CN111849939B - 一种缺口dna偏好性高保真聚合酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。本发明公开了源自耐辐射奇球菌DNA聚合酶I的Klenow片段（KlenDr）的高保真聚合特性具有非3’‑5’校正外切活性依赖的特点，且具有结合缺口DNA的偏好性，不同于现有的商用高保真聚合酶。由于KlenDr对缺口DNA底物特异的亲和性，不会切除上游引物的3’末端，且很少替换下游核苷酸链，结合其高保真聚合特性，本发明提出KlenDr在核酸扩增，DNA缺口填充等基因工程操作以及测序文库的构建中将具有十分广阔的应用前景。

Description

一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。
背景技术
DNA聚合酶在分子克隆、DNA测序、文库构建等基因工程操作中具有广泛的应用价值，其准确复制DNA序列的能力至关重要。目前商业化应用的高保真DNA聚合酶大都依赖于3’-5’外切校正活性：当插入的核苷酸不符合Watson-Crick碱基互补配对原则时，不合适的空间构象会迫使新插入的核苷酸从聚合活性中心转移到3’-5’外切活性中心，从而切除该错误插入的核苷酸，以保证DNA复制的准确性。目前商业化应用的不依赖于3’-5’校正外切活性的高保真聚合酶尚缺乏。
DNA聚合酶通常偏好结合引物-模板结构的DNA，然而，随着生物技术的发展，人们对基因改造的需求多样性增加，例如基于T5转座酶的测序文库构建中需要补平接头与片段之间的缺口，而目前尚未见商业化的特异性偏好结合缺口DNA的聚合酶。此外，虽然多数聚合酶都可以填补缺口，但往往带有3’-5’校正外切核酸酶活性，会降解上游的3’末端。突变了外切校正活性的聚合酶虽然不降解上游核苷酸，但保真性又会有所降低，且替换下游核苷酸链（Strand Displacement）的活性也会增强。
DNA聚合酶I是人类最早发现的DNA聚合酶类，具有5’-3’核酸酶结构域、3’-5’ 外切核酸酶结构域和DNA聚合酶结构域（如图1所示）。大肠杆菌的DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶(或胰蛋白酶)处理后可分为34kDa的小片段和74kDa的Klenow片段。Klenow片段包含了3’-5’ 外切核酸酶结构域和DNA聚合酶结构域，是商业上广泛应用的一种DNA聚合酶。2007年，Heinz等人体外表达纯化了耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans R1）中与大肠杆菌Klenow片段同源的蛋白（KlenDr），报道了它的高保真聚合特性和微弱的链替换合成能力，但是并没有进一步的底物偏好性等研究，所以至今该聚合酶缺乏应用价值。
发明内容
针对目前基因工程和测序文库构建过程中对DNA聚合场景的多样性需求，本发明深入挖掘KlenDr的聚合特性，提供了缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。
一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶，具有不依赖于3’-5’校正外切活性的高保真聚合特性，偏好结合缺口DNA，所述DNA聚合酶来源于耐辐射奇球菌Deinococcus radioduransR1，购自美国模式菌种保藏中心，编号：ATCC 13939，包含蛋白序列ID为ANC71194.1的第289-921位氨基酸，如SEQ ID NO .1所示。
所述的一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶在核酸扩增中的应用，用于填补DNA缺口。
所述的核酸扩增体系的反应缓冲液为50~200 mM KCl，20~30mM Tris HCl pH 7.5~8.0，1~10 mM MgCl2，0.1~0.5 mM dNTPs，0.1 mg/ml BSA，1 mM DTT。
所述的应用，核酸扩增体系的最适反应温度为25-37℃。
所述的应用，适用于包括需要填补DNA缺口的基因工程操作和测序文库构建。
所述的测序文库构建包括基于Tn5转座子的文库构建。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）KlenDr高保真聚合特性非3’-5’外切校正活性依赖，可避免上游引物链的降解，适用于不需要3’-5’外切活性的核酸扩增过程。
（2）KlenDr偏好结合缺口DNA，结合其较弱的链替换合成能力，适用于需要填补DNA缺口的基因工程操作和测序文库构建过程。
附图说明
图1是DNA聚合酶I家族的结构域示意图。
图2是纯化的KlenDr蛋白的SDS-PAGE胶电泳图；
显示其纯度在95%以上。
图3是KlenDr与大肠杆菌Klenow片段的3’-5’校正外切活性比较。
图4是耐辐射奇球菌、大肠杆菌和水生嗜热菌中DNA聚合酶I 3’-5’校正外切核酸酶结构域的多序列比对图；
其中蓝色代表保守的氨基酸，红色代表大肠杆菌Klenow片段的活性中心保守氨基酸（D355，E357，D424）。
图5是KlenDr与大肠杆菌Klenow片段对引物-模板结构和缺口DNA结构的结合能力比较。
图6是KlenDr与大肠杆菌Klenow片段填补缺口DNA活性的比较。
图7是常规聚合酶与KlenDr处理DNA缺口的模式图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白表达菌株的构建
根据2016年重新测序注释的耐辐射奇球菌R1基因组（ASM163882v1），DNA聚合酶 I（蛋白序列ID：ANC71194.1）包含921个氨基酸，相比旧版（ASM856v1）减少了N端的35个氨基酸。本发明涉及的KlenDr源于新版DNA聚合酶I序列的第289-921位氨基酸。图1是DNA聚合酶I家族的结构域示意图，其中耐辐射奇球菌的结构域位于第二项。
（1）使用天根生物的细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）提取耐辐射奇球菌R1的基因组，用NanoDrop 1000（Thermo公司）测定其浓度和纯度。
（2）根据新版DNA聚合酶I的第289-921位氨基酸和pet28a质粒设计一对可用于同源重组的引物，上游引物KlenDr-F为：5’-gtgccgcgcggcagccatatgCTGGGGCTGAACGGGCCA-3’，小写字母为pet28a载体上的同源片段，酶切位点为NdeI；下游引物为5’-acggagctcgaattcggatccTCACTTCGTGTCAAACCAGTTCG-3’，小写字母为pet28a载体上的同源片段，酶切位点为BamHI。以耐辐射奇球菌R1基因组DNA为模板，用全式金TransStart FastPfu DNAPolymerase对目的片段进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一后，用Wizard SV Geland PCR Clean-Up试剂盒对PCR产物进行纯化回收。
（3）用诺维赞ClonExpress II One Step Cloning重组酶系统将KlenDr基因的片段重组至NdeI/BamHI双酶切线性化后的pet28a载体上（N端含有6 x His标签）。
（4）将重组的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（全式金公司）中，涂布在含有40μg/mL Kanamycin的固体LB培养基上，37 ℃倒置培养过夜。
（5）挑选若干单菌落于5ml含40μg/mL Kanamycin的液体LB培养基中，37℃震荡培养10h。用Axygen质粒提取试剂盒抽提质粒，并根据T7/T7ter引物进行测序，经BLAST序列比对正确后，将质粒放至-20℃保存。
实施例2：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白的诱导表达
（1）将构建成功的Pet28a-KlenDr表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株（全式金公司）中，用含40μg/mL Kanamycin和34μg/mL chloramphenicol抗生素的固体LB培养基筛选成功转化的克隆菌株。
（2）挑取成功转化的单菌落至5ml液体培养基中，37℃震荡培养过夜，然后转接至500ml培养基中，培养至OD600为0.6-0.8，放至冰上冷却10min，加入100ul 1M IPTG，于30℃培养5h，诱导目的蛋白表达。
（3）诱导结束后，用8000rpm，离心8min收集菌体，并用1x PBS重悬洗涤菌体，最后用8000rpm离心5min，弃上清，菌体置于-80℃保存。
实施例3：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白的纯化
（1）菌体裂解：按照1g菌体（湿重）加入15 mL裂解Buffer（300 mM NaCl，20 mMTris HCl pH 8.0，5% Glycerol，3 mM β-Me，10 mM咪唑）重悬细胞。用超声细胞破碎仪（宁波新芝，JY92-IIN）冰水浴破碎细胞至悬液透光，参数为交变杆Φ6，功率60%，超声2.5s、间隙9 .9 s、时间60-90 min。破碎后的细胞悬液用15000 rpm离心35min，去除细胞碎片，保留上清，并用0.22或0.45μM滤膜过滤。
（2）镍柱亲和纯化：镍柱（HisTrap HP 1ml）购自GE HealthCare公司。先用Ni-bufferA（300 mM NaCl，20 mM Tris HCl pH 8.0，5% Glycerol，3 mM β-Me）平衡镍柱，用1ml/min的流速让细胞裂解液与镍柱充分结合，再分别用15%，50%和100%的Ni-bufferB（300mM NaCl，20 mM Tris HCl pH 8.0，5% Glycerol，3 mM β-Me，300mM 咪唑）进行梯度洗脱。用SDS-PAGE胶对洗脱产物进行检测，目的蛋白于150mM咪唑浓度下被洗脱液。
（3）脱盐：脱盐柱（HiTrap Desalting）购自GE HealthCare公司。收集含有目的蛋白的洗脱液，用GE 超滤浓缩管（30 kDa）浓缩至<1ml，1ml/min流速上样和洗脱。脱盐Buffer含20 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl和5% Glycerol。
（4）Heparin柱纯化：HiTrap Heparin HP柱购自GE HealthCare公司。Heprain-bufferA为20 mM Tris-HCl pH8.0、100 mM NaCl和5% Glycerol，Heprain-bufferB为20 mMTris-HCl pH8.0、800 mM NaCl和5% Glycerol。按50ml体积线性梯度增加buffer B的比例至100%，收集各蛋白峰，经SDS-PAGE检测，发现目的蛋白于35% buffer B时被洗脱。
（5）分子筛纯化：Superdex 200 Increase 10/300 GL购自GE HealthCare公司。将所获目的蛋白用超滤管（30kDa）浓缩到约500μl体积，分子筛Buffer为20 mM Tris-HClpH8.0、100 mM KCl，0.8ml/min上样和洗脱，目的蛋白约在14.5 mL洗脱体积处出峰。目的蛋白后经SDS-PAGE电泳，结果所获蛋白分子量约为70kDa，纯度达95%以上（如图2所示）。将目的蛋白浓缩后用NanoDrop仪器测定蛋白浓度，用液氮速冻，置于于-80 ℃保存。
实施例4：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白不具有3’-5’校正外切核酸酶活性
（1）KlenDr体外3’-5’校正外切核酸酶活性的检测：
3’端含有错配的引物-模板DNA序列由上海生工公司合成：引物序列为5’-CGTGCCTAGCGTA-3’，其中5’末端带有6-FAM荧光标记，模板序列为5’-ACGAGTCATGCTACGCTAGGCACGA-3’。将引物序列和模板序列分别添加100uM和200uM至50 ul退火体系（20 mM Tris HCl pH8.0，100 mM NaCl）中，得到终浓度为2 uM含标记的引物-模板结构。
体外酶活反应体系（10ul）反应体系包含100 mM NaCl、20 mM Tris-HCl (pH8.0)、 0.1 mg/ml BSA、1 mM DTT、10-500 nM KlenDr、5mM MgCl2和50 nM含有3’末端错配的引物-模板底物。37℃反应10min后，加入5ul quench buffer（90% 甲酰胺，50 mM EDTA，0.01% 溴酚蓝）终止反应，将产物98℃加热5min，使DNA充分变性，立即放至冰上冷却。用15%TBE-urea-PAGE胶分离产物，180V电泳50min，用Typhoon 9500仪器（GE Healthcare公司）扫描成像。本实验使用大肠杆菌Klenow片段（购买自New England Biolabs）作为3’-5’校正外切核酸酶活性的阳性对照。
凝胶成像结果如图3所示，大肠杆菌的Klenow片段在10nM时即表现明显的校正外切活性，而KlenDr在500nM时也未见外切产物，提示KlenDr缺乏3’-5’的校正外切核酸酶活性。
（2）大肠杆菌、水生嗜热菌、耐辐射奇球菌DNA聚合酶I中3’-5’外切结构域的多序列比对：
为了进一步确认KlenDr的3’-5’校正外切核酸酶活性，我们将KlenDr与大肠杆菌、水生嗜热菌和的Klenow片段进行多序列比对（图4）。大肠杆菌Klenow中的3’-5’外切结构域中重要的与催化金属离子结合的酸性氨基酸包括D355，E357，D424（图4中标记为红色），已知水生嗜热菌因缺乏这些氨基酸而不具有活性，KlenDr的序列同样也不具有大肠杆菌Klenow片段中的这些重要氨基酸，进一步确定了KlenDr校正外切核酸酶活性的缺失。
实施例5：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白偏好结合缺口DNA
：模板序列为5’- GATGTCAAGCAGTCCTAACTTTTTTTGAGGCAGAGTCC-3’，上游引物序列为5’-FAM- GGACTCTGCCTCAA-3’，下游序列为5’- AGTTAGGACTGCTTGACATC-3’，其中上游引物序列的5’末端带有6-FAM标记。模板，上游，下游序列分别添加200uM,100uM和200uM至50ul退火体系（20 mM Tris HCl pH8.0，100 mM NaCl）中，得到终浓度为2 uM的缺口DNA结构。引物-模板结构的模板序列为5’-ACGAGTCATGTTACGCTAGGCACGA-3’，退火方式同实施例1。
耐辐射奇球菌KlenDr蛋白与双链缺口DNA和引物模板DNA的结合反应体系（10 ul）包含：50 nM FAM标记的底物，50-5000 nM KlenDr或Klenow，100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mg/ml BSA ，1 mM DTT，5 mM EDTA。反应体系37℃孵育30min，加入5ulnative loading buffer（20mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl， 20%甘油）经10% Native-PAGE电泳分离，用Typhoon 9500仪器（GE Healthcare公司）扫描成像。
如图5所示，KlenDr更偏好结合双链缺口型DNA底物，而非引物-模板结构的底物，与大肠杆菌Klenow片段的底物偏好性相反，更偏好结合引物-模板结构。
实施例6：耐辐射奇球菌KlenDr蛋白在填补双链缺口中的应用
由于大肠杆菌Klenow片段会切除上游引物的3’末端，本实验采用校正外切活性突变了的Klenowexo-作为对照（购买自New England Biolabs）。
耐辐射奇球菌KlenDr蛋白填补DNA缺口的反应体系（10 ul）包含：100 nM FAM标记的底物，100 nM KlenDr或Klenowexo-，100 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.1 mg/mlBSA，1 mM DTT，5 mM MgCl2，1-50 μM dNTPs。其中双链缺口DNA结构的序列和形成方式同实施例2。将该反应体系于37℃下反应20min后，加入5 ul quench buffer，终止反应，将产物98℃加热5min，使DNA充分变性，立即放至冰上冷却。用15% TBE-urea-PAGE胶分离产物，180V电泳50min，用Typhoon 9500仪器（GE Healthcare公司）扫描成像。
如图6所示，KlenDr在填补缺口后有个明显的停顿，而对照组的Klenow则具有更强的链替换合成能力，因而KlenDr更适合填补缺口的核酸扩增聚合场景。
实施例7：KlenDr在基于Tn5转座子的建库方法中的应用
基于Tn5转座子的建库方法在二代测序中应用广泛，尤其是染色质开放性测序技术（ATAC-Seq）中，其建库原理如下：首先利用Tn5转座酶将接头序列插入到DNA双链中，两个Tn5插入就可以形成一个完整的文库。然后再利用DNA聚合酶将T5转座产生的缺口补平，用连接酶连接。最后，经PCR扩增即可完成文库扩增。如图7所示，本发明中的KlenDr十分适合应用于其中的缺口填补过程，不仅对缺口DNA具有特异的结合偏好，还能在不降解上游核苷酸的前提下保证插入核苷酸的准确度，并且很少替换合成下游核苷酸链，以上这些将有效提高整体建库过程的效率。
以上仅是本发明的优选实施方式，但本发明并不局限于上述详细方法，根据本发明的教导和启示，任何熟悉此技术方案的人，利用本发明公开的KlenDr的聚合酶特性进行的核酸扩增等，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用
<141> 2020-07-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 632
<212> PRT
<213> 耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans R1)
<400> 1
Leu Gly Leu Asn Gly Pro Glu Gln Asp Gly His Ala Pro Asp Asp Leu
1 5 10 15
Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Thr Pro Glu Glu Asp Glu Ala Ala Ala
20 25 30
Leu Pro Ala Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ala Glu Trp Gln Thr Pro Ala
35 40 45
Glu Gly Ala Val Trp Gly Tyr Val Leu Ser Arg Glu Asp Asp Leu Thr
50 55 60
Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Thr Phe Glu Asp Gly Val Ala Arg Pro
65 70 75 80
Ala Pro Val Ser Glu Pro Asp Glu Trp Ala Gln Ala Glu Ala Pro Glu
85 90 95
Asn Leu Phe Gly Glu Leu Leu Pro Ser Asp Lys Pro Leu Thr Lys Lys
100 105 110
Glu Gln Lys Ala Leu Glu Lys Ala Gln Lys Asp Ala Glu Lys Ala Arg
115 120 125
Ala Lys Leu Arg Glu Gln Phe Pro Ala Thr Val Asp Glu Ala Glu Phe
130 135 140
Val Gly Gln Arg Thr Val Thr Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Ala
145 150 155 160
His Leu Ser Val Arg Gly Thr Val Val Glu Pro Gly Asp Asp Pro Leu
165 170 175
Leu Tyr Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Asn Thr Asn Met Pro Val Val
180 185 190
Ala Lys Arg Tyr Leu Asp Arg Glu Trp Pro Ala Asp Ala Pro Thr Arg
195 200 205
Ala Ala Ile Thr Gly His Leu Leu Arg Glu Leu Pro Pro Leu Leu Asp
210 215 220
Asp Ala Arg Arg Lys Met Tyr Asp Glu Met Glu Lys Pro Leu Ser Gly
225 230 235 240
Val Leu Gly Arg Met Glu Val Arg Gly Val Gln Val Asp Ser Asp Phe
245 250 255
Leu Gln Thr Leu Ser Ile Gln Ala Gly Val Arg Leu Ala Asp Leu Glu
260 265 270
Ser Gln Ile His Glu Tyr Ala Gly Glu Glu Phe His Ile Arg Ser Pro
275 280 285
Lys Gln Leu Glu Thr Val Leu Tyr Asp Lys Leu Glu Leu Ala Ser Ser
290 295 300
Lys Lys Thr Lys Leu Thr Gly Gln Arg Ser Thr Ala Val Ser Ala Leu
305 310 315 320
Glu Pro Leu Arg Asp Ala His Pro Ile Ile Pro Leu Val Leu Glu Phe
325 330 335
Arg Glu Leu Asp Lys Leu Arg Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Ile Pro Asn
340 345 350
Leu Val Asn Pro His Thr Gly Arg Leu His Thr Thr Phe Ala Gln Thr
355 360 365
Ala Val Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu Asn Pro Asn Leu Gln Asn
370 375 380
Ile Pro Ile Arg Ser Glu Leu Gly Arg Glu Ile Arg Lys Gly Phe Ile
385 390 395 400
Ala Glu Asp Gly Phe Thr Leu Ile Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu
405 410 415
Leu Arg Leu Leu Ala His Ile Ala Asp Asp Pro Leu Met Gln Gln Ala
420 425 430
Phe Val Glu Gly Ala Asp Ile His Arg Arg Thr Ala Ala Gln Val Leu
435 440 445
Gly Leu Asp Glu Ala Thr Val Asp Ala Asn Gln Arg Arg Ala Ala Lys
450 455 460
Thr Val Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser
465 470 475 480
Asn Asp Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Ala Ala Thr Phe Ile Glu Ile
485 490 495
Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Gly Ile Arg Arg Tyr Ile Asn His Thr Leu
500 505 510
Asp Phe Gly Arg Thr His Gly Tyr Val Glu Thr Leu Tyr Gly Arg Arg
515 520 525
Arg Tyr Val Pro Gly Leu Ser Ser Arg Asn Arg Val Gln Arg Glu Ala
530 535 540
Glu Glu Arg Leu Ala Tyr Asn Met Pro Ile Gln Gly Thr Ala Ala Asp
545 550 555 560
Ile Met Lys Leu Ala Met Val Gln Leu Asp Pro Gln Leu Asp Ala Ile
565 570 575
Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Leu Ile Glu Ala
580 585 590
Pro Leu Asp Lys Ala Glu Gln Val Ala Ala Leu Thr Lys Lys Val Met
595 600 605
Glu Asn Val Val Gln Leu Lys Val Pro Leu Ala Val Glu Val Gly Thr
610 615 620
Gly Pro Asn Trp Phe Asp Thr Lys
625 630

Claims (5)

1.一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶在核酸扩增中的应用，其特征在于，用于填补DNA缺口；
所述缺口DNA偏好性高保真聚合酶具有不依赖于3’-5’校正外切活性的高保真聚合特性，偏好结合缺口DNA，所述缺口DNA偏好性高保真聚合酶来源于耐辐射奇球菌（Deinococcusradiodurans）R1，购自美国模式菌种保藏中心，编号：ATCC 13939，蛋白序列ID为ANC71194.1的第290-921位氨基酸，如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，核酸扩增体系的反应缓冲液为50~200 mMKCl，20~30mM Tris HCl pH 7.5~8.0，1~10 mM MgCl2，0.1~0.5 mMdNTPs，0.1 mg/ml BSA，1mM DTT。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，核酸扩增体系的最适反应温度为25-37℃。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：适用于包括需要填补DNA缺口的基因工程操作和测序文库构建。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的测序文库构建包括基于Tn5转座子的文库构建。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104212782A (zh) * 2014-06-13 2014-12-17 浙江大学 耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法
CN104854237A (zh) * 2012-12-13 2015-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
WO2016077763A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bio-engineered hyper-functional "super" helicases

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9193974B2 (en) * 2006-05-10 2015-11-24 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
US9428737B1 (en) * 2010-01-11 2016-08-30 Eric Gaucher Taq polymerase sequences useful for incorporating analogs of nucleoside triphosphates
US8759062B2 (en) * 2010-06-18 2014-06-24 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′- mismatch discrimination
CN103987843B (zh) * 2011-12-08 2015-12-23 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104854237A (zh) * 2012-12-13 2015-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
CN104212782A (zh) * 2014-06-13 2014-12-17 浙江大学 耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法
WO2016077763A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bio-engineered hyper-functional "super" helicases

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biochemical characterization of a unique DNA polymerase A from the extreme radioresistant organism Deinococcus radiodurans";Xingru Zhou et al.;《Biochimie》;20210313;第185卷;第22-32页 *
"Lesion Bypass Activity of DNA Polymerase A from the Extremely Radioresistant Organism Deinococcus radiodurans";Kathrin Heinz et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20070214;第282卷(第15期);第10908页第2栏第2段，第10909页第1栏第1-3段、第2栏最后1段 *
"Metal Binding to DNA Polymerase I, Its Large Fragment, and Two 3’,5’-Exonuclease Mutants of the Large Fragment";Gregory P. Mullen et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;19900825;第265卷(第24期);第14327页第2栏第2段 *
"Recombination and Replication in DNA Repair of Heavily Irradiated Deinococcus radiodurans";Dea Slade et al.;《Cell》;20090319;第136卷;第1049页第2栏第2段、第1052页图7 *
Kathrin Heinz et al.."Lesion Bypass Activity of DNA Polymerase A from the Extremely Radioresistant Organism Deinococcus radiodurans".《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》.2007,第282卷(第15期), *

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