CN115975987A - 一种AscI限制性内切酶的制备方法 - Google Patents
一种AscI限制性内切酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115975987A CN115975987A CN202310109337.5A CN202310109337A CN115975987A CN 115975987 A CN115975987 A CN 115975987A CN 202310109337 A CN202310109337 A CN 202310109337A CN 115975987 A CN115975987 A CN 115975987A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- asci
- restriction
- seq
- gene
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种AscI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：步骤一、合成AscI.M‑R限制‑修饰系统的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体，所述AscI.M‑R限制‑修饰系统编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示；步骤二、将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；步骤三、AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。本发明通过密码子优化来调整修饰酶与限制酶的表达量，只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达，能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的AscI限制性内切酶，操作流程简化，成本低，成功率高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞工程技术领域，具体涉及一种AscI限制性内切酶的制备方法。
背景技术
细菌防御系统的发现和对其分子机制的深入研究，推动了生物学工具的发展，甚至整个生命科学领域革命性的进步。比如：细菌限制-修饰系统中限制性内切酶的发现，引发了基因工程的革命，成为分子克隆的必备工具。限制性修饰系统(RM system)广泛存在于超过90％的细菌和古细菌中。为保护自身DNA不被裂解，细菌通过甲基转移酶对自身DNA腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基化修饰，限制性内切酶可切割未被修饰的噬菌体基因组，阻止噬菌体DNA复制。
目前Ⅱ型限制性内切酶被广泛应用于基因工程中。AscI是分枝杆菌(Arthrobacter species)体内的一种typeII型限制性内切酶，特异性的识别双链DNA中的“GGCGCGCC”序列并分别在双链5’端之后第二个G残基进行切割(GG^CGCGCC)，切割后的片段具有黏性末端，是遗传及基因工程上实用性较高的限制性内切酶种类。然而，野生型大肠杆菌中AscI酶切位点并没有被甲基化保护，因此传统的大肠杆菌中限制性内切酶的制备方法繁琐需要多个步骤：
1、将带有位点特异性甲基化酶基因的重组载体转入大肠杆菌中，获得具备基底甲基化保护的重组菌；
2、制作具备基底甲基化表达的重组菌感受态细胞；
3、将融合了纯化标签的限制性内切酶蛋白表达质粒转入具备基底甲基化表达的重组菌感受态细胞中；
4、获得阳性单克隆，培养进行限制性内切酶的表达。
目前尚无国内外文献介绍限制性内切酶AscI的重组表达与纯化方法。因此，提供一种高表达量、低成本、流程简便的高效制备AscI限制性内切酶的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，在大肠杆菌中构建AscI.M-R限制-修饰系统，通过密码子优化来调整修饰酶AscI.M与限制酶AscI.R的表达量，只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达，操作流程简化，成功率高。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体；
步骤二、将所述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，获得具备表达并纯化的AscI限制性内切酶重组菌；
步骤三、摇瓶培养进行AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。
进一步地，AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，步骤一中经密码子优化AscI.M和AscI.R的氨基酸序列，得到AscI.M和AscI.R的编码基因，以基因合成的方式合成AscI.M-R限制-修饰系统。
进一步地，AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，AscI.R的氨基酸序列如SEQID NO:2所示，AscI.M编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，AscI.R编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，AscI.R编码基因的DNA序列还含有纯化标签序列；可选地，纯化标签序列为6×His标签序列。
进一步地，步骤一具体为：将AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因，通过NcoI和XhoI酶切位点插入至原核表达载体。
进一步地，所述原核表达载体为pET28a载体。
进一步地，所述大肠杆菌感受态细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
进一步地，所述重组载体还包括两个T7启动子。
进一步地，将AscI限制性内切酶重组菌进行诱导表达后，通过亲和纯化层析进行AscI的纯化。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种AscI限制性内切酶的制备方法，在大肠杆菌中构建AscI.M-R限制-修饰系统，通过密码子优化来调整修饰酶AscI.M与限制酶AscI.R的表达量，只需构建一个质粒即可实现两种蛋白等量并同步表达；并利用AscI.R末端融合的纯化标签就可以根据需要实现限制性内切酶AscI的快速分离纯化。本发明的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的AscI限制性内切酶，操作流程简化，成功率高，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明的一个实施例的简要操作流程图；
图2为实施例3中经过纯化后的AscI蛋白的SDS-PAGE图；
图3为实施例4中的酶切实验后的琼脂糖凝胶电泳图，其中Marker为分子梯度，AscI+ClaI(N)为第一组反应，AscI为第二组反应，AscI(M)+ClaI(N)为第三组反应；N代表限制性内切酶购自NEB，M代表限制性内切酶购自武汉莫纳生物；
图4为含AscI.M-R限制-修饰系统的重组载体图谱。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明的一个具体实施方式的构建、表达及纯化的流程图如图1所示。
实施例1含AscI.M-R限制-修饰系统的重组菌株的构建
1)构建含AscI.M-R限制-修饰系统的重组载体
本实施例中，AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，AscI.R的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。首先，两个序列在设计时排除了AscI酶切位点，在AscI.R序列的3’端加入6×HIS纯化标签，并经过了密码子优化，优化后的AscI.M编码基因的DNA序列如SEQ IDNO:3所示，融合了6×HIS纯化标签的AscI.R编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。然后，分别在AscI.M和AscI.R序列的5’端设计加上两个强启动子T7，通过基因合成获得AscI.M-R限制-修饰系统，AscI.M-R限制-修饰系统的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
通过重组酶介导的的构建反应，将AscI.M-R限制-修饰系统的DNA序列，通过NcoI和XhoI酶切位点插入至原核表达载体pET28a上，克隆位点为5’NcoI/3’XhoI，获得含AscI.M-R限制-修饰系统的重组质粒。其中，在SEQ IDNO:5所示的序列上加上两个酶切位点的引物对ASCIF和ASCIR的序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；重组酶由泓迅生物生产。经过测序确认，构建后的原核表达载体氨基酸翻译读码框正确。
2)制备含AscI.M-R限制-修饰系统的重组质粒的重组大肠杆菌菌株
利用热激转化法将含有AscI.M-R限制-修饰系统的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购于上海唯地生物)，操作步骤如下：从-80℃冰箱取一管100μl BL21(DE3)感受态细胞于冰上融化，后加入10ng已构建的AscI.M-R重组质粒并轻轻混匀,冰上静置15分钟；然后于42℃水浴热激90秒，迅速放回冰中并静置2分钟；向管中加入700μl LB液体培养基，于37℃、210rpm摇床培养60分钟复苏抗性基因。最后从800μl菌液中吸取200μl，于含有卡那(Kanamycin)抗性的平板上涂布均匀，平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。获得的阳性克隆即含有AscI.M-R限制-修饰系统的重组质粒的重组大肠杆菌菌株。
实施例2AscI限制性内切酶的表达与纯化
以400ml表达为例：取实施例1中制备的含有AscI.M-R重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆，接种至含有25μg/ml的卡那(Kanamycin)抗性的4ml的LB培养基中，于过夜摇床培养，次日接种于Kanamycin抗性的400ml LB摇瓶中，于220rpm/min下37℃摇床培养至OD 0.4-0.6，再加入终浓度1mM的IPTG进行诱导，37℃，表达20小时。
8000rcf离心力下离心5min收集菌体，去除上清培养基，使用30ml的预冷buffer(buffer配方20mM Tris，500mM Nacl，pH7.5)悬浮菌体，4℃条件下超声波细胞破碎机超声破菌15min，贝克曼低温离心机10000rcf离心15min去除沉淀，上清与Ni亲和纯化介质进行结合。通过泵将离心去沉淀的上清与2ml Ni离子纯化柱介质混合，依次用50，250，500mM的咪唑缓冲液洗脱收集，洗脱获得的液体通过跑SDS-PAGE胶确定AscI限制性内切酶的纯化条件。通过测试，利用Ni离子纯化柱纯化AscI限制性内切酶的洗脱条件是250mM的咪唑。最后通过透析袋透析(透析使用无50％甘油的Dilution buffer)去除咪唑。Dilution buffer配方：10mM Tris-HCl(pH 7.4at 25℃)，100mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT，0.2mg/ml BSA，50％glycerol。
AscI限制性内切酶SDS-PAGE结果如图2所示，通过本发明的制备方法，400ml LB培养基能快速纯化获得AscI限制性内切酶的提取物，测得蛋白质含量为1.04mg/ml。
实施例3AscI限制性内切酶的酶活的测定
1单位限制性内切酶(1U)通常定义：在建议使用的Buffer及温度下1小时内消化1μg线性化质粒DNA(含有1个相应内切酶位点)，总反应体积为20μl所需的酶量。所用酶活鉴定质粒的DNA如SEQ ID NO:8所示。
取实施例2中表达和纯化后的AscI限制性内切酶进行酶活测定。通过酶切实验确定表达纯化的AscI限制性内切酶的活性是否正常。进行三组反应，第一组使用实施例2中的AscI和购买的ClaI进行双酶切，第二组使用实施例2中的AscI进行单酶切，第三组使用购买的AscI和ClaI进行双酶切。反应条件为：三组酶切反应设计均为50μl反应体系，50μl反应缓冲体系组分如表1所示，对应的限制性内切酶2.2μl，10×quickbuffer(购自ThermoFisher)，2.5μg质粒(构建有基因的商用Puc57载体)，37℃下水浴30min。其中，对照使用的AscI购自武汉莫纳生物，ClaI购自NEB。
表1
取2.5μg质粒作为底物进行酶切反应，酶切后的反应液取10μl，用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，实施例2制备的AscI进行单酶切或双酶切，均能正常切割质粒，表明AscI限制性内切酶功能正常。
申请人声明，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的权利要求保护范围，应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本领域技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，均包括在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种AscI限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、合成AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体；
步骤二、将所述重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，获得具备表达并纯化的AscI限制性内切酶重组菌；
步骤三、AscI限制性内切酶的诱导表达与纯化。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，经密码子优化AscI.M和AscI.R的氨基酸序列，得到所述AscI.M和AscI.R的编码基因，以基因合成的方式合成所述AscI.M-R限制-修饰系统。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述AscI.M的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述AscI.R的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述AscI.M编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，所述AscI.R编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述AscI.R编码基因的DNA序列还含有纯化标签序列；
优选地，所述纯化标签序列为6×His标签序列。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：将AscI.M-R限制-修饰系统的编码基因，通过NcoI和XhoI酶切位点插入至原核表达载体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a载体。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞包括大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体包括两个T7启动子。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述AscI限制性内切酶重组菌进行诱导表达后，通过亲和纯化层析进行AscI的纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310109337.5A CN115975987A (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种AscI限制性内切酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310109337.5A CN115975987A (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种AscI限制性内切酶的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115975987A true CN115975987A (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=85961034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310109337.5A Pending CN115975987A (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种AscI限制性内切酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115975987A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101225396A (zh) * | 2008-02-04 | 2008-07-23 | 金普诺安蛋白质工程技术（北京）有限公司 | 利用基因工程生产限制性内切酶的方法 |
| CN102250846A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-11-23 | 上海近岸科技有限公司 | 重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法 |
| CN106967743A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-07-21 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种重组NotI限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法 |
-
2023
- 2023-02-14 CN CN202310109337.5A patent/CN115975987A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101225396A (zh) * | 2008-02-04 | 2008-07-23 | 金普诺安蛋白质工程技术（北京）有限公司 | 利用基因工程生产限制性内切酶的方法 |
| CN102250846A (zh) * | 2011-07-19 | 2011-11-23 | 上海近岸科技有限公司 | 重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法 |
| CN106967743A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-07-21 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种重组NotI限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ADO24183.1: "M.AscI [Arthrobacter sp. NEB 688]", GENBANK, 10 February 2011 (2011-02-10) * |
| ADO24184.1: "AscI [Arthrobacter sp. NEB 688]", GENBANK, 10 February 2011 (2011-02-10) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11053505B2 (en) | Cleavable fusion tag for protein overexpression and purification | |
| CN112063643A (zh) | 一种用于检测细菌中膜蛋白相互作用的表达载体及方法 | |
| CN114262697B (zh) | 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 | |
| CN108913712B (zh) | 一种重组Tn5转座酶的表达纯化方法 | |
| CN114645033B (zh) | 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用 | |
| CN117487778A (zh) | 一种全新的基于CRISPR-Cas12b的碱基编辑器的构建及其应用 | |
| CN113088501B (zh) | 一种用于生产l-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及l-草铵膦生产方法 | |
| CN109486779B (zh) | Dna甲基转移酶及其可溶性异源表达和分离纯化方法 | |
| CN112813088B (zh) | 重组DpnI限制性内切酶的制备方法 | |
| CN108148852B (zh) | 一种海藻酸裂解酶sha-6基因及应用 | |
| CN115975987A (zh) | 一种AscI限制性内切酶的制备方法 | |
| CN110551697A (zh) | 侧耳类食用菌麦角硫因合成酶pegt1和pegt2在合成麦角硫因中的应用 | |
| CN111019922B (zh) | 一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用 | |
| CN106318922A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶的制备方法 | |
| JPH01225483A (ja) | 組換え体プラスミド | |
| CN117821484A (zh) | 一种HindIII限制性内切酶的制备方法及其应用 | |
| CN118222471A (zh) | 一种表达AscI限制性内切酶的重组菌及AscI限制性内切酶的制备方法 | |
| CN117343942B (zh) | 一种pagA重组蛋白及其制备方法 | |
| CN117187210B (zh) | 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 | |
| CN111849939B (zh) | 一种缺口dna偏好性高保真聚合酶及其应用 | |
| CN114958808B (zh) | 一种小型编辑基因组的CRISPR/Cas系统及其专用的CasX蛋白 | |
| CN116731984B (zh) | 一种基于TadA8e突变体实现碱基颠换的编辑工具及应用 | |
| CN117535270A (zh) | 一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法 | |
| CN116732074A (zh) | 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 | |
| CN108624574B (zh) | 一种s-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |