CN114645033A

CN114645033A - 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用

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Publication number: CN114645033A
Application number: CN202210289860.6A
Authority: CN
Inventors: 朱斌; 成锐
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology; Shenzhen Huazhong University of Science and Technology Research Institute
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology; Shenzhen Huazhong University of Science and Technology Research Institute
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114645033B

Abstract

本发明提供了一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述金属离子为镁离子、锰离子、钙离子。本发明通过在GajB蛋白或GajB'蛋白的氨基端接入识别标签，并选择合适的纯化方法提高了三磷酸核苷水解酶的纯度。该三磷酸核苷水解酶可应用于DNA检测、DNA加工、基因编辑、基因工程等领域。

Description

一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用。

背景技术

三磷酸核苷是核苷酸的几种结构之一，根据核苷酸分子中的磷酸基个数，核苷酸分子结构有一磷酸核苷(NMP)、二磷酸核苷(NDP)及三磷酸核苷(NTP)。核苷是由嘌呤或嘧啶碱基与核糖形成的缩合物，这种缩合物的核糖上的五位羟基再与三聚磷酸成脂，就形成三磷酸核苷，同时，它们也是核苷酸的合成底物。三磷酸核苷是一种含有三个磷酸基团的核苷酸，自然界常见的型态包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸胸腺苷(TTP)以及三磷酸尿苷(UTP)等。这些分子中包含一个核糖，若是将核糖替换常去氧核糖，那么会使核甘三磷酸变成去氧核苷三磷酸(dNTP)，如去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧鸟苷三磷酸(dGTP)等。

核苷三磷酸是一种分子，含有与5-碳糖结合的氮基，三个磷酸基团与糖结合。它们是DNA和RNA的构建模块，在体内，核苷三磷酸盐也作为细胞反应的能量来源，并参与信号传导途径。核苷三磷酸不能被很好的吸收，因此它们通常在细胞内合成。

三磷酸核苷水解可释放能量，例如三磷酸腺苷(ATP)，它是由腺嘌呤、核糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，是生物体内最直接的能量来源。ATP中的高能磷酸键断裂，ATP水解成ADP+Pi(游离磷酸基团)+能量，高能磷酸键水解时释放的能量多达30.54kJ/mol。因此，三磷酸核苷水解所释放出来的能量可帮助蛋白质发挥作用，比如它可以帮助解旋酶或其他蛋白质在DNA是在DNA上移动。

2018年，Doron S等人在《Systematic discovery of antiphage defensesystems in the microbial pangenome》(Doron S,Melamed S,Ofir G,et al.Science,2018,359(6379))中报道了Gabija细菌防御系统，它包含GajA蛋白和GajB蛋白两个组分，能有效地抵抗多种噬菌体对细菌的入侵。后续研究发现GajA蛋白和GajB蛋白对Gabija系统防御功能的发挥都是不可或缺的，二者必需协同作用。最近，GajA蛋白的功能已被解析(Chengand Zhu et al.,A nucleotide-sensing endonuclease from the Gabija bacterialdefense system.Nucleic acids research,2021,49(9))，但它的活性受核苷酸抑制且其周转率比较差，单独的GajA蛋白不足以抵抗噬菌体入侵，GajB可能协助或促进GajA发挥作用，共同实现破坏噬菌体入侵的目的。但GajB如何与GaiA协同工作仍不清楚，GajB的功能也未被揭示。因此，GajB功能的解析将有利于理解Gabija细菌防御系统的作用机制，也将促进GajB的开发利用和Gabija系统体外功能的实现及应用。

发明内容

为了研究GajB蛋白的功能，发明人做了大量的实验研究，发现GajB蛋白并没有解旋酶活性，但却具有催化三磷酸核苷水解的活性，可为蛋白质运动提供能量；即本发明的发明人发现了GajB蛋白的一种新的功能和用途，GajB蛋白可以作为三磷酸核苷水解酶使用。发明人在进一步研究过程中，还发现了另一种全新的三磷酸核苷水解酶，取名为GajB'蛋白，它与GajB蛋白相比，仅在N端多了5个氨基酸，但具有更强的三磷酸核苷特异性水解活性。发明人还成功克隆并建立了GajB蛋白和GajB'蛋白的表达和纯化方法，并对二者进行了功能鉴定和应用探索，发现GajB蛋白或GajB'蛋白通过与Gabija系统中另一组分GajA蛋白协同发挥作用，能够作为DNA加工、基因工程和基因编辑等领域有效的工具酶。具体地，本发明采用如下技术方案来实现：

一种三磷酸核苷水解酶，所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

现有技术中虽然已经公开了Gabija细菌防御系统包含GajA蛋白和GajB蛋白两个组分，具有较强的噬菌体防御功能；GajA蛋白的功能已被现有技术解析，但是GajB蛋白的功能还未见有相关研究报道。发明人根据现有技术，预测GajB蛋白为UvrD-like解旋酶，它包含一个UvrD超家族结构域。然而，发明人在经过大量的实验研究后发现GajB蛋白并无解旋酶活性，但具有三磷酸核苷水解活性，可为蛋白质运动提供能量。GajB蛋白的这一功能彻底打破了本领域技术人员的常规认知。同时，发明人在研究过程中，还发现了GajB的另一种编码形式GajB'，它与GajB相比，仅在N端多了5个氨基酸，但却具有更强的三磷酸核苷水解活性。无论是GajB蛋白还是GajB'蛋白作为三磷酸核苷水解酶，都必须在金属离子和DNA同时存在下，才具有三磷酸核苷水解活性，并且，这种活性在金属离子为镁离子、锰离子、钙离子、钴离子中任一种时，活性更强。

在可选的实施方式中，所述DNA为ssDNA，所述金属离子为镁离子。

发明人研究了各种不同种类的DNA对三磷酸核苷水解酶活性的影响，最终发现在ssDNA和镁离子存在下，三磷酸核苷水解酶的活性最强，并且其活性不受ssDNA来源的影响。

在可选的实施方式中，所述GajB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在可选的实施方式中，所述GajB'蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。在诱导表达GajB'蛋白时，既可以直接使用SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，也可以使用先将SEQID No.4的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。一般情况下，为了提高表达效率，选择使用将SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。

本发明还提供了所述三磷酸核苷水解酶的纯化方法，包括以下步骤：

S1、GajB蛋白或GajB'蛋白表达：制备含有所述GajB蛋白的编码基因或所述GajB'蛋白的编码基因，以及识别标签的编码基因的重组载体；将所述重组载体转化到感受态细胞中培养，诱导表达，经细胞裂解后收集上清液；

S2、收集目标蛋白溶液并纯化：将步骤S1中得到的上清液通过镍柱，按浓度由低到高的顺序加入20～100mmol/L咪唑溶液洗脱，收集每一个浓度的咪唑溶液洗脱的蛋白液分别进行SDS-PAGE电泳检测，收集纯度较高的GajB蛋白溶液或GajB'蛋白溶液，经超滤浓缩和凝胶过滤层析后，收集洗脱峰溶液；将所述洗脱峰溶液超滤浓缩后加入透析袋中，用透析液透析3次，收集透析后的蛋白即为目标蛋白；所述凝胶过滤层析使用的洗脱液的成分包含pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液，300mmol/L NaCl，0.5mmol/L DTT；所述透析液的成分包含pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT，0.5mmol/L EDTA，1v/v％Triton X-100，50v/v％甘油。

发明人通过基因克隆的方法得到了GajB蛋白的基因，并在研究中发现了GajB的另一种编码形式，将其命名为GajB'；将GajB蛋白的基因或GajB'蛋白的基因分别插入到原核表达载体(例如pET-28a载体)中，再将识别标签的编码基因也克隆至所述原核表达载体中，然后转到感受态细胞中进行培养和诱导表达。为了得到高纯度及高活性的GajB蛋白或GajB'蛋白，发明人进一步利用镍柱层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、蛋白透析等多种方法对表达的蛋白进行纯化，并对纯化方法进行优化，最终得到了高纯度的GajB蛋白或GajB'蛋白。为了检验得到的GajB蛋白和GajB'蛋白的活性，发明人进行了体外功能鉴定，发现它们都具有三磷酸核苷水解活性，且GajB'蛋白的活性比GajB蛋白高得多。

