CN109266628B - 一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用 - Google Patents

Abstract

为实现上述目的，本发明公开一种融合的Taq DNA聚合酶，其为DNA单链结合蛋白Sac7d或DNA单链结合蛋白sso7d分别与野生型Taq DNA聚合酶融合而成。本发明提供的一种融合的Taq DNA聚合酶，增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

Description

一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种融合的Taq DNA聚合酶及其应用。

背景技术

PCR是分子生物学领域最基本但是最重要的方法，它可以将微量的核酸复制扩大，实现生物学上的研究，大大促进了分子生物学和相关学科的发展。PCR的主要成分包括：反应Buffer、酶、dNTP、模板、引物。这些组分中，每个组分都是PCR扩增不可缺少的，但DNA聚合酶是实现DNA复制的关键，目前针对这些不同的组分，研究者关注最多的是酶的研究，期望通过对酶的改造，实现更多应用，比如：血液直扩、土壤直扩、植物直扩等。

Taq DNA聚合酶存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。其在结构上由三部分构成：DNA聚合酶区、3’核酸外切酶区和5’核酸外切酶区，只有5’→3’DNA聚合酶活性和5’→3’的外切酶活性，缺少3’→5’的外切酶活性。Taq DNA聚合酶是重要的生物技术工具酶，广泛应用于疾病诊断与治疗、传染病检测、药物作用机理等医药领域。

随着医药科技的发展，对Taq酶性能的要求不断提高，野生型的Taq DNA聚合酶已经不能满足特殊PCR技术的要求了，例如用于定点突变时要求聚合酶有较高的保真性，用于长片段扩增时要求聚合酶有较高的扩增效率。由此而带来了多种酶的改造方法，比如：通过制备酶单分子纳米凝胶提高酶的稳定性(化学修饰)；定点突变置换氨基酸，如3’端核酸外切酶区的氨基酸变化使其失去5’→3’的外切功能(分子修饰)等等。目前常用的改造方法有定点突变、定点缺失、基因融合等。

当前对Taq DNA聚合酶改造用的最多的是聚合酶联合应用、定点突变、缺失突变等，通过定向改变氨基酸种类，达到增强某种性能的目的。例如：Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，所以将Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶联合应用，利用Taq DNA聚合酶较强的延伸能力和Pfu DNA聚合酶的校正功能，使得扩增可以达到40kb。例如：将Taq DNA聚合酶543位的丝氨酸定点突变为天冬酰胺，可以增强Taq DNA聚合酶和模板引物复合物的相互作用，提高了对高GC含量等困难模板的扩增能力。

很多报道通过酶改造增强了Taq DNA聚合酶的扩增效率、扩增特异性等，但是很少有报道提高了Taq DNA聚合酶在不经过纯化的DNA，实现直接用血液进行扩增。当下用于医院或者工业用户的扩增都是样本数量庞大，如果要先进行DNA提取纯化，再进行扩增，一方面需耗费很长的时间，另一方面DNA交叉污染可能出现很多假阳性，不利于结果的判定。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明目的提供的一种融合的Taq DNA聚合酶，增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

为实现上述目的，本发明提供一种融合的Taq DNA聚合酶，其为DNA单链结合蛋白Sac7d或DNA单链结合蛋白sso7d分别与野生型Taq DNA聚合酶融合而成。

本发明所述的野生型Taq DNA聚合酶的编码序列优选如SEQ ID NO.3所示。

本发明所提供的融合的Taq DNA聚合酶，编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列还可以为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。

本发明还提供一种载体，所述载体包含可编码上述融合的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列。

具体的，上述载体可以包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

该载体可以进一步由可编码上述融合的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。所述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体。

所述表达载体可以为本领域常用载体，如可以为pET-28a。

具体的，上述载体可以由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入pET-28a等表达载体经重组得到。

本发明还提供一种重组细胞，该重组细胞可以包含编码上述融合的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列。

具体的，该重组细胞包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

该重组细胞还可包含载体，所述载体包含可编码上述Taq DNA聚合酶的核苷酸序列。

进一步的，该重组细胞还可包含载体，所述载体包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

重组细胞可包含载体，所述载体可以由编码上述融合的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

进一步的，该重组细胞还可包含载体，所述载体由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

所述表达载体可以为本领域常用载体，如可以为pET-28a。

所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌等。

本申请还提供上述融合的Taq DNA聚合酶的制备方法，构建含有可编码上述融合的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列的载体，转化至宿主细胞获得重组细胞，表达融合的TaqDNA聚合酶。

