CN111690626B

CN111690626B - 一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111690626B
Application number: CN202010634495.9A
Authority: CN
Inventors: 曹林; 聂俊伟; 瞿志鹏; 张力军; 吴恒; 韩锦雄; 江明扬
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111690626A

Abstract

本发明提供了一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述融合型Taq DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶突变体和DNA结合蛋白，所述Taq DNA聚合酶突变体为将野生型Taq DNA聚合酶的螺旋‑发夹‑螺旋DNA结合区的一个或多个位点进行取代突变而获得的蛋白质。本发明的融合型Taq DNA聚合酶具有增强的核酸结合能力、扩增速度和对杂质的耐受能力，对逆转录酶的抑制作用具有良好的抗性，对痕量模板具有良好的扩增性能，可以省略核酸提取步骤而直接对生物样本进行检测；由此构建的一步法RT‑qPCR试剂盒检测速度快、灵敏度高、准确性好，在RNA病毒检测领域具有广泛的应用前景。

Description

一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

目前，RNA病毒的检测方法主要包括免疫检测和核酸检测，其中，核酸检测以RT-qPCR应用最为广泛，具有检测速度快、准确性高的特点。RT-qPCR即反转录实时荧光定量PCR，首先将RNA模板反转录为cDNA，再利用PCR进行定量检测的技术。RT-qPCR包括荧光染料法和荧光探针法：荧光染料法是利用荧光染料与双链DNA的小沟结合、指示扩增产物的增加；Taqman荧光探针是一段特异性寡核苷酸，两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光，PCR扩增时，聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，荧光基团和淬灭基团分离从而发出荧光。PCR过程中每一分子产物的生成都伴随着一分子荧光信号的产生，通过记录荧光信号实现对PCR过程的实时监测。利用多重荧光还可以实现对不同基因位点的同时鉴定。

RT-qPCR包括一步法和两步法。一步法RT-qPCR无需构建cDNA文库而克隆微量mRNA，cDNA合成与PCR反应在同一反应体系中进行，省略了cDNA与PCR之间的处理过程。两步法RT-qPCR首先利用反转录酶合成cDNA，随后以cDNA为模板进行PCR，即RNA反转录与qPCR扩增分两步进行。与两步法相比，一步法RT-qPCR快速、简便，降低了污染几率、避免了RNA二级结构的形成、减少了PCR反应的错配率。而两步法RT-qPCR的优势在于存在中间产物cDNA，可以保存，qPCR只取逆转录产物的1/10进行反应，可以调整PCR条件，重现性强，在第二步qPCR反应体系中加入特异性引物，灵敏度高，成本低。但是，两步法RT-qPCR包括第一链cDNA合成和随后的qPCR反应，容易造成污染。在临床的实践应用中，为了快速获得检测结果、避免开盖操作导致的污染问题，主要采用一步法RT-qPCR进行，目前已经获得临床许可的新型冠状病毒肺炎检测试剂盒多基于单重或者多重一步法RT-qPCR。

在一步法RT-qPCR中，一个反应体系中的逆转录酶和DNA聚合酶分别行使cDNA合成和PCR扩增的功能。逆转录酶(RTase)是存在于RNA病毒体内的RNA依赖性DNA聚合酶，具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA的第一条链；(2)Rnase水解活性：水解Rnase杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以一条DNA链为模板合成互补的双链DNA。

在选择逆转录酶时，一般选择无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶，具有RNaseH活性的逆转录酶会与聚合酶竞争结合RNA模板和DNA引物(或cDNA延伸链)，形成杂合链，并降解杂合链中的RNA链；被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量与长度。DNA聚合酶一般选择具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。

在文献报道和实际应用中，一步法RT-qPCR存在的主要问题为逆转录酶对DNA聚合酶具有较强的抑制作用，降低了灵敏度和扩增效率，尤其当模板量较低时，容易出现线型斜趴、扩增不起线的现象，严重影响了微量模板的检出率与检测限。目前研究人员对造成这一现象的原因及分子机制尚无清晰的了解，主要通过调整两种酶的比例和缓冲体系组成进行缓解，但是不能从根本上解决这一问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用，通过对野生型Taq DNA聚合酶进行定向改造，提高Taq DNA聚合酶的模板结合能力、模板扩增能力和杂质耐受能力，减弱RTase对Taq DNA聚合酶的抑制作用，有利于提高一步法RT-qPCR对痕量模板的检测灵敏度，适用于对病毒进行直接扩增检测。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体为将野生型Taq DNA聚合酶的螺旋-发夹-螺旋DNA结合区(HhH2)的一个或多个位点进行取代突变而获得的蛋白质。

本发明中，以野生型Taq DNA聚合酶为基础，以增强酶的扩增速度、杂质耐受能力为目的，通过对螺旋-发夹-螺旋DNA结合区(Helix-hairpin-helix motif)进行定向进化筛选，得到一株抗逆性较好的Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体对检测体系中的唾液、痰液或血液杂质具有显著增强的耐受能力，并对逆转录酶具有显著增强的抗抑制能力。

优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体为将野生型Taq DNA聚合酶的第187位氨基酸和/或第230位氨基酸进行取代突变而获得的蛋白质。

本发明中，Taq DNA聚合酶突变体的突变位点包括第187位氨基酸和/或第230位氨基酸，所述第187位氨基酸位点位于野生型Taq DNA聚合酶的DNA结合区域(Helix-hairpin-helix class 2(Pol1 family)motifs)，所述第230位氨基酸位点位于野生型Taq DNA聚合酶的DNA结合区域(Helix-hairpin-helix class 1(Pol1 family)motifs)，是该区域的核心氨基端。

优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的突变位点包括G187A、G187D、E230K、E230R或E230H中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，将野生型Taq DNA聚合酶的第187位甘氨酸突变为丙氨酸或天冬氨酸，将中性氨基酸突变为酸性氨基酸，但是不改变氨基酸的极性，将第230位谷氨酸突变为赖氨酸、精氨酸或组氨酸，将酸性氨基酸突变为碱性氨基酸，但是同样不改变氨基酸的极性；上述突变位点位于DNA结合区，显著增强了Taq DNA聚合酶突变体对核酸的亲和力与结合力，同时显著提高了该突变体的扩增速度和对杂质的耐受能力。

优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的突变位点包括G187A和E230K。

优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTADESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIRKKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE。

第二方面，本发明提供了一种融合型Taq DNA聚合酶，所述融合型Taq DNA聚合酶包括第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体和DNA结合蛋白。

优选地，所述DNA结合蛋白连接于所述Taq DNA聚合酶突变体的羧基端。

优选地，所述DNA结合蛋白包括硫化叶菌属来源的DNA结合蛋白。

本发明中，在第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体的羧基端添加DNA结合蛋白Sac7d(GenBank：AAA80315.1)，增加了融合蛋白的核酸结合结构域数量，增强了融合蛋白对核酸的结合能力，提高了融合蛋白的抗逆转录酶活性。

优选地，所述DNA结合蛋白包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

VKVKFKYKGEEKEVDTSKIKKVWRVGKMVSFTYDDNGKTGRGAVSEKDAPKELLDMLARAEREKK。

优选地，所述融合型Taq DNA聚合酶包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTADESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIRKKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKEVKVKFKYKGEEKEVDTSKIKKVWRVGKMVSFTYDDNGKTGRGAVSEKDAPKELLDMLARAEREKK。

本发明中，融合型Taq DNA聚合酶命名为Taq-M2，对逆转录酶的抑制作用具有显著增强的抵抗能力，对痕量模板具有良好的扩增性能，对唾液、痰液或血液等杂质的耐受能力强，可以实现对生物样本的直接检测而不需要提前进行核酸提取，所述融合型Taq DNA聚合酶应用于病毒检测，表现出灵敏度高、特异性好、杂质耐受性佳的优势。

第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码第二方面所述的融合型Taq DNA聚合酶的DNA片段。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

atgagggggatgctgcccctctttgagcccaagggccgggtcctcctggtggacggccaccacctggcctaccgcaccttccacgccctgaagggcctcaccaccagccggggggagccggtgcaggcggtctacggcttcgccaagagcctcctcaaggccctcaaggaggacggggacgcggtgatcgtggtctttgacgccaaggccccctccttccgccacgaggcctacggggggtacaaggcgggccgggcccccacgccggaggactttccccggcaactcgccctcatcaaggagctggtggacctcctggggctggcgcgcctcgaggtcccgggctacgaggcggacgacgtcctggccagcctggccaagaaggcggaaaaggagggctacgaggtccgcatcctcaccgccgacaaagacctttaccagctcctttccgaccgcatccacgtcctccaccccgaggggtacctcatcaccccggcctggctttgggaaaagtacggcctgaggcccgaccagtgggccgactaccgggccctgaccgccgacgagtccgacaaccttcccggggtcaagggcatcggggagaagacggcgaggaagcttctggaggagtgggggagcctggaagccctcctcaagaacctggaccggctgaagcccgccatccggaagaagatcctggcccacatggacgatctgaagctctcctgggacctggccaaggtgcgcaccgacctgcccctggaggtggacttcgccaaaaggcgggagcccgaccgggagaggcttagggcctttctggagaggcttgagtttggcagcctcctccacgagttcggccttctggaaagccccaaggccctggaggaggccccctggcccccgccggaaggggccttcgtgggctttgtgctttcccgcaaggagcccatgtgggccgatcttctggccctggccgccgccagggggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccctcagggacctgaaggaggcgcgggggcttctcgccaaagacctgagcgttctggccctgagggaaggccttggcctcccgcccggcgacgaccccatgctcctcgcctacctcctggacccttccaacaccacccccgagggggtggcccggcgctacggcggggagtggacggaggaggcgggggagcgggccgccctttccgagaggctcttcgccaacctgtgggggaggcttgagggggaggagaggctcctttggctttaccgggaggtggagaggcccctttccgctgtcctggcccacatggaggccacgggggtgcgcctggacgtggcctatctcagggccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcccgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggaccagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaagaccggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatcgtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgaccccttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggccacggccacgggcaggctaagtagctccgatcccaacctccagaacatccccgtccgcaccccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggccctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctgatccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggcgtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggggtcctctacggcatgtcggcccaccgcctctcccaggagctagccatcccttacgaggaggcccaggccttcattgagcgctactttcagagcttccccaaggtgcgggcctggattgagaagaccctggaggagggcaggaggcgggggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgctacgtgccagacctagaggcccgggtgaagagcgtgcgggaggcggccgagcgcatggccttcaacatgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctggctatggtgaagctcttccccaggctggaggaaatgggggccaggatgctccttcaggtccacgacgagctggtcctcgaggccccaaaagagagggcggaggccgtggcccggctggccaaggaggtcatggagggggtgtatcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctctccgccaaggaggtgaaggtaaagttcaagtataagggtgaagagaaagaagtagacacttcaaagataaagaaggtttggagagtaggcaaaatggtgtcctttacctatgacgacaatggtaagacaggtagaggagctgtaagcgagaaagatgctccaaaagaattattagacatgttagcaagagcagaaagagagaagaaataa。

优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5(带His-Tag)：

atgagggggatgctgcccctctttgagcccaagggccgggtcctcctggtggacggccaccacctggcctaccgcaccttccacgccctgaagggcctcaccaccagccggggggagccggtgcaggcggtctacggcttcgccaagagcctcctcaaggccctcaaggaggacggggacgcggtgatcgtggtctttgacgccaaggccccctccttccgccacgaggcctacggggggtacaaggcgggccgggcccccacgccggaggactttccccggcaactcgccctcatcaaggagctggtggacctcctggggctggcgcgcctcgaggtcccgggctacgaggcggacgacgtcctggccagcctggccaagaaggcggaaaaggagggctacgaggtccgcatcctcaccgccgacaaagacctttaccagctcctttccgaccgcatccacgtcctccaccccgaggggtacctcatcaccccggcctggctttgggaaaagtacggcctgaggcccgaccagtgggccgactaccgggccctgaccgccgacgagtccgacaaccttcccggggtcaagggcatcggggagaagacggcgaggaagcttctggaggagtgggggagcctggaagccctcctcaagaacctggaccggctgaagcccgccatccggaagaagatcctggcccacatggacgatctgaagctctcctgggacctggccaaggtgcgcaccgacctgcccctggaggtggacttcgccaaaaggcgggagcccgaccgggagaggcttagggcctttctggagaggcttgagtttggcagcctcctccacgagttcggccttctggaaagccccaaggccctggaggaggccccctggcccccgccggaaggggccttcgtgggctttgtgctttcccgcaaggagcccatgtgggccgatcttctggccctggccgccgccagggggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccctcagggacctgaaggaggcgcgggggcttctcgccaaagacctgagcgttctggccctgagggaaggccttggcctcccgcccggcgacgaccccatgctcctcgcctacctcctggacccttccaacaccacccccgagggggtggcccggcgctacggcggggagtggacggaggaggcgggggagcgggccgccctttccgagaggctcttcgccaacctgtgggggaggcttgagggggaggagaggctcctttggctttaccgggaggtggagaggcccctttccgctgtcctggcccacatggaggccacgggggtgcgcctggacgtggcctatctcagggccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcccgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggaccagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaagaccggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatcgtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgaccccttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggccacggccacgggcaggctaagtagctccgatcccaacctccagaacatccccgtccgcaccccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggccctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctgatccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggcgtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggggtcctctacggcatgtcggcccaccgcctctcccaggagctagccatcccttacgaggaggcccaggccttcattgagcgctactttcagagcttccccaaggtgcgggcctggattgagaagaccctggaggagggcaggaggcgggggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgctacgtgccagacctagaggcccgggtgaagagcgtgcgggaggcggccgagcgcatggccttcaacatgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctggctatggtgaagctcttccccaggctggaggaaatgggggccaggatgctccttcaggtccacgacgagctggtcctcgaggccccaaaagagagggcggaggccgtggcccggctggccaaggaggtcatggagggggtgtatcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctctccgccaaggaggtgaaggtaaagttcaagtataagggtgaagagaaagaagtagacacttcaaagataaagaaggtttggagagtaggcaaaatggtgtcctttacctatgacgacaatggtaagacaggtagaggagctgtaagcgagaaagatgctccaaaagaattattagacatgttagcaagagcagaaagagagaagaaacaccaccaccaccaccactaa。

第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的核酸分子。

第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括第四方面所述的表达载体。

优选地，所述宿主细胞的基因组中整合有第三方面所述的核酸分子。

第六方面，本发明提供了一种第二方面所述的融合型Taq DNA聚合酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将第三方面所述的核酸分子连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，诱导培养并收集上清液，分离纯化得到所述融合型Taq DNA聚合酶。

第七方面，本发明提供了一种RT-qPCR试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的融合型Taq DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒还包括所述融合型Taq DNA聚合酶的抗体。

本发明中，Taq DNA聚合酶的抗体，与Taq DNA polymerase结合后能够在65℃以下抑制Taq DNA polymerase的聚合酶活性，可以非常有效地抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。

优选地，所述试剂盒还包括逆转录酶。

优选地，所述试剂盒还包括引物对、荧光探针、荧光染料、dNTPs或PCR缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

第八方面，本发明提供了一种RT-qPCR方法，所述方法包括采用第七方面所述的试剂盒对生物样本和/或生物样本RNA进行检测的步骤。

第九方面，本发明提供了一种第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体、第二方面所述的融合型Taq DNA聚合酶、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的宿主细胞或第七方面所述的试剂盒在制备RNA病毒检测试剂中的应用。

优选地，所述RNA病毒包括新型冠状病毒和/或猪腹泻冠状病毒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对野生型Taq DNA聚合酶的第187位氨基酸和/或第230位氨基酸进行取代突变，得到的Taq DNA聚合酶突变体具有增强的核酸亲和力与结合力，对检测体系中的唾液、痰液或血液杂质具有显著增强的耐受能力，并对逆转录酶具有显著增强的抗抑制能力；

(2)本发明采用Taq DNA聚合酶突变体和DNA结合蛋白构建融合型Taq DNA聚合酶，进一步提高了融合蛋白对核酸的结合能力、扩增速度和对杂质的耐受能力，对逆转录酶的抑制作用具有良好的抗性，对痕量模板具有良好的扩增性能，可以省略核酸提取步骤而直接对生物样本进行检测；

(3)本发明的基于融合型Taq DNA聚合酶的RT-qPCR试剂盒检测速度快、灵敏度高、准确性好，在RNA病毒检测领域具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。

附图说明

图1为融合型DNA聚合酶(Taq-M2)和野生型Taq DNA聚合酶(Taq)对血液的耐受性检测结果图；

图2为一步法RT-qPCR对提取的猪腹泻冠状病毒RNA的检测结果图，DNA聚合酶分别为融合型DNA聚合酶(Taq-M2)和野生型Taq DNA聚合酶(Taq)；

图3为一步法RT-qPCR直接对猪腹泻冠状病毒的检测结果图，DNA聚合酶分别为融合型DNA聚合酶(Taq-M2)和野生型Taq DNA聚合酶(Taq)；

图4为一步法RT-qPCR对提取的新型冠状病毒RNA的检测结果图，样本中含有唾液杂质，DNA聚合酶分别为融合型DNA聚合酶(Taq-M2)和野生型Taq DNA聚合酶(Taq)。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料来源：

逆转录酶HiScript II Reverse Transcriptase购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号为R201-01；野生型Taq DNA聚合酶(Champagne Taq DNA polymerase)及反应液(10×Champagne Taq Buffer(Mg²⁺plus))购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号为P122-d2；Taq DNA聚合酶突变体封闭处理用抗体Champagne Taq antibody购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号为P121-01。

实施例1融合型Taq DNA聚合酶的制备

将SEQ ID NO:5所示的核酸序列装载至pET28，通过组氨酸标签(His-Tag)进行纯化，构建融合型Taq DNA聚合酶的表达载体；将构建成功的表达载体转入宿主细胞，液体培养基培养，当OD600＝0.4～0.6时加入终浓度为1mM的IPTG，16℃、180rpm诱导表达过夜。收集菌体，超声破碎后进行过柱纯化，步骤如下：

(1)利用低压层析系统，将上清液以0.5mL/min的流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱中(生工生物工程(上海)股份有限公司)；

(2)采用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min的流速冲洗层析柱，至流出液的OD280值达到基线；

(3)采用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min的流速冲洗层析柱，至流出液的OD280值达到基线；

(4)采用Ni-IDA ELution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min的流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

(5)采用Bradford检测蛋白浓度，并采用12％SDS-PAGE检测蛋白纯度；

(6)采用超滤管(Minipore)进行蛋白浓缩，得到纯化的融合型Taq DNA聚合酶，标准测活后采用储存缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油，pH8.0)稀释，保存于-20℃。

实施例2

本实施例以λDNA为模板，以人全血作为杂质投入λDNA模板中，投入量分别为0％、5％、10％和15％，采用融合型DNA聚合酶(Taq-M2)进行PCR扩增，引物如SEQ ID NO:6～7所示，扩增体系如表1所示，并设置野生型Taq DNA聚合酶(Taq)对照组，对照组的扩增体系如表2所示；

λDNA上游引物(SEQ ID NO:6)：AGCAGTGCAGCGAACTGAGC；

λDNA下游引物(SEQ ID NO:7)：AAGCGCAGACGGTCGATGT。

表1融合型DNA聚合酶(Taq-M2)扩增体系

表2野生型Taq DNA聚合酶(Taq)扩增体系

成分	加入量(μL)
		Champagne Taq DNA polymerase(5U/μL)	1
10×Champagne Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2
		λDNA上游引物(10μM)	0.4
λDNA下游引物(10μM)	0.4
		λDNA(100ng/μL)	2
稀释血液	5
		DEPC H<sub>2</sub>O	补齐至20

扩增程序如表3所示：95℃预变性5min；扩增循环为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸5min。

表3 PCR扩增程序

结果如图1所示，扩增产物的长度为2Kb，在人全血的投入量为0％～15％的范围内，融合型DNA聚合酶(Taq-M2)均可以耐受人全血杂质，扩增出目的条带；而野生型Taq DNA聚合酶(Taq)仅可以耐受低浓度的人全血杂质，当人全血杂质的浓度升高到15％后，便无法成功扩增出目的条带。

实施例3

本实施例以猪腹泻冠状病毒(PEDV)疫苗为样本，采用病毒核酸快速提取试剂盒(货号R312-01)提取病毒RNA，步骤如下：

(1)在1.5mL无RNA酶(RNase-free)离心管中加入200μL无水乙醇，多个样品预先分装；

(2)加入200μL样品，涡旋混匀；

(3)将吸附柱置于2mL收集管中，添加上述混合液至吸附柱中，12000g离心1min；

(4)弃滤液，将吸附柱装回2mL收集管中，加入600μL漂洗液(预先加入无水乙醇)，12000g离心30sec，弃滤液；

(5)重复步骤(4)一次；

(6)将吸附柱装回收集管中，12000g空柱离心2min；

(7)将吸附柱转移至新的1.5mL收集管(试剂盒提供)中，加入50μL洗脱液至吸附柱的膜中央，室温放置1min，12000g离心1min；

(8)弃去吸附柱，得到猪腹泻冠状病毒(PEDV)RNA，直接用于后续检测或置于-30～-15℃短期保存或置于-70℃以下长期保存；

(9)将提取的RNA进行10倍梯度稀释，添加量分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，并以DEPC H₂O作为阴性对照组，每个稀释梯度重复两个复孔，进行PCR扩增。