在可选的实施方式中，所述感受态细胞为大肠杆菌细胞，优选为BL21(DE3)感受态细胞。

在可选的实施方式中，所述透析袋的长度为3～10cm。

在可选的实施方式中，所述识别标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种。

本发明中的三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在GajB蛋白或GajB'蛋白的氨基端连接识别标签是为了在纯化过程中提高纯化效果，得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质。本发明中所使用的识别标签主要为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种，这些标签均为目前行业内常用的氨基酸序列已知的标签；例如，所述组氨酸标签中组氨酸的个数≥6，再例如所述组氨酸标签的核苷酸序列如SEQID No.5所示。在纯化结束后，可以选择去掉或不去掉目标蛋白(即GajB蛋白或GajB'蛋白)上的标签，因为标签的存在与否并不影响GajB蛋白或GajB'蛋白对三磷酸核苷的水解活性。

在可选的实施方式中，步骤S1中所述重组载体还包含柔性肽段的编码基因，所述柔性肽段由1～10个氨基酸组成。

在GajB蛋白或GajB'蛋白与识别标签之间设置柔性肽段的作用是使所关联的标签充分展示，同时不影响目标蛋白的正确折叠。柔性肽段至少为1个氨基酸，最多可以为10种不同的氨基酸的串联组合或者总种类数不超过10的若干种不同氨基酸的串联组合。

在可选的实施方式中，所述柔性肽段为若干个甘氨酸和若干个丝氨酸的串联组合；例如，所述柔性肽段为4个甘氨酸和2个丝氨酸的串联组合，即GGSGGS，6个氨基酸；或为8个甘氨酸和2个丝氨酸的串联组合，即GGGGSGGGGS，10个氨基酸等。

在可选的实施方式中，所述柔性肽段中还包含蛋白酶切位点，例如包含LVPAGS蛋白酶切位点。

在可选的实施方式中，所述柔性肽段的氨基酸序列为SSGLVPAGSH(SEQ ID No.9)，即该柔性肽段中包含了序列为SSG的甘氨酸和丝氨酸的串联组合，也包含了酶切位点LVPAGS，还包含1个组氨酸(H)。

在可选的实施方式中，步骤S1的具体方法为：将GajB蛋白的编码基因或GajB'蛋白的编码基因和识别标签的编码基因均克隆至表达载体中，得到重组载体；将重组载体转化到感受态细胞中得到重组细胞，将重组细胞涂布于含有卡那霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中过夜，挑取单克隆鉴定获得的三磷酸核苷水解酶表达菌种；将三磷酸核苷水解酶表达菌种转接至LB培养基中，于37℃过夜活化，按1v/v％比例稀释后在37℃下放大培养；待OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG在10～16℃的温度下诱导三磷酸核苷水解酶表达，16～20h后收集菌体，再加入细菌裂解液裂解，离心，得上清液；IPTG在培养体系中的终浓度为0.05～0.4mmol/L。获得三磷酸核苷水解酶表达菌种后，如果不是立刻进行下一步操作，可以将其置于-80℃保种。

在可选的实施方式中，所述卡那霉素在所述LB培养基中的浓度为50μg/mL。

在可选的实施方式中，所述上清液的制备方法为：将所述菌体混合物在5000rpm、4℃下离心15min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀重悬于细菌裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，重复冻融两次；再在14000rpm、4℃下离心1h，离心后取上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤，即得细菌裂解后的上清液；所述细菌裂解液中含有pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液、300mmol/L NaCl、0.5g/L溶菌酶、0.5mmol/L DTT。

本发明还提供了所述三磷酸核苷水解酶的应用，将所述三磷酸核苷水解酶用于DNA检测、DNA加工、基因工程、基因编辑技术中。

在可选的实施方式中，将所述三磷酸核苷水解酶用于定性或/和定量检测ssDNA；或将所述三磷酸核苷水解酶与GajA蛋白一起用于DNA加工、基因工程、基因编辑技术中。

在可选的实施方式中，所述GajA蛋白来自于Bacillus cereus VD045(蜡样芽孢杆菌VD045)，或者来自于与所述GajB蛋白的氨基酸序列同源性高于20％并与Gabija系统的另一组分GajA蛋白直接相连的其他同源蛋白。

在可选的实施方式中，所述三磷酸核苷水解酶的最佳反应体系包含pH＝7的Tris-HCl缓冲液，100mmo/L MgCl₂，1mmol/L DTT。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：(1)本发明发现了GajB蛋白的一种全新的功能应用，即在DNA和金属离子存在的条件下，将GajB蛋白作为三磷酸核苷水解酶使用；还发现了另一种GajB'蛋白，与GajB蛋白相比，其仅在N端多了5个氨基酸，但在相同条件下却比GajB蛋白具有更高的三磷酸核苷水解活性。(2)本发明还提供了上述两种蛋白的纯化方法，通过在两种蛋白的N端接入识别标签，选择合适的纯化方法提高了三磷酸核苷水解酶纯度。(3)利用GajB蛋白或GajB'蛋白与Gabija系统中的GajA蛋白的协同作用，为DNA检测、DNA加工、基因编辑和基因工程等领域提供了一种有效的候选工具酶。

附图说明

图1为实施例1提供的三磷酸核苷水解酶的结构域组成；

图2为实施例1中检测GajB与GajA的相互作用时目标蛋白GajAB的电泳检测图；

图3为实施例1中检测GajB与GajA的相互作用时目标蛋白GajA+B的电泳检测图；

图4为实施例1中检测GajB与GajA的相互作用时目标蛋白GajA、GajB的电泳检测图；

图5为实施例1中电泳比较GajA、GajB、GajA+B和GajAB蛋白大小的结果图；

图6为实施例1中GajB'蛋白的质谱检测结果图；

图7为实施例1中GajB'蛋白的N端测序得到的N端前50个氨基酸的序列图；

图8为实施例1中得到的Gabija系统的组成及GajB蛋白、GajB'蛋白的起始位置示意图；

图9为实施例2中电泳检测三磷酸核苷水解酶的纯度结果图；

图10中图10A、10B分别对应实施例3中GajB'蛋白、GajB蛋白在不同温度条件下的活性检测结果图；

图11中图11A、11B分别对应为实施例3中GajB'蛋白、GajB蛋白在不同pH值的Tris-HCl缓冲液存在条件下的活性检测结果图；

图12中图12A、12B分别对应为实施例3中GajB'蛋白、GajB蛋白在不同金属离子存在条件下的活性检测结果图；

图13为实施例3中GajB'蛋白和GajB蛋白在不同DNA存在下的活性检测结果图；

图14为实施例3中GajB'蛋白及其突变体的活性检测结果图；

图15为实施例3中GajB蛋白和GajB'蛋白分别对不同种类核苷酸的活性检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

以下实施例中，pET-28a载体采购自北京索莱宝科技有限公司；E.coli BL21(DE3)细胞购于北京擎科生物科技有限公司；LB培养基为自行配制，成分为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl；卡那霉素采购自北京索莱宝科技有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)采购自北京索莱宝科技有限公司；溶菌酶采购自北京索莱宝科技有限公司；二硫苏糖醇(DTT)采购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；咪唑采购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；考马斯亮蓝G-250采购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司(Bio-Rad)；PrimerSTAR Mix采购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

以下实施例中，在对GajB蛋白或GajB'蛋白进行纯化时，为了提高纯化效果得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质，会在GajB蛋白或GajB'蛋白的氨基端连接识别标签或/和柔性肽段；识别标签在纯化结束后可以选择是否去掉，无论是否去掉识别标签，都不影响GajB蛋白或GajB'蛋白对三磷酸核苷的水解活性。例如，在进行诱导表达时，将SEQ ID No.3的GajB基因或SEQ ID No.4的GajB'基因克隆至表达载体上(表达载体带有如SEQ ID No.5所示的组氨酸标签的核苷酸序列和编码如SEQ ID No.9所示的柔性肽段的基因)，并且，在利用SEQ ID No.3的核苷酸序列时，在其C端加上终止密码子(例如taa)；在利用SEQ ID No.4的核苷酸序列时，先将该核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg，更改后不改变编码的氨基酸，且能极大地提高表达效率(更改方法参考Gualerz et al.,Initiation of mRNATranslation in Prokaryotes.Biochemistry,1990,29(25))，并在C端加上终止密码子(例如taa)。在将Gabija系统的编码基因克隆至表达载体上时，在SEQ ID No.6的核苷酸序列的C端加上了终止密码子taa。

实施例1：GajB蛋白与GajA蛋白的相互作用研究，GajB'蛋白的发现和功能研究

1、GajB蛋白与GajA蛋白的相互作用检测

(1)GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因由一个启动子驱动诱导表达(目标蛋白记为GajAB蛋白)

基因重组：Gabija细菌防御系统包含GajA蛋白和GajB蛋白(如SEQ ID No.1所示)两个组分，利用基因合成(基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)的方法获得Gabija系统的编码序列(如SEQ ID No.6所示)，将其克隆到原核表达载体pET-28a的酶切位点Nde I和Not I之间，使其基因5’末端融合60个碱基长度的DNA片段，将得到的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)细胞中，即得重组质粒转化的感受态细胞。

培养重组细胞并诱导表达：37℃下，将重组质粒转化的感受态细胞置于1L含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，摇床培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的终浓度为0.1mmol/L，将该LB培养基置于12℃摇床诱导表达20h。

收集目标蛋白：将上述诱导表达后获得的菌体混合物在5000rpm、4℃离心15min，收集菌体沉淀，将菌体重悬于含有20mmol/L的Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液、300mmol/LNaCl、0.5mg/mL溶菌酶、0.5mmol/L DTT的细菌裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，接着再反复冻融两次；置于冷冻高速离心机中14000rpm、4℃离心1h，离心后将上清转移至另一干净的离心管中，然后将分离出的上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤进一步去除杂质，过滤后的上清液可直接用于镍柱纯化或4℃短暂保存。

目标蛋白纯化：配制含有20mmol/L的Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液和300mmol/LNaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行稀释，分别得到20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L四种浓度的咪唑溶液备用。使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将上述过滤后的上清液缓慢流过镍柱，接着按照浓度由低到高的顺序分批加入20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来；在加入上述不同浓度梯度的咪唑溶液洗脱时，每一浓度洗脱下来的蛋白液需分别用干净的冻存管保存，并按洗脱的先后顺序及咪唑浓度做好标记。

将上述经不同浓度咪唑溶液洗脱得到的蛋白液分别进行10％SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝G-250染色进行检测，结果如图2所示，图2中Marker表示预染蛋白分子量标准，“诱导前”表示加入IPTG诱导前取样检测，“诱导后”表示加入IPTG诱导后取样检测，“上清”表示细菌裂解离心后得到的上清液取样检测，“沉淀”表示细菌裂解离心后的沉淀取样检测，“穿透液”表示过滤后的上清液流过镍柱得到的液体取样检测，“洗脱液”表示经20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L的咪唑溶液洗脱后收集的液体取样检测；图2中GajA蛋白带N端His-tag，GajB蛋白不带标签。从图2中可以看出，GajB蛋白与GajA蛋白一起挂柱，而只有GajA蛋白含有N端His-tag，理论上不带标签的GajB蛋白不能挂在Ni柱上，这表明GajB蛋白与GajA蛋白具有相互作用，所以才能与GajA蛋白一起被洗脱下来。

(2)GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因在同一个表达载体中分别由两个相同启动子驱动(目标蛋白记为GajA+B蛋白)

将GajB蛋白的编码基因与GajA蛋白的编码基因分别由两个相同的启动子驱动(启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)，GajA蛋白的编码基因含有N端His-tag(如SEQID No.8所示)，而GajB蛋白的编码基因不带任何标签(如SEQ ID No.3所示)。将含有N端His-tag的GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因均克隆至同一原核表达载体pET-28a的酶切位点Nde I和Not I之间，使其基因5’末端融合60个碱基长度的DNA片段，将得到的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)细胞中，即得重组质粒转化的感受态细胞。将得到的重组质粒转化的感受态细胞(重组细胞)按照上述第(1)项中的“培养重组细胞并诱导表达”、“收集目标蛋白”、“目标蛋白纯化”的步骤重复操作，得到的经不同浓度咪唑溶液洗脱得到的蛋白液分别进行10％SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝G-250染色进行检测，结果如图3所示，图3中Marker表示预染蛋白分子量标准，“诱导前”表示加入IPTG诱导前取样检测，“诱导后”表示加入IPTG诱导后取样检测，“上清”表示细菌裂解离心后得到的上清液取样检测，“沉淀”表示细菌裂解离心后的沉淀取样检测，“穿透液”表示过滤后的上清液流过镍柱得到的液体取样检测，“洗脱液”表示经20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L的咪唑溶液洗脱后收集的液体取样检测。从图3中可以看出，GajB蛋白仍然与GajA蛋白一起挂柱，进一步验证了上述结论，即GajB蛋白与GajA蛋白之间具有相互作用。

(3)GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因分别在两个相同的表达载体中单独表达(目标蛋白分别记为GajA、GajB)

进一步将GajB蛋白的编码基因与GajA蛋白的编码基因单独诱导表达，GajA蛋白的编码基因含有N端His-tag(如SEQ ID No.8所示)，而GajB蛋白的编码基因不带任何标签(如SEQ ID No.3所示)，将含有N端His-tag的GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因分别克隆至两个原核表达载体pET-28a的酶切位点Nde I和Not I之间，使其基因5’末端融合60个碱基长度的DNA片段，将得到的两份重组载体分别转化到两份E.coli BL21(DE3)细胞中，即得两份重组质粒转化的感受态细胞。将得到的两份重组质粒转化的感受态细胞(重组细胞)分别按照上述第(1)项中的“培养重组细胞并诱导表达”、“收集目标蛋白”的步骤重复操作，将得到的两份上清液混合后通过0.45μm孔径的滤膜过滤进一步去除杂质，得到上清液混合物。配制含有20mmol/L的Tris-HCl(pH＝7.5)缓冲液和300mmol/L NaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行稀释，分别得到20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L四种浓度的咪唑溶液备用。使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将上述上清液混合物缓慢流过镍柱，接着按照浓度由低到高的顺序分批加入20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来；在加入上述不同浓度梯度的咪唑溶液洗脱时，每一浓度洗脱下来的蛋白液需分别用干净的冻存管保存，并按洗脱的先后顺序及咪唑浓度做好标记。然后将经不同浓度咪唑溶液洗脱得到的蛋白液分别进行10％SDS-PAGE电泳，再利用考马斯亮蓝G-250染色进行检测，结果如图4所示，图4中Marker表示预染蛋白分子量标准，“GajANHis”表示由含有N端His-tag的GajA蛋白的编码基因诱导表达的蛋白，“GajB不含His-tag”表示由GajB的编码基因诱导表达的蛋白，“诱导前”表示加入IPTG诱导前取样检测，“诱导后”表示加入IPTG诱导后取样检测，“上清”表示细菌裂解离心后得到的上清液取样检测，“沉淀”表示细菌裂解离心后的沉淀取样检测，“穿透液”表示上清液混合物流过镍柱得到的液体取样检测，“20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L”分别表示经20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、100mmol/L的咪唑溶液洗脱后收集的液体取样检测。从图4中可以看出，GajB蛋白依然与GajA蛋白一起挂柱，再次验证不管采用何种方式进行诱导表达，GajB蛋白与GajA蛋白之间都具有相互作用。

2、GajB蛋白的另一种编码形式GajB'蛋白的确定

在上述第1项“GajB蛋白与GajA蛋白的相互作用检测”的实验过程中，发明人发现GajA蛋白的编码基因和GajB蛋白的编码基因由一个启动子驱动诱导表达时，得到的目标蛋白GajAB蛋白中具有2种形式的GajB蛋白，二者相差很小，结果如图5所示，图5中Marker表示预染蛋白分子量标准，“GajA，1μL”表示取1μL 10μM GajA蛋白样品进行凝胶电泳，“GajB，1μL”表示取1μL 10μM GajB蛋白样品进行凝胶电泳，“GajA+B，1μL”表示取1μL 10μM GajA+B蛋白样品进行凝胶电泳，“GajAB，1μL”表示取1μL 10μMGajAB蛋白样品进行凝胶电泳，“GajAB，2μL”表示取2μL 10μM GajAB蛋白样品进行凝胶电泳，“GajAB，4μL”表示取4μL 10μM GajAB蛋白样品进行凝胶电泳。从图5中可以看出，其中较小的条带大小与GajB蛋白一致，而较大的条带大小比GajB蛋白略大，命名为GajB'蛋白。将GajB'蛋白的条带切胶，采用LC-MS/MS的方法进行质谱检测(交由武汉金开瑞生物工程有限公司完成)，检测结果如图6所示，图6中下划线标示的氨基酸表示其可信度在95％以上，从图中可知它在GajB蛋白上的整体覆盖度为74.7％。为进一步明确GajB'蛋白的编码序列，我们进行了蛋白质的N端测序(交由百蓁生物技术(武汉)有限公司完成)，结果如图7所示，GajB'蛋白(如SEQ ID No.2所示)与GajB蛋白(如SEQ ID No.1所示)相比仅在N端多了5个氨基酸(图7中方框标示)。在Gabija系统的编码基因中比对核苷酸序列，发明人发现在GajB蛋白起始密码子AUG的上游还具有另一个起始位点GUG，这是此前生物信息学预测没有预测到的。

综合以上结果，发明人确定了Gabija系统的具体编码形式，结果如图8所示，Gabija系统还存在另一种编码形式GajB'蛋白的编码基因(如SEQ ID No.4所示)，它在GajB蛋白起始密码子AUG的上游还具有另一个起始位点GUG，编码一个仅比GajB蛋白多5个氨基酸的GajB'蛋白。GajB和GajB'蛋白的结构域组成如图1所示，它们均包含一个UvrD超家族结构域。

实施例2：GajB和GajB'蛋白的编码基因扩增，三磷酸核苷水解酶纯化方法

S1、GajB和GajB'蛋白的基因扩增及蛋白表达

利用基因合成(基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)的方法获得GajB基因和GajB'基因，并将GajB基因(或GajB'基因)克隆至原核表达载体pET-28a的酶切位点Nde I和Not I之间，使其基因5’末端融合60个碱基长度的DNA片段，该DNA片段编码GajB蛋白(或GajB'蛋白)、组氨酸标签(如SEQ ID No.5所示)，以及组氨酸标签与GajB蛋白(或GajB'蛋白)之间的柔性肽段(如SEQ ID No.9所示)，将得到的重组载体转化到E.coli BL21(DE3)细胞中，即得重组质粒转化的感受态细胞。

37℃下，将重组质粒转化的感受态细胞置于1L含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，摇床培养至OD600值为0.6～0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的终浓度为0.1mmol/L，将该LB培养基置于12℃摇床诱导表达20h。

S2、GajB蛋白和GajB'蛋白的纯化

细菌裂解：将步骤S1获得的菌体混合物在5000rpm、4℃离心15min，收集菌体沉淀，将菌体重悬于含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、300mM NaCl、0.5mg/mL溶菌酶、0.5mM DTT的裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，接着再反复冻融两次；置于冷冻高速离心机中14000rpm、4℃离心1h，离心后将上清转移至另一干净的离心管中，然后将分离出的上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤进一步去除杂质，过滤后的上清液可直接用于镍柱纯化或4℃短暂保存。

镍柱纯化：配制含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)和300mM NaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行稀释，得到20mM、40mM、60mM、100mM四种浓度的咪唑溶液备用。使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将所述过滤后的上清液缓慢流过镍柱，下一步按照由低浓度到高浓度的顺序分批加入20mM、40mM、60mM、100mM的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来；在加入上述不同浓度梯度的咪唑溶液洗脱时，每一浓度洗脱下来的蛋白液需用若干干净的冻存管保存，并按洗脱的先后顺序及咪唑浓度作好标记，最后将所有洗脱下来的蛋白液通过SDS-PAGE电泳进行检测，选择较高纯度的GajB蛋白和GajB'蛋白于4℃保存。

凝胶过滤层析：将镍柱亲和层析收集的蛋白溶液通过超滤浓缩后用凝胶过滤层析法进一步纯化，收集洗脱峰溶液。本实施例所用的凝胶过滤层析洗脱缓冲液成分：pH＝7.5、20mM Tris-HCl缓冲液，300mM NaCl，0.5mM DTT。

蛋白透析：剪取一段3～10cm透析袋，底部用重力夹夹紧，将凝胶过滤层析后收集的洗脱峰溶液加入透析袋中然后塑料夹封口，再将透析袋置于1L含有pH＝7.5、50mM Tris-HCl缓冲液，100mM NaCl，1mM DTT，0.5mM EDTA，1v/v％Triton X-100，50v/v％甘油的透析液中，置于磁力搅拌器上搅拌促进溶液交换，间隔6h更换新鲜透析液透析三次，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

将透析后的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝G-250染色对透析后的GajB蛋白和GajB'蛋白的纯度进行检测，结果如图9所示，可以看出透析后蛋白条带单一，表明GajB蛋白和GajB'蛋白经过以上纯化步骤后得到了纯度较高的蛋白质。

实施例3：纯化后的三磷酸核苷水解酶的体外功能

1、实施例2纯化后的三磷酸核苷水解酶的活性检测

以下实验中GajB'蛋白或GajB蛋白对三磷酸核苷的水解活性检测均采用PiColorLock^TM Phosphate检测试剂盒(购于EXPEDEON公司)，操作方法参照试剂盒说明书。

(1)温度对三磷酸核苷水解酶活性的影响

为了探究实施例2纯化的三磷酸核苷水解酶的活性，发明人首先研究了反应温度对三磷酸核苷水解酶活性的影响，反应体系如下：水，6.5μL；10×反应buffer，1μL；5mMATP，1μL；5μM ssDNA，1μL；10μM蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；所述蛋白为GajB'蛋白或GajB蛋白，所述10×反应buffer的成分为200mM Tris-HCl(pH＝7.0)、100mM MgCl₂、10mMDTT；反应分别在10℃、20℃、30℃、37℃、42℃、50℃下进行，反应时间为15min。活性检测结果如图10所示，从图10中图10A可以看出，GajB'蛋白在10～50℃的温度下均具有活性，在30℃条件下活性最强；从图10中图10B可以看出，GajB蛋白同样是在10～50℃的温度下均具有活性，在30℃条件下活性最强；对比图10A和图10B可以看出，同样的反应体系和反应条件下，GajB'蛋白对三磷酸核苷的水解活性明显比GajB蛋白强

(2)pH值对三磷酸核苷水解酶活性的影响

为了研究pH值对三磷酸核苷水解酶活性的影响，分别在不同pH值的Tris-HCl缓冲液体系中反应，反应体系如下：水，5.5μL；200mM Tris-HCl缓冲液，1μL；100mM MgCl₂，1μL；5mM ATP，1μL；5μM ssDNA，1μL；10μM蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；所述蛋白为GajB'蛋白或GajB蛋白，分别在Tris-HCl缓冲液的pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0条件下反应，以水代替Tris-HCl缓冲液的反应体系作为对照组，反应温度为30℃，反应时间为15min。检测GajB'蛋白或GajB蛋白对三磷酸核苷的水解活性，结果如图11所示，从图11中图11A可以看出，GajB'蛋白在pH＝6.0～10.0的范围内均具有三磷酸核苷水解活性，在pH＝7.0时活性最强；同样地，从图11中图11B可以看出，GajB蛋白在pH＝6.0～10.0的范围内均具有三磷酸核苷水解活性，在pH＝7.0时活性最强。

(3)金属离子对三磷酸核苷水解酶活性的影响

酶促反应一般是需要金属离子的，所以发明人检测了GajB'蛋白或GajB蛋白水解活性对金属离子的需求，反应体系如下：水，5.5μL；200mM pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液，1μL；50mM金属离子源，1μL；5mM ATP，1μL；5μM ssDNA，1μL；10μM蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；所述蛋白为GajB'蛋白或GajB蛋白，所述金属离子源分别为MgCl₂、MnCl₂、CaCl₂、ZnCl₂、CoCl₂、NiCl₂、EDTA，以水代替金属离子源的反应体系作为对照组，反应在30℃下进行，反应时间为15min。检测GajB'蛋白或GajB蛋白对三磷酸核苷的水解活性，结果如图12所示，从图12中图12A可以看出，GajB'蛋白在Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺存在下均有三磷酸核苷水解活性，在镁离子存在下活性最强；同样地，从图12中图12B可以看出，GajB蛋白在Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺存在下均有三磷酸核苷水解活性，在镁离子存在下活性最强；而在没有金属离子存在只有DNA存在的反应体系(对照组)中，GajB'蛋白或GajB蛋白均不具有对三磷酸核苷的水解活性。

(4)DNA对三磷酸核苷水解酶活性的影响

为了研究DNA对GajB'蛋白或GajB蛋白水解三磷酸核苷的活性的影响，发明人比较了不同DNA存在条件下的反应体系中，GajB'蛋白或GajB蛋白对三磷酸核苷的水解活性，反应体系如下：水，5.5μL；200mM pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液，1μL；100mM MgCl₂，1μL；5mMATP，1μL；5μM DNA，1μL；10μM蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；所述蛋白为GajB'蛋白或GajB蛋白，所述DNA分别为56-nt-dsDNA、56-nt-ssDNA、T7 DNA、λDNA、pUC19质粒DNA、M13DNA、host DNA、λ955-PCR DNA、312bp-PCR DNA、ssRNA和dsRNA，反应温度为30℃，反应时间为15min。检测GajB'蛋白或GajB蛋白对三磷酸核苷的水解活性，结果如图13所示。图13中，56n-t-dsDNA表示合成的56-nt-ssDNA经过退火后得到的dsDNA，56-nt-ssDNA表示合成的56-nt-ssDNA；T7 DNA表示T7噬菌体(采购自NEB公司)的基因组DNA；λDNA表示λ噬菌体(采购自NEB公司)的基因组DNA；pUC19表示pUC19质粒(采购自北京索莱宝科技有限公司)的DNA；M13DNA表示M13噬菌体(采购自NEB公司)的基因组DNA；host DNA表示噬菌体宿主菌大肠杆菌

11303^TM(购于美国模式培养物集存库)的基因组DNA；λ955-PCR DNA表示以λDNA(采购自NEB公司)为模板，经PCR扩增得到的955bp片段，PCR反应体系如下：水，7μL；λDNA，1μL；10μMλ955-F(正向引物SEQ ID No.10：atccaagcttatgggccgccacgacgatgaacagac)，1μL；10μMλ955-R(反向引物SEQ ID No.11：ctagaccctccaaatccgctgccaccgcc)，1μL；PrimerSTARMix，10μL；PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃，15s；60℃，10s；72℃，10s；35个循环，最后72℃保持5min；CK表示不加DNA的对照组；312bp-PCR表示以pUC19质粒DNA为模板，经PCR扩增后获得的312bp的DNA，PCR反应体系如下：水，7μL；pUC19质粒DNA，1μL；10μM pUC19-F(正向引物SEQ ID No.12：aaccccccgttcagcccgacc)，1μL；10μM pUC19-R(反向引物SEQ IDNo.13：cggaggaccgaaggagctaacc)，1μL；PrimerSTAR Mix，10μL；PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃，15s；60℃，3s；72℃，10s；35个循环，最后72℃保持5min。

从图13中可以看出，GajB蛋白或GajB'蛋白的活性是受DNA激活的，尤其在56-nt-dsDNA或56-nt-ssDNA存在下，活性更强；在ssDNA存在下活性最强；在没有DNA存在只有金属离子存在的反应体系(对照组)中，GajB蛋白或GajB'蛋白均不具有三磷酸核苷水解活性。

(5)GajB'蛋白突变体活性研究

为进一步确认GajB'蛋白的活性，发明人进行了突变体研究，通过已知功能的UvrD、Rep、PcrA蛋白进行序列对比，推测K23、T24、D162、E163是它们的活性位点，E3和E5可能也是它的活性位点，所以发明人分别构建了E3A/E5A、K23/T24和D162/E163突变体，并在如下反应体系下进行三磷酸核苷水解反应：水，5.5μL；200mM pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液，1μL；100mM MgCl₂，1μL；5mM ATP，1μL；5μM ssDNA，1μL；10μMGajB'蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；反应温度为30℃，反应时间为15min。检测GajB'蛋白对三磷酸核苷的水解活性，结果如图14所示，发现K23/T24和D162/E163突变后，GajB'蛋白的活性几乎完全消失。

基于以上实验的结果分析，发明人建立的GajB蛋白或GajB'蛋白的最适反应条件为：200mM pH＝7的Tris-HCl缓冲液，100mM MgCl₂，1mM DTT，最适反应温度为30℃。

2、GajB蛋白和GajB'蛋白的活性差异比较

为了比较GajB蛋白和GajB'蛋白对各种不同核苷酸的活性，采用不同的核苷酸为反应底物进行反应，反应体系如下：水，5.5μL；200mM pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液，1μL；100mM MgCl₂，1μL；5mM核苷酸，1μL；5μM ssDNA，1μL；10μM蛋白，0.5μL；反应体系总体积为10μL；反应温度为30℃，反应时间为15min。所述蛋白为GajB'蛋白或GajB蛋白，所述核苷酸分别为ATP、UTP、CTP、GTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP。检测不同核苷酸为底物时，三磷酸核苷水解酶的反应活性，结果如图15所示。从图15中可以看出，GajB蛋白和GajB'蛋白均对ATP、GTP和dGTP具有水解活性，对其余核苷酸几乎没有活性；GajB'蛋白对ATP、GTP、dATP和dGTP活性比较强，对UTP也有部分活性，对其余核苷酸活性较弱。通过比较GajB蛋白和GajB'蛋白的活性强弱，发明人发现GajB'蛋白的活性远高于GajB蛋白，GajB'蛋白仅比GajB蛋白多了N端的5个氨基酸，表明GajB'蛋白N端的5个氨基酸对它的活性至关重要。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

深圳华中科技大学研究院

<120> 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Arg Glu Gln Ile Ile Lys Asp Gly Gly Asn Ile Leu Val Thr

1 5 10 15

Ala Gly Ala Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile Leu Val Ser Lys Ile Glu

20 25 30

Ala Asp Leu Lys Glu Asn Lys Thr His Tyr Ser Ile Ala Ala Val Thr

35 40 45

Phe Thr Asn Lys Ala Ala Lys Glu Ile Glu Gly Arg Leu Gly Tyr Ser

50 55 60

Ser Arg Gly Asn Phe Ile Gly Thr Asn Asp Gly Phe Val Glu Ser Glu

65 70 75 80

Ile Ile Arg Pro Phe Ile Lys Asp Ala Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Asp

85 90 95

Asn Phe Thr Ala Glu Tyr Phe Asp Asn Gln Phe Ala Ser Tyr Asp Lys

100 105 110

Gly Leu Gln Val Leu Lys Tyr Gln Asn Ile Leu Gly Thr Tyr Ser Asn

115 120 125

Pro Lys Lys Asn Phe Lys Phe Gln Leu Ala Leu Asp Ile Leu Lys Lys

130 135 140

Ser Leu Val Ala Arg Gln Tyr Ile Phe Ser Lys Tyr Phe Lys Ile Phe

145 150 155 160

Ile Asp Glu Tyr Gln Asp Ser Asp Lys Asp Met His Asn Leu Phe Met

165 170 175

Tyr Leu Lys Asp Gln Leu Lys Ile Lys Leu Phe Ile Val Gly Asp Pro

180 185 190

Lys Gln Ser Ile Tyr Ile Trp Arg Gly Ala Glu Pro Glu Asn Phe Asn

195 200 205

Gly Leu Ile Glu Asn Ser Thr Asp Phe Asn Lys Tyr His Leu Thr Ser

210 215 220

Asn Phe Arg Cys Cys Gln Asp Ile Gln Asn Tyr Ser Asn Leu Phe Asn

225 230 235 240

Glu Glu Thr Arg Ser Leu Ile Lys Glu Lys Asn Glu Val Gln Asn Val

245 250 255

Ile Ser Ile Ala Asp Asp Met Pro Ile Ser Asp Ile Leu Leu Lys Leu

260 265 270

Thr Glu Glu Lys Gln Val Leu Asn Ile Glu Ala Glu Leu Val Ile Leu

275 280 285

Val Arg Arg Arg Asn Gln Ala Ile Glu Ile Met Lys Glu Leu Asn Glu

290 295 300

Glu Gly Phe Asn Phe Ile Phe Ile Pro Gln Thr Pro Leu Asp Arg Ala

305 310 315 320

Thr Pro Asn Ala Thr Leu Leu Lys Glu Val Ile Lys Tyr Val Lys Asn

325 330 335

Asp Arg Tyr Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Glu Ile Val Gly Asn Leu

340 345 350

Ser Ser Arg Glu Ile Lys Glu Ile Gln Lys Ile Ile Asn Glu Leu Leu

355 360 365

Val Pro Asn Ile Asn Gln Val Leu Ile Asn Gln Val Leu Ile Asn Leu

370 375 380

Phe Ala Lys Leu Glu Ile Thr Leu Asp Thr Arg Glu Ile Thr Ala Phe

385 390 395 400

Thr Glu Val Met Met Thr Asn Glu Phe Asp Ile Ala Phe Asp Thr Asn

405 410 415

Glu Tyr Leu His Lys Ile Phe Thr Val His Ser Ala Lys Gly Leu Glu

420 425 430

Phe Asn Gln Val Ile Ile Thr Ala Ser Asp Tyr Asn Val His Tyr Asn

435 440 445

Arg Asp Thr Asn Glu His Tyr Val Ala Thr Thr Arg Ala Lys Asp Lys

450 455 460

Leu Ile Val Ile Met Asp Asn Lys Lys Tyr Ser Asp Tyr Ile Glu Thr

465 470 475 480

Leu Met Lys Glu Leu Lys Ile Lys Asn Ile Ile Lys Ser Ile

485 490

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Glu Asp Glu Met Ser Arg Glu Gln Ile Ile Lys Asp Gly Gly

1 5 10 15

Asn Ile Leu Val Thr Ala Gly Ala Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile Leu

20 25 30

Val Ser Lys Ile Glu Ala Asp Leu Lys Glu Asn Lys Thr His Tyr Ser

35 40 45

Ile Ala Ala Val Thr Phe Thr Asn Lys Ala Ala Lys Glu Ile Glu Gly

50 55 60

Arg Leu Gly Tyr Ser Ser Arg Gly Asn Phe Ile Gly Thr Asn Asp Gly

65 70 75 80

Phe Val Glu Ser Glu Ile Ile Arg Pro Phe Ile Lys Asp Ala Phe Gly

85 90 95

Asn Asp Tyr Pro Asp Asn Phe Thr Ala Glu Tyr Phe Asp Asn Gln Phe

100 105 110

Ala Ser Tyr Asp Lys Gly Leu Gln Val Leu Lys Tyr Gln Asn Ile Leu

115 120 125

Gly Thr Tyr Ser Asn Pro Lys Lys Asn Phe Lys Phe Gln Leu Ala Leu

130 135 140

Asp Ile Leu Lys Lys Ser Leu Val Ala Arg Gln Tyr Ile Phe Ser Lys

145 150 155 160

Tyr Phe Lys Ile Phe Ile Asp Glu Tyr Gln Asp Ser Asp Lys Asp Met

165 170 175

His Asn Leu Phe Met Tyr Leu Lys Asp Gln Leu Lys Ile Lys Leu Phe

180 185 190

Ile Val Gly Asp Pro Lys Gln Ser Ile Tyr Ile Trp Arg Gly Ala Glu

195 200 205

Pro Glu Asn Phe Asn Gly Leu Ile Glu Asn Ser Thr Asp Phe Asn Lys

210 215 220

Tyr His Leu Thr Ser Asn Phe Arg Cys Cys Gln Asp Ile Gln Asn Tyr

225 230 235 240

Ser Asn Leu Phe Asn Glu Glu Thr Arg Ser Leu Ile Lys Glu Lys Asn

245 250 255

Glu Val Gln Asn Val Ile Ser Ile Ala Asp Asp Met Pro Ile Ser Asp

260 265 270

Ile Leu Leu Lys Leu Thr Glu Glu Lys Gln Val Leu Asn Ile Glu Ala

275 280 285

Glu Leu Val Ile Leu Val Arg Arg Arg Asn Gln Ala Ile Glu Ile Met

290 295 300

Lys Glu Leu Asn Glu Glu Gly Phe Asn Phe Ile Phe Ile Pro Gln Thr

305 310 315 320

Pro Leu Asp Arg Ala Thr Pro Asn Ala Thr Leu Leu Lys Glu Val Ile

325 330 335

Lys Tyr Val Lys Asn Asp Arg Tyr Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Glu

340 345 350

Ile Val Gly Asn Leu Ser Ser Arg Glu Ile Lys Glu Ile Gln Lys Ile

355 360 365

Ile Asn Glu Leu Leu Val Pro Asn Ile Asn Gln Val Leu Ile Asn Gln

370 375 380

Val Leu Ile Asn Leu Phe Ala Lys Leu Glu Ile Thr Leu Asp Thr Arg

385 390 395 400

Glu Ile Thr Ala Phe Thr Glu Val Met Met Thr Asn Glu Phe Asp Ile

405 410 415

Ala Phe Asp Thr Asn Glu Tyr Leu His Lys Ile Phe Thr Val His Ser

420 425 430

Ala Lys Gly Leu Glu Phe Asn Gln Val Ile Ile Thr Ala Ser Asp Tyr

435 440 445

Asn Val His Tyr Asn Arg Asp Thr Asn Glu His Tyr Val Ala Thr Thr

450 455 460

Arg Ala Lys Asp Lys Leu Ile Val Ile Met Asp Asn Lys Lys Tyr Ser

465 470 475 480

Asp Tyr Ile Glu Thr Leu Met Lys Glu Leu Lys Ile Lys Asn Ile Ile

485 490 495

Lys Ser Ile

<210> 3

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctagag aacaaataat aaaggatggg ggtaatattc ttgttaccgc tggagcaggt 60

tcgggtaaaa caacaatatt agttagtaaa attgaagctg atttaaaaga aaataaaact 120

cattactcaa ttgcagctgt tacttttaca aataaggcag caaaagaaat cgagggaaga 180

ttagggtatt catcaagagg gaattttatt ggcactaacg atggttttgt cgagtctgaa 240

attattaggc cgtttattaa agatgcattt ggaaatgatt atccagacaa tttcactgct 300

gaatattttg ataaccaatt tgcttcatac gataagggat tgcaagtgct aaaatatcaa 360

aatatattag ggacttatag taatcctaaa aagaatttta agtttcaatt ggctttagat 420

attttaaaaa aatcacttgt cgctagacaa tatatatttt caaaatactt caagatattt 480

atagacgagt accaagattc ggataaggat atgcataatt tatttatgta tttaaaggat 540

cagcttaaaa ttaagttatt tattgttggt gacccaaaac aatctattta tatctggagg 600

ggagcagaac ctgaaaattt taatggtctt atagaaaatt ctacggattt taataaatat 660

catttaactt ccaactttcg atgctgtcag gatattcaaa attactctaa tttatttaat 720

gaagaaacta gaagcttaat taaagaaaaa aatgaggttc aaaatgtaat cagtatagca 780

gacgatatgc caatttcaga tattttatta aaattaacag aagaaaagca ggtattaaac 840

atagaagcgg aattagtgat tttagtccgg agacgtaatc aagccattga aataatgaaa 900

gaactaaatg aagaagggtt taattttatt tttattcccc aaaccccatt agatagggca 960

actccaaatg caactctttt aaaagaggta attaaatatg ttaaaaatga tagatattca 1020

atatatgatt tagctgctga aattgtaggt aatctaagtt cacgagaaat taaggagata 1080

caaaaaataa ttaatgaatt actagtacct aatattaatc aggtactaat taatcaggta 1140

ttaattaatt tatttgctaa attagaaatt actttagata ctagagaaat tacagcattt 1200

acagaagtaa tgatgacgaa tgaatttgac atagcatttg atacaaatga atatttacat 1260

aaaatattta ctgtacattc tgcaaaagga ttagaattta atcaagtcat tattactgca 1320

agtgattaca atgtacacta taatagagat actaacgaac attatgttgc tacaactaga 1380

gcaaaagata aattaattgt cattatggat aataagaagt actcagatta tattgagacg 1440

ctaatgaaag aacttaaaat taaaaatatt attaagtcaa ta 1482

<210> 4

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgatagagg atgaaatgtc tagagaacaa ataataaagg atgggggtaa tattcttgtt 60

accgctggag caggttcggg taaaacaaca atattagtta gtaaaattga agctgattta 120

aaagaaaata aaactcatta ctcaattgca gctgttactt ttacaaataa ggcagcaaaa 180

gaaatcgagg gaagattagg gtattcatca agagggaatt ttattggcac taacgatggt 240

tttgtcgagt ctgaaattat taggccgttt attaaagatg catttggaaa tgattatcca 300

gacaatttca ctgctgaata ttttgataac caatttgctt catacgataa gggattgcaa 360

gtgctaaaat atcaaaatat attagggact tatagtaatc ctaaaaagaa ttttaagttt 420

caattggctt tagatatttt aaaaaaatca cttgtcgcta gacaatatat attttcaaaa 480

tacttcaaga tatttataga cgagtaccaa gattcggata aggatatgca taatttattt 540

atgtatttaa aggatcagct taaaattaag ttatttattg ttggtgaccc aaaacaatct 600

atttatatct ggaggggagc agaacctgaa aattttaatg gtcttataga aaattctacg 660

gattttaata aatatcattt aacttccaac tttcgatgct gtcaggatat tcaaaattac 720

tctaatttat ttaatgaaga aactagaagc ttaattaaag aaaaaaatga ggttcaaaat 780

gtaatcagta tagcagacga tatgccaatt tcagatattt tattaaaatt aacagaagaa 840

aagcaggtat taaacataga agcggaatta gtgattttag tccggagacg taatcaagcc 900

attgaaataa tgaaagaact aaatgaagaa gggtttaatt ttatttttat tccccaaacc 960

ccattagata gggcaactcc aaatgcaact cttttaaaag aggtaattaa atatgttaaa 1020

aatgatagat attcaatata tgatttagct gctgaaattg taggtaatct aagttcacga 1080

gaaattaagg agatacaaaa aataattaat gaattactag tacctaatat taatcaggta 1140

ctaattaatc aggtattaat taatttattt gctaaattag aaattacttt agatactaga 1200

gaaattacag catttacaga agtaatgatg acgaatgaat ttgacatagc atttgataca 1260

aatgaatatt tacataaaat atttactgta cattctgcaa aaggattaga atttaatcaa 1320

gtcattatta ctgcaagtga ttacaatgta cactataata gagatactaa cgaacattat 1380

gttgctacaa ctagagcaaa agataaatta attgtcatta tggataataa gaagtactca 1440

gattatattg agacgctaat gaaagaactt aaaattaaaa atattattaa gtcaata 1497

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catcatcatc atcatcac 18

<210> 6

<211> 3220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaattca gtaatattac aataaagaac ttcaggaatt ttgaaaaagt aaatataaat 60

ttagataata aaaatgtgat tttcgggatg aatgatattg gaaaaacaaa ttttttatat 120

gcattgagat ttcttttaga taaagagata agaaaattcg gttttaataa atctgattat 180

cataaacatg acacttctaa aaaaattgaa attattttaa cacttgattt gtctaattat 240

gaaaaggatg aagatacaaa aaaacttatt tcagtggtta agggtgctag aacatcggca 300

aatgcagatg ttttttatat cgcactagaa tctaaatatg atgataaaga attatatggg 360

aacataattt taaaatgggg atcggaacta gataatttaa tagatatacc agggagaggg 420

aacataaacg cgttagataa tgtatttaag gtgatttata taaatccgct tgttgattta 480

gacaaattgt tcgcacaaaa taaaaaatat atttttgaag agtcacaggg taatgaatca 540

gatgaaggga ttttaaataa tattaaatct ttaacagatc aagtaaatca acaaatagga 600

gaaatgacaa ttattaaggg tttccagcaa gagataacaa gtgaatatag gtctttaaaa 660

aaagaagagg tttctattga gctgaagtcc gaaatggcaa ttaaaggatt tttctcagat 720

attattccat atataaaaaa agacggtgat tctaattact atccaacctc aggggatggt 780

agaagaaaaa tgctttctta ctctatatat aactatctgg ctaagaaaaa atatgaggat 840

aaaattgtta tttatttaat tgaggaaccc gaaattagtc tacatagatc aatgcaaatt 900

gctttatcaa aacagttatt tgaacaatct acatataaat attttttctt atccactcac 960

tctcctgaac ttctttatga aatggataat acaagattaa taagagtgca ttcaactgaa 1020

aaggttgtat gttcttccca tatgtataat gtggaagaag cctatggaag tgtcaagaaa 1080

aagctaaata aagctttatc atcggctcta tttgctgaaa gagtactttt aatagaaggt 1140

ccttcagaaa aaatattatt tgaaaaggtt ttagacgaag tagaaccaga atatgaatta 1200

aatggaggtt tcttgcttga agtaggaggg acgtacttta atcattatgt gtgtacatta 1260

aatgatttag gtataaccca tataattaaa acagataatg atttgaaatc aaaaaaaggt 1320

aaaaaaggtg tatacgaatt actaggatta aatagatgct taaacttatt aggacgtgaa 1380

aatctagatg agattactat tgacatccct gaagatataa aaggtaagaa gaaaaaagag 1440

agacttaatg aaagaaaaaa agagattttt aaacaatata aaaatgaggt aggggaattc 1500

ttaggggaac gaatatattt atcggaaatc gatctggaaa atgatttata ttctgcaatt 1560

ggtgaaagca tgaaaagaat ttttgaaaac gaagatcccg tgcactattt acagaaaagt 1620

aaactattta acatggtcga gctagtaaat aatttaagta ctaaagattg ttttgatgtt 1680

tttgagcacg aaaaatttgc atgcctaaag gagttggtgg gtagtgatag aggatgaaat 1740

gtctagagaa caaataataa aggatggggg taatattctt gttaccgctg gagcaggttc 1800

gggtaaaaca acaatattag ttagtaaaat tgaagctgat ttaaaagaaa ataaaactca 1860

ttactcaatt gcagctgtta cttttacaaa taaggcagca aaagaaatcg agggaagatt 1920

agggtattca tcaagaggga attttattgg cactaacgat ggttttgtcg agtctgaaat 1980

tattaggccg tttattaaag atgcatttgg aaatgattat ccagacaatt tcactgctga 2040

atattttgat aaccaatttg cttcatacga taagggattg caagtgctaa aatatcaaaa 2100

tatattaggg acttatagta atcctaaaaa gaattttaag tttcaattgg ctttagatat 2160

tttaaaaaaa tcacttgtcg ctagacaata tatattttca aaatacttca agatatttat 2220

agacgagtac caagattcgg ataaggatat gcataattta tttatgtatt taaaggatca 2280

gcttaaaatt aagttattta ttgttggtga cccaaaacaa tctatttata tctggagggg 2340

agcagaacct gaaaatttta atggtcttat agaaaattct acggatttta ataaatatca 2400

tttaacttcc aactttcgat gctgtcagga tattcaaaat tactctaatt tatttaatga 2460

agaaactaga agcttaatta aagaaaaaaa tgaggttcaa aatgtaatca gtatagcaga 2520

cgatatgcca atttcagata ttttattaaa attaacagaa gaaaagcagg tattaaacat 2580

agaagcggaa ttagtgattt tagtccggag acgtaatcaa gccattgaaa taatgaaaga 2640

actaaatgaa gaagggttta attttatttt tattccccaa accccattag atagggcaac 2700

tccaaatgca actcttttaa aagaggtaat taaatatgtt aaaaatgata gatattcaat 2760

atatgattta gctgctgaaa ttgtaggtaa tctaagttca cgagaaatta aggagataca 2820

aaaaataatt aatgaattac tagtacctaa tattaatcag gtactaatta atcaggtatt 2880

aattaattta tttgctaaat tagaaattac tttagatact agagaaatta cagcatttac 2940

agaagtaatg atgacgaatg aatttgacat agcatttgat acaaatgaat atttacataa 3000

aatatttact gtacattctg caaaaggatt agaatttaat caagtcatta ttactgcaag 3060

tgattacaat gtacactata atagagatac taacgaacat tatgttgcta caactagagc 3120

aaaagataaa ttaattgtca ttatggataa taagaagtac tcagattata ttgagacgct 3180

aatgaaagaa cttaaaatta aaaatattat taagtcaata 3220

<210> 7

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg 60

gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat atacc 115

<210> 8

<211> 1797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgaaattca gtaatattac aataaagaac ttcaggaatt ttgaaaaagt aaatataaat 120

ttagataata aaaatgtgat tttcgggatg aatgatattg gaaaaacaaa ttttttatat 180

gcattgagat ttcttttaga taaagagata agaaaattcg gttttaataa atctgattat 240

cataaacatg acacttctaa aaaaattgaa attattttaa cacttgattt gtctaattat 300

gaaaaggatg aagatacaaa aaaacttatt tcagtggtta agggtgctag aacatcggca 360

aatgcagatg ttttttatat cgcactagaa tctaaatatg atgataaaga attatatggg 420

aacataattt taaaatgggg atcggaacta gataatttaa tagatatacc agggagaggg 480

aacataaacg cgttagataa tgtatttaag gtgatttata taaatccgct tgttgattta 540

gacaaattgt tcgcacaaaa taaaaaatat atttttgaag agtcacaggg taatgaatca 600

gatgaaggga ttttaaataa tattaaatct ttaacagatc aagtaaatca acaaatagga 660

gaaatgacaa ttattaaggg tttccagcaa gagataacaa gtgaatatag gtctttaaaa 720

aaagaagagg tttctattga gctgaagtcc gaaatggcaa ttaaaggatt tttctcagat 780

attattccat atataaaaaa agacggtgat tctaattact atccaacctc aggggatggt 840

agaagaaaaa tgctttctta ctctatatat aactatctgg ctaagaaaaa atatgaggat 900

aaaattgtta tttatttaat tgaggaaccc gaaattagtc tacatagatc aatgcaaatt 960

gctttatcaa aacagttatt tgaacaatct acatataaat attttttctt atccactcac 1020

tctcctgaac ttctttatga aatggataat acaagattaa taagagtgca ttcaactgaa 1080

aaggttgtat gttcttccca tatgtataat gtggaagaag cctatggaag tgtcaagaaa 1140

aagctaaata aagctttatc atcggctcta tttgctgaaa gagtactttt aatagaaggt 1200

ccttcagaaa aaatattatt tgaaaaggtt ttagacgaag tagaaccaga atatgaatta 1260

aatggaggtt tcttgcttga agtaggaggg acgtacttta atcattatgt gtgtacatta 1320

aatgatttag gtataaccca tataattaaa acagataatg atttgaaatc aaaaaaaggt 1380

aaaaaaggtg tatacgaatt actaggatta aatagatgct taaacttatt aggacgtgaa 1440

aatctagatg agattactat tgacatccct gaagatataa aaggtaagaa gaaaaaagag 1500

agacttaatg aaagaaaaaa agagattttt aaacaatata aaaatgaggt aggggaattc 1560

ttaggggaac gaatatattt atcggaaatc gatctggaaa atgatttata ttctgcaatt 1620

ggtgaaagca tgaaaagaat ttttgaaaac gaagatcccg tgcactattt acagaaaagt 1680

aaactattta acatggtcga gctagtaaat aatttaagta ctaaagattg ttttgatgtt 1740

tttgagcacg aaaaatttgc atgcctaaag gagttggtgg gtagtgatag aggatga 1797

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Ser Gly Leu Val Pro Ala Gly Ser His

1 5 10

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atccaagctt atgggccgcc acgacgatga acagac 36

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctagaccctc caaatccgct gccaccgcc 29

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaccccccgt tcagcccgac c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggaggaccg aaggagctaa cc 22

Claims

1.一种三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述三磷酸核苷水解酶为GajB蛋白或GajB'蛋白，在金属离子和DNA同时存在的条件下，使用所述三磷酸核苷水解酶水解三磷酸核苷；所述GajB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述GajB'蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述金属离子为镁离子、锰离子、钙离子、钴离子。

2.根据权利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述DNA为ssDNA，所述金属离子为镁离子。

3.根据权利要求1所述的三磷酸核苷水解酶，其特征在于，所述GajB蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述GajB'蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，在诱导表达所述GajB'蛋白时，直接使用所述SEQ ID No.4的核苷酸序列或将所述SEQ ID No.4的核苷酸序列的N端起始密码子gtg更改为atg后的核苷酸序列。

4.权利要求1～3任一项所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，所述识别标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，步骤S1中所述重组载体中还包含柔性肽段的编码基因，所述柔性肽段由1～10个氨基酸组成。

7.根据权利要求6所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，所述柔性肽段中还包含蛋白酶切位点。

8.根据权利要求4所述的三磷酸核苷水解酶的纯化方法，其特征在于，步骤S1的具体方法为：将所述所述GajB蛋白的编码基因或所述GajB'蛋白的编码基因和所述识别标签的编码基因均克隆至表达载体中，得到重组载体；将所述重组载体转化到感受态细胞中得到重组细胞，将所述重组细胞涂布于含有卡那霉素的LB培养基平板上，置于培养箱中过夜，挑取单克隆鉴定获得的三磷酸核苷水解酶表达菌种；将所述三磷酸核苷水解酶表达菌种转接至LB培养基中，过夜活化，按1v/v％比例稀释后放大培养，待OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG在10～16℃的温度下诱导所述三磷酸核苷水解酶表达，16～20h后收集菌体，将所述菌体在5000rpm、4℃下离心15min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀重悬于细菌裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，重复冻融两次；再在14000rpm、4℃下离心1h，离心后取上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤，即得细菌裂解后的上清液；所述IPTG在培养体系中的终浓度为0.05～0.4mmol/L；所述细菌裂解液中含有pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液、300mmol/LNaCl、0.5g/L溶菌酶、0.5mmol/L DTT。

9.权利要求1～3任一项所述的三磷酸核苷水解酶的应用，其特征在于，将所述三磷酸核苷水解酶用于DNA检测、DNA加工、基因工程、基因编辑技术中。

10.根据权利要求9所述的三磷酸核苷水解酶的应用，其特征在于，将所述三磷酸核苷水解酶用于定性或/和定量检测ssDNA；或将所述三磷酸核苷水解酶与GajA蛋白一起用于DNA加工、基因工程、基因编辑技术中。