本方法还提供一种Taq DNA聚合酶试剂，所述试剂中含有上述融合的Taq DNA聚合酶。

本发明还提供上述融合的Taq DNA聚合酶在PCR中的应用。

本发明所述的应用，可以直接用血液作为模板进行扩增。

本发明所述的应用，用血液扩增时，血液在PCR反应体系中的占比(体积)不高于20％，优选的不高于15％。

本申请的有益效果：

本申请所述的融合的Taq DNA聚合酶增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

附图说明

图1是实施例2所述的4种酶扩增电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1制备融合的Taq DNA聚合酶

我们获得了表达DNA单链结合蛋白的3个基因：HMF、Sac7d、sso7d，其序列可通过现有公开途径查询获得，或者分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列中出去野生型Taq DNA聚合酶即除去SEQ ID NO.3的序列后剩余的序列。通过前期扩增、胶回收、测序得到HMF、Sac7d、sso7d的核酸序列，用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将HMF、Sac7d、sso7d分别与Taq首尾相连在pET28a载体，得到重组基因，转化到大肠杆菌中，37℃摇菌1小时(转速200-250rpm)，5000rpm离心5min，弃900μl上清，剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在Kan平板上涂布。37℃培养箱中倒置培养12-16h。通过PCR鉴定阳性菌落，将阳性菌落送测序，确认基因序列正确。将正确的大肠杆菌IPTG诱导表达蛋白，用本行业通俗的方法纯化蛋白，得到融合的3种Taq DNA聚合酶，分别命名为HMF-Taq(编码序列如SEQ ID NO.4所示)、Sac7d-Taq(编码序列如SEQ ID NO.1所示)、sso7d-Taq(编码序列如SEQ ID NO.2所示)。

同源重组所用的引物序列

HMF-Taq-1-F：taagaaggagatataccatgTAAGAAGGAGATATACCATGGATGATG

HMF-Taq-1-R：catccccgaattcatGCTCTTAATTGCGAGCTTAATGTC

HMF-Taq-2-F：agagcATGAATTCGGGGATGCTGC

HMF-Taq-2-R：tgatgatgatggctgctgccTCACTCCTTGGCGGAGAGC

Sac7d–Taq-1-F：taagaaggagatataccatgGTGAAGGTAAAGTTCAAGTATAAGGGTG

Sac7d–Taq-1-R：gcagcatccccgaattcatTTTCTTCTCTCTTTCTGCTCTTGCT

Sac7d–Taq-2-F：aATGAATTCGGGGATGCTGC

Sac7d–Taq-2-R：tgatgatgatggctgctgccTCACTCCTTGGCGGAGAGC

sso7d-Taq-1-F：taagaaggagatataccatgGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAG

sso7d-Taq-1-R：gcatccccgaattcatTCACTTTTTCTGCTTCTCCAGCA

sso7d-Taq-2-F：gtgaATGAATTCGGGGATGCTGC

sso7d-Taq-2-R：tgatgatgatggctgctgccTCACTCCTTGGCGGAGAGC

实施例2检测得到的改进的Taq DNA聚合酶直接用于血液扩增的效果

测试改造后的HMF-Taq、Sac7d-Taq、sso7d-Taq和野生型Taq(序列如SEQ ID NO.3所示)在血液直扩时的效果。

测试用到的反应Buffer配方：30mM Tris，pH8.3，Mg 2.5mM，KCl 10mM，海藻糖0.5M，反应酶浓度2U/μl。

血液模板浓度为反应体系的15％。反应程序：95℃30sec，95℃5min，58℃30sec，72℃30sec(35cycles)，72℃5min。

扩增所用的引物序列：

R：CTGCCCGTAGTAGTCGTAATCGTCCTCCAT

F：AACTGCTGCTTGGCTACAGCGACATCGA

PCR产物在1％的琼脂糖胶进行电泳，得到如图1结果，显示通过基因融合得到的Sac7d-Taq、sso7d-Taq可以在含有15％血液的体系中良好扩增，而对比例HMF-Taq和野生型Taq则扩增效果较弱。

实施例3检测HMF-Taq、Sac7d-Taq、sso7d-Taq和野生型Taq在不同浓度血液存在下的酶活

将实施例1制备的3种酶和野生型Taq组成的4种酶(HMF-Taq、Sac7d-Taq、sso7d-Taq和野生型Taq)分别与活化的小牛胸腺DNA和P³²标记的dATP一起温育，在不同体积浓度血液抑制的情况下，70℃下保持10分钟，通过检测核苷酸渗入DNA的速度检测酶的活性，在酶标仪上检测，得到结果如表1所示，显示通过基因融合得到的Sac7d–Taq、sso7d-Taq在不同血液存在的情况下，酶活性稳定，15％血液依然能维持90％以上的活性，而野生型和HMF-Taq活性分别下降至11％、30％。

表1：4种酶在血液抑制下检测酶活结果(酶活，单位：％)

序列表

<110> 南京市胸科医院

<120> 一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2697

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaaggtaa agttcaagta taagggtgaa gagaaagaag tagacacttc aaagataaag 60

aaggtttgga gagtaggcaa aatggtgtcc tttacctatg acgacaatgg taagacaggt 120

agaggagctg taagcgagaa agatgctcca aaagaattat tagacatgtt agcaagagca 180

gaaagagaga agaaaatgaa ttcggggatg ctgcccctct ttgagcccaa gggccgggtc 240

ctcctggtgg acggccacca cctggcctac cgcaccttcc acgccctgaa gggcctcacc 300

accagccggg gggagccggt gcaggcggtc tacggcttcg ccaagagcct cctcaaggcc 360

ctcaaggagg acggggacgc ggtgatcgtg gtctttgacg ccaaggcccc ctccttccgc 420

cacgaggcct acggggggta caaggcgggc cgggccccca cgccggagga ctttccccgg 480

caactcgccc tcatcaagga gctggtggac ctcctggggc tggcgcgcct cgaggtcccg 540

ggctacgagg cggacgacgt cctggccagc ctggccaaga aggcggaaaa ggagggctac 600

gaggtccgca tcctcaccgc cgacaaagac ctttaccagc tcctttccga ccgcatccac 660

gtcctccacc ccgaggggta cctcatcacc ccggcctggc tttgggaaaa gtacggcctg 720

aggcccgacc agtgggccga ctaccgggcc ctgaccgggg acgagtccga caaccttccc 780

ggggtcaagg gcatcgggga gaagacggcg aggaagcttc tggaggagtg ggggagcctg 840

gaagccctcc tcaagaacct ggaccggctg aagcccgcca tccgggagaa gatcctggcc 900

cacatggacg atctgaagct ctcctgggac ctggccaagg tgcgcaccga cctgcccctg 960

gaggtggact tcgccaaaag gcgggagccc gaccgggaga ggcttagggc ctttctggag 1020

aggcttgagt ttggcagcct cctccacgag ttcggccttc tggaaagccc caaggccctg 1080

gaggaggccc cctggccccc gccggaaggg gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag 1140

aagcccatgt gggccgatct tctggccctg gccgccgcca gggggggccg ggtccaccgg 1200

gcccccgagc cttataaagc cctcagggac ctgaaggagg cgcgggggct tctcgccaaa 1260

gacctgagcg ttctggccct gagggaaggc cttggcctcc cgcccggcga cgaccccatg 1320

ctcctcgcct acctcctgga cccttccaac accacccccg tgggggtggc ccggcgctac 1380

ggcggggagt ggacggagga ggcgggggag cgggccgccc tttccgagag gctcttcgcc 1440

aacctgtggg ggaggcttga gggggaggag aggctccttt ggctttaccg ggaggtggag 1500

aggccccttt ccgctgtcct ggcccacatg gaggccacgg gggtgcgcct ggacgtggcc 1560

tatctcaggg ccttgtccct ggaggtggcc gaggagatcg cccgcctcga ggccgaggtc 1620

ttccgcctgg ccggccaccc cttcaacctc aactcccggg accagctgga aagggtcctc 1680

tttgacgagc tagggcttcc cgccatcggc aagacgaaga agaccggcaa gcgctccacc 1740

agcgccgccg tcctggaggc cctccgcgag gcccacccca tcgtggagaa gatcctgcag 1800

taccgggagc tcaccaagct gaagagcacc tacattgacc ccttgccgga cctcatccac 1860

cccaggacgg gccgcctcca cacccgcttc aaccagacgg ccacggccac gggcaggcta 1920

agtagctccg gccccaacct ccagaacatc cccgtccgca ccccgcttgg gcagaggatc 1980

cgccgggcct tcatcgccga ggaggggtgg ctattggtgg tgctggacta tagccagata 2040

gagctcaggg tgctggccca cctctccggc gacgagaacc tgatccgggt cttccaggag 2100

gggcgggaca tccacacgga gaccgccagc tggatgttcg gcgtcccccg ggaggccgtg 2160

gaccccctga tgcgccgggc ggccaagacc atcaacttcg gggtcctcta cggcatgtcg 2220

gcccaccgcc tctcccagga gctagccatc ccttacgagg aggcccaggc cttcattgag 2280

cgctactttc agagcttccc caaggtgcgg gcctggattg agaagaccct ggaggagggc 2340

aggaggcggg ggtacgtgga gaccctcttc ggccgccgcc gctacgtgcc agacctagag 2400

gcccgggtga agagcgtgcg ggaggcggcc gagcgccgcg ccttcaacat gcccgtccag 2460

ggcaccgccg ccgacctcat gaagctggct atggtgaagc tcttccccag gctggaggaa 2520

atgggggcca ggatgctcct tcaggtccac gacgagctgg tcctcgaggc cccaaaagag 2580

agggcggagg ccgtggcccg gctggccaag gaggtcatgg agggggtgta tcccctggcc 2640

gtgcccctgg aggtggaggt ggggataggg gaggactggc tctccgccaa ggagtga 2697

<210> 2

<211> 2694

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaaccgtaa agttcaagta caaaggcgaa gaaaaagagg tagacatctc caagatcaag 60

aaagtatggc gtgtgggcaa gatgatctcc ttcacctacg acgagggcgg tggcaagacc 120

ggccgtggtg cggtaagcga aaaggacgcg ccgaaggagc tgctgcagat gctggagaag 180

cagaaaaagt gaatgaattc ggggatgctg cccctctttg agcccaaggg ccgggtcctc 240

ctggtggacg gccaccacct ggcctaccgc accttccacg ccctgaaggg cctcaccacc 300

agccgggggg agccggtgca ggcggtctac ggcttcgcca agagcctcct caaggccctc 360

aaggaggacg gggacgcggt gatcgtggtc tttgacgcca aggccccctc cttccgccac 420

gaggcctacg gggggtacaa ggcgggccgg gcccccacgc cggaggactt tccccggcaa 480

ctcgccctca tcaaggagct ggtggacctc ctggggctgg cgcgcctcga ggtcccgggc 540

tacgaggcgg acgacgtcct ggccagcctg gccaagaagg cggaaaagga gggctacgag 600

gtccgcatcc tcaccgccga caaagacctt taccagctcc tttccgaccg catccacgtc 660

ctccaccccg aggggtacct catcaccccg gcctggcttt gggaaaagta cggcctgagg 720

cccgaccagt gggccgacta ccgggccctg accggggacg agtccgacaa ccttcccggg 780

gtcaagggca tcggggagaa gacggcgagg aagcttctgg aggagtgggg gagcctggaa 840

gccctcctca agaacctgga ccggctgaag cccgccatcc gggagaagat cctggcccac 900

atggacgatc tgaagctctc ctgggacctg gccaaggtgc gcaccgacct gcccctggag 960

gtggacttcg ccaaaaggcg ggagcccgac cgggagaggc ttagggcctt tctggagagg 1020

cttgagtttg gcagcctcct ccacgagttc ggccttctgg aaagccccaa ggccctggag 1080

gaggccccct ggcccccgcc ggaaggggcc ttcgtgggct ttgtgctttc ccgcaagaag 1140

cccatgtggg ccgatcttct ggccctggcc gccgccaggg ggggccgggt ccaccgggcc 1200

cccgagcctt ataaagccct cagggacctg aaggaggcgc gggggcttct cgccaaagac 1260

ctgagcgttc tggccctgag ggaaggcctt ggcctcccgc ccggcgacga ccccatgctc 1320

ctcgcctacc tcctggaccc ttccaacacc acccccgtgg gggtggcccg gcgctacggc 1380

ggggagtgga cggaggaggc gggggagcgg gccgcccttt ccgagaggct cttcgccaac 1440

ctgtggggga ggcttgaggg ggaggagagg ctcctttggc tttaccggga ggtggagagg 1500

cccctttccg ctgtcctggc ccacatggag gccacggggg tgcgcctgga cgtggcctat 1560

ctcagggcct tgtccctgga ggtggccgag gagatcgccc gcctcgaggc cgaggtcttc 1620

cgcctggccg gccacccctt caacctcaac tcccgggacc agctggaaag ggtcctcttt 1680

gacgagctag ggcttcccgc catcggcaag acgaagaaga ccggcaagcg ctccaccagc 1740

gccgccgtcc tggaggccct ccgcgaggcc caccccatcg tggagaagat cctgcagtac 1800

cgggagctca ccaagctgaa gagcacctac attgacccct tgccggacct catccacccc 1860

aggacgggcc gcctccacac ccgcttcaac cagacggcca cggccacggg caggctaagt 1920

agctccggcc ccaacctcca gaacatcccc gtccgcaccc cgcttgggca gaggatccgc 1980

cgggccttca tcgccgagga ggggtggcta ttggtggtgc tggactatag ccagatagag 2040

ctcagggtgc tggcccacct ctccggcgac gagaacctga tccgggtctt ccaggagggg 2100

cgggacatcc acacggagac cgccagctgg atgttcggcg tcccccggga ggccgtggac 2160

cccctgatgc gccgggcggc caagaccatc aacttcgggg tcctctacgg catgtcggcc 2220

caccgcctct cccaggagct agccatccct tacgaggagg cccaggcctt cattgagcgc 2280

tactttcaga gcttccccaa ggtgcgggcc tggattgaga agaccctgga ggagggcagg 2340

aggcgggggt acgtggagac cctcttcggc cgccgccgct acgtgccaga cctagaggcc 2400

cgggtgaaga gcgtgcggga ggcggccgag cgccgcgcct tcaacatgcc cgtccagggc 2460

accgccgccg acctcatgaa gctggctatg gtgaagctct tccccaggct ggaggaaatg 2520

ggggccagga tgctccttca ggtccacgac gagctggtcc tcgaggcccc aaaagagagg 2580

gcggaggccg tggcccggct ggccaaggag gtcatggagg gggtgtatcc cctggccgtg 2640

cccctggagg tggaggtggg gataggggag gactggctct ccgccaagga gtga 2694

<210> 3

<211> 2502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaattcgg ggatgctgcc cctctttgag cccaagggcc gggtcctcct ggtggacggc 60

caccacctgg cctaccgcac cttccacgcc ctgaagggcc tcaccaccag ccggggggag 120

ccggtgcagg cggtctacgg cttcgccaag agcctcctca aggccctcaa ggaggacggg 180

gacgcggtga tcgtggtctt tgacgccaag gccccctcct tccgccacga ggcctacggg 240

gggtacaagg cgggccgggc ccccacgccg gaggactttc cccggcaact cgccctcatc 300

aaggagctgg tggacctcct ggggctggcg cgcctcgagg tcccgggcta cgaggcggac 360

gacgtcctgg ccagcctggc caagaaggcg gaaaaggagg gctacgaggt ccgcatcctc 420

accgccgaca aagaccttta ccagctcctt tccgaccgca tccacgtcct ccaccccgag 480

gggtacctca tcaccccggc ctggctttgg gaaaagtacg gcctgaggcc cgaccagtgg 540

gccgactacc gggccctgac cggggacgag tccgacaacc ttcccggggt caagggcatc 600

ggggagaaga cggcgaggaa gcttctggag gagtggggga gcctggaagc cctcctcaag 660

aacctggacc ggctgaagcc cgccatccgg gagaagatcc tggcccacat ggacgatctg 720

aagctctcct gggacctggc caaggtgcgc accgacctgc ccctggaggt ggacttcgcc 780

aaaaggcggg agcccgaccg ggagaggctt agggcctttc tggagaggct tgagtttggc 840

agcctcctcc acgagttcgg ccttctggaa agccccaagg ccctggagga ggccccctgg 900

cccccgccgg aaggggcctt cgtgggcttt gtgctttccc gcaagaagcc catgtgggcc 960

gatcttctgg ccctggccgc cgccaggggg ggccgggtcc accgggcccc cgagccttat 1020

aaagccctca gggacctgaa ggaggcgcgg gggcttctcg ccaaagacct gagcgttctg 1080

gccctgaggg aaggccttgg cctcccgccc ggcgacgacc ccatgctcct cgcctacctc 1140

ctggaccctt ccaacaccac ccccgtgggg gtggcccggc gctacggcgg ggagtggacg 1200

gaggaggcgg gggagcgggc cgccctttcc gagaggctct tcgccaacct gtgggggagg 1260

cttgaggggg aggagaggct cctttggctt taccgggagg tggagaggcc cctttccgct 1320

gtcctggccc acatggaggc cacgggggtg cgcctggacg tggcctatct cagggccttg 1380

tccctggagg tggccgagga gatcgcccgc ctcgaggccg aggtcttccg cctggccggc 1440

caccccttca acctcaactc ccgggaccag ctggaaaggg tcctctttga cgagctaggg 1500

cttcccgcca tcggcaagac gaagaagacc ggcaagcgct ccaccagcgc cgccgtcctg 1560

gaggccctcc gcgaggccca ccccatcgtg gagaagatcc tgcagtaccg ggagctcacc 1620

aagctgaaga gcacctacat tgaccccttg ccggacctca tccaccccag gacgggccgc 1680

ctccacaccc gcttcaacca gacggccacg gccacgggca ggctaagtag ctccggcccc 1740

aacctccaga acatccccgt ccgcaccccg cttgggcaga ggatccgccg ggccttcatc 1800

gccgaggagg ggtggctatt ggtggtgctg gactatagcc agatagagct cagggtgctg 1860

gcccacctct ccggcgacga gaacctgatc cgggtcttcc aggaggggcg ggacatccac 1920

acggagaccg ccagctggat gttcggcgtc ccccgggagg ccgtggaccc cctgatgcgc 1980

cgggcggcca agaccatcaa cttcggggtc ctctacggca tgtcggccca ccgcctctcc 2040

caggagctag ccatccctta cgaggaggcc caggccttca ttgagcgcta ctttcagagc 2100

ttccccaagg tgcgggcctg gattgagaag accctggagg agggcaggag gcgggggtac 2160

gtggagaccc tcttcggccg ccgccgctac gtgccagacc tagaggcccg ggtgaagagc 2220

gtgcgggagg cggccgagcg ccgcgccttc aacatgcccg tccagggcac cgccgccgac 2280

ctcatgaagc tggctatggt gaagctcttc cccaggctgg aggaaatggg ggccaggatg 2340

ctccttcagg tccacgacga gctggtcctc gaggccccaa aagagagggc ggaggccgtg 2400

gcccggctgg ccaaggaggt catggagggg gtgtatcccc tggccgtgcc cctggaggtg 2460

gaggtgggga taggggagga ctggctctcc gccaaggagt ga 2502

<210> 4

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagaaggag atataccatg gatgatggga gaattaccaa ttgccccagt tgacagactt 60

ataagaaagg ctggtgctca gagagttagc gagcaagcag ctaaggtact tgcagagcac 120

cttgaggaaa aagctattga gatcgcaaaa aaggcagtag atcttgcaaa gcacgcaggt 180

agaaagaccg ttaaggtcga agacattaag ctcgcaatta agagcatgaa ttcggggatg 240

ctgcccctct ttgagcccaa gggccgggtc ctcctggtgg acggccacca cctggcctac 300

cgcaccttcc acgccctgaa gggcctcacc accagccggg gggagccggt gcaggcggtc 360

tacggcttcg ccaagagcct cctcaaggcc ctcaaggagg acggggacgc ggtgatcgtg 420

gtctttgacg ccaaggcccc ctccttccgc cacgaggcct acggggggta caaggcgggc 480

cgggccccca cgccggagga ctttccccgg caactcgccc tcatcaagga gctggtggac 540

ctcctggggc tggcgcgcct cgaggtcccg ggctacgagg cggacgacgt cctggccagc 600

ctggccaaga aggcggaaaa ggagggctac gaggtccgca tcctcaccgc cgacaaagac 660

ctttaccagc tcctttccga ccgcatccac gtcctccacc ccgaggggta cctcatcacc 720

ccggcctggc tttgggaaaa gtacggcctg aggcccgacc agtgggccga ctaccgggcc 780

ctgaccgggg acgagtccga caaccttccc ggggtcaagg gcatcgggga gaagacggcg 840

aggaagcttc tggaggagtg ggggagcctg gaagccctcc tcaagaacct ggaccggctg 900

aagcccgcca tccgggagaa gatcctggcc cacatggacg atctgaagct ctcctgggac 960

ctggccaagg tgcgcaccga cctgcccctg gaggtggact tcgccaaaag gcgggagccc 1020

gaccgggaga ggcttagggc ctttctggag aggcttgagt ttggcagcct cctccacgag 1080

ttcggccttc tggaaagccc caaggccctg gaggaggccc cctggccccc gccggaaggg 1140

gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag aagcccatgt gggccgatct tctggccctg 1200

gccgccgcca gggggggccg ggtccaccgg gcccccgagc cttataaagc cctcagggac 1260

ctgaaggagg cgcgggggct tctcgccaaa gacctgagcg ttctggccct gagggaaggc 1320

cttggcctcc cgcccggcga cgaccccatg ctcctcgcct acctcctgga cccttccaac 1380

accacccccg tgggggtggc ccggcgctac ggcggggagt ggacggagga ggcgggggag 1440

cgggccgccc tttccgagag gctcttcgcc aacctgtggg ggaggcttga gggggaggag 1500

aggctccttt ggctttaccg ggaggtggag aggccccttt ccgctgtcct ggcccacatg 1560

gaggccacgg gggtgcgcct ggacgtggcc tatctcaggg ccttgtccct ggaggtggcc 1620

gaggagatcg cccgcctcga ggccgaggtc ttccgcctgg ccggccaccc cttcaacctc 1680

aactcccggg accagctgga aagggtcctc tttgacgagc tagggcttcc cgccatcggc 1740

aagacgaaga agaccggcaa gcgctccacc agcgccgccg tcctggaggc cctccgcgag 1800

gcccacccca tcgtggagaa gatcctgcag taccgggagc tcaccaagct gaagagcacc 1860

tacattgacc ccttgccgga cctcatccac cccaggacgg gccgcctcca cacccgcttc 1920

aaccagacgg ccacggccac gggcaggcta agtagctccg gccccaacct ccagaacatc 1980

cccgtccgca ccccgcttgg gcagaggatc cgccgggcct tcatcgccga ggaggggtgg 2040

ctattggtgg tgctggacta tagccagata gagctcaggg tgctggccca cctctccggc 2100

gacgagaacc tgatccgggt cttccaggag gggcgggaca tccacacgga gaccgccagc 2160

tggatgttcg gcgtcccccg ggaggccgtg gaccccctga tgcgccgggc ggccaagacc 2220

atcaacttcg gggtcctcta cggcatgtcg gcccaccgcc tctcccagga gctagccatc 2280

ccttacgagg aggcccaggc cttcattgag cgctactttc agagcttccc caaggtgcgg 2340

gcctggattg agaagaccct ggaggagggc aggaggcggg ggtacgtgga gaccctcttc 2400

ggccgccgcc gctacgtgcc agacctagag gcccgggtga agagcgtgcg ggaggcggcc 2460

gagcgccgcg ccttcaacat gcccgtccag ggcaccgccg ccgacctcat gaagctggct 2520

atggtgaagc tcttccccag gctggaggaa atgggggcca ggatgctcct tcaggtccac 2580

gacgagctgg tcctcgaggc cccaaaagag agggcggagg ccgtggcccg gctggccaag 2640

gaggtcatgg agggggtgta tcccctggcc gtgcccctgg aggtggaggt ggggataggg 2700

gaggactggc tctccgccaa ggagtga 2727

Claims (12)

1.一种融合的Taq DNA聚合酶，其特征在于，编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列插入pET-28a表达载体经重组得到。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含载体，所述载体包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

7.权利要求1所述的融合的Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，构建含有SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的载体，转化至宿主细胞获得重组细胞，表达融合的Taq DNA聚合酶。

8.一种Taq DNA聚合酶试剂，所述试剂中含有权利要求1所述融合的Taq DNA聚合酶。

9.权利要求1所述融合的Taq DNA聚合酶在PCR中的应用。

10.权利要求1所述融合的Taq DNA聚合酶在直接用血液作为模板进行PCR扩增中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，血液在PCR反应体系中的体积占比不高于20%。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，血液在PCR反应体系中的体积占比不高于15%。

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