだけには限定されない）から調製されたDNAサンプルからのPCR増幅を実質的に可能にするであろう。
【０１５７】
【表４】
例６． Sso7d 融合ポリメラーゼは PCR において短い延長時間を必要とする：
ポリメラーゼのプロセッシング性は、重合段階の効率に直接的に影響を及ぼす。例えば、低いプロセッシング性を有するポリメラーゼは、より頻繁に解離し、そしてプライムされた鋳型に再結合するのにより時間を必要とし、ところが高いプロセッシング性を有するポリメラーゼは完全な鋳型の複製を完結するためにより少ない結合現象を必要とする。例２に示されるように、Sso7d融合タンパク質は、それらの修飾されていない対抗部分よりも有意に高いプロセッシング性を有する。
【０１５９】
従って、その融合タンパク質は、PCR反応のプライマー延長段階の間、より効果的であるべきである。本明細書において、本発明者は、Sso7d融合ポリメラーゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、PCRの間、大きなフラグメントを増幅するために短い延長時間を必要とすることを示す例を提供する。さらに、本発明者は、単一の酵素融合ポリメラーゼが、大きなフラグメントの増幅のために当業界において現在使用される酵素混合物（DyNAzyme EXT）に比較して、限定された時間で、大きなDNAフラグメントを増幅する増強された能力を示すことを示す。
【０１６０】
例６−１．Sso7d融合ポリメラーゼはPCRにおいて短い延長時間を必要とする：
λDNA（2.25pM）を、PCR鋳型として使用した。３種のプライマー対、すなわちL71F（5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号13）及びL71R（5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’）（配列番号14）、L18015F（5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’）（配列番号15）及びL23474R（5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’）（配列番号16）、及びL18015F（5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’）（配列番号17）及びL29930R（5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’）（配列番号18）を、それぞれ、0.9kb、5.5kb、及び11.9kbのサイズのDNAフラグメントを増幅するために使用した。個々の反応は40単位/mlのポリメラーゼ（前記単位は、例２に記載のように定義された）、及び0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。
【０１６１】
Pfu（Stratageneからの）のために使用される反応緩衝液は、20Mmのトリス−HCl（pH8.8）、2mMのMgSO4、10mM のKCｌ、10mMの (NH4)2SO4、0.1％のTritonX−100及び0.1mg/mlのBSAを含んだ。Pfu−Sso7d、Taq及びSso7d−Taqのための反応緩衝液は、追加の40cmのKClを含む上記緩衝液であった。１分又は５分の延長時間を有する２つのサイクリングプログラムを、PCR増幅のために使用した。個々のサイクリングプログラムは、94℃で20秒、ポリメラーゼの添加による80℃での熱開始、94℃で10秒、72℃で１又は５分、及び72℃で５分（20サイクル）から構成された。
【０１６２】
結果は、Pfu−Sso7d融合タンパク質が１分の延長時間を用いて、１kb及び5kbのフラグメントを増幅することができ、そして５分の延長時間を用いて、10kbのフラグメントを増幅することができた。対照的に、Pfuポリメラーゼは、１分又は５分の延長時間を用いて、1kbのフラグメントのみを増幅した。同様に、Sso7d−Taq融合タンパク質は、１分の延長時間を用いて、１kbのフラグメントを増幅し、そして５分の延長時間を用いて、１kb及び5kbのフラグメントを増幅し、そしてTaqポリメラーゼは、５分の延長時間により、１kbのフラグメントのみを増幅した。
従って、融合タンパク質におけるSso7dの存在は、修飾されていないタンパク質に比較して、PCR反応において短い延長時間をもたらす。
【０１６３】
例６−２．Pfu−Sso7d融合ポリメラーゼは存在する長いPCR酵素混合物より性能がすぐれている：
現在、長いDNAフラグメントのPCR増幅は、非プル−フリーディングポリメラーゼ（例えば、Taq又はDyNAyme II）及び少量のプルーフリーディングポリメラーゼ（例えば、Pfu又はDeep Vent）の両者を含む酵素混合物の使用を必要とする。本発明者は、長いPCRにおいて１つの高性能の長いPCR酵素DyNAzyme EXT (Finnzymesからの) に単一の融合酵素Pfu−Sso7dを比較し、そしてPfu−Sso7dが、特に制限された延長時間を伴なって、DyNAzyme EX7より性能がすぐれていることを示した。
【０１６４】
λDNA（2.25pM）をPCR鋳型として使用した。４対のプライマー、すなわちL71F（5’− CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号13）及びL71R（5’− GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’）（配列番号14）、L30350F（5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号19）及びL35121R（5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’）（配列番号20）、L2089F（5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’）（配列番号21）及びL7112R（5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’）（配列番号22）、及びL30350F（5’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’）（配列番号23）及びL40547R（5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’）（配列番号24）を用いて、それぞれ、0.9kb, 4.8kb、5.0kb及び10.2kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。
【０１６５】
４種の濃度（10単位/ml、20単位/ml、40単位/ml及び80単位/ml）のPfu−Sso7dを用い、そして２種の濃度（20単位/ml及び40単位/ml）のDyNAzymeEXTを使用した。個々の反応は、0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。Pfu−Sso7dのための反応緩衝液は、例６−１に記載される通りであった。DyNAzyme EXTのための反応緩衝液は、20mMのトリス（pH9.0）、2mMのMgCl2、15mMの (NH4)2SO4及び0.1％のTriton X-100 (Finnzymesにより提供される) を含んだ。すべての反応成分をまず、氷上で混合し、そしてサンプルプレートを、90℃以上に予備加熱された熱サイクラー（MJ Research）中に配置することによって、反応を開始した。PCRサイクリングプログラムは、95℃での20秒、94℃での10秒及び70℃で１又は1.5分（20サイクル）、及び72℃で10分（１サイクル）から成る。
【０１６６】
図３に示されるように、Pfu−Ssoudを用いて１分間の延長時間は、10, 20, 40及び80単位/mlのポリメラーゼの存在下で、有意な量の0.9kbの生成物を生成した。4.8kb及び5.0kbの生成物を生成したが、但し、40及び80単位/mlのポリメラーゼの存在下で、低レベルで生成された。1.5分の延長時間を用いて、4.8kb及び5.0kbの生成物を、10単位/ml又はそれよりも高いPfu−Sso7dにより生成し、そして10.2kbのフラグメントを、40及び80単位/mlのPfu−Sso7dにより有意な量で生成した。対照的に、DyNAzyme EXTが使用される場合、1kb及び4.8kbの生成物のみが、40単位/mlのポリメラーゼの存在下で、1.5分の延長時間を用いて生成され、そして10kbの生成物は検出されなかった。
従って、融合ポリメラーゼPfu−Sso7dは、長いPCRにおいて、酵素混合物、例えばDyNAzyme EXTよりも単一の酵素として著しくより効果的である。
【０１６７】
例７． Sso7d 融合タンパク質は PCR 増幅においてより感受性である：
この例は、Sso7dの融合ポリメラーゼが、修飾されていないポリメラーゼに比較して、低コピー数で存在する標的物を増幅できることを示す。プラスミドDNAを、PCR鋳型として使用し、そしてT3及びT7を、500bpのフラグメントを増幅するプライマーとして使用した。プラスミドDNAの量は変化し、その結果、PCR反応に存在するDNA鋳型のコピー数は108〜１の範囲であった。サイクリングプログラムは、99℃で３分、96℃で１秒、50℃で15秒、及び68℃で30秒（25又は35サイクル）、続いて68℃で５分（１サイクル）であった。104〜108の鋳型コピー数（25μlの反応当たり）に関しては、25サイクルの増幅が行われ；１〜104の鋳型コピー数（25μlの反応数当たり）に関しては、35サイクルの増幅が行われた。
【０１６８】
Sso7d融合ポリメラーゼを、効果的な増幅のための鋳型の最少コピー数のための必要な条件下で修飾されていないポリメラーゼに比較した。表Vに表されるように、Pfu−Sso7dはDNAの少数のコピーを増幅するその能力においてPfuよりもより有意に敏感であり、このことは、本発明の融合ポリメラーゼがPCR反応の感受性を５倍ほど高めることができることをしめす。
【０１６９】
【表５】
例８． Sso7d 融合ポリメラーゼは PCR 反応において高い特異性を維持する：
例３に示されるように、Sso7d−Δtaq融合タンパク質は、PCR増幅において高いアニーリング温度及び/又は短いプライマーを可能にするその能力により表されるように、プライマー鋳型相互作用を安定化する。融合タンパク質のこの性質がPCRにおいて非特異的増幅をもたらすかどうかを評価するために、複合DNA鋳型（例えばヒトゲノムDNA）を、標的鋳型として使用した。次の２種の例は、Pfu−Sso7dを用いて達成される増幅の特異性が最も通常に使用されるPCR酵素であるTaqほどであることを示す。
【０１７１】
例８−１．Pfu−Sso7dを用いてのヒトDNAからの性−特異的マーカーの増幅：
胎盤又は絨毛膜組織（Sigmaからの）からのヒト雌又は雄型DNA（濃度、１fM）を鋳型として使用した。プライマーH−Amelo−Y（5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’）（配列番号25）及びH−Amelo−YR（5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’）（配列番号26）を用いて、X染色体からの212bpのアンプリコン及びY染色体からの218bpのアンプリコンを増幅した。単一の212bpのフラグメントは、雌型DNAから増幅され、そして３種のフラグメント（212bp、218bp及び212bp/218bpのヘテロ接合体）は雄型DNAから予測された。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の４種のdNTPを含んだ。
【０１７２】
Taqのための反応緩衝液は、10mMのトリス（pH8.8）、50mMのKCl，1.5mMのMgCl2及び0.1％のTriton−X−100（Amershamにより提供される）を含んだ。Pfu−Sso7dのための反応緩衝液は、DyNAzyme EXT緩衝液（例６−２を参照のこと）及び追加の40mMのKClを含んだ。すべての反応成分を氷上で混合し、そして反応を、65℃以上に予備加熱された熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始した。サイクリングプログラムは、95℃で２分、94℃で5秒、64℃で10秒、及び72℃10秒（30サイクル）、続いて72℃で７分（１サイクル）から成った。予測されるサイズの特異的アンプリコンを、Pfu−Sso7d及びTaqポリメラーゼの両者により増幅した。
【０１７３】
例８−２．Pfu−Sso7dを用いてのヒトDNAからのβ−グロビン遺伝子の増幅：
胎盤又は絨毛膜組織（Sigmaからの）からのヒトDNA（1fM）を鋳型として使用した。３種のプライマー対、すなわちBglbn536F（5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’）（配列番号27）及びBglbn536R（5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’）（配列番号28）、Bglbn536F及びBglbn1083R、及びBglbn536及びBglbn1408R（5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’）（配列番号29）を用いて、それぞれ0.5、1.1及び1.4kbのサイズのDNAフラグメントを増幅した。個々の反応は、20単位/mlのポリメラーゼ及び0.36mMの個々の４種のｄNTDを含んだ。Tgq及びPfu−Sso7dのための反応緩衝液は例８−１に記載されている。
【０１７４】
すべての反応成分を氷上で混合し、そして反応を、65℃以上に予備加熱された熱サイクラー中にプレートを配置することによって開始した。サイクリングプログラムは、95℃で２分、94℃で45秒、64℃で45秒、及び72℃１分（30サイクル）、続いて72℃で７分（１サイクル）から成った。使用される３種のプライマー対の個々により、予測されるサイズの増幅された生成物を、Pfu−Sso7dを用いて生成した。それらの結果は、Pfu−Sso7dを用いることによって達成される増幅の特異性がTaqポリメラーゼによるその特異性に等しいか又はそれよりも良好であることを示す。
【０１７５】
配列表：
配列番号１：合成Sso7d遺伝子：
【化１】
配列番号２：Sso7dのアミノ酸配列：
【化２】
配列番号３：Sso7d−ΔTaq融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化３】
【化４】
配列番号４：Sso7d−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
配列番号６：Sso7d−Taq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１０】
配列番号７：Pfu−Sso7融合タンパク質をコードするDNA配列：
【化１１】
【化１２】
【化１３】
配列番号８：Pfu−Sso7d融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
配列番号10：Sac7d−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化１８】
配列番号11：PL−ΔTaq融合タンパク質をコードするDNA配列；
【化１９】
【化２０】
【化２１】
配列番号12：PL−ΔTaq融合タンパク質のアミノ酸配列：
【化２２】
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号14：プライマーL71R：
5’−GCACAGCGGCTGGCTGAGGA−3’
配列番号15：プライマーL18015F：
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
配列番号16：プライマーL2347R：
5’−GAAAGACGATGGGTCGCTAATACGC−3’
配列番号17：プライマーL18015F：
5’−TGACGGAGGATAACGCCAGCAG−3’
【０１９５】
配列番号18：プライマーL29930R：
5’−GGGGTTGGAGGTCAATGGGTTC−3’
配列番号19：プライマーL30350F：
5’−CCTGCTCTGCCGCTTCACGC−3’
配列番号20：プライマーL35121R：
5’−CACATGGTACAGCAAGCCTGGC−3’
配列番号21：プライマーL2089F：
5’−CCCGTATCTGCTGGGATACTGGC−3’
配列番号22：プライマーL7112R：
5’−CAGCGGTGCTGACTGAATCATGG−3’
配列番号23：プライマーL30350F：
5’−CCTGCCTGCCGCTTCACGC−3’
【０１９６】
配列番号24：プライマーL40547R：
5’−CCAATACCCGTTTCATCGCGGC−3’
配列番号25：プライマーH-Amelo-Y：
5’−CCACCTCATCCTGGGCACC−3’
配列番号26 ：プライマーH-Amelo-YR：
5’−GCTTGAGGCCAACCATCAGAGC−3’
配列番号27 ：ヒトβ−グロビンプライマー536F：
5’−GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG−3’
配列番号28 ：ヒトβ−グロビンプライマー536R：
5’−GCTCACTCAGTGTGGCAAAG−3’
配列番号29 ：ヒトβ−グロビンプライマー1408R：
5’−GATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGG−3’
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１a-cは、Sso7d−修飾されたポリメラーゼの効率と修飾されていない十分な長さのポリメラーゼの効率とを比較するために、異なった長さのプライマーを用いて行われるPCR増幅反応の結果を示す。
【図２】 図２は、Taqに比較してSac7d−ΔTaqを用いて生成されるPCR生成物を評価するために、12ntの前方向プライマーを用いてのPCR増幅反応の結果を示す。
【図３】 図３は、Pfu−Sso7dが長いPCRにおいてDyNAzyme EXTよりもより効果的であることを示すPCR増幅反応の結果を示す。
Claims (12)
- 異種ドメインである第１ドメイン及び第２ドメインを少なくとも含んでなるタンパク質であって、
第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸番号７〜７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するとともに、第２ドメインと共有結合しており、
第２ドメインが、ポリメラーゼドメインであり、
第１ドメインの存在が、それに結合される第１ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、ポリメラーゼドメインのプロセッシング性質を増強することを特徴とするタンパク質。 - 前記ポリメラーゼドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項１記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼドメインが、サーマス（Thermus）ポリメラーゼドメインを含んで成る請求項１又は請求項２に記載のタンパク質。
- 前記ポリメラーゼドメインが、ピロコーカス（Pyrococcus）ポリメラーゼドメインを含んで成る請求項１記載のタンパク質。
- 前記第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸番号７〜７１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５記載のタンパク質。
- 異種ドメインである第１ドメイン及び第２ドメインを少なくとも含んでなるタンパク質であって、
第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸番号７〜７１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するとともに、第２ドメインと共有結合しており、
第２ドメインが、ポリメラーゼドメインであり、
前記第１ドメインの存在が、それに結合される第１ドメインを有さない同一のタンパク質に比較して、核酸の二本鎖コンホメーションを少なくとも１℃安定化することを特徴とするタンパク質。 - 前記ポリメラーゼドメインが、熱安定性ポリメラーゼ活性を有する請求項７記載のタンパク質。
- 前記第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸番号７〜７１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７又は請求項８に記載のタンパク質。
- 前記第１ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項９記載のタンパク質。
- 水溶液中の核酸を修飾するための方法であって、
（ｉ）前記核酸を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質と接触せしめ、ここで前記溶液が、前記第１ドメインの前記核酸への結合を可能にし、そして前記ポリメラーゼドメインの触媒態様での機能を可能にする温度で存在し、そしてその組成のものであり；そして
（ii）前記溶液における核酸の前記触媒ドメインによる修飾を可能にする
ことを含んで成る方法。 - ポリメラーゼ鎖反応を用いて標的核酸の配列を修飾する方法であって、
（ｉ）水溶液における前記標的核酸を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質と接触せしめ、ここで前記水溶液は、前記第１ドメインによる前記標的核酸への結合を可能にし、そして前記標的核酸の配列にハイブリダイズされるプライマーの前記ポリメラーゼドメインによる伸長を可能にする組成のものであり；
（ii）前記標的核酸の配列を増幅するポリメラーゼ鎖反応温度プロフィールを用いて前記溶液をインキュベートする
ことを含んで成る方法。
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