JP5210530B2 - RrhJ1I制限・修飾酵素およびその遺伝子 - Google Patents
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Description
分子遺伝学、または生化学等の発展により、DNAが遺伝を司る本体であることが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病の解明や、遺伝子操作等において現在幅広く用いられている有用な酵素である。このうち、特にDNA塩基配列を特異的に認識し、特定のDNAを切断するII型制限酵素が重要かつ必要なものとして用いられている。
これまでに種々の微生物において制限酵素および修飾酵素の存在が確認されており、これらの酵素は、宿主内で制限・修飾系に関与していることが知られている。
これまでに、染色体中に組み込まれたMspIメチラーゼ遺伝子を有する大腸菌K802株を用いてNaeI制限酵素の生産を行った結果、この大腸菌は、細胞1μg当たり、野生株(Lechevalieria aerocolonigenes ATCC23870)の50倍の活性(37℃、1時間の反応で1μgのDNAを分解できる酵素量)を有していたことが報告されている(特許文献1)。
(1)以下の(A)または(B)のタンパク質。
(A)配列番号2記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質
(2)(1)記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(3)以下の(a)または(b)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号1記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
(4)以下の(A)または(B)のタンパク質。
(A)配列番号4記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B)配列番号4記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質
(5)(4)記載のタンパク質をコードする遺伝子。
(6)以下の(a)または(b)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号3記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号3記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
(7)(2)、(3)、(5)、または(6)のいずれか1項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(8)(7)記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(9)(8)記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I制限酵素の製造方法。
(10)(8)記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I修飾酵素の製造方法。
本発明のRrhJ1I制限酵素は、例えば、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むものである。配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素には、配列番号2記載のアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、さらに特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
さらに、配列番号2記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質も本発明のRrhJ1I制限酵素に含まれる。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素は、前記のものに限定されることはなく、配列番号4記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質であって、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質を含むものである。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素には、配列番号4記載のアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
さらに、配列番号4記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質も本発明のRrhJ1I修飾酵素に含まれる。
本発明のRrhJ1I 制限酵素遺伝子は、本発明のRrhJ1I制限酵素をコードする遺伝子である。本発明のRrhJ1I制限酵素は前述のとおりである。本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子は、例えば、配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のRrhJ1I 制限酵素遺伝子には、配列番号1記載の塩基配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、より好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、さらに特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性(同一性)を有する塩基配列であって、RrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号1に記載の塩基配列において、1個または数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列であって、RrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子には、配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I 制限酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子などは本発明のRrhJ1I制限酵素遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件については後述する。
本発明のRrhJ1I 修飾酵素遺伝子には、配列番号3記載の塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性(同一性)を有する塩基配列であって、RrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号3に記載の塩基配列において、1個または数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列であって、RrhJ1I修飾酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
また、本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子には、配列番号3に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRrhJ1I 修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子も本発明のRrhJ1I修飾酵素遺伝子に含まれる。
以下に、ハイブリダイゼーションによりRrhJ1I制限酵素遺伝子またはRrhJ1I修飾酵素遺伝子を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。
こうして得られたクローンの中には、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が保持されている。そして、クローンから目的の遺伝子を得るには、アルカリ法などの公知のポリヌクレオチド抽出方法を使用する。
遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異(サイレント変異と呼ばれる)もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
本明細書において、「RrhJ1I 制限・修飾系酵素の遺伝子」には、RrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子およびRrhJ1I 制限酵素による切断よりDNAを保護するRrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子が含まれる。
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア・コリであれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、前述のT.ManiatisらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual等に記載されている。
本発明のRrhJ1I 制限酵素を製造するには、まず前記のようなRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子と、RrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子とを組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中よりRrhJ1I 制限酵素活性を有するタンパク質を採取することによりRrhJ1I 制限酵素を製造することができる。
この場合、形質転換体はRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターと、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの両方の組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いてもよい。
また、RrhJ1I修飾酵素をコードする遺伝子の代わりに、RrhJ1I修飾酵素が修飾する塩基配列と同じ塩基配列を修飾する酵素(例としてはNaeI修飾酵素)をコードする遺伝子を用いてもよい。
この場合、形質転換体はRrhJ1I 制限酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターと、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの両方の組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いてもよい。
あるいは、RrhJ1I 修飾酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターのみで形質転換された形質転換体を用いてもよい。
本明細書において、ターミネーターは、例えば、trpオペロンターミネータをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の制限酵素または修飾酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌(エシェリヒア・コリ)、枯草菌(バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis))、ロドコッカス菌(Rhodococcus)、放線菌などの細菌、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株(例えば、XL1-Blue MRF’)、K802株、C600株などを挙げることができる。
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる本発明の制限酵素および修飾酵素は、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、濃縮、精製することができる。
J1菌の制限酵素活性を調べるために、まずJ1株を培養し、培養した菌体を集めて超音波処理にて破砕した後、超遠心分離を行って上清を集め、これを活性測定用の試料とする。この試料の適当量を、基質であるλファージDNA(λ−DNA)とともに37℃でインキュベートした後、基質DNAの分解をアガロースゲル電気泳動により確認する。
当該方法を用いてJ1菌の制限酵素活性を調べると、酵素活性は、λ−DNAを13Kbの大きさに切断する活性として検出される。
この工程において、まず、修飾酵素遺伝子および制限酵素遺伝子をクローニングする。クローニングの方法としては、J1菌染色体ライブラリーからのサザンハイブリダイゼーション法やインバースPCR法を用いることができる。得られるDNA断片の塩基配列は通常の方法、たとえばジデオキシ法によって決定することができる。さらに、得られた塩基配列を解析することにより、その塩基配列中のタンパク質をコードしうる領域(オープンリーディングフレーム、ORF)の存在を推定することができる。
本工程では、工程(iii)で得られたORF1および/またはORF3の塩基配列を基に、J1菌染色体DNAからPCRでRrhJ1I修飾酵素遺伝子および/またはRrhJ1I制限酵素遺伝子を含むDNA断片を増幅する。次に、増幅したDNA断片を適当なベクターに結合して大腸菌を形質転換し、RrhJ1I修飾酵素および/またはRrhJ1I制限酵素が発現する形質転換体を作製する。
制限酵素および/または修飾酵素を発現する形質転換体を作製するには、まず、得られたRrhJ1I制限・修飾系酵素の遺伝子を適当な宿主細胞、たとえばエシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ロドコッカス菌(Rhodococcus)、放線菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターに常法に従い接続する。そして、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製すればよい。
一方、RrhJ1I 修飾酵素の発現には上記の形質転換体の他、修飾酵素遺伝子のみを保持する形質転換体を用いることもできる。RrhJ1I修飾酵素を発現させるための形質転換体としては、例えば、RrhJ1I修飾酵素を含むプラスミドpTJM01(実施例6)を含有する形質転換体XL1-Blue MRF'/pTJM01を挙げることができる。
本工程では、工程(iv)で得られた形質転換体から制限酵素、または修飾酵素を精製する。
得られた遺伝子が目的の制限・修飾系酵素をコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子の塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用いたPCRによって不足する領域を増幅したり、あるいは得られた遺伝子の断片をプローブとしてDNAライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード領域を得ることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。以下は本発明の例示であって本発明を限定する趣旨ではない。
J1菌からの制限酵素の精製は以下の方法で行った。
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J-1株をMYKG培地(0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%バクトモルトエキス、1% グルコース、0.2% K2HPO4、0.2% KH2PO4、pH7.0)で、30℃にて72時間振盪培養した。
菌体を破砕用緩衝液(10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM 2-mercaptoethanol、1 mM EDTA)に懸濁したのち、4℃で超音波破砕を行った。遠心分離(12,000 rpm、4℃、30 min)で得られた上清を無細胞抽出液とした。次に、核酸を除去するため、ストレプトマイシン硫酸塩を終濃度4%になるように無細胞抽出液に添加して、氷上で30分間静置後、遠心分離によって沈殿を除去した。得られた上清を酵素精製緩衝液(10 mM Potassium phosphate buffer(pH 7.5)、10 mM 2-mercaptoethanol、5% glycerol)で一晩透析を行った後、DEAE-Sepharose(GEヘルスケア バイオサイエンス社)、HiTrap Heparin(GEヘルスケア バイオサイエンス社)、HiTrap Q(GEヘルスケア バイオサイエンス社)、P-cellulose(ワットマン)、HiPrep Sephacryl S-200 HR(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を用いて精製を行い、J1菌制限酵素を得た。全ての精製操作は4℃で行った。
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J-1株を100mlのMYKG培地中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液(0.1M EDTA、0.15M NaCl (pH8.0))4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40mgを加えて37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA (pH8.0))飽和フェノールを加え、撹拌後、遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90%、80%、70%のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム(4%イソアミルアルコール含有)を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、染色体DNA標品を得た。
J1菌修飾酵素遺伝子をPCRで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
NaeIとNgoMIVはGCCGGCを切断する制限酵素である。先ず、これらの制限酵素に対応する修飾酵素のアミノ酸ホモロジー解析を行った。その結果、両酵素のN末端付近のGCQALGL(配列番号22)と、C末端付近のGNAFPPP(配列番号23)が一致していることから、このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドJM-01(配列番号10)、JM-04(配列番号11)を合成し、プライマーに用いた。PCRは以下の条件で実施し、約0.9Kbのバンドの増幅が確認された。
鋳型DNA(J1菌染色体DNA、実施例2) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ) 10μl
プライマーJM-01(配列番号10) 1μl
プライマーJM-04(配列番号11) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
DMSO 10μl
滅菌水 68μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ) 1μl
総量 100μl
温度サイクル:94℃:30秒、65℃:30秒および72℃:1分の反応を30サイクル
プライマー
JM-01:GGN GGN CAR GCN CTN GGN CT(配列番号10)
JM-04:GGN GGN GGR AAN GCR TTN CC(配列番号11)
J1菌修飾酵素遺伝子全長のクローニングは以下の方法で行った。
J1菌ゲノムDNAを制限酵素SacIIで分解し、切断したゲノムDNAをGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を用いて回収し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ)を用いて環化した。次に、環化したゲノムDNAを鋳型に使用し、配列番号12、13のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて以下の条件でPCRを行い、約1Kbの断片を増幅した。
鋳型DNA(環化J1ゲノムDNA) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ) 10μl
プライマーJM-05(配列番号12) 1μl
プライマーJM-06(配列番号13) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ) 1μl
総量 100μl
温度サイクル:94℃:30秒、65℃:30秒および72℃:10分の反応を30サイクル
プライマー
JM-05:TTTCCAGACCTAGTGCCTGA(配列番号12)
JM-06:GGCAGTAGAAGTGGCCGGAC(配列番号13)
JM-07:ACGTAACCGAACTCGGTCAG(配列番号14)
JM-08:GTATCGGCAGATCGGCAATG(配列番号15)
J1菌制限酵素遺伝子のクローニングを実施例4と同様の方法で行った。
J1菌ゲノムDNAを制限酵素SphIで分解し、切断したゲノムDNAをGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を用いて回収し、DNA Ligation Kit(タカラバイオ)を用いて環化した。次に、環化したゲノムDNAを鋳型に使用し、配列番号16、17のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて実施例4と同様の条件でPCRを行い、約6Kbの断片を増幅した。
JK-01:CCGGCGCGATCAAACGGGTG(配列番号16)
JK-02:TGCTGACCATCGGGCACCTG(配列番号17)
JM-33:CCaagcttATCGCTCGCGGGGGTGCTCCG(配列番号19)
J1菌修飾酵素を得るために、実施例5で得られたプラスミドpJRM01を鋳型として使用して、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてPCRを行った。この際、修飾酵素をPtrcプロモーター下流のNcoIサイトに結合させるため、J1菌修飾酵素の2番目のアミノ酸をセリン(TCG)からスレオニン(ACG)に置換した。
鋳型DNA(組換えプラスミドpJRM01) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ) 10μl
プライマーJM-18(配列番号20) 1μl
プライマーJM-11(配列番号21) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ) 1μl
総量 100μl
温度サイクル:94℃:30秒、65℃:30秒および72℃:1分の反応を30サイクル
プライマー
JM-18:GGGTCATGACGCGGTCCAGCTACGAG(配列番号20)
JM-11:CTCCctgCAGGCGGCGTGGAAGCCTGG(配列番号21)
本実施例により、RrhJ1I修飾酵素遺伝子を含むベクターを含有した本発明の大腸菌組換え体は、大量のRrhJ1I修飾酵素を発現することが明らかになった。
(1)J1菌修飾酵素発現プラスミドpMCLMの構築
実施例2で調製したJ1菌染色体DNAを鋳型にして、以下の条件でPCRを行った。
反応液組成
鋳型DNA(J1菌染色体、実施例2) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ) 10μl
プライマーJ1-M5(配列番号24) 1μl
プライマーJ1-M6(配列番号25) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ) 1μl
総量 100μl
温度サイクル:94℃:30秒、59℃:30秒および72℃:2分の反応を30サイクル
プライマー
J1-M5:GGGAGGTATGATCGATCCGTTC(配列番号24)
J1-M6:CGGCCAGGCGTGGAAG(配列番号25)
実施例2で調製したJ1菌染色体DNAを鋳型にして、以下の条件でPCRを行った。
反応液組成
鋳型DNA(J1菌染色体、実施例2) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ) 10μl
プライマーJ1-R17(配列番号26) 1μl
プライマーJ1-R18(配列番号27) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
滅菌水 78μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ) 1μl
総量 100μl
温度サイクル:94℃:30秒、66℃:30秒および72℃:1分の反応を30サイクル
プライマー
J1-R17:GATCCACCCGCCCACACCAC(配列番号26)
J1-R18:GGCTTCCGGCCACCGGGAAAG(配列番号27)
(1)無細胞抽出液の調製
実施例7(2)で作製したJ1菌制限酵素発現ベクターを含む大腸菌組換え体(XL1-Blue MRF'/pMCLM+pGErR10)をLB培地(100μg/ml アンピシリン、25μg/ml クロラムフェニコール含有)で37℃で16時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、破砕用緩衝液に懸濁したのち、4℃で10分間、超音波による破砕を行った。破砕液は遠心分離(12,000 rpm、4℃、30 min)し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
また比較例として、以下の実験を行った。J1菌を実施例1の方法で培養し、実施例8(1)と同様の手法で調製したサンプルをJ1菌の無細胞抽出液とした。また、それぞれの無細胞抽出液のタンパク質濃度はBioRad Protein Assay Kit(バイオラド)を用いて定量した。
(1)で調製した無細胞抽出液を用いて、RrhJ1I制限酵素活性を調べた。
基質としてλ−DNAをHindIIIで切断したDNA(TOYOBO:λ/HindIII digest)0.5μgを使用し、大腸菌組換え体またはJ1菌の無細胞抽出液(それぞれ40μgタンパク質)を制限酵素用L buffer(タカラバイオ)と共に加え、37℃でサンプリングしながら1時間インキュベートした。サンプリングした反応液はフェノール処理を行って、電気泳動に共した。用いた基質DNAは、RrhJ1I制限酵素で切断されると約3.0Kbのバンドが出現する。
電気泳動の結果より、大腸菌組換え体の無細胞抽出液(図7「E.coli」)は反応20分で約3kbのバンドが出現したが、J1菌の無細胞抽出液(図7「R.rhodochrous J1」)は反応1時間後でもバンドは出現しなかった。以上の結果より、RrhJ1I制限酵素遺伝子を含むベクターを含有した本発明の大腸菌組換え体は、J1菌より大量の制限酵素を生産していることを確認した。
配列番号2:RrhJ1I制限酵素のアミノ酸配列
配列番号3:RrhJ1I修飾酵素の塩基配列
配列番号4:RrhJ1I修飾酵素のアミノ酸配列
配列番号5:実施例3で得られたDNAの塩基配列
配列番号6:実施例4で得られたDNAの塩基配列
配列番号7:実施例5で得られたDNAの塩基配列
配列番号8:ORF2の塩基配列
配列番号9:配列番号8から推定されるアミノ酸配列
配列番号10:プライマー
配列番号11:プライマー
配列番号12:プライマー
配列番号13:プライマー
配列番号14:プライマー
配列番号15:プライマー
配列番号16:プライマー
配列番号17:プライマー
配列番号18:プライマー
配列番号19:プライマー
配列番号20:プライマー
配列番号21:プライマー
配列番号22:NaeI対応修飾酵素とNgoMIV対応修飾酵素のN末端相同アミノ酸配列
配列番号23:NaeI対応修飾酵素とNgoMIV対応修飾酵素のC末端相同アミノ酸配列
配列番号24:プライマー
配列番号25:プライマー
配列番号26:プライマー
配列番号27:プライマー
配列表中、nはa、t、gまたはcを示す。
配列表中、rはgまたはaを示す。
Claims (6)
- 以下の(A)、(B)、または(C)のタンパク質。
(A)配列番号2記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質
(C)配列番号2記載のアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列を含み、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質 - 請求項1記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)または(b)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号1記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと同一性が90%以上で、かつRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNA - 請求項2または3に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項5記載の形質転換体の培養物からRrhJ1I制限酵素活性を有するタンパク質を採取することを含む、RrhJ1I制限酵素の製造方法。
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