CN116732074A - 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 - Google Patents
一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116732074A CN116732074A CN202310681137.7A CN202310681137A CN116732074A CN 116732074 A CN116732074 A CN 116732074A CN 202310681137 A CN202310681137 A CN 202310681137A CN 116732074 A CN116732074 A CN 116732074A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sapi
- restriction enzyme
- recombinant
- expression vector
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 claims description 17
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 14
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 101150109178 M1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150046652 M2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 4
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法，属于外源表达技术领域。本发明公开了表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体，以及表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌，利用所述重组菌生产限制性内切酶SapI。本发明的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的SapⅠ限制性内切酶，极大地降低了SapⅠ的制备成本，提高了制备效率。
Description
技术领域
本发明属于外源表达技术领域，具体涉及一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法。
背景技术
限制性核酸内切酶是可以识别特定的脱氧核苷酸序列并进行切割的核酸酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，从而起到保护细胞原有的遗传信息的作用。限制性内切酶的发现促使DNA重组技术的诞生，从而极大地推动了现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。
在细菌中，限制性内切酶及其相应的甲基转移酶构成限制-修饰系统，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制性内切酶对自身DNA片段的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控二者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护，保护完成后再表达限制性内切酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因此被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对的限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化修饰的外源DNA。
关于限制-修饰系统在原核细胞中表达的研究表明，系统的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提。由于DNA分子的结构组成和特性，自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶，分别是C5甲基酶、N4胞嘧啶和N6腺嘌呤甲基酶。当一个有限制性内切酶识别位点的DNA被甲基转移酶修饰后，这个DNA分子就会具有抵抗相应限制酶切割的特性。即通常情况下，如果DNA识别序列相同(或识别序列包含在内)并且甲基化酶修饰位点和方式也一致，那么这种经过甲基转移酶特异性甲基化修饰的DNA就具有可以抵抗相似识别序列的限制性内切酶的切割作用，从而保护宿主细胞的DNA免受破坏。
自20世纪60年代末第一个限制性内切酶被发现之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得广泛应用。关于限制性内切酶的研究，多年来着重与它们作为工具酶的实用价值，包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中SapⅠ是一种应用较为广泛的限制性内切酶，其识别位点是：5’-GCTCTTC-3’-3’-CGAGAAG-5’，不仅可以作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物制药方向也具有广泛的需求和应用价值。但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的SapⅠ限制酶价格偏高，在一定程度上限制了它的广泛应用。因此，提供一种高表达量、低成本、分离纯化程序简便、蛋白得率高的制备SapⅠ的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法，可稳定且高效进行限制酶SapⅠ的重组表达，制备方法操作简单，能够在较短的时间内制备得到高纯度、高活性的限制性内切酶SapⅠ。
本发明提供了一种重组表达载体，包括至少一个拷贝的限制性内切酶SapⅠ的编码基因。
优选的，还包括GFP-Sumo片段，且所述GFP-Sumo片段与限制性内切酶SapⅠ的编码基因一端连接。
优选的，所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌的构建方法，包括以下步骤：
分别利用上述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，筛选后得所述重组菌；
所述第二重组载体包括限制性内切酶SapⅠ的甲基转移酶的编码基因。
优选的，所述第二重组载体的构建方法，包括将所述甲基转移酶的两个亚基M1和M2基因片段通过柔性融合蛋白接头连接后，克隆到表达载体中，得所述第二重组载体。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌。
本发明还提供了利用上述重组菌生产限制性内切酶SapⅠ的方法，包括以下步骤：诱导培养所述重组菌，裂解菌体后，菌体裂解液中包含所述限制性内切酶SapⅠ。
优选的，所述诱导培养的温度为20～25℃，时间为18～24h，且在所述诱导培养时伴随搅拌。
优选的，利用IPTG诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，对所述重悬液破碎后离心，收集上清。
优选的，在收集上清后还包括纯化。
有益效果：本发明提供了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体及重组菌，通过对限制性内切酶SapⅠ的编码基因进行特异的密码子优化，并将其与GFP-Sumo修饰蛋白融合表达，实现了限制性内切酶SapⅠ的高效重组表达；抵抗限制性内切酶SapⅠ对宿主基因组DNA的酶切，相对无甲基化保护的表达系统，可稳定且高效进行限制酶SapⅠ的重组表达。本发明的制备方法操作简单，能够在较短的时间内制备得到高纯度、高活性的SapⅠ限制性内切酶。本发明在此纯化基础上可进行工业化放大，有利于限制性内切酶SapⅠ的大批量生产。
附图说明
图1为pET-28a-SapⅠ的载体图谱；
图2为pUC-19-M.SapⅠ的载体图谱；
图3为本发明实施例3中离子交换柱纯化从吸收峰对应的Fractions中每管蛋白吸取10μL进行SDS-PAGE验证，即纯化后的SapⅠ蛋白SDS-PAGE图，其中M为蛋白Marker，从上至下的条带依次为170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa，泳道1、2、3、4分别为吸收峰对应的Fractions中的每管蛋白；
图4为本发明实施例4中利用SapⅠ限制性内切酶双酶切后得到的核酸的凝胶电泳图，其中，M代表DNAMarker，从上到下依次为10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp；泳道1是λDNA，泳道2是BamhⅠ单酶切对照，泳道3-10分别是将SapⅠ原液稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍的双酶切图，最终活力定为600U/μL。
具体实施方式
本发明提供了一种重组表达载体，包括至少一个拷贝的限制性内切酶SapⅠ的编码基因。
本发明所述重组表达载体中优选还包括GFP-Sumo片段，且所述GFP-Sumo片段与限制性内切酶SapⅠ的编码基因一端连接。本发明所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示；所述GFP-Sumo片段的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。
本发明所述重组表达载体含有位于限制性内切酶SapⅠ编码基因上游的T7启动子、GFP-Sumo序列以及标签序列，所述启动子用于驱动所述编码基因的转录，所述GFP-Sumo序列可以减少SapⅠ基因的突变并增加可溶性表达，所述GFP-Sumo序列与所述编码基因可通过PCR无缝连接。本发明所述GFP-Sumo能与SapⅠ更好地配合作用，减少SapⅠ基因的突变的同时进一步提高SapⅠ蛋白的表达水平。本发明对所述标签序列的种类并没有特殊限定，如实施例中选择8×His标签序列。
本发明对所述重组表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段将所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因片段克隆到基础载体中即可，所述基础载体优选为原核表达载体，实施例中以pET-28a为例进行说明，通过同源重组将限制性内切酶SapⅠ的编码基因和GFP-Sumo片段整合到pET-28a中的..。
本发明还提供了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌的构建方法，包括以下步骤：
分别利用上述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，筛选后得所述重组菌；
所述第二重组载体包括限制性内切酶SapⅠ的甲基转移酶的编码基因。
本发明利用上述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，所述第二重组载体优选含有一个或多个拷贝的限制性内切酶SapⅠ所对应的特异性甲基转移酶M.SapⅠ的编码基因，由于限制性内切酶SapⅠ的识别序列是不对称的(一条链为5’-GCTCTTC-3’，另一条链为5’-GAAGAGC-3’)，故该天然特异性甲基化酶M.SapⅠ具有两个亚基，分别为M1和M2。因此，所述的特异性甲基转移酶M.SapⅠ是由M1和M2通过柔性融合蛋白接头(GGGGS)3相连而组成的。本发明经密码子优化的甲基转移酶M.SapⅠ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.3所示。本发明在构建所述第二重组载体时，优选将上述SEQ ID No.3所示的序列通过同源重组连接入表达载体pUC-19中，得到甲基转移酶重组表达载体pUC-19-M.SapⅠ。
本发明利用上述重组表达载体和第二重组载体(甲基转移酶重组表达载体pUC-19-M.SapⅠ)共同转化感受态细胞，本发明所述感受态细胞优选为原核细胞，实施例中选择原核表达系统中的大肠杆菌表达系统，具有周期短、培养条件简单、成本低等特点。本发明优选将限制性内切酶SapⅠ重组表达载体和特异性甲基转移酶M.SapⅠ重组表达载体共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布于氨苄卡纳霉素抗性平板进行培养。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌。
本发明还提供了利用上述重组菌生产限制性内切酶SapⅠ的方法，包括以下步骤：诱导培养所述重组菌，裂解菌体后，菌体裂解液中包含所述限制性内切酶SapⅠ。
本发明所述诱导培养的温度优选为20～25℃，时间优选为18～24h，且在所述诱导培养时伴随搅拌，搅拌速率优选为180～200rpm。本发明所述诱导培养优选为利用诱导剂进行，所述诱导剂优选包括IPTG，所述IPTG为终浓度优选为0.3～0.5mM。本发明所述诱导培养的参数，诱导温度可以影响蛋白产生的速度，从而影响蛋白的正确折叠，温度较高时蛋白质因来不及正确折叠而容易形成包涵体，温度低则影响蛋白质的产量，但同时低温也可以提高可溶蛋白的含量；IPTG诱导剂浓度太高会影响菌株的生长，诱导剂浓度太低则不足以诱导基因充分表达。在本发明所述诱导培养参数下，得到的限制性内切酶SapⅠ的活性高。
本发明在利用IPTG诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，对所述重悬液破碎后离心，收集上清。本发明所述裂解缓冲液优选包含如下组分：10～20mM的Tris-HCl(pH8.0)、100～200mM的NaCl、20mM的咪唑和10％(v/v)的甘油。本发明所述裂解缓冲液的体积优选为所述菌体体积的5～10倍。
本发明对利用上述裂解缓冲液重悬后的菌体，得到的重悬液进行破碎，所述破碎优选包括低温高压破碎和超声破碎，所述低温高压破碎的低温优选为4～6℃，所述高压优选为为80～100MPa。本发明所述低温高压破碎的次数优选为5次(30min)。所述低温高压破碎可以破碎菌体释放其中的内容物。本发明对经低温高压破碎后的裂解液进行超声破碎，优选设置程序为5s on，5s off，100～200次循环。经所述超声破碎后，可以进一步破碎细胞膜，从而释放细菌中的目的蛋白。
本发明对超声后得到的液体进行离心，并收集上清，所述离心的转速优选为12000～14000rpm，离心时间优选为10～30min，取上清为粗产品。本发明在收集上清后优选还包括纯化。
本发明所述纯化优选包括以下步骤：将裂解菌体得到的粗产品依次进行镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化。本发明所述镍柱亲和层析使用的缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B；所述缓冲液A优选包括20mM Tris-HCl，pH8.0、20mM咪唑、200mMNaCl、10％甘油，所述缓冲液B优选包括20mMTris-HCl，pH8.0、500mM咪唑、200mM NaCl、10％甘油。本发明所述离子交换层析纯化使用的离子交换柱优选为Q柱阴离子交换柱；使用的缓冲液包括缓冲液C和缓冲液D；所述缓冲液C优选包括20mM Tris-HCl，pH8.0、100mMNaCl、1mM DTT、10％甘油，所述缓冲液D优选包括20mM Tris-HCl，pH8.0、1MNaCl、1mM DTT、10％甘油。
本发明在上述纯化后优选还包括回收，回收含有SapⅠ限制性内切酶的洗脱液用Storage Buffer置换；所述Storage Buffer优选包括10mM Tris-HCl，pH7.5、200mMNaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％甘油。
在本发明中，镍柱亲和层析是一种依据生物大分子与配体可逆的专一性结合原理，从而专一的分离特异的生物大分子的层析系统。Ni Sepharose 6FF可以与带8×His(组氨酸)标签的目的蛋白结合，使用低浓度咪唑除去没有与之结合的杂蛋白，再使用高浓度咪唑洗脱下目的蛋白，达到分离纯化SapⅠ限制酶的目的。本发明使用25mM低浓度咪唑去除杂蛋白，使用100～300mM梯度高浓度咪唑洗脱目的蛋白，可以更高效地得到初步纯化的SapⅠ限制酶。
本发明进一步使用离子交换层析纯化系统对SapⅠ限制酶进行精细纯化。离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。使用离子交换层析纯化的关键在于缓冲液pH的选择，合适的缓冲液有助于目的蛋白与杂蛋白的分离。SapⅠ限制酶的等电点为6.3左右，本发明所述SapⅠ蛋白在Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液中带负电，使用Q柱阴离子交换层析柱能够有效分离纯化目的蛋白，得到高纯度的SapⅠ限制酶。
通过上述镍柱亲和层析纯化和离子交换层析纯化获得的SapⅠ蛋白的纯度高，且整个纯化过程仅需1～2h，避免了长时间纯化过程导致的酶活性降低，更有利于酶产量和活性的提高。经上述纯化后，SapⅠ能够达到分子生物学实验的纯度要求。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用的试材和方法如非特殊说明，均为本领域中可常规得到的市售材料以及可通过文献查阅得到方法。
LB液体培养基：1L水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g氯化钠，高压灭菌。
LB固体培养基：1L水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g氯化钠，琼脂15g，高压灭菌。
1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入100mL TAE溶液，微波炉中加热2min使其完全溶解，加入10μL胶红核酸染料，混匀后倒入插好梳子的胶板中，室温放置20min，待其完全凝固。
1M Tris-HCl(pH8.0)：800mL水中加入121.14g Tris碱，待Tris碱完全溶解后，使用稀盐酸将其pH调至8.0，定容至1L，过滤除菌后4℃保存。
实施例1
构建甲基化保护的SapⅠ重组工程菌
1、pET-28a-SapⅠ原核表达质粒的构建
将密码子优化后的SapⅠ基因克隆到含8×His(组氨酸)标签的pET-28a载体上，构建pET-28a-SapⅠ原核表达质粒，具体方法如下：
根据大肠杆菌的密码子偏好性对SapⅠ的编码基因进行密码子优化，最终确定经密码子优化后的SapⅠ的编码基因序列如SEQ ID No.1所示。使用引物(上游SEQ ID No.4：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGcatatgtctaaaggtgaagaactgttc-3’，下游SEQ ID No.5：5’-CTGGGTTGCCAGACGGCGaccaccgatctgttcacggtg-3’)对GFP-Sumo基因PCR引入同源臂，同时使用引物(上游SEQ ID No.6：5’-caccgtgaacagatcggtggtCGCCGTCTGGCAACCCAG-3’，下游SEQID No.7：5’-CAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTC-3’)对SapⅠ基因PCR从而引入同源臂，并使用引物(上游SEQ ID No.8：5’-GAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTG-3’，下游SEQ ID No.9：5’-TATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3’)对质粒pET28a进行PCR得到带有同源臂的载体，将插入片段SapⅠ、GFP-Sumo与载体共同同源重组得到重组载体pET-28a-SapⅠ，如图1所示。将重组载体pET-28a-SapⅠ转化到DH5α感受态细胞后涂布到卡纳霉素抗性平板上，挑取单菌落扩大培养后提取质粒测序，确认序列无误。
2、pUC-19-M.SapⅠ重组质粒的构建
通过柔性融合蛋白接头(GGGGS)3将M1和M2连接起来构建融合表达蛋白片段，合成出带有同源臂的全长的融合表达蛋白序列。之后使用引物(上游SEQ ID No.10：5’-CGCAGCGAGTCAGTGAGCG-3’，下游SEQ ID No.11：5’-CGAAAAGTGCCACCTGACGTC-3’)对pUC19质粒PCR得到带有同源臂的载体，然后将M1、M2融合表达片段通过同源重组连接到pUC-19载体上，得到重组载体pUC-19-M.SapⅠ，如图2所示。将重组载体pUC-19-M.SapⅠ转化DH5α感受态细胞后涂布到氨苄霉素抗性平板上，挑取单菌落扩大培养后提取质粒测序，确认序列无误。
3、筛选甲基化保护的含有SapⅠ片段的重组工程菌
将测序正确的重组表达质粒pET-28a-SapⅠ和pUC-19-M.SapⅠ共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，之后在无菌操作台内涂布到含氨苄霉素和卡那霉素抗性的LB固体培养基上筛选培养，获得甲基化保护的含有SapⅠ片段的重组表达菌株。
实施例2
SapⅠ限制内切酶的表达
1、SapⅠ限制性内切酶的诱导表达
从筛选抗性平板上挑取单克隆菌落接种到25mL含有氨苄霉素和卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃220rpm震荡培养过夜；
按照1:100的比例转接震荡培养过夜后的菌液至新的100mL LB培养基中(100μg/mL氨苄抗生素、50μg/mL卡纳抗生素)震荡培养5h；
将震荡培养5h后的菌液转接到900mL LB培养基中(100μg/mL氨苄抗生素、50μg/mL卡纳抗生素)，37℃220rpm震荡培养2～4h至OD600为0.8左右；
将培养瓶放入冰水混合物预冷10min左右，加入终浓度为0.5mM IPTG，22℃220rpm诱导24h。
2、菌体的收集与处理
(1)将培养24h的菌液收集到离心瓶中，4000rpm 4℃离心10～15min，弃上清液；
(2)对菌体称重，以1:5～1:10的比例用预冷的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0、200mM NaCl、20mM咪唑、10％甘油)重悬菌体，倒入100mL烧杯中，将烧杯半埋在冰水混合物中以保持低温；
(3)使用高压连续细胞破碎机破碎细胞，以转接2L LB培养基诱导SapⅠ限制酶表达为例，参照设置压强为100MPa，4℃高压破碎4～6次；
(4)高压破碎后，使用超声波细胞破碎仪，以转接2LLB培养基诱导SapⅠ限制酶表达为例，参照设置超声功率为600W，超声时间30～45min，温度上限4℃，5s on，5s off；超声时始终保持烧杯半埋在冰水混合物中；
(5)超声破碎后，将裂解液13000rpm，4℃离心20min；
(6)收集上清，弃沉淀。
实施例3
SapⅠ限制内切酶的纯化
1、蛋白过镍柱纯化
(1)使用0.45μm滤膜过滤上清液；
(2)使用蠕动泵以12.5rpm的转速将BufferB(20mM Tris-HCl，pH8.0、500mM咪唑、200mM NaCl、10％甘油)缓慢泵入HisTrap FF镍柱至少2个柱体积，完全去除镍柱内的杂蛋白；之后再以12.5rpm将BufferA(20mM Tris-Hcl，pH8.0、20mM咪唑、200mM NaCl、10％甘油)缓慢泵入镍柱至少2个柱体积，平衡镍柱内盐浓度，使其与蛋白所在的上清液相同；
(3)使用蠕动泵以12.5rpm的转速将上清液缓慢泵入镍柱，此时蛋白与NiSepharose结合；
(4)打开AKTA纯化系统，运行Pump Wash程序，使用BufferA、BufferB先后冲洗A泵、B泵以及整个系统；安装镍柱，使用5％BufferB漂洗除去杂蛋白，至UV不再波动；
(5)以Gradient形式设定洗脱程序：5％-100％，30min。收集Fraction，每管1ml。根据UV280吸收值的变化收集UV吸收峰所在的Fractions。
(6)清洗镍柱：用至少3倍柱体积的BufferB和BufferA先后冲洗柱子，最后用去离子水冲洗柱子和整个系统。卸下镍柱，保存在4℃
2、蛋白离子交换柱纯化
(1)将收集到的蛋白通过透析袋将溶液替换为Buffer C(20mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、1mM DTT、10％甘油)，然后将透析后的溶液分装，13000rpm、4℃离心10min去除杂质与沉淀，收集上清，过0.45μm滤膜；
(2)使用蠕动泵将BufferD(20mM Tris-HCl，pH8.0、1MNaCl、1mM DTT、10％甘油)缓慢泵入Q柱，冲洗除去交换柱中的杂蛋白，至少冲洗3个柱体积；再使用Buffer C冲洗至少3个柱体积平衡层析柱内盐浓度，使其与蛋白溶液盐浓度保持一致。之后使用蠕动泵将上一步收集到的上清缓慢泵入Q柱。
(3)打开AKTA纯化系统，运行Pump Wash程序，使用Buffer C、Buffer D先后冲洗A泵、B泵以及整个系统；安装Q柱阴离子交换柱；使用Buffer C冲洗Q柱至UV不再波动
(4)以Gradient形式设定洗脱程序：0-100％，30min。收集Fraction，每管1mL。
(5)清洗离子交换柱：用至少3倍柱体积的Buffer D和Buffer C先后冲洗柱子，最后用去离子水冲洗柱子和整个系统。卸下离子交换柱，保存在4℃。
(6)程序运行结束后，根据UV280吸收值的变化收集UV吸收峰所在的Fractions。经过SDS-PAGE鉴定Fraction收集的每管蛋白纯度与蛋白浓度。结果如图3所示。
(7)收集好每管蛋白后，使用透析袋将蛋白溶液透析置换成Storage Buffer(10mMTris-HCl，pH7.4、200mM NaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％甘油)，分装后投入液氮，放到-80℃保存。使用Nanodrop 2000C(Thermo Fisher)测定蛋白浓度，测得纯化得到的SapⅠ限制内切酶浓度为0.201mg/ml。
实施例4
SapⅠ限制内切酶的活性鉴定
对实施例3中制备的限制性内切酶SapⅠ进行活性鉴定。使用含有SapⅠ和BamHⅠ-HF酶切位点的质粒进行双酶切验证，酶切体系为10μL，其中含有1μg质粒，载体与基因的大小分别为4776bp与1651bp，酶切时间为1h，BamHⅠ-HF用量为0.2μL。分别加入稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍后的SapⅠ原液。
结果如图4所示，结果显示，使用稀释600倍后的SapⅠ限制性内切酶原液在10μL体系中酶切1h能够完全切开1μg含有SapⅠ位点的质粒。限制性内切酶SapⅠ的酶活定义为：37℃下，在20μL反应体系中，1μL酶能够在1h内完全消化1μgλDNA。因而，限制性内切酶SapⅠ活力约为600U/μL。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种重组表达载体，其特征在于，包括至少一个拷贝的限制性内切酶SapⅠ的编码基因。
2.根据权利要求1所述重组表达载体，其特征在于，还包括GFP-Sumo片段，且所述GFP-Sumo片段与限制性内切酶SapⅠ的编码基因一端连接。
3.根据权利要求1或2所述重组表达载体，其特征在于，所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别利用权利要求1～3任一项所述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，筛选后得所述重组菌；
所述第二重组载体包括限制性内切酶SapⅠ的甲基转移酶的编码基因。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述第二重组载体的构建方法，包括将所述甲基转移酶的两个亚基M1和M2基因片段通过柔性融合蛋白接头连接后，克隆到表达载体中，得所述第二重组载体。
6.利用权利要求4或5所述构建方法构建得到的表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌。
7.利用权利要求6所述重组菌生产限制性内切酶SapⅠ的方法，其特征在于，包括以下步骤：诱导培养所述重组菌，裂解菌体后，菌体裂解液中包含所述限制性内切酶SapⅠ。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为20～25℃，时间为18～24h，且在所述诱导培养时伴随搅拌。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，利用IPTG诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，对所述重悬液破碎后离心，收集上清。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，在收集上清后还包括纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310681137.7A CN116732074A (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310681137.7A CN116732074A (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116732074A true CN116732074A (zh) | 2023-09-12 |
Family
ID=87903892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310681137.7A Pending CN116732074A (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116732074A (zh) |
-
2023
- 2023-06-09 CN CN202310681137.7A patent/CN116732074A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111607003A (zh) | 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用 | |
| AU626521B2 (en) | Production and purification of a protein fused to a binding protein | |
| JP5698536B2 (ja) | アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法 | |
| US5945326A (en) | Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease | |
| Lin et al. | Cloning and Expression of the γ‐Polyglutamic Acid Synthetase Gene pgsBCA in Bacillus subtilis WB600 | |
| CN114657113A (zh) | 一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用 | |
| WO2014097733A1 (ja) | ヒト上皮細胞増殖因子の製造方法 | |
| CN110592045B (zh) | 一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(r,s)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用 | |
| JPH09500011A (ja) | Ｐ．ブルガリスからのコンドロイチナーゼｉ及びｉｉ遺伝子のクローニング及び発現 | |
| KR101841264B1 (ko) | 효모 자식작용 활성화 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 결정화 방법 | |
| CN116732074A (zh) | 一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法 | |
| CN102465146B (zh) | 融合表达重组制备t4核酸内切酶v | |
| CN116286903A (zh) | 一种核酸酶的基因序列及应用 | |
| CN111748544B (zh) | 一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法 | |
| JP5210530B2 (ja) | ＲｒｈＪ１Ｉ制限・修飾酵素およびその遺伝子 | |
| EP0619373B1 (en) | Method for cloning and producing the BglII restriction endonuclease and modification methylase | |
| JP4903004B2 (ja) | ロドコッカス属に属する細菌の形質転換方法 | |
| WO2001021776A1 (en) | A NOVEL TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE, HpyCH4V, OBTAINABLE FROM HELICOBACTER PYLORI CH4 AND A PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
| WO2001021777A1 (en) | A NOVEL TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE, HpyCH4III, OBTAINABLE FROM HELICOBACTER PYLORI CH4 AND A PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
| CN115975987A (zh) | 一种AscI限制性内切酶的制备方法 | |
| CN111849939B (zh) | 一种缺口dna偏好性高保真聚合酶及其应用 | |
| JPS63102684A (ja) | 遺伝子およびその利用方法 | |
| US7029900B2 (en) | Type II restriction endonuclease BtgZI, obtainable from Bacillus thermoglucosidasius 36A and a process for producing the same | |
| EP1298212B1 (en) | Method for cloning and expression of BsmBI restriction endonuclease and BsmBI methylase in E. coli and purification of BsmBI endonuclease | |
| WO2009054754A1 (fr) | Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |