CN108192907B - 一种热稳定dna扩增融合酶 - Google Patents

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract

本发明提供一种热稳定DNA扩增融合酶。该热稳定DNA扩增融合酶由Taq DNA聚合酶与一种来自于海洋纳米古菌（Nanoarchaeum equitans）的DNA结合蛋白相连接获得，所述结合通过Taq DNA聚合酶与DNA结合蛋白通过构建融合蛋白载体进行原核表达实现。表达后的产物保持了Taq DNA聚合酶的聚合活性，同时DNA结合蛋白与PCR反应中的DNA模板‑引物复合体具有较强的结合作用，极大增强了PCR反应的效率。使用该方法制备的DNA扩增融合酶不仅可以广泛使用于分子生物学等科研领域，还可以应用于临床分子诊断、法医学检测、食品及环境监测等多个领域。

Description

一种热稳定DNA扩增融合酶
技术领域
本发明涉及一种热稳定DNA扩增融合酶，属于生物技术的应用领域。
背景技术
获得过诺贝尔奖的PCR (Polymerase Chain Reaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它的目的是使得DNA片断在短时间内迅速扩增。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。被许多科学家视为近几十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。
Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus (Taq)中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，对于PCR的应用有里程碑的意义。PCR循环包括变性（90°C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，可以将底物模板在很短的1-2个小时内增加几千万到几十亿倍。特别是实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断。
PCR的性能及其结果的精确度和准确度通常与热稳定性DNA聚合酶有关，酶的选择是反应成功的关键。因此在科研或临床上，DNA聚合酶对各种极低浓度的微量样品的扩增效率是直接导致PCR成败的重要因素。影响PCR扩增效率的一个主要因素是DNA聚合酶与DNA模板-引物复合体的结合能力。在反应的设置中，常规DNA聚合酶与DNA模板-引物复合物的相互作用是基于DNA聚合酶本身的三维构象，所以，如何在不改变其热稳定性的前提下，通过改变DNA聚合酶的蛋白质结构从而增强其与模板-引物复合物的结合和相互作用、降低对模板结构的敏感性、增强对高GC含量等困难模板的扩增能力成为了提高Taq酶扩增效率的重要研究方向。
发明内容
基于以上原因，本发明的目的在于优化设计并表达纯化出一种具有较高扩增效率的热稳定DNA扩增融合酶，以及其制备方法，并进一步提供了该热稳定DNA扩增融合酶的氨基酸和基因编码信息。其成果可广泛使用于分子生物学等科研领域，及临床分子诊断、法医学检测、食品及环境监测等多个领域。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
一种热稳定DNA扩增融合酶，采用如下步骤：
步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQNO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过GGTACTGGTACTGGTGGT所组成的连接序列相连接；
步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；
步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；
步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50μg /ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50μg /ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mM IPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时；5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，-20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80V电泳，10%分离胶，120V电泳，进行SDS-PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致，融合酶的表达条件为1mMIPTG,37℃诱导培养5小时；
步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；2L级别的发酵培养和诱导的条件按照步骤四中表达条件确立的方法进行；采用XZ-8M型大容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4℃离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml 50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM ImidazolcpH8.0缓冲液中,震荡离心4℃离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后茵泥重悬于50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM Imidazolc pH8.0缓冲液中，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF利0.5mM EDTA,采用HN92-II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400伏、超声4s、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,-20℃冻存待用；然后再采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液50mM NaH2P04,500mM KC1,20mM Imi dazole, 2mM DTT pH8.0洗涤到基线，Protio@NI-NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱;Sephdex G-25脱盐柱脱盐;SP阳离子柱离子梯洗脱; Superdex 200分子筛柱分离;50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50%的甘油、0.5% Tween-20、0.5% NP-40和200μg/ml BSA，得到6ml融合酶蛋白。
采用上述技术方案的有益效果是：
1) 本发明的热稳定DNA扩增融合酶中的DNA结合蛋白能在PCR反应体系里面增强酶与DNA模板-引物复合物的相互作用，降低对模板结构的敏感性，从而增强了Taq DNA 聚合酶的聚合活性，由于融合的蛋白也是来源于一种耐高温的古菌菌株，使得融合酶扩增时依然具有耐高温的特性，同时，具有更强的特异性和扩增效率。
2) 本发明的热稳定DNA扩增融合酶可广泛应用于高灵敏度和有较强背景基因组扩增( 如基因组中某个特定基因位点或外源病原体的检测)、DNA序列测定、MultiplexPCR、TA克隆等。
3) 本发明提供的制备热稳定DNA扩增融合酶方法能简单、有效的制备具有稳定增强PCR反应效率的DNA聚合酶。
附图说明
图1为电泳的结果示意图。
图2为纯化后的电泳结果示意图。
图3为扩增后的电泳结果A示意图。
图4为扩增后的电泳结果B示意图。
具体实施方式
实施例一：融合酶基因工程菌的建立
1、融合基因序列的合成
采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQ NO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过GGTACTGGTACTGGTGGT所组成的连接序列相连接，以便于表达纯化出来的融合酶的两个功能区保持原有蛋白的天然构象，发挥各个功能区原有的分子生物学功能。
2、表达载体的构建
再将以上所述两部分功能区和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码。全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存。
3、基因工程菌的制备
将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500ul的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用。
实施例二：融合酶表达条件的确立
挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养。第二天在5个100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50ug/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8左右时，其中一个培养管不加IPTG诱导剂，另外四管，两两各加入0.5mM和1mMIPTG，两两各在30℃和37℃诱导培养5小时。
5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100V、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，-20℃冻存。
按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5%，80V电泳，10%分离胶，120V电泳，进行SDS-PAGE电泳。电泳的结果图1所示，得到的目的片段的大小为108KD左右，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致，融合酶的最佳表达条件为1mM IPTG,37℃诱导培养5小时。
实施例三：融合酶的纯化
为方便小规模纯化，获得亳克级的融合酶,满足下一步用于融合酶的质量控制和初步应用中实验需求,进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化。
2L级别的发酵培养和诱导的条件按照实施方法二中表达条件确立的方法进行。采用XZ-8M型人容量低温高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司),5000rpm,5分钟,4°C离心去菌液，收集菌体。再重悬于100ml (50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM Imidazolc pH8.0) 缓冲液中,震荡离心4'C离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留。将沉淀后菌泥重悬于以上同样溶液中，为避免蛋白的降解，维持蛋白的构象和避免蛋白聚集,在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF利0.5mM EDTA,采用HN92-II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400伏、超声4S、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,-20℃冻存待用。
采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器(利穗科技(苏州) 有限公司) 对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液(50mM NaH2P04,500mM KC1,20mM Imi dazole, 2mM DTTpH8.0) 洗涤到基线，Protio@NI-NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱;Sephdex G-25脱盐柱脱盐;SP阳离子柱离子梯洗脱; Superdex 200分子筛柱分离;50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50%的甘油、0.5% Tween-20、0.5% NP-40和200μg/ml BSA，得到6ml (2.5mg/ml)融合酶蛋白。纯化后的电泳结果如图2所示。
实施例四：融合酶与普通非融合taq酶扩增效率的比较
分别以人、小鼠、芸豆基因组DNA作为检测模板，用PCR反应体系来验证酶的扩增效率。25ul反应体系：10×PCR buffer 2.5ul, 2mM MgCl2, 0.4uM上下游引物，200uM dNTP,0.5ng DNA模板，0.5ul聚合酶。反应条件为95℃ 3min,94℃ 20s, 55℃ 20s, 70℃ 20s,30个循环。水作为阴性对照。
扩增时所使用的引物如下：
HomoActin-F：5′-ctgagcgcaagtactccgtgt-3′
HomoActin-R：5′-tctgcgcaagttaggttttgtc-3′
MusActin-F：5′-cagccatgtacgtagccatc-3′
MusActin-R：5′-cacgctcggtcaggatcttc-3′
PV-F：5′-tgtacggtgaaggatggc-3′
PV-R：5′-caaacacaggtagcagcatc-3′
扩增后的电泳结果如图3所示，从左到右第一条为marker，第2-4条为融合酶扩增结果；第5、6条为阴性对照，第7-9条为非融合酶。热稳定DNA扩增融合酶的扩增效果明显优于普通非融合taq酶的结果。
实施例五：融合酶与其它品牌商业化DNA聚合酶扩增效率的比较
将上述实施案例中的人基因组DNA分别稀释10倍、100倍、1000倍后作为检测模板，用PCR反应体系来验证酶的扩增效率。25ul反应体系：10×PCR buffer 2.5ul,2mM MgCl2,0.4uM上下游引物，200uM dNTP, 0.5ng DNA模板，0.5ul聚合酶。反应条件为95℃ 3min,94℃ 20s, 55℃ 20s, 70℃ 20s,30个循环。水作为阴性对照。
扩增时所使用的引物如下：
HomoActin-F：5′-ctgagcgcaagtactccgtgt-3′
HomoActin-R：5′-tctgcgcaagttaggttttgtc-3′
扩增后的电泳结果如图4所示，从左到右第一条为marker，第2-4条为商业酶三个梯度扩增，第5-7条为融合蛋白，第8条为阴性对照热稳定DNA扩增融合酶的扩增效果明显优于其它商业化品牌的DNA聚合酶的结果。
序列表
<110> 遵义医学院
<120> 一种热稳定DNA扩增融合酶
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 高保真酶基因
<400> 1
atgccagagg tattcatcgg gaaaaagcca ttaaccaatt atgtaatggc agtagtaatg 60
caattcatgc aaggcgcaaa cgaagtagta ataaaagcaa gaggtagaaa catttctaga 120
gcagtagatg tagcagaaag agtaagaaaa agattcttag ctggccaagt agatgttgga 180
gacataaaaa ttgattctga agaagtagta gacccagcaa caggacaaaa aaggacagta 240
tcaacaatag aaataaaatt agttaagaaa taa 273
<210> 2
<211> 2499
<212> DNA
<213> 高保真酶基因
<400> 2
atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120
gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180
gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240
tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300
gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360
gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420
gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgccctcca ccccgagggg 480
tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540
gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600
gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660
ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720
ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780
aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840
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ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960
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gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200
gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260
gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320
ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380
ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440
cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500
cccgccatcg gcaagacgga gaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560
gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtaccggga gctcaccaag 1620
ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680
cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740
ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800
gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860
cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920
gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgccgg 1980
gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040
gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100
cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160
gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220
cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280
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cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460
gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499
<210> 3
<211> 2784
<212> DNA
<213> 融合酶基因
<400> 3
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caattcatgc aaggcgcaaa cgaagtagta ataaaagcaa gaggtagaaa catttctaga 120
gcagtagatg tagcagaaag agtaagaaaa agattcttag ctggccaagt agatgttgga 180
gacataaaaa ttgattctga agaagtagta gacccagcaa caggacaaaa aaggacagta 240
tcaacaatag aaataaaatt agttaagaaa ggtactggta ctggtggtat gagggggatg 300
ctgcccctct ttgagcccaa gggccgggtc ctcctggtgg acggccacca cctggcctac 360
cgcaccttcc acgccctgaa gggcctcacc accagccggg gggagccggt gcaggcggtc 420
tacggcttcg ccaagagcct cctcaaggcc ctcaaggagg acggggacgc ggtgatcgtg 480
gtctttgacg ccaaggcccc ctccttccgc cacgaggcct acggggggta caaggcgggc 540
cgggccccca cgccggagga ctttccccgg caactcgccc tcatcaagga gctggtggac 600
ctcctggggc tggcgcgcct cgaggtcccg ggctacgagg cggacgacgt cctggccagc 660
ctggccaaga aggcggaaaa ggagggctac gaggtccgca tcctcaccgc cgacaaagac 720
ctttaccagc tcctttccga ccgcatccac gccctccacc ccgaggggta cctcatcacc 780
ccggcctggc tttgggaaaa gtacggcctg aggcccgacc agtgggccga ctaccgggcc 840
ctgaccgggg acgagtccga caaccttccc ggggtcaagg gcatcgggga gaagacggcg 900
aggaagcttc tggaggagtg ggggagcctg gaagccctcc tcaagaacct ggaccggctg 960
aagcccgcca tccgggagaa gatcctggcc cacatggacg atctgaagct ctcctgggac 1020
ctggccaagg tgcgcaccga cctgcccctg gaggtggact tcgccaaaag gcgggagccc 1080
gaccgggaga ggcttagggc ctttctggag aggcttgagt ttggcagcct cctccacgag 1140
ttcggccttc tggaaagccc caaggccctg gaggaggccc cctggccccc gccggaaggg 1200
gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag gagcccatgt gggccgatct tctggccctg 1260
gccgccgcca gggggggccg ggtccaccgg gcccccgagc cttataaagc cctcagggac 1320
ctgaaggagg cgcgggggct tctcgccaaa gacctgagcg ttctggccct gagggaaggc 1380
cttggcctcc cgcccggcga cgaccccatg ctcctcgcct acctcctgga cccttccaac 1440
accacccccg agggggtggc ccggcgctac ggcggggagt ggacggagga ggcgggggag 1500
cgggccgccc tttccgagag gctcttcgcc aacctgtggg ggaggcttga gggggaggag 1560
aggctccttt ggctttaccg ggaggtggag aggccccttt ccgctgtcct ggcccacatg 1620
gaggccacgg gggtgcgcct ggacgtggcc tatctcaggg ccttgtccct ggaggtggcc 1680
gaggagatcg cccgcctcga ggccgaggtc ttccgcctgg ccggccaccc cttcaacctc 1740
aactcccggg accagctgga aagggtcctc tttgacgagc tagggcttcc cgccatcggc 1800
aagacggaga agaccggcaa gcgctccacc agcgccgccg tcctggaggc cctccgcgag 1860
gcccacccca tcgtggagaa gatcctgcag taccgggagc tcaccaagct gaagagcacc 1920
tacattgacc ccttgccgga cctcatccac cccaggacgg gccgcctcca cacccgcttc 1980
aaccagacgg ccacggccac gggcaggcta agtagctccg atcccaacct ccagaacatc 2040
cccgtccgca ccccgcttgg gcagaggatc cgccgggcct tcatcgccga ggaggggtgg 2100
ctattggtgg ccctggacta tagccagata gagctcaggg tgctggccca cctctccggc 2160
gacgagaacc tgatccgggt cttccaggag gggcgggaca tccacacgga gaccgccagc 2220
tggatgttcg gcgtcccccg ggaggccgtg gaccccctga tgcgccgggc ggccaagacc 2280
atcaacttcg gggtcctcta cggcatgtcg gcccaccgcc tctcccagga gctagccatc 2340
ccttacgagg aggcccaggc cttcattgag cgctactttc agagcttccc caaggtgcgg 2400
gcctggattg agaagaccct ggaggagggc aggaggcggg ggtacgtgga gaccctcttc 2460
ggccgccgcc gctacgtgcc agacctagag gcccgggtga agagcgtgcg ggaggcggcc 2520
gagcgcatgg ccttcaacat gcccgtccag ggcaccgccg ccgacctcat gaagctggct 2580
atggtgaagc tcttccccag gctggaggaa atgggggcca ggatgctcct tcaggtccac 2640
gacgagctgg tcctcgaggc cccaaaagag agggcggagg ccgtggcccg gctggccaag 2700
gaggtcatgg agggggtgta tcccctggcc gtgcccctgg aggtggaggt ggggataggg 2760
gaggactggc tctccgccaa ggag 2784
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
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ctgagcgcaa gtactccgtg t 21
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<212> DNA
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tgtacggtga aggatggc 18
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<212> DNA
<213> 引物
<400> 9
caaacacagg tagcagcatc 20

Claims (1)

1.一种热稳定DNA扩增融合酶，其特征在于：它采用如下步骤制备：
步骤一：采用全基因合成的重叠PCR延伸方法，利用高保真酶合成SEQ NO.1和SEQ NO.2所显示的核苷酸序列，将两部分所显示的核苷酸序列，通过GGTACTGGTACTGGTGGT所组成的连接序列相连接；
步骤二：再将以上所述两部分核苷酸序列和连接序列通过引物重叠PCR连接起来的过程中，对全长片段进行连接时，在上下游引物的两端分别加上EcoRI和SalI两个限制性内切酶的识别和酶切位点，同时在下游引物上加上终止密码；全长扩增后，得到SEQ NO.3所示全长序列，经过双酶切连接到pET28a(+)载体的相应位点，转化大肠杆菌DH5alpha,在500μl的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，提取重组质粒，进行双酶切和测序鉴定，选择含有正确重组质粒的菌落进行保存；
步骤三：然后将正确的重组质粒转化到制备的高效感受态大肠杆菌表达菌株BL21中，在500μl的培养基中，37℃培养0.5小时，涂布于含有筛选抗生素卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养24小时，挑选单菌落，保存待用；
步骤四：挑选基因工程菌单菌落于含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的100ml液体LB培养基中，37℃过夜培养；第二天在100ml的培养瓶中加入含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的50ml液体LB培养基，将含有过夜培养基因工程菌的菌液按照1:20的比例加入，37℃培养4小时，待OD600达到0.8时，加入IPTG诱导剂，在37℃诱导培养5小时；
5000rpm、10分钟、4℃离心收集和洗涤菌体，重悬于缓冲溶液中，在冰上用超声法破碎细胞，功率100瓦、间隔5秒、30个循环、循环三次，再4℃、12000rpm离心20分钟，取上清，-20℃冻存；按照胶厚度0.75cm，浓缩胶5％，80V电泳，10％分离胶，120V电泳，进行SDS-PAGE电泳；电泳得到的目的片段的大小为108KD，与SEQ NO.3所显示的融合酶基因编码的蛋白大小基本一致；
步骤五：进行2L级别的发酵培养,诱导和纯化；采用XZ-8M型大容量低温高速离心机,5000rpm,5分钟,4℃离心去菌液，收集菌体；再重悬于100ml50mM NaH2P04,500mM KCl,10mMImidazole pH8.0缓冲液中,震荡离心4℃离心收集菌体,以去除LB液体培养基残留；将沉淀后菌泥重悬于50mM NaH2P04,500mM KCl,10mM Imidazole pH8.0缓冲液中，在上述重悬中加入终浓度为2mM DTT、1mM PMSF和0.5mM EDTA,采用HN92-II超声破碎仪,Q6号变辐杆,冰浴、功率400瓦、超声4s、间息5s,30个循环、循环五次,再4℃、10000rpm离心40分钟,取上清,采用0.45μm过滤器过滤除颗粒,-20℃冻存待用；然后再采用APPS MV 50D蛋白纯化仪器对过滤后的上清进行纯化，100ml上样，用溶液50mM NaH2P04,500mM KC1,20mM Imidazole,2mMDTT pH8.0洗涤到基线，
Figure FDA0002582609630000021
NI-NTA 10ml预装亲和柱咪唑梯度洗脱；Sephdex G-25脱盐柱脱盐；SP阳离子柱离子梯洗脱；Superdex 200分子筛柱分离；50ml的50KD超滤管浓缩,再加入终浓度为50％的甘油、0.5％Tween-20、0.5％NP-40和200μg/ml BSA，得到6ml融合酶蛋白。
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