PCR扩增引物如SEQ ID NO:8～9所示，荧光探针如SEQ ID NO:10所示，扩增体系如表4所示，并设置野生型Taq DNA聚合酶(Taq)对照组，对照组的扩增体系如表5所示，扩增条件如表6所示，PCR扩增在

3进行上机反应；

PEDV上游引物(SEQ ID NO:8)：CGTGAGCCTGGCTTAGTCTTG；

PEDV下游引物(SEQ ID NO:9)：CATACGTCGCGATGAAACAAA；

PEDV荧光探针(SEQ ID NO:10)：

Cy5-CGCATGAACTTCAAAATCATACTGCGACG-BHQ2。

表4融合型DNA聚合酶(Taq-M2)扩增体系

成分	加入量(μL)
		HiScript II Reverse Transcriptase	1
Taq-M2(5U/μL)	1
		Champagne Taq antibody(5U/μL)	1
10×Champagne Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2
		PEDV上游引物(10μM)	0.4
PEDV下游引物(10μM)	0.4
		PEDV荧光探针(10μM)	0.2
RNA模板样本	2
		DEPC H<sub>2</sub>O	补齐至20

表5野生型Taq DNA聚合酶(Taq)扩增体系

成分	加入量(μL)
		HiScript II Reverse Transcriptase	1
Champagne Taq DNA polymerase(5U/μL)	1
		10×Champagne Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2
PEDV上游引物(10μM)	0.4
		PEDV下游引物(10μM)	0.4
PEDV荧光探针(10μM)	0.2
		RNA模板样本	2
DEPC H<sub>2</sub>O	补齐至20

表6 qPCR扩增条件

结果如图2所示，Taq-M2显示出更好的扩增线型，平台较Taq-WT高将近一倍，灵敏度在每个稀释梯度下提前1～1.5个Ct值，具有更高的检测灵敏度和有效性。

实施例4

本实施例以猪腹泻冠状病毒(PEDV)疫苗为样本，不进行病毒RNA提取，直接采用5μL和0.5μL样本为模板进行RT-qPCR，引物探针序列和扩增体系与实施例3相同，扩增条件如表7所示。

表7 qPCR扩增条件

结果如图3所示，在投入病毒进行直接扩增时，Taq-M2较Taq-WT显示出明显的扩增优势，两个稀释梯度下灵敏度提前2～3个Ct值，平台也高出一倍。显示出Taq-M2在病毒样本直接裂解扩增的优异性能。

实施例5

本实施例以新型冠状病毒的ORF1ab和N基因合成的假病毒为样本，采用实施例3的方法提取病毒RNA后，进行10倍梯度稀释，以10⁰和10^-1作为模板投入，并加入5μL唾液作为杂质。

ORF1ab的扩增引物和荧光探针如SEQ ID NO:11～13所示，N基因的扩增引物和荧光探针如SEQ ID NO:14～16所示，扩增体系如表8所示，并设置野生型Taq DNA聚合酶(Taq)对照组，对照组的扩增体系如表9所示，扩增条件如表10所示，PCR扩增在

3进行上机反应；

ORF1ab上游引物(SEQ ID NO:11)：GTGARATGGTCATGTGTGGCGG；

ORF1ab下游引物(SEQ ID NO:12)：

CARATGTTAAASACACTATTAGCATA；

ORF1ab荧光探针(SEQ ID NO:13)：

FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ1；

N基因上游引物(SEQ ID NO:14)：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；

N基因下游引物(SEQ ID NO:15)：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；

N基因荧光探针(SEQ ID NO:16)：

ROX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1。

表8融合型DNA聚合酶(Taq-M2)扩增体系

成分	加入量(μL)
		HiScript II Reverse Transcriptase	1
Taq-M2(5U/μL)	1
		Champagne Taq antibody(5U/μL)	1
10×Champagne Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>plus)	2
		ORF1ab上游引物(10μM)	0.4
ORF1ab下游引物(10μM)	0.4
		ORF1ab荧光探针(10μM)	0.2
N基因上游引物(10μM)	0.4
		N基因下游引物(10μM)	0.4
N基因荧光探针(10μM)	0.2
		RNA模板样本	2
唾液	5
		DEPC H<sub>2</sub>O	补齐至20

表9野生型Taq DNA聚合酶(Taq)扩增体系

表10 qPCR扩增条件

结果如图4所示，Ct统计如表11所示，说明有杂质样本唾液存在时，Taq-M2具有更好的检测灵敏度，显示出更好的耐受度，Ct值统计结果显示Taq-M2每一重的灵敏度平均提前1.5个Ct值，并且两重扩增较为均衡。

表11 Ct统计结果

综上所述，本发明的Taq DNA聚合酶突变体具有增强的模板结合能力、模板扩增能力和杂质耐受能力，与DNA结合蛋白融合构建的融合型Taq DNA聚合酶对逆转录酶的抑制作用具有良好的抗性，由此构建的试剂盒实现了一步法RT-qPCR检测生物样本的技术效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京诺唯赞生物科技有限公司

<120> 一种融合型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

<130> 20200701

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Ala Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Lys Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Gly Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr

1 5 10 15

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe Thr

20 25 30

Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp

35 40 45

Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys

50 55 60

Lys

65

<210> 3

<211> 897

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Ala Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Lys Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Gly Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

Val Lys Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr

835 840 845

Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Val Ser Phe Thr

850 855 860

Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu Lys Asp

865 870 875 880

Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys

885 890 895

Lys

<210> 4

<211> 2694

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120

gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180

gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240

tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300

gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360

gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420

gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480

tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540

gactaccggg ccctgaccgc cgacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600

gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660

ctggaccggc tgaagcccgc catccggaag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720

ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780

aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840

ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900

ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960

cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020

gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080

ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140

gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200

gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260

gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320

ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380

ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440

cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500

cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560

gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620

ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680

cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740

ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800

gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860

cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920

gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980

gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040

gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100

cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160

gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220

cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280

atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340

cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400

cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460

gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggaggtga aggtaaagtt caagtataag 2520

ggtgaagaga aagaagtaga cacttcaaag ataaagaagg tttggagagt aggcaaaatg 2580

gtgtccttta cctatgacga caatggtaag acaggtagag gagctgtaag cgagaaagat 2640

gctccaaaag aattattaga catgttagca agagcagaaa gagagaagaa ataa 2694

<210> 5

<211> 2712

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120

gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180

gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240

tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300

gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360

gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420

gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480

tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540

gactaccggg ccctgaccgc cgacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600

gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660

ctggaccggc tgaagcccgc catccggaag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720

ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780

aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840

ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900

ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960

cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020

gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080

ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140

gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200

gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260

gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320

ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380

ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440

cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500

cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560

gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620

ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680

cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740

ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800

gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860

cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920

gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980

gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040

gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100

cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160

gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220

cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280

atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340

cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400

cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460

gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggaggtga aggtaaagtt caagtataag 2520

ggtgaagaga aagaagtaga cacttcaaag ataaagaagg tttggagagt aggcaaaatg 2580

gtgtccttta cctatgacga caatggtaag acaggtagag gagctgtaag cgagaaagat 2640

gctccaaaag aattattaga catgttagca agagcagaaa gagagaagaa acaccaccac 2700

caccaccact aa 2712

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcagtgcag cgaactgagc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagcgcagac ggtcgatgt 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtgagcctg gcttagtctt g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catacgtcgc gatgaaacaa a 21

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgcatgaact tcaaaatcat actgcgacg 29

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgaratggt catgtgtggc gg 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caratgttaa asacactatt agcata 26

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims

1.一种融合型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述融合型Taq DNA聚合酶由Taq DNA聚合酶突变体和DNA结合蛋白组成；

所述DNA结合蛋白连接于所述Taq DNA聚合酶突变体的羧基端；

所述Taq DNA聚合酶突变体为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

所述DNA结合蛋白为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

所述融合型Taq DNA聚合酶为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1所述的融合型Taq DNA聚合酶的DNA片段；

所述核酸分子为SEQ ID NO:4所示的核酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求2所述的核酸分子。

6.一种权利要求1所述的融合型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求2所述的核酸分子连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

7.一种RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的融合型Taq DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述融合型Taq DNA聚合酶的抗体。

9.根据权利要求7所述的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶。

10.根据权利要求7所述的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物对、荧光探针、荧光染料、dNTPs或PCR缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

11.一种非诊断目的的RT-qPCR方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求7-10中任一项所述的试剂盒对生物样本和/或生物样本RNA进行检测的步骤。

12.一种权利要求1所述的融合型Taq DNA聚合酶、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4或5所述的宿主细胞或权利要求7-10中任一项所述的试剂盒在制备RNA病毒检测试剂中的应用。