PL208400B1 - Wyizolowany segment DNA kodujący MmeI restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej MmeI oraz metylazy MmeI - Google Patents
Wyizolowany segment DNA kodujący MmeI restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej MmeI oraz metylazy MmeIInfo
- Publication number
- PL208400B1 PL208400B1 PL374263A PL37426303A PL208400B1 PL 208400 B1 PL208400 B1 PL 208400B1 PL 374263 A PL374263 A PL 374263A PL 37426303 A PL37426303 A PL 37426303A PL 208400 B1 PL208400 B1 PL 208400B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- leu
- mmel
- endonuclease
- lys
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Tło wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel.
Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy fragmentu DNA (kwasu deoksyrybonukleinowego), który to fragment koduje jeden polipeptyd posiadający dwie pokrewne funkcje enzymatyczne, mianowicie funkcję enzymu, który rozpoznaję sekwencję DNA 5'-TCC(Pu)AC-3' i przecina wiązania fosfodiestrowe pomiędzy 20 a 21 resztą od końca 3' względem tej sekwencji rozpoznawanej na tej nici DNA oraz pomiędzy 18 a 19 resztą od końca 5' względem sekwencji rozpoznawanej na nici komplementarnej 5'-GT(Py)GGT-3' w celu wytworzenia zasadowego wydłużenia na końcu 3' (nazywanego dalej endonukleazą restrykcyjną Mmel) oraz drugą aktywność enzymatyczną, która rozpoznaje tę samą sekwencję DNA, 5'-TCC(Pu)AC-3', ale modyfikuje tę sekwencję poprzez dodanie grupy metylowej w celu zapobieżenia przecięciu przez endonukleazę Mmel. Niniejszy wynalazek dotyczy także wektora zawierającego wyizolowany segment DNA, transformowanego gospodarza zawierającego ten segment DNA oraz sposobu wytwarzania endonukleazy restrykcyjnej Mmel z takiego transformowanego gospodarza.
W niniejszym wynalazku opisuje się takż e procesy identyfikowania dodatkowych fragmentów DNA, które kodują enzymy mające te same ogólne właściwości co Mmel, lecz potencjalnie mające wyjątkowe sekwencje rozpoznawania DNA. Proces taki zależy od zastosowania sekwencji aminokwasowej enzymu Mmel przedstawionej w tym zgłoszeniu lub w dalszej kolejności od dodatkowych sekwencji zidentyfikowanych w przebiegu tego procesu. Możliwym jest także zidentyfikowanie, w przebiegu opisanego procesu, dodatkowych fragmentów DNA, z których każdy koduje polipeptyd mający znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do polipeptydu Mmel. Przewiduje się, że polipeptydy kodowane przez te fragmenty DNA będą wykazywać podobne funkcje do polipeptydu Mmel. W szczególności przewiduje się, że mają one posiadać podwójną funkcję enzymatyczną przecinania DNA w sposób specyficzny we względnie dalekiej odległości od specyficznej sekwencji rozpoznawania, a także modyfikowania ich sekwencji rozpoznawania w celu ochrony przed cięciem DNA gospodarza w wyniku aktywności endonukleazy. Przykładem takiego enzymu zidentyfikowanego w tym procesie jest CstMI. CstMI został zidentyfikowany jako potencjalna endonukleaza z powodu jego bardzo znacznego podobieństwa sekwencji aminokwasowej do Mmel. CstMI rozpoznaje sekwencję 5'-AAGGAG-3' i przecina wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resztami 20 i 21 od końca 3' względem sekwencji rozpoznawania 5 na tej nici DNA oraz pomiędzy resztami 18 i 19 od końca 5' względem sekwencji rozpoznawania na nici komplementarnej 5'-CTCCTT-3' w celu wytworzenia 2 zasadowego wydłużenia od końca 3'.
Endonukleazy restrykcyjne są klasą enzymów, które w naturze występują u prokariontów. Istnieje kilka klas znanych układów restrykcyjnych, z których endonukleazy typu II są klasą mającą zastosowanie w inżynierii genetycznej. Jeśli te endonukleazy typu II zostaną oczyszczone z innych zanieczyszczających składników prokariotycznych, mogą być zastosowane w laboratorium do przecinania cząsteczek DNA na określone fragmenty. Właściwość ta umożliwia jednoznaczną identyfikację cząsteczek DNA i ich frakcjonowanie na ich składowe geny. Endonukleazy restrykcyjne okazały się nieodzownym narzędziem w nowoczesnych badaniach genetycznych. Stanowią biochemiczne „nożyczki”, z udziałem których prowadzona jest inżynieria i analiza genetyczna.
Endonukleazy restrykcyjne działają poprzez rozpoznawanie i wiązanie się do poszczególnych sekwencji nukleotydów („sekwencja rozpoznawana”) na cząsteczce DNA. Po związaniu, endonukleazy typu II przecinają cząsteczkę wewnątrz lub po jednej stronie sekwencji. Różne endonukleazy restrykcyjne wykazują powinowactwo względem różnych rozpoznawanych miejsc. Większość endonukleaz restrykcyjnych rozpoznaje sekwencje długości od 4 do 6 nukleotydów, choć ostatnio wyizolowane niewielką liczbę endonukleaz restrykcyjnych, które rozpoznają od 7 do 8 swoiście określonych nukleotydów. Większość rozpoznawanych sekwencji zawiera podwójną oś symetrii i w większości przypadków wszystkie nukleotydy są swoiście określone. Jednakże, niektóre endonukleazy restrykcyjne wykazują zdegenerowaną lub osłabioną specyficzność, jako że rozpoznają wiele zasad w jednej lub więcej pozycji w swojej sekwencji rozpoznawanej, a pewne endonukleazy restrykcyjne rozpoznają sekwencje asymetryczne. Haelll, która rozpoznaje sekwencję 5'-GGCC-3' jest przykładem endonukleazy restrykcyjnej posiadającej symetryczną, nie zdegenerowaną sekwencję rozpoznawaną; Haell,
PL 208 400 B1 która rozpoznaje 5'-(Pu)GCGC(Py)-3' stanowi przykład endonukleazy restrykcyjnej posiadającej zdegenerowaną lub mniej specyficzną sekwencję rozpoznawaną; podczas gdy BspMI, która rozpoznaje 5'-ACCTGC-3' stanowi przykład endonukleazy restrykcyjnej, której sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna. Endonukleazy typu II o symetrycznych rozpoznawanych sekwencjach na ogół przecinają symetrycznie wewnątrz lub w pobliżu rozpoznawanego miejsca, podczas gdy te, które rozpoznają sekwencje asymetryczne mają tendencję do cięcia w odległości od 1 do 20 nukleotydów po jednej stronie miejsca rozpoznawania. Enzym według niniejszego zgłoszenia, Mmel (wraz z CstMI) wyróżnia przecinanie DNA w najdalszej odległości od rozpoznawanej sekwencji spośród wszystkich znanych endonukleaz restrykcyjnych typu II. Zidentyfikowano ponad dwieście określonych endonukleaz restrykcyjnych u kilku tysięcy zbadanych dotychczas gatunków bakterii.
Drugim składnikiem układów restrykcyjnych są metylazy modyfikujące. Enzymy te są komplementarne do endonukleaz restrykcyjnych i stanowią środek, dzięki któremu bakterie mają zdolność ochrony ich własnego DNA oraz odróżniania go od obcego, zakażającego DNA. Metylazy modyfikujące rozpoznają i wiążą się z taką samą nukleotydową rozpoznawaną sekwencją, jak odpowiadająca endonukleaza restrykcyjna, ale zamiast trawić DNA, chemicznie modyfikują jeden lub inny spośród nukleotydów w obrębie sekwencji, przez dodanie grupy metylowej. Po metylacji, rozpoznawana sekwencja nie jest już więcej przecinana przez endonukleazę restrykcyjną. DNA komórki bakteryjnej jest modyfikowane w wyniku aktywności jej metylazy modyfikującej i przez to jest niewrażliwe na obecność endogennej endonukleazy restrykcyjnej. Jedynie nie zmodyfikowany, a przez to rozpoznany jako obcy, DNA jest wrażliwy na rozpoznanie przez endonukleazę restrykcyjną i przecięcie. Metylotransferazy modyfikujące są zazwyczaj enzymami oddzielnymi od ich pokrewnych partnerów endonukleazowych. W niektórych przypadkach, pojedynczy polipeptyd posiada zarówno funkcję metylotransferazy modyfikującej, jak i funkcję endonukleazy, na przykład Eco57I. W takich przypadkach, istnieje druga metylotransferaza jako część układu restrykcji-modyfikacji. W przeciwieństwie do tego, układ Mmel według niniejszego zgłoszenia nie posiada drugiej metylotransferazy towarzyszącej polipeptydowi endonukleaza-metylotransferaza.
Nazwy endonukleaz pochodzą od bakterii, z których zostały uzyskane. Zatem, gatunek Haemophilus aegyptius, wytwarza na przykład 3 różne endonukleazy restrykcyjne, nazwane Hael, Haell oraz Haelll. Enzymy te rozpoznają i przecinają odpowiednio sekwencje 5'(W)GGCC(W)-3', 5'-(Pu)GCGC(Py)-3' oraz 5'-GGCC-3'. Z drugiej strony, Escherichia coli RY13 wytwarza tylko jeden enzym, EcoRI, który rozpoznaje sekwencję 5'-GAATTC-3'.
Ogólnie sądzi się, że w naturze endonukleazy restrykcyjne odgrywają rolę ochronną w utrzymywaniu prawidłowego funkcjonowania komórki bakteryjnej. Umożliwiają one bakterii oporność na zakażenie obcymi cząsteczkami DNA, takimi jak wirusy i plazmidy, które w innym wypadku doprowadziłyby do ich zniszczenia lub pasożytowałyby na nich. Uczestniczą one w oporności poprzez wiązanie się do zakażających cząsteczek DNA i przecinanie ich w każdym miejscu, w którym pojawia się sekwencja rozpoznawana. Wynikła dezintegracja inaktywuje wiele zakażających genów i pozostawia DNA podatnym na dalszą degradację powodowaną przez endonukleazy.
Z rozmaitych szczepów bakteryjnych wyizolowano ponad 3000 endonukleaz restrykcyjnych. Ponad 240 spośród nich rozpoznaje sekwencje unikalne, podczas gdy pozostałe posiadają wspólne specyficzności rozpoznawania. Endonukleazy restrykcyjne, które rozpoznają tę samą sekwencję nukleotydową zwane są „izoschizomerami”. Choć sekwencje rozpoznawane izoschizomerów są identyczne, mogą się one między sobą różnić pod względem miejsca cięcia (np., Xmal versus Smal, Endow i wsp., J. Mol. Biol. 112: 521 (1977); Waalwijk i wsp., Nucleic Acids Res. 5: 3231 (1978)) oraz częstości przecinania rozmaitych miejsc (Xhol versus PaeRll, Gingeras i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402 (1983)).
Endonukleazy restrykcyjne tradycyjnie dzieli się na trzy główne klasy; typ I, typ II i typ III. Układy restrykcyjne typu I tworzą wielopeptydowy kompleks składający się z polipeptydów restrykcyjnych, polipeptydów modyfikujących oraz polipeptydów specyficzności lub rozpoznawania DNA. Układy typu I wymagają dwuwartościowego kationu, ATP oraz S-adenylozylometioniny (SAM) jako kofaktorów. Układy typu II przecinają DNA w przypadkowych miejscach w odległości do kilku tysięcy par zasad od ich miejsca rozpoznawania. Układy typu III rozpoznają na ogół asymetryczną sekwencję DNA i przecinają w specyficznej pozycji 20 do 30 par zasad po jednej stronie względem rozpoznawanej sekwencji. Układy takie wymagają oprócz SAM kofaktora ATP oraz kationu dwuwartościowego. Układy typu III tworzą kompleks polipeptydu endonukleazy i polipeptydu modyfikującego, który albo modyfikuje, albo przecina DNA w miejscu rozpoznawania. Z powodu owego współzawodnictwa pomiędzy ich aktywno4
PL 208 400 B1 ścią modyfikującą a aktywnością przecinania układy typu III powodują częściowe trawienie substratu DNA, w związku z czym nie są przydatne do genetycznych manipulacji.
Mmel nie wymaga ATP do aktywności przecinania DNA i przecina je całkowicie; zatem może zostać sklasyfikowana jako endonukleaza typu II. W sposób odmienny od pozostałych enzymów typu II jednak, Mmel składa się z pojedynczego polipeptydu, który łączy zarówno aktywność endonukleazową, jak i modyfikującą i jest sam przez się wystarczający do tworzenia pełnego układu restrykcyjnomodyfikacyjnego. Mmel przecina także w najdalszej odległości od specyficznej rozpoznawanej sekwencji DNA spośród wszystkich endonukleaz typu II (tak jak czyni to CstMI). Mmel jest całkiem dużych rozmiarów i wydaje się mieć trzy funkcjonalne domeny połączone w jednym polipeptydzie. Składają się one z amino-końcowej domeny, która zawiera endonukleazowy motyw cięcia DNA i która może być także zaangażowana w rozpoznawanie DNA, domenę modyfikującą DNA najbardziej podobną do klasy gamma metylotransferaz N6mA oraz domenę końca karboksylowego przypuszczalnie zaangażowaną w tworzenie dimeru i prawdopodobnie rozpoznawanie DNA. Enzym wymaga SAM zarówno do aktywności przecinającej, jak i modyfikującej. Pojedynczy polipeptyd Mmel wystarcza do modyfikowania wektora plazmidowego niosącego gen in vivo w celu zapewnienia ochrony przed przecinaniem przez Mmel in vitro, ponadto ma także zdolność przecinania nie zmodyfikowanych cząsteczek DNA in vitro, gdy zastosowany zostanie bufor endonukleazowy zawierający Mg++ oraz SAM.
Istnieje ciągłe zapotrzebowanie na nowe endonukleazy restrykcyjne typu II. Pomimo, że obecnie dostępne są endonukleazy restrykcyjne typu II, które rozpoznają wiele swoistych sekwencji nukleotydowych, nowe endonukleazy restrykcyjne, które rozpoznają nowe sekwencje zapewniają większe możliwości i zdolność manipulacji genetycznych. Każda nowa, niepowtarzalna endonukleaza umożliwia naukowcom precyzyjne przecinanie DNA w nowych miejscach w cząsteczce DNA, ze wszystkimi możliwościami, jakie to niesie.
Streszczenie wynalazku
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczany jest wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, który charakteryzuje się tym, że wyizolowany DNA uzyskuje się z plazmidu pTBMmel o numerze dostę powym ATCC PTA-4521.
Następnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wektor, do którego wprowadzono segment DNA kodujący Mmel, endonukleaza-metylaza, jak zdefiniowano powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana rekombinowanym wektorem z wprowadzonym segmentem wyizolowanego DNA, jak zdefiniowano powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel, polegający na tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji wspomnianej endonukleazy i metylazy.
Szczegółowo, sposób ten obejmuje hodowlę transformowanego gospodarza, takiego jak E. coli, zawierającego fragment DNA kodujący polipeptyd układu restrykcyjnego Mmel, zbieranie wyhodowanych komórek, uzyskiwanie z nich wolnego od komórek ekstraktu i oddzielanie oraz pozyskiwanie endonukleazy restrykcyjnej Mmel z wolnego od komórek ekstraktu.
Niniejszy wynalazek pozwala także na przeprowadzenie wytwarzania endonukleazy restrykcyjnej kodowanej przez sekwencje DNA zidentyfikowane jako homologiczne względem Mmel. Sposób ten obejmuje hodowlę stransformowanego gospodarza, takiego jak E. coli, zawierającego gen dla tych układów restrykcyjnych, zbieranie wyhodowanych komórek, uzyskiwanie z nich wolnego od komórek ekstraktu oraz oddzielanie i pozyskiwanie endonukleazy restrykcyjnej z wolnego od komórek ekstraktu.
Endonukleaza, oznaczoną dalej „Mmel”:
(1) rozpoznaje zdegenerowaną sekwencję nukleotydową 5'-TCC(Pu)AC-3' w dwuniciowym DNA, jak to przedstawiono poniżej:
5'-TCC(Pu)AC-3'
3'-AGG(Py)TG-5' (gdzie G oznacza guaninę, C oznacza cytozynę, A oznacza adeninę, T oznacza tymidynę, (Pu) oznacza prynę albo A, albo G oraz (Py) oznacza pirymidynę, albo C, albo T);
(2) przecina DNA w miejscu wiązania fosfodiestrowego za nukleotydem w kierunku 3' od sekwencji rozpoznawanej 5'-TCC(Pu)AC-3' i przed 18 nukleotydem w kierunku 5' do komplementarnej nici rozpoznawanej sekwencji 5'-GT(Py)GGA-3' w celu wytworzenia 2 zasadowego wydłużenia od końca 3':
5'-TCC(Pu)AC(N20)/-3'
PL 208 400 B1
3'-AGG(Py)GT(18)/-5' oraz (3) metyluje sekwencję rozpoznawaną określoną w (1) in vivo w celu ochrony DNA gospodarza przed przecinaniem w wyniku aktywności endonukleazy Mmel.
W oparciu o niniejszy wynalazek moż na wytworzyć dodatkowe fragmenty DNA, o których stwierdzono, że każdy koduje polipeptydy, które są znacząco podobne pod względem sekwencji do polipeptydu restrykcyjno-modyfikującego Mmel. Fragment DNA kodujący polipeptyd Mmel umożliwia identyfikację tych dodatkowych potencjalnych endonukleaz przez zastosowanie przeszukiwania podobieństw w bazach danych, takich jak GENBANK, przy zastosowaniu programu, takiego jak BLAST (Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Te fragmenty DNA, jak również jakiekolwiek inne fragmenty o takim podobieństwie do Mmel, które mogą być w przyszłości złożone w bazach danych, są kandydatami, które mogą kodować polipeptydy podobne do Mmel, w taki sposób, że kodowane polipeptydy działają zarówno jako endonukleazy restrykcyjne, jak i metylotransferazy. Polipeptydy te mogą, podobnie do Mmel, przecinać DNA w podobnej odległości od sekwencji rozpoznawanej, w zakresie 18 do 20 nukleotydów lub więcej, która to cecha jest niepowtarzalna i znajduje zastosowanie w pewnych technikach biologii molekularnej. Specyficznie, polipeptydy te zawierają motywy aminokwasowe wspólne dla metylotransferaz DNA N6mA w środkowej części polipeptydu, posiadają motyw wspólny dla endonukleaz restrykcyjnych znajdujący się w amino-końcowym odcinku polipeptydów, składający się z aminokwasów D/E(X8-X12)D/EXK i posiadają region kilkuset aminokwasów znajdujący się za konserwowanymi motywami metylotrasferazowymi, które są znacząco podobne do tego regionu Mmel i o których sądzi się, że służą jako domena dimeryzująca i prawdopodobnie rozpoznająca sekwencję DNA. Przedstawiono przykład takiego polipeptydu, CstMI. Wykazano, że CstMI rozpoznaje asymetryczną sekwencję 6 par zasad 5'-AAGGAG-3' i przecina DNA w taki sam sposób, jak Mmel; 5'-AAGGAGN20/N18-3'. Endonukleaza kodowana przez takie fragmenty DNA może być wytwarzana w procesie stosowanym dla Mmel, jak to opisano poniżej.
Krótki opis rysunków
Figura 1 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel DNA lambdy, T7, phiXl74, pBR322 oraz pUC19.
Figura 2 - sekwencja DNA locus genu Mmel (SEK ID NR: 1).
Figura 3 - sekwencja aminokwasowa locus genu Mmel (SEK ID NR: 2).
Figura 4 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel DNA pTBMme.1 oraz nie zmodyfikowanych substratów DNA.
Figura 5 - żel agarozowy przedstawiający trawienie przez Mmel nie zmetylowanych, półzmetylowanych i całkowicie zmetylowanych substratów DNA.
Figura 6 - inkorporacja wyznakowanych grup metylowych do nie zmetylowanych, półzmetylowanych i całkowicie zmetylowanych substratów DNA.
Figura 7 - wielokrotne przyrównanie sekwencji aminokwasowych Mmel (SEK ID NR: 3 do SEK ID NR: 14) i polipeptydów homologicznych pochodzących z publicznych baz danych.
Szczegółowy opis wynalazku
Sekwencja rozpoznawana oraz miejsce cięcia endonukleazy według niniejszego wynalazku, zostało opisane uprzednio (Boyd, Nucleic Acids Res. 14: 5255-5274 (1986)). Jednakże, wytwarzanie enzymu Mmel z naturalnego gospodarza, Methylophilus methylotrophus, okazało się trudne z powodu bardzo niskiej wydajności pozyskiwania enzymu i względnej trudności hodowli gospodarza M. methylotrophus w dużych ilościach. W celu przezwyciężenia tych ograniczeń w wytwarzaniu Mmel, niniejsze zgłoszenie opisuje identyfikację sekwencji DNA kodującej gen Mmel i ekspresję tego genu Mmel w organizmie odpowiedniego gospodarza, w danym przypadku E. coli. Ta manipulacja fragmentu DNA kodującego Mmel w rezultacie daje zarówno znaczący wzrost w ilości wytwarzanego enzymu w przeliczeniu na gram komórek, jak i znaczący wzrost w łatwości hodowli w dużych ilościach komórek zawierających enzym Mmel.
Zastosowano bez powodzenia kilka standartowych podejść wykorzystywanych typowo przez specjalistów, do klonowania Mmel. W szczególności, nie powiodła się próba selekcji metylazy (Wilson i wsp., patent USA nr 5 200 333). Stworzono kilka losowych bibliotek DNA M. methylotrophus w E. coli i poddano trawieniu za pomocą Mmel, ale nie uzyskano klonów zawierających metylazy Mmel.
Spróbowano drugiego podejścia, lecz bez powodzenia. W podejściu tym, do przeszukiwania biblioteki losowych klonów stworzonych w podstawieniowych wektorach faga lambda zastosowano przeciwciała specyficzne względem N6mA. Próba powiodła się pod względem pozyskania klonów pozytywnych na metylazę, lecz okazało się, że wszystkie przebadane klony wykazywały raczej eks6
PL 208 400 B1 presję metylotransferazy drugiego układu restrykcyjnego w M. methylotrophus, metylazy Mmell (sekwencja rozpoznawana 5'-GATC-3') niż pożądaną aktywność metylazy Mmel.
Zakończona sukcesem próba uzyskania pożądanego fragmentu DNA kodującego układ restrykcyjny Mmel obejmowała kilka etapów. Najpierw, opracowano nową procedurę oczyszczania w celu oczyszczenia peptydu endonukleazy Mmel z M. methylotrophus do osiągnięcia homogenności. Po uzyskaniu tego ultra czystego polipeptydu endonukleazy Mmel w znacznej ilości, określono sekwencję aminokwasową końca aminowego oraz wewnętrznych peptydów powstałych po degradacji bromocyjanem. Przy zastosowaniu uzyskanej sekwencji aminokwasowej, zsyntetyzowano zdegenerowane startery DNA komplementarne do DNA kodującego sekwencje aminokwasowe i zastosowano do amplifikacji PCR części genu Mmel. Określono sekwencję DNA tej części genu Mmel. Następnie uzyskano pełną sekwencję genu endonukleazy Mmel oraz otaczających sekwencji DNA wykorzystując technikę odwrotnego PCR. Zaprojektowano dużą liczbę starterów pokrywających się z uzyskaną sekwencją DNA, zsyntetyzowano i zastosowano w połączeniu z wieloma różnymi matrycami. Odwrócone matryce PCR wytworzono poprzez trawienie genomowego DNA M. methylotrophus rozmaitymi endonukleazami restrykcyjnymi, a następnie ligację pociętego DNA M. methylotrophus w niskim stężeniu w celu uzyskania cząsteczek kolistych. Wypróbowano rozmaite startery w połączeniach z rozmaitymi matrycami w celu znalezienia połączeń starter-matryca, które wytwarzały specyficzny produkt amplifikacji PCR. Produkty w ten sposób otrzymane zostały zsekwencjonowane. Po uzyskaniu sekwencji DNA kodującej pełny gen endonukleazy Mmel, zaprojektowano startery w celu specyficznego zamplifikowania genu z genomowego DNA M. methylotrophus. Namnożony gen został wstawiony do wektora ekspresyjnego i sklonowany do gospodarza E. coli. Gospodarz został sprawdzony i wykazano, że ma zdolność zarówno do ekspresji aktywności endonukleazy Mmel, jak i do modyfikowania in vivo rekombinowanego wektora ekspresyjnego w taki sposób, że był on zabezpieczony przed aktywnością endonukleazy Mmel in vitro.
Odkrycie, że pojedynczy polipeptyd kodujący endonukleazę Mmel zapewnia także in vivo ochronę przed Mmel, jest sprzeczne z uprzednio opublikowanymi informacjami dotyczącymi Mmel (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998)). Szczególnie, referencja ta pouczała, że polipeptyd endonukleazy Mmel nie zapewniał ochrony przed cięciem przez endonukleazę Mmel. Praca ta donosiła, że do modyfikowania miejsca Mmel na obu niciach, a tym samym blokowania cięcia przez endonukleazę Mmel wymagana jest oddzielna metylotransferaza o wielkości 48 kD. W szczególności, referencja poucza, że polipeptyd endonukleazy Mmel modyfikuje adeninę jedynie w górnej nici rozpoznawanej sekwencji 5'-TCCRAC-3' i że tak zmodyfikowane DNA jest przecinane przez endonukleazę Mmel. Fragment DNA według niniejszego wynalazku koduje gen endonukleazy Mmel, który, o ile występuje sam w gospodarzu E. coli, czyni wektor zawierający endonukleazę Mmel opornym na przecinanie przez oczyszczoną endonukleazę Mmel. Dalej, endonukleazą Mmel wytwarzana z tego fragmentu nie przecina fragmentu DNA zmodyfikowanego w pozycji adeniny górnej nici, 5'-TCCRAC-3', jeśli brak jest modyfikacji przeciwnej lub dolnej nici. Jest to sprzeczne z danymi zawartymi w referencji Tucholskiego. Endonukleaza Mmel według niniejszego zgłoszenia przecina także fragment DNA, w którym reszta adeninowa w dolnej nici jest zmodyfikowana 5-GTYGGA-3', co sprzeczne jest z danymi z referencji Tucholskiego. W przypadku, gdy zarówno górna, jak i dolna nić są zmodyfikowane w resztach adeninowych, endonukleazą Mmel nie przecina DNA. Nie znaleziono żadnego drugiego genu metylotransferazy, takiego jak opisany w referencji Tucholskiego, sąsiadującego z genem endonukleazy Mmel. Istnieje otwarta ramka odczytu bezpośrednio w kierunku 3' względem genu endonukleazy Mmel, która mogłaby kodować białko o w przybliżeniu odnotowywanym rozmiarze wykazujące drugą aktywność metylotransferazy (48 kD). Jednakże, ten potencjalny polipeptyd nie zawiera motywów aminokwasowych znajdowanych w metylotransferazach, ani, sklonowany w E. coli, nie zapewnia ochrony przed endonukleazą Mmel. O ile referencja Tucholskiego wskazuje na konieczność istnienia drugiego polipeptydu metylotransferazy w celu zapewnienia ochrony przed aktywnością endonukleazy Mmel w komórce gospodarza, w niniejszej aplikacji wykazano, że fragment DNA kodujący polipeptyd endonukleazy Mmel jest wystarczający do zapewnienia takiej ochrony. Dodatkowo, jedenaście opisanych tutaj fragmentów DNA, które kodują sekwencje aminokwasowe podobne do Mmel, nie jest oflankowanych przez jakiekolwiek rozpoznawalne DNA genów metylotransferazy. Wskazuje to na fakt, że polipeptydy te prawdopodobnie same zapewniają zarówno ochronę DNA gospodarza, jak i aktywność endonukleazy skierowaną przeciwko nie zmodyfikowanym substratom DNA, bez drugiej metylotransferazy jako części układu restrykcji-modyfikacji. Pozostaje to w sprzeczności z innymi układami restrykcji-modyfikacji typu II.
PL 208 400 B1
Ta sama grupa (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998) oraz Anna Podhajska, informacja przekazana osobiście) uprzednio donosiła o sekwencji aminokwasowej składającej się z ośmiu reszt dla pojedynczego wewnętrznego fragmentu trawienia CnBr (sekwencja GRGRGVGV (SEK ID NR: 50). Wielokrotnie bez powodzenia próbowano przeprowadzić PCR na podstawie tej sekwencji. Wykazano, że sekwencja ta nie jest związana z Mmel po ustaleniu rzeczywistej sekwencji aminokwasowej Mmel według niniejszego wynalazku. Zatem ustalenie poprawnych wewnętrznych sekwencji aminokwasowych, które umożliwiły klonowanie genu Mmel, zależało od nowego sposobu oczyszczania, opisanego w tej aplikacji, mającego na celu wytworzenie wystarczająco czystego Mmel w wystarczająco dużej ilości w celu ustalenia sekwencji Mmel poprzez hodowlę aminokwasowych fragmentów wewnętrznych po działaniu bromocyjankiem, jak zostało to przeprowadzone w niniejszym zgłoszeniu.
W przykł adzie II otrzymali ś my Mmel poprzez hodowl ę transformowanego gospodarza zawierającego gen Mmel, takiego jak E. coli ER2683 zawierającego pTBMmel.1 i odzyskiwanie z komórek ednonukleazy. Próbkę E. coli ER2683 zawierającą pTBMmel.1 (NEB#1457) złożono zgodnie z warunkami i zastrzeżeniami Budapest Treaty z American Type Culture Collection (ATCC) 3 lipca 2002 i przyporządkowano Nr Dostępowy Patentu PTA-4521.
W celu odzyskania enzymu według niniejszego wynalazku, E. coli zawierające pTBMmel.1 (NEB #1457) można hodować stosując każdą odpowiednią technikę. Na przykład, E. coli zawierające pTBMmel.1 można hodować w pożywce bulionowej Luria zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w warunkach tlenowych w 37°C z napowietrzaniem. Komórki w późnej fazie logarytmicznej wzrostu indukowane są przez dodanie 0,3 mM IPTG, hodowane przez dodatkowe 4 godziny, zbierane przez odwirowanie i albo od razu niszczone albo przechowywane w formie zamrożonej w -70°C.
Enzym Mmel może być izolowany z komórek E. coli zawierających pTBMmel.1 przez tradycyjne techniki oczyszczania białka. Na przykład, osad komórek zawieszany jest w roztworze buforu i poddawany sonifikacji, dyspersji w wysokim ciśnieniu lub trawieniu enzymatycznemu w celu umożliwienia ekstrakcji endonukleazy przez roztwór buforu. Nie zniszczone komórki i resztki komórkowe są następnie usuwane przez odwirowanie w celu wytworzenia wolnego od komórek ekstraktu zawierającego Mmel. Endonukleaza Mmel, wraz jej z odpowiadającą, wewnętrzną aktywnością metylazy jest następnie oczyszczana z wolnego od komórek ekstraktu przez chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię sitową lub połączenie tych sposobów, w celu wytworzenia endonukleazy według niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy także dodatkowych fragmentów DNA, z których każdy koduje polipeptyd posiadający znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do polipeptydu Mmel. Przewiduje się, że polipeptydy kodowane przez te fragmenty DNA będą wykazywać podobne do Mmel funkcje. Szczególnie, przewiduje się, że posiadają one podwójne funkcje enzymatyczne przecinania DNA w sposób specyficzny w stosunkowo dalekiej odległości od specyficznej sekwencji rozpoznawanej, a także modyfikowania ich sekwencji rozpoznawanych w celu ochrony DNA gospodarza przed przecinaniem w wyniku ich aktywności endonukleolitycznej. Po ustaleniu sekwencji aminokwasowej endonukleazy Mmel, jak to opisano w tej aplikacji, sekwencje złożone w bazach danych mogą być porównane z tą sekwencją Mmel w celu odnalezienia tych kilku sekwencji, które są wysoce znacząco podobne do Mmel. Sposób ten jest podobny do tego z patentu USA nr 6 383 770 (Roberts i wsp.), za wyjątkiem tego, że tutaj raczej poszukujemy podobieństwa do sekwencji endonukleazy Mmel niż sekwencji, które pokrywają się z bazą danych białek metylotransferazy lub endonukleazy, a następnie sprawdzamy każde niezidentyfikowane otwarte ramki odczytu znajdujące się obok potencjalnych otwartych ramkach odczytu metylotransferazy. Przed zidentyfikowaniem sekwencji aminokwasowej Mmel, sekwencje DNA kodujące białka pokrewne do Mmel, nie były włączone do bazy danych sekwencji genów enzymów restrykcyjnych i metylotransferaz, wykorzystywanej przez Roberts i wsp., powyżej, jako że sekwencje te nie były połączone z żadną znaną funkcją endonukleazową. Ujawniony tutaj sposób identyfikacji potencjalnych endonukleaz podobnych do Mmel jest zatem bardziej swoisty niż sposób według patentu USA nr 6 383 770 (Roberts i wsp.).
Przeszukiwanie podobieństw sekwencji Mmel względem sekwencji dostępnych w bazach danych, takich jak GENEBANK, wykonuje się stosując program taki jak BLAST (Altschul i wsp., Nucleic -10
Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Sekwencję z oceną wartości oczekiwanej (E) mniejszą niż E = e-10 rozpatruje się jako endonukleazę będącą potencjalnym kandydatem. Sekwencje dające wartości oczekiwane o wiele niższe, tak niskie jak E = e- rozpatruje się z wysokim prawdopodobieństwem jako endonukleazy podobne do Mmel. Takie podobne do Mmel peptydy będące kandydatami są dalej badane w celu sprawdzenia czy są zgodne z architekturą domen, którą wykazuje Mmel. Prawdziwy kan8
PL 208 400 B1 dydat będzie zawierał motyw pofałdowania endonukleazy, zazwyczaj w formie (D/E)X8-X12(D/E)XK w amino-koń cowej części peptydu, (Aravind i wsp., Nucleic Acids Res. 28: 3417-3432 (2000)). Prawdziwy kandydat będzie zawierał motywy metylotransferazy w części środkowej peptydu podobne do metylotransferaz adeninowych N6-metylowych klasy gamma i sekwencje podobne do części karboksylowej Mmel w części karboksylowej peptydu kandydata. Takie wyszukiwanie BLAST wykonane 12 czerwca 2003 wykazało następujące sekwencje jako bardzo znacząco podobne do Mmel:
Nr dostępu GENEBANK | Opis | Wynik | Wartość E | SEK ID Nr |
1. gi 11579486821 ref| NP_284504.11 | białko hipotetyczne [Neisseri | 643 | 0,0 | 6 |
2. gi | 99457971 gb | AAG03371.11 | GcrY [Corynobacte- rium striatum ... | 604 | e-171 | 8 |
3. gi 1160777441 ref | NP_388558.11 | białko podobne do hipotetycznego | 564 | e-159 | 7 |
4. gi| 28373198| ref| NP_783835.11 | białko próbne YeeA [Lactoba . | 531 | e-149 | 3 |
5. gi | 231106381 gb | ZP_00096791.11 | białko hipotetyczne [Novosph . | 426 | e-118 | 10 |
6. gi | 274505191 gb | AAO14619.11 AF465251_62 | nieznane [Lactobacillus . | 217 | 9e-55 | 4 |
7. gi 1158072581 ref | NP_295988.11 | metylotransferaza modyfikująca DNA | 213 | 1e-53 | 14 |
8. gi 1158077881 ref | NP_285443.11 | konserwowane białko hipotetyczne | 164 | 7e-39 | 13 |
9. gi| 21231551| ref | NP_637468.11 | konserwowane białko hipotetyczne | 142 | 2e-32 | N/A |
10. gi | 208039631 emb | CAD31540.11 | domniemane białko metylazy DNA | 134 | 7e-30 | 11 |
11. gi 1234518261 gb | AAN32874.11 AF461726.1 | nieznane [Pseudomonas f . | 98 | 6e-19 | 9 |
12. gi 1161250791 ref| NP_419643.11 | konserwowane białko hipotetyczne | 92 | 3e-17 | 12 |
13. gi 1109545341 ref| NP_044172.11 | M. jannaschii przewidywane kodujące . | 76 | 2e-12 | N/A |
Większość z tych białek, w ich wpisach w bazach danych, oznaczono jako hipotetyczne lub przypuszczalne. Wiele z nich wydaje się być polipeptydami o pełnej długości, tak jak sekwencja #2 powyżej: GcrY. Takie peptydy kandydujące mogą zostać poddane ekspresji, jak to opisano w Roberts, w celu identyfikacji oczekiwanej aktywnoś ci endonukleazy. Niektóre geny endonukleaz mogą być nieaktywne w poszczególnym szczepie zastosowanym do sekwencjonowania (Lin i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2740-2745 (2001)). W takim wypadku ekspresja funkcjonalnej endonukleazy może okazać się prawdopodobna dzięki naprawie mutacji, które inaktywowały te geny. Kilka homologów Mmel, takich jak #7 (SEK ID NR: 14) (Deinococcus radiodurans DR2267) oraz #8 (SEK ID NR: 13) (Deinococcus radiodurans DR0119.1) posiada błędy w otwartej ramce odczytu. DR2267 posiada kodon stop, TAG, który przedwcześnie kończy otwartą ramkę odczytu, w pozycji, w której Mmel posiada kwas glutaminowy kodowany przez kodon GAG. Przez zamianę tego kodonu stop TAG na GAG możliwe może się stać przywrócenie aktywności tego potencjalnego genu endonukleazy. DR0119.1 także jest uszkodzony w taki sposób, że ma przesunięcie ramki odczytu, które uszkadza otwartą ramkę odczytu. Sekwencja Mmel może być stosowana w celu nakierowania na miejsce, w którym należy zreperować to przesunięcie ramki odczytu przez maksymalizację podobieństwa sekwencji DR0119.1 do sekwencji Mmel. Może to z powodzeniem przywrócić aktywność endonukleazy DR0119.1.
PL 208 400 B1
Alternatywna droga wytwarzania endonukleaz polega na wykorzystaniu struktury ich domen podobnych poprzez wykonanie wymiany domen. Możliwa jest wymiana domeny amino-końcowej peptydu podobnego do Mmel na domenę amino-końcową w białku Mmel, na przykład przez wymianę sekwencji potencjalnego nowego genu do pierwszego motywu metylotransferazy (motyw X, „Gly Ala His Tyr Thr Ser” w Mmel, w celu zastąpienia tej części Mmel aż do tej samej sekwencji. Podejście to może być szczególnie przydatne, kiedy dostępna jest tylko część sekwencji lub potencjalny gen stracił funkcję z powodu licznych mutacji. Podejście to wytworzy białko chimerowe, które potencjalnie posiada aktywność endonukleazy i przecina w pewnej odległości od sekwencji rozpoznawanej, podobnie jak Mmel, ale rozpoznaje nową sekwencję DNA. Można także odnaleźć w bazach danych sekwencje, które są wysoce podobne do Mmel, ale są częściowe. Na przykład, sekwencja #11 (SEK ID Nr: 9) powyżej (Pseudomonas fluorescens) pochodzi z małego fragmentu sekwencji DNA znajdującej się w bazie danych. W celu otrzymania funkcjonalnej ednonukleazy podobnej do Mmel z tej sekwencji, można zastosować odwrotny PCR lub inne techniki do otrzymania sekwencji DNA sąsiadującej z przytoczonym fragmentem, a następnie zastosować tę sekwencję w celu otrzymania nienaruszonego genu endonukleazy.
Po zidentyfikowaniu sekwencji, potencjalna endonukleaza może zostać poddana ekspresji i scharakteryzowana, jak to opisano w Roberts i wsp., powyż ej. Tutaj, jednakż e, nie ma oddzielnego genu metylotransferazy mogącego podlegać ekspresji wraz z endonukleazą. Po sklonowaniu takiej potencjalnej endonukleazy i poddaniu jej ekspresji w odpowiednim gospodarzu, takim jak E. coli, ekstrakt wolny od komórek jest przygotowywany i analizowany w celu wykrycia jakiejkolwiek aktywności endonukleazy. Takie oznaczanie endonukleazy musi obejmować kofaktor SAM wymagany przez te endonukleazy.
Po stwierdzeniu specyficznej aktywności przecinania DNA, sekwencja rozpoznawana i miejsce przecinania mogą zostać ustalone za pomocą standardowych sposobów. (Schildkraut (1984) w Genet. Eng. (NY) tom 6 (Setlow J. K., Hollaender, A. Ed.). str. 117-140. Plenum Press, New York „Screening for and characterizing restriction endonucleases.”).
Tak zidentyfikowane enzymy mogą być izolowane z komórek E. coli niosących fragmenty DNA w odpowiednim wektorze, za pomocą tradycyjnych technik oczyszczania biał ka. Na przykł ad, osad komórek zawieszany jest w roztworze buforu i poddawany sonifikacji, dyspersji w wysokim ciśnieniu lub enzymatycznemu trawieniu w celu umożliwienia ekstrakcji endonukleazy przez roztwór buforu. Nienaruszone komórki i resztki komórkowe są następnie usuwane przez odwirowywanie w celu wytworzenia ekstraktu wolnego od komórek zawierającego enzymy.
Endonukleaza wraz z odpowiadającą jej wewnętrzną aktywnością metylazy jest następnie oczyszczana z ekstraktu wolnego od komórek za pomocą chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa, chromatografii sitowej lub połączenia tych sposobów w celu wytworzenia endonukleazy według niniejszego wynalazku.
Przewiduje się, że te fragmenty DNA, jak również jakiekolwiek inne fragmenty o takim podobieństwie do Mmel, że mogą być one złożone w przyszłości w bazach danych, kodują polipeptydy, które są podobne do Mmel, w taki sposób, że kodowane polipeptydy działają zarówno jako endonukleazą restrykcyjna, jak i metylotransferaza.
Polipeptydy te mogą, podobnie do Mmel, przecinać DNA w podobnej odległości od rozpoznawanej sekwencji, w zakresie około 18 do 20 nukleotydów lub więcej, która to cecha jest wyjątkowa i przydatna w pewnych technologiach biologii molekularnej.
Przykładem takiego enzymu zidentyfikowanego w tym procesie jest CstMI. CstMI został zidentyfikowany jako potencjalna endonukleaza z powodu swojego wysoce znaczącego podobieństwa sekwencji aminokwasowej do Mmel. CstMI kodowany jest przez sekwencję #2 powyżej (SEK ID NR: 8), dającą wysoce znaczącą wartość oczekiwaną wynoszącą e-171 w porównaniu z Mmel za pomocą BLAST. CstMI rozpoznaje asymetryczną sekwencję 6 par zasad 5'-AAGGAG-3' i przecina DNA w ten sam sposób, co Mmel: przecina wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy 20 a 21 resztą w kierunku 3' względem tej rozpoznawanej sekwencji na tej nici DNA oraz pomiędzy 18 a 19 resztą w kierunku 5' względem sekwencji rozpoznawanej na nici komplementarnej 5'-CTCCTT-3', w wyniku czego wytwarzane jest 2 zasadowe wydłużenie od końca 3'.
Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące przykłady.
Przykłady te są dostarczone dla celów pomocniczych w zrozumieniu wynalazku i nie mają być interpretowane jako jego ograniczenie.
Cytowane powyżej i poniżej referencje zamieszczone są tutaj w formie odnośników.
PL 208 400 B1
P r z y k ł a d I. Oczyszczanie endonukleazy Mmel
Pojedynczą kolonię Methylophilus methylotrophus (NEB # 1190) hodowano przez 24 godziny w 1 litrze pożywki μΜ (0,08 μΜ CUSO4, 0,448 μΜ MnSO4, 0,348 μΜ ZnSO4, 6,0 μΜ FeCl3, 18 μΜ CaCO3, 1,6 mM MgSO4, 9,0 mM NaH2PO4, 10,9 mM K2HPO4, 13,6 mM (NH4)2SO4). Hodowlę tę stosowano do zaszczepienia 100 litrów pożywki Μ. Komórki hodowano w warunkach tlenowych w 37°C, przez noc, aż do fazy stacjonarnej. Pięć 100 litrowych fermentatorów było wymaganych do zebrania
752 gramów mokrego osadu komórkowego.
750 gramów osadu komórkowego M. methylotrophus zawieszano w 2,25 litra Buforu A (20 mWI Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol) i przepuszczano przez homogenizator Gaulin przy ~12000 funta na cal kwadratowy. Lizat odwirowywano przy ~13000 x G przez 40 minut i zbierano nadsącz.
Roztwór nadsączu nanoszono na 500 Hyper-D (BioSepra S.A.), którą równoważono w buforze A. Zastosowano płukanie 1,0 L buforu A, a następnie nanoszono 2 l gradientu NaCl od 0,05 Μ do 1Μ w buforze A, po czym frakcje zbierano. Frakcje oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel przez inkubowanie z 1 μg DNA Lambda (NEB) w 50 μl buforu NEB 1, uzupełnionego 32 μΜ S-adenozylo-L-metioniną (SAM) przez 15 minut w 37°C. Aktywność Mmel eluowano przy 0,3 M do 0,4 M NaCl.
Frakcje kolumny heparynowej Hyper-D zawierające aktywność Mmel łączono, rozcieńczano do 50 mM NaCl buforem A (bez NaCl) i nanoszono na 105 ml kolumnę Q Source 15 (Amersham Biotech), zrównoważoną buforem A. Stosowano płukanie 210 ml buforu A, a następnie nanoszono 1,0 L gradientu NaCl od 0,05 M do 0,7 M w buforze A. Frakcje zbierano i oznaczano aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel znajdowano we frakcji niezwiązanej.
Pulę Source 15 Q nanoszono na 22 ml kolumnę AF-Heparin-TSK (TosoHaas), zrównoważoną buforem A. Stosowano płukanie 44 ml buforu A, po czym nanoszono liniowy gradient NaCl od 0,05 M do 1,0 M w buforze A. Frakcje zbierano i oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel eluowano pomiędzy 0,26 M a 0,29 M NaCl. Frakcje zawierające aktywność pulowano i dializowano przeciw buforowi B (20 mM NaPO4 (pH 7,0), 50 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol).
Przedializowaną pulę AF-Heparin-TSK nanoszono na 6 ml kolumnę Resorce 15 S (Amerscham Biotech), zrównoważoną buforem B. Stosowano płukanie 12 ml buforu B, po czym nanoszono liniowy gradient NaCl od 0,05 M do 1,0 M w buforze B. Frakcje zbierano i oznaczano na aktywność endonukleazy Mmel. Aktywność Mmel eluowano pomiędzy 0,14 M a 0,17 M NaCl.
Pulę tę nanoszono na 2 litrową kolumnę rozdzielającą pod względem wielkości Superdex 75 (Amersham Biotech), zrównoważoną buforem C (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 1,0 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol). Frakcje zbierano pomiędzy 500 a 1500 ml eluatu buforem C, po czym analizowano za pomocą oznaczenia endonukleazy Mmel i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym na 4-20% gradiencie żelowym, po którym przeprowadzano znakowanie białka barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Frakcje wymyte pomiędzy 775 a 825 ml odpowiadały aktywności Mmel i prążkowi białka o wielkości 105 kDa. Frakcje te pulowano i dializowano przeciw buforowi D (20 Mm NaPO4 (pH 7,0), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% Glicerol).
Przedializowaną pulę kalibracyjną nanoszono na 16 ml kolumnę Ceramic HTP (BioRad), zrównoważoną buforem D. Po przemyciu 32 ml buforu D, nanoszono liniowy gradient od 0,02 M do 1,0 M NaPO4 w buforze D. Frakcje zbierano i oznaczano za pomocą oznaczenia endonukleazy Mmel i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym na 4-20% gradiencie żelowym, po czym następowało znakowanie białka barwnikiem Coomassie Brilliant Blue. Mmel wymywano pomiędzy 0,26 M a 0,3 M NaPO4. Porcję kilku frakcji zawierających pojedynczy prążek homogennego białka o wielkości 105 kDa stosowano do sekwencjonowania białka. Resztę oczyszczonych frakcji Mmel pulowano (6 ml 0,36 mg/ml) i dializowano przeciw buforowi do przechowywania (10 mM Tris (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% Glicerol). Oczyszczony enzym Mmel przechowywano w -20°C.
Oznaczenie aktywności
Próbki od 1-4 μl dodawano do 50 μl roztworu substratu składającego się z 1 x bufor NEB 1, 32 μΜ S-adenozylo-L-metioniny oraz 1 μg DNA (DNA Lambda, PhiX174 lub pUC19). Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 15 minut w 37°C, dodawano 20 μl roztworu stop i analizowano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym.
Optymalizowana aktywność endonukleazy
Po oczyszczeniu Mmel z M. methylotrophus, przeprowadzano doświadczenia w celu ustalenia optymalnych warunków reakcji dla przecinania DNA. Okazało się, że aktywność endonukleazy była
PL 208 400 B1 znacząco zwiększona w obecności potasu w buforze reakcyjnym. Reakcje przeprowadzano w 4°C do 37°C i od 5 do 60 minut bez znacznej zmiany w ilości przecinanego DNA. Do maksymalnego przecinania wymagane były stężenia enzymu w lub blisko równowagi stechiometrycznej dla miejsc DNA. Duży nadmiar enzymu blokował przecinanie. Dane te zastosowano do ponownego ustalenia aktywności Mmel i do określenia funkcjonalnej jednostki endonukleazy.
Definicja jednostki
Jedna jednostka Mmel jest określona jako ilość Mmel wymagana do całkowitego przecięcia 1 μg DNA PhiX174 w ciągu 15 minut w 37°C w buforze NEB 4 (20 mM Tris-octanu, 10 mM octanu magnezu, 50 mM octanu potasu, 1 mM ditiotreitolu (pH 7,9 w 25°C)) uzupełnionym 80 pM S-adenozylo-L-metioniną (SAM).
P r z y k ł a d II. Klonowanie endonukleazy Mmel
1. Oczyszczanie DNA: przygotowywano całkowite genomowe DNA Methylophilus methylotrophus. 5 gramów osadu komórkowego zawieszano w 20 ml 25% sacharozy, 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, do którego dodawano 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0. Następnie dodawano 6 ml roztworu lizozymu (10 mg/ml lizozymu w 0,25 M Tris-HCl, pH 8,0), a zawiesinę komórek inkubowano w 4°C przez 16 godzin. Następnie dodawano 25 ml mieszaniny Lytic (1% Triton-X100, 0,05 M Tris, 62 mM EDTA, pH 8,0) oraz 5 ml 10% SDS, a roztwór inkubowano w 37°C przez 5 minut. Roztwór ekstrahowano jedną objętością zrównoważonej mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (50:48:2 obj./obj./obj.), a fazę wodną odzyskiwano i ekstrahowano jedną objętością zrównoważonej mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1 obj./obj.) dwukrotnie. Następnie dializowano roztwór wodny przeciw czterem zmianom 2 L 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0. Przedializowany roztwór DNA trawiono Rnazą (100 μg/ml) w 37°C przez 1 godzinę. DNA wytrącano przez dodanie 1/10 objętości 5 M NaCl i 0,55 objętości 2-propanolu i nawijano na szklaną pałeczkę. DNA przemywano krótko 70% etanolem, krótko suszono na powietrzu i rozpuszczano w 20 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) do stężenia w przybliżeniu 500 μg/ml i przechowywano w 4°C.
2. Endonukleazę Mmel oczyszczano do homogenności, tak jak opisano w przykładzie I powyżej.
3. Sekwencje aminokwasowe endonukleazy końca aminowego oraz dla kilku wewnętrznych produktów trawienia bromocyjanem polipeptydu Mmel. Endonukleazę restrykcyjną Mmel, przygotowaną jak to opisano w przykładzie I powyżej, poddawano elektroforezie i elektroblottingowi zgodnie z procedurą Matsudaira (Matsudaira J. Biol. Chem. 262: 10035-10038, (1987)), z modyfikacjami opisanymi uprzednio (Looney i wsp., Gene 80: 193-208 (1989)). Błonę barwiono Coomassie Blue R-250, a prążek białka o wielkości w przybliżeniu 105 kDa wycinano i poddawano sekwencyjnej degradacji w sekwencjonerze ABI Procise 494 Protein/Peptide z dostarczaniem fazy gazowej (Waite-Rees i wsp., J. Bacteriol. 173: 5207-5219 (1991)). Otrzymana sekwencja aminokwasowa pierwszych 14 aminokońcowych reszt była następująca: ALSWNEIRRKAIEF (SEK ID NR: 15).
Dodatkową próbkę endonukleazy Mmel, 20 μq w 20 μl traktowano bromocyjanem (Sigma) rozpuszczonym w 200 μl 88% destylowanego kwasu mrówkowego przez 24 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Tę mieszaninę reakcyjną odparowywano do sucha i ponownie zawieszano w 20 μl buforu obciążającego (1,5 M Tris-HCl, pH 8,5, 12% glicerol, 4% SDS, 0,05% Serva Blue G, 0,05% czerwień fenolowa) w 100°C przez 5 minut. Próbkę tę poddano elektroforezie na Tris-Tricine 10 do 20% poliakrylamidowego gradientu żelowego (Invitrogen) przez trzy godziny, a następnie przenoszono na błonę dwufluorku poliwinylidenu (PVDF) (Problott, Applied Biosystems Inc.) przy zastosowaniu 10 mM buforu CAPS (10 mM kwas 3-[cykloheksylamino]-1-propanosulfonowy, 10% metanol, 0,05% SDS, 0,005% ditioterytiol, doprowadzone do pH 11,0 za pomocą NaOH) przez 18 godzin przy 200 woltach w zbiorniku elektroblottera (TE52, Hoeffer). Błonę znakowano Coomassie BlueR-250 i obserwowano główne prążki o wielkościach 25 kilodaltonów (kD), 14 kD, 7,5 kD oraz 6 kD, jak również mniejsze prążki. Te wyznakowane prążki białkowe wycinano z błony i każdy poddawano degradacji sekwencyjnej. Fragmenty inne niż fragment amino końcowy pochodzą z wewnętrznego cięcia bromocyjanem w resztach metioninowych znajdujących się w obrębie białka, powinny być zatem poprzedzone metionina.
Pierwszych 29 reszt 25 kD peptydu odpowiadało (M)KISDEFGNYFARIPLKSTXXIXEXNALQ (SEK ID NR: 16). Reszty 20, 21, 23 oraz 25, oznaczone X, nie zostały zidentyfikowane. Pierwszych 40 reszt aminokwasowych uzyskanych z 14 kD fragmentu wyglądało następująco:
(M)DAKKRRNLGAHYTSEANILKLIKPLLLDELWVVFXKVKN (SEK ID NR:17).
PL 208 400 B1
Reszta 36 nie została zidentyfikowana. Pierwszych 25 reszt 7,5 kD peptydu odpowiadało (M)KSRGKDLDKAYDQALDYFSGIAER (SEK ID NR: 18). Wykazano, że 6 kD fragment zawiera mieszaninę trzech sekwencji.
4. Amplifikacja części endonukleazy Mmel: dane dotyczące sekwencji aminowego końca peptydu, peptydu 25 kD, 14 kD i 7,5 kD zastosowano do zaprojektowania serii zdegenerowanych starterów do PCR odpowiadających kodonom dla reszt aminokwasowych. Porządek wewnętrznych fragmentów peptydu nie był znany, zatem dla tych fragmentów sporządzono zarówno starter lewy (nić sensowna), jak i starter prawy (nić antysensowna). Startery wyglądały następująco:
Fragment 25 kD: reszty DEFGNYFA (SEK ID NR: 19)
Lewy:
1) 5'-GARTTYGGNAAYTAYTTYGC-3' (SEK ID NR: 20)
Prawy:
2) 5'-AARTARTTNCCRAAYTCRTC-3' (SEK ID NR: 21)
Fragment 14 kD: reszty MDAKKR (SEK ID NR: 22)
Lewy A:
3) 5'-ATGGAYGCNAARAARCG-3' (SEK ID NR: 23)
Prawy B:
4) 5'-ATGGAYGCNAARAARAG-3' (SEK IDNR: 24)
Lewy:
5) 5'-CGNCGYTTYTTNGCRTCCAT-3' (SEK ID NR: 25)
Fragment 7,5 kD: reszty DKAYDQA (SEK ID NR: 26)
Lewy:
6) 5'-GAYAARGCNTAYGAYCARGC-3' (SEK ID NR: 27)
Prawy:
7) 5'-GCYTGRTCRTANGCYTTRTC-3' (SEK ID NR: 28) gdzie:
Y = T, C,
R = A, G,
H = A, T, C,
S = G, C,
N = A,C,G,T.
Startery 1 i 2 pozyskano z 25 kD peptydu CNBr Mmel i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (1) lub nici antysensownej (2) genu. Startery 3 do 5 pozyskano z 14 kD peptydu CNBr i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (3 i 4) lub nici antysensownej (5) genu, przy czym 3 i 4 różniły się użyciem kodonu dla reszty argininowej. Startery 6 i 7 pozyskano z 7,5 kD peptydu CNBr i zostały sporządzone w celu rozpoczęcia syntezy nici sensownej (6) lub nici antysensownej (7) genu.
Reakcje amplifikacji PCR przeprowadzano przy zastosowaniu następujących kombinacji starterów: 1 z 5, 1 z 7, 3 z 2, 3 z 7, 5 4 z 2, 4 z 7, 6 z 2 oraz 6 z 7. Część genu Mmel zamplifikowano w reakcji PCR poprzez połączenie:
μl 10x buforu Thermopol (NEB), μl 4mM roztworu dNTP (NEB), μl genomowego DNA Mmel (500 μg/ml roztworu podstawowego), μ l 100 mM MgSO4,
586 μί dH2O, μl (32 jednostki) polimerazy Vent® egzo-DNA (NEB).
Ta mieszanina wyjściowa została podzielona na 8 równych objętości po 90 μ^ do których dodano po 5 μl startera lewego (10 μΜ roztworu podstawowego) i 5 μl startera prawego (10 μΜ roztworu podstawowego). Parametry cykli wyglądały następująco: 95°C przez 3 minuty w jednym cyklu, następnie 95°C przez 30 sekund, 46°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty przez 25 cykli.
Produkty reakcji namnażania poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i analizowano. Uzyskano główne produkty namnażania DNA mające po 450 par zasad (bp) (startery 2 z 4), 650 bp (startery 5 z 6) oraz 1100 bp (startery 2 z 6). Te wielkości fragmentów zgodne są z 7,5 kD fragmentem CnBr lokalizowanym najbliżej aminowego końca białka i w przybliżeniu w odległości 650 bp od 14 kD fragmentu CnBr, przy czym 14 kD fragment znajdował się pomiędzy 7,5 kD a 25 kD fragmentem i przylegał do 25 kD fragmentu. Namnożone fragmenty DNA oczyszczano w żelu i sekwencjonowano
PL 208 400 B1 przy zastosowaniu starterów, zastosowanych do namnażania. Wynik translacji otrzymanej sekwencji DNA pokrywał się z sekwencją aminokwasowa uzyskaną z oczyszczonej endonukleazy Mmel, co wskazuje, że udało się uzyskać część sekwencji DNA genu endonukleazy Mmel.
5. Określanie sekwencji DNA dla całego genu Mmel i DNA sąsiadującego: zastosowano technikę odwrotnego PCR w celu przedłużenia sekwencji DNA po obu stronach liczącego 1060 par zasad genu Mmel otrzymanego powyżej. Aby to osiągnąć zaprojektowano i zsyntetyzowano serię starterów pokrywających się z sekwencją DNA genu Mmel i ukierunkowanych do odwrotnego PCR. Genomowe DNA Mmel zostało pocięte dużą liczbą endonukleaz restrykcyjnych i zligowane w niskim stężeniu w celu wytworzenia kolistych matryc DNA.
A. Genomowe DNA Mmel strawiono dziesięcioma różnymi endonukleazami restrykcyjnymi, a następnie koliście zligowano w celu uzyskania matryc DNA do namnażania przy zastosowaniu techniki odwrotnego PCR. Zastosowano następujące enzymy restrykcyjne:
BspHI (T/CATGA),
EcoRI (G/AATTC),
Hindlll (A/AGCTT),
HinPlI (G/CGC),
Mspl (C/CGG),
Nlalll (CATG/),
Pstl (CTGCA/G),
SacI (GAGCT/C),
SphI (GCATG/C),
Xbal (T/CTAGA).
Trawienia enzymami restrykcyjnymi przeprowadzano przez mieszanie:
μl 10 x buforu NEB zalecanego dla enzymu (zmiennie w zależności od enzymu), μl genomowego DNA M. methyloptrophus (1 μg), μί dH2O, μl (10-20 jednostek) enzymu restrykcyjnego.
Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Endonukleaza restrykcyjna była inaktywowana poprzez ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w 65°C (80°C dla Pstl) przez 20 minut. Strawione DNA było następnie ligowane do fragmentów kolistych poprzez dodawanie 50 μl 10 x buforu do ligazy DNA T4, 400 μl dH2O i 3 μl stężonej ligazy DNA T4 (6000 jednostek, New England Biolabs, Inc.) oraz inkubowane w 16°C przez 16 godzin. Zligowane DNA ekstrahowano następnie za pomocą fenolu i chloroformu, wytrącano za pomocą 2-propanolu i ponownie zawieszano w 100 μl buforu TE.
B. Amplifikacja DNA sąsiadującego z liczącym 1060 par zasad fragmentem genu endonukleazy Mmel: zaprojektowano dwie pary starterów PCR, po jednej w pobliżu każdego końca liczącej 1060 par zasad sekwencji otrzymanej z bezpośredniego PCR przeprowadzonego z zastosowaniem starterów zdegenerowanych. Sekwencje starterów były następujące:
starter IP 1:
5'-GTTGGATCCCGCACAGATTGCTCAGG-3' (SEK ID NR: 29), starter IP 2:
5'-GTTGGATCCTACGTTAATCTGAATAAGATG-3' (SEK ID NR: 30), starter IP 3:
5'-GTTGGATCCTGTTAATCTGAAACGCTGG-3' (SEK ID NR: 31), starter IP 4: 5'-GTTGGATCCTTATACCAAAATGTGAGGTC-3' (SEK ID NR: 32).
Reakcje odwrotnego PCR przeprowadzono na 10 kolistych matrycach wytworzonych powyżej przy zastosowaniu par starterów IP 1 z IP 2, IP 3 z IP 4 oraz IP 1 z IP 3. Reakcje amplifikacji przeprowadzono poprzez zmieszanie:
μl 10 x buforu Thermopol (NEB), μl 4mM roztworu dNTP (NEB), μl startera IP (lewy), μl startera IP (prawy), μl 100 mM MgSO4,
534 μl dH2O, μl (32 jednostki) egzo-polimerazy DNA Vent® (NEB).
Mieszanina wyjściowa została podzielona na dziesięć probówek po 76 μ( do których dodano 4 μl odpowiednio strawionej, zligowanej koliście matrycy. Parametry cykli wynosiły 95°C przez 3 minu14
PL 208 400 B1 ty dla pierwszego cyklu, a następnie 95°C przez 30 sekund, 56°C przez 30 sekund, 72°C przez 3 minuty przez 25 cykli. Produkty namnażania były analizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Dla starterów IP 1 oraz IP 2 z matrycą SphI i matrycą Nlalll uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 825 par zasad. Dla starterów IP 3 i IP z matrycą BspHI uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 800 par zasad. Dla starterów IP 1 i IP 3 z matrycą EcoRI uzyskano produkt liczący w przybliżeniu 1500 par zasad. Te namnożono fragmenty DNA oczyszczano w żelu, sekwencjonowano i składano z otrzymaną uprzednio sekwencją . Zł o ż ona sekwencja nie zawierał a peł nej ramki odczytu endonukleazy Mmel. Złożona sekwencja została zastosowana do bezpośredniej syntezy drugiej grup par starterów do odwrotnego PCR. Sekwencje tych starterów były następujące:
starter IP 5:
5'-TTCAGAAATACGAGCGATGC-3' (SEK ID NR: 33), starter IP 6:
5'-GTCAAGCCATAAACACCATC-3' (SEK ID NR: 34), starter IP 7:
5'-GAGGGTCAGAAAGGAAGCTG-3' (SEK ID NR: 35), starter IP 8:
5'-GTCCAACTAACCCTTTATGG-3' (SEK ID NR: 36).
Reakcje namnażania za pomocą odwrotnego PCR przeprowadzano jak wyżej. Przy zastosowaniu starterów IP 5 i IP 6 uzyskano produkty z matrycy Nlalll (w przybliżeniu 450 par zasad) oraz z matrycy Mspl (w przybliż eniu 725 par zasad), lecz nie z innych matryc otrzymanych po ligacji kolistej. Przy zastosowaniu starterów IP 7 i IP 8 uzyskano produkty z matrycy EcoRI (w przybliżeniu 500 par zasad), matrycy SphI (w przybliżeniu 825 par zasad) oraz z matrycy BspHI (w przybliżeniu 750 par zasad). Te fragmenty DNA zsekwencjonowano, a sekwencję składano z sekwencją uprzednio otrzymaną. Złożona sekwencja nie zawierała jeszcze całej otwartej ramki odczytu endonukleazy Mmel, wykonano więc kolejną rundę syntezy startera oraz odwrotnego PCR. Wytworzono dodatkowe matryce DNA tak jak powyżej, ale z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych Apol (R/AATY), Asel (AT/TAAT), BsaHI (GR/CGYC), Mfel (C/AATTG), Sspl (AAT/ATT) oraz EcoRV (GAT/ATC) w celu strawienia genomowego DNA M. methylotropus. Sekwencje starterów tej trzeciej rundy były następujące:
starter IP 9:
5'-TTCCTAGTGCTGAACCTTTG-3' (SEK ID NR: 37), starter IP 10:
5'-GTTGCGTTACTTGAAATGAC-3' (SEK ID NR: 38), starter IP 11:
5'-CCAAAATGGAACTTGTTTCG-3' (SEK ID NR: 39), starter IP 12:
5'-GTGAGTGCGCCCTGAATTAG-3' (SEK ID NR: 40).
Reakcje namnażania odwrotnego PCR wykonywano jak powyżej. Przy zastosowaniu starterów IP 9 oraz IP 10 uzyskano produkty z matrycy Nlalll (w przybliżeniu 425 par zasad), matrycy Mfel (w przybliżeniu 750 par zasad), matrycy Apol (w przybliżeniu 800 par zasad) oraz matrycy Mspl (w przybliżeniu 2100 par zasad). Przy zastosowaniu starterów IP 11 oraz IP 12 uzyskano produkty z matrycy SphI (w przybliżeniu 875 par zasad), matrycy BspHI (w przybliżeniu 925 par zasad), matrycy EcoRI (w przybliżeniu 950 par zasad). Te fragmenty DNA sekwencjonowano i sekwencję składano z sekwencjami otrzymanymi uprzednio. Dalsze sekwencjonowanie wykonywano na liczą cym 2100 par zasad produkcie IP 9, IP 10 Mspl przy zastosowaniu trzech dodatkowych starterów:
starter S1:
5'-GCTTCATTTCATCCTCTGTGC-3' (SEK ID NR: 41), starter S2:
5'-TAACCGCCAAAATTAATCGTG-3' (SEK ID NR: 42), starter S3:
5'-CCACTATTCATTACAACACC-3' (SEK ID NR: 43).
Ostateczna sekwencja złożona (figura 2) zawierała całkowity gen endonukleazy restrykcyjnej Mmel, jak również 1640 par zasad sekwencji poprzedzającej gen oraz 1610 par zasad sekwencji znajdującej się za genem.
6. Klonowanie genu endonukleazy Mmel w E. coli: przypuszczalna otwarta ramka odczytu endonukleazy Mmel została zidentyfikowana ze złożenia sekwencji DNA otrzymanego z sekwencjonoPL 208 400 B1 wania różnych fragmentów DNA zamplifikowanych za pomocą odwrotnego PCR. Początek otwartej ramki odczytu zidentyfikowano na podstawie dopasowania przewidywanej sekwencji aminokwasowej na końcu aminowym otwartej ramki odczytu z sekwencją określoną na podstawie białka endonukleazy Mmel. Przewidywany koniec otwartej ramki odczytu umożliwiałby kodowanie polipeptydów o wielkości w przybliżeniu 105 kDa, co pasowało do obserwowanej wielkości natywnej endonukleazy Mmel. Sekwencja aminokwasowa wydedukowana na podstawie translacji tej otwartej ramki odczytu zawierała motywy konserwowanych sekwencji DNA metylotransferaz N6mA. Jednakże, nie zaobserwowano żadnej otwartej ramki odczytu zawierającej motywy konserwowanych sekwencji pośród DNA metylotransferaz, przylegającej do genu endonukleazy Mmel, co przewidywano. Zdecydowano się podjąć próbę dokonania ekspresji endonukleazy Mmel w E. coli bez drugiej metylotransferazy obecnej w celu ochrony DNA gospodarza E. coli przez przecinaniem. Zsyntetyzowano startery oligonukleotydowe w celu specyficznej amplifikacji genu Mmel z DNA genomowego M. methylothropus w celu dokonania ekspresji w wektorze klonującym pRRS (Skoglund, Gene 88: 1-5 (1990)).
Starter lewy zawierał miejsce Pstl do klonowania, kodon stop w ramce z genem lacZ wektora, konsensusowe miejsce wiązania rybosomu E. coli, kodon ATG dla startu translacji (zamieniony z GTG stosowanym przez M. methylotrophus dla umożliwienia większej ekspresji w E. coli) oraz 20 nukleotydów, pokrywających się z sekwencją DNA M. methylotrophus:
5'-GTTCTGCAGTTAAGGATAACATATATGGCTTTAAGCTGGAACGAG-3' (SEK ID 5 NR: 44).
Starter prawy zawierał miejsce BamHI do klonowania oraz 22 nukleotydy, pokrywające się z sekwencją DNA M. methylotrophus w kierunku 3' od końca otwartej ramki odczytu Mmel:
5'-GTTGGATCCGTCGACATTAATTAATTTTGCCCTTAG-3' (SEK ID NR: 45).
Gen Mmel namnożono w reakcji PCR przez połączenie:
μl buforu Thermopol 10 x (NEB), μl 4 mM roztworu DTP,
12,5 μl lewego startera (10 μΜ roztworu wyjściowego),
12.5 μl prawego startera (10 μΜ roztworu wyjściowego), μl genomowego DNA Mmel (500 μg/ml roztworu wyjściowego),
387 μί dH2O, ® μl (6 jednostek) polimerazy DNA Vent .
Mieszaninę reakcyjną zmieszano i rozdzielono do 5 probówek po 80 μί. Dodano MgSO4 (100 mM roztworu wyjściowego) w celu uzyskania stężenia końcowego jonów Mg++ wynoszącego odpowiednio 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM oraz 6 mM. Parametry cykli wynosiły: 95°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund, 72°C przez 3 minuty, przez 24 cykle. Mieszaniny analizowano za pomocą elektroforezy żelowej i reakcje zawierające 3 mM do 6 mM Mg++ zawierały prążek DNA o pożądanej wielkości 2,8 kpz. Te mieszaniny reakcyjne łączono, a prążek 2,8 kpz oczyszczono z żelu. Namnożony fragment genu Mmel o wielkości 2,8 kpz trawiono za pomocą endonukleaz BamHI oraz Pstl (NEB) w następujących warunkach reakcyjnych:
μί buforu reakcyjnego BamHI 10 x (NEB),
1.5 μί BSA (NEB), μί zamplifikowanego fragmentu DNA genu Mmel o wielkości 2,8 kpz, μί dH2O, μί endonukleazy BamHI (100 jednostek), μί endonukleazy Pstl (100 jednostek).
Mieszaninę reakcyjną mieszano i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Małe fragmenty odcięte z końców fragmentu DNA 2,8 kpz usuwano wraz z endonukleazami poprzez oczyszczanie na kolumnie wirówkowej Qiagen QiaPrep zgodnie z instrukcjami producenta.
Przecięty fragment DNA genu Mmel ligowano z wektorem pRRS w następujący sposób: 10 μί strawionego, oczyszczonego fragmentu Mmel 2,8 kpz mieszano z 5 μί wektora pRRS uprzednio trawionego BamHI i Pstl i oczyszczonego, 5 μί dH2O, 20 μί buforu QuickLigase 2 x (NEB), mieszaninę reakcyjną mieszano i dodawano 2 μί ligazy QuickLigase. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. 5 μί mieszaniny reakcji ligacyjnej transformowano do 50 μί chemokompetentnych komórek E. coli ER2683, a komórki umieszczano na szalkach z pożywką L zawierającą 100 μg/ml ampicyliny i inkubowano w 37°C przez noc. Uzyskano w przybliżeniu 200 transformantów, a analizowano 18 transformantów reprezentatywnych w następujący sposób: izolowano plazmid z każdej kolonii za pomocą procedur minilizy i trawiono endonukleazami AlwNI i Ndel w celu ustalenia czy zawierają wstawkę o prawidłowej wielkości. 2 spośród 18 transformantów zawierało wstawkę
PL 208 400 B1 o prawidłowej wielkości około 2800 pz. Oba klony badano w celu sprawdzenia, czy wytwarzają one aktywność endonukleazy Mmel. Klony hodowano przez noc w 37°C w 500 ml pożywki L zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Komórki zbierano przez wirowanie, zawieszano w 10 ml buforu do sonifikacji (20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) i niszczono przez sonifikację. Nie oczyszczony lizat oczyszczano za pomocą wirowania, a nadsącz odzyskiwano. Lizat oznaczano na aktywność endonukleazy w serii rozcieńczeń lizatu w 1 x buforze reakcyjnym NEB 1 (New England Biolabs) zawierającym 20 μg/ml substratu DNA lambda i uzupełnionym SAM do stężenia końcowego 100 μM. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Produkty reakcji analizowano za pomocą elektroforezy żelowej na 1% żelu agarozowym w 1 x buforze TBE. Jeden z dwóch klonów posiadał aktywność endonukleazy Mmel. Ten aktywny klon oznaczono jako szczep NEB1457 i stosowano do późniejszego wytwarzania Mmel. Konstrukt plazmidowy wykazujący ekspresję aktywności Mmel w tym klonie oznaczono jako pTBMmel.1.
P r z y k ł a d III. Endonukleaza Mmel zapewnia ochronę in vitro przeciwko przecinaniu przez
Mmel
Plazmid pTBMmel.1 oczyszczano z NEB1457 przy zastosowaniu protokołu do minilizy Qiagen. Plazmid ten ma dwa miejsca Mmel w sekwencji wektora oraz jedno miejsce w genie Mmel. Plazmid trawiono Mmel w celu sprawdzenia, czy to DNA jest oporne na aktywność endonukleazy Mmel, co wskazywałoby na to, że pojedynczy gen Mmel był zdolny do metylacji DNA in vivo w celu ochrony DNA gospodarza przeciwko jego aktywności endonukleazy.
W celu sprawdzenia tego przygotowano następującą mieszaninę:
μl DNA pTBMmel.1 po minilizie, μl 10 x buforu NEB 4, μl SAM (1 mM roztworu wyjściowego),
110 μί dH2O, μl endonukleazy Mmel (15 jednostek).
Mieszaninę reakcyjną mieszano i dzielono na trzy części. Do jednej trzeciej dodawano 0,5 μl dH2O do drugiej części dodawano 0,5 μl wektora pRRS, a do trzeciej części dodawano 0,5 μl DNA PhiX174 w ramach kontroli pozytywnej. pTBMmel.1 nie został pocięty przez aktywność endonukleazy Mmel, podczas gdy DNA PhiX174 oraz cząsteczki DNA pRRS w tej samej reakcji ulegały przecinaniu, co wskazuje na to, że trzy miejsca Mmel w DNA pTBMmnel.1 są oporne na aktywność endonukleazy Mmel (figura 4).
P r z y k ł a d IV. Wrażliwość endonukleazy Mmel na metylację
Wcześniejsza literatura donosiła, że endonukleaza Mmel metyluje jedynie jedną nić swoich rozpoznawanych sekwencji i że taka półmetylacja nie blokuje następczego trawienia DNA przez endonukleazę (Tucholski, Gene 223 (1998) 293-302). W celu sprawdzenia tego, zsyntetyzowano zestaw czterech oligonukleotydów w taki sposób, by substrat DNA mógł powstać w postaci nie zmetylowanej (oligo 1 + oligo 2), zmetylowanej jedynie w górnej nici (oligo 3 + oligo 2), zmetylowanej jedynie w dolnej nici (oligo 1 + oligo 4) lub zmetylowanej na obu niciach (oligo 3 + oligo 4). Zsyntetyzowane oligonukleotydy miały następujące sekwencje:
Oligo 1:
5'-FAM-GTTTGAAGACTCCGACGCGATGGCCAGCGATCGIGCGCCTCAGCTTTTG-3' (SEK ID NR: 46),
Oligo 2:
5'-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGTCGGAGTCTTCAAAC-3' (SEK ID NR: 47),
Oligo 3:
5'-FAM-GTTTGAAGACTCCG (6Ma) CGCGATGGCCAGCGATCGGCGCCTCAGCTTTTG-3' (SEK ID NR: 48),
Oligo 4:
5'-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGT:CGG (6mA) GTCTTCAAAC-3' (SEK ID NR: 49).
(Pozostałe nukleotydy nie wchodzące w skład rozpoznawanej sekwencji Mmel były także zmetylowane dla celów innych badań, ale jako że Mmel nie ma żadnej specyficzności względem sekwencji tych nukleotydów nie wpływa to na aktywność Mmel i te pozostałe metylacje zostały tu dla jasności pominięte). Dwuniciowe DNA tworzono przez mieszanie 100 μl górnej nici oligonukleotydu (14 μM roztworu wyjściowego) ze 100 μl dolnej nici oligonukleotydu (14 μM roztworu wyjściowego), podgrzaPL 208 400 B1 nie do 85°C i powolne schładzanie do 30°C przez 20 minut. Następnie, stosowano Mmel do przecięcia par oligonukleotydów w 30 μΐ mieszaniny reakcyjnej 1 x buforu NEB 4, 2,5 μΜ oligonukleotydów, 100 μΜ SAM oraz 2,5 jednostek Mmel. Jako kontrolę stosowano także endonukleazę restrykcyjną Hpy1881 do przecinania oligo DNA.
Rozpoznawana sekwencja Hyp188I zachodzi na pierwszych 5 nukleotydów rozpoznawanej sekwencji Mmel, w tym DNA, 5'-TCNGA-3' i jest blokowana przez metylację adeniny w każdej nici DNA. Zgodnie z oczekiwaniami okazało się, że Mmel przecina nie zmetylowane DNA. W przeciwieństwie do wcześniejszych danych (Tucholski, Gene 223: 293-302 (1998)) Mmel nie przecinał półzmetylowanych DNA, gdy zmetylowana była jedynie nić górna: 5'-TCCG(N6mA)C-3'. Jeśli jedynie dolna nić była zmetylowana, Mmel przecinał DNA (figura 5).
Wynik ten jest zgodny zarówno z obserwowaną zdolnością pojedynczego enzymu Mmel do ochrony DNA gospodarza przeciwko cięciu in vivo, jak i obserwacją, że Mmel metyluje jedynie górną nić swojej rozpoznawanej sekwencji. Potwierdziliśmy doniesienie, że enzym Mmel metyluje jedynie górną nić swojej rozpoznawanej sekwencji przez metylacje powyższych par oligo stosując wyznakowany trytem H3-SAM, odpłukiwanie nie wstawionego SAM i zliczanie radioaktywności w DNA. Zarówno nie zmetylowane oligo DNA, jak i nie zmetylowane na górnej nici, a zmetylowane na dolnej nici cząsteczki DNA, miały większe niż 10-krotne zliczenia niż tło, podczas gdy nie zmetylowne na dolnej nici, a zmetylowane na górnej nici DNA oraz DNA z obiema zmetylowanymi nićmi miały zliczenia bliskie tłu (fig. 6). Wyniki te wskazują, że Mmel jest nowym typem układu restrykcji modyfikacji, który nie wymaga oddzielnego enzymu metylotransferazy do modyfikowania DNA gospodarza w celu ochrony przeciwko aktywności endonukleazy, jak to jest w przypadku enzymów typu IIG (zwanego także typem IV), takich jak Eco571.
P r z y k ł a d V. Sekwencjonowanie i analiza DNA
Sekwencjonowanie DNA: sekwencjonowanie DNA przeprowadzano na dwuniciowych matrycach w automatycznym sekwensatorze ABI 373 lub ABI 377. Namnożone fragmenty DNA oraz poszczególne klony sekwencjonowano ze starterami zsyntetyzowanymi jak powyżej lub z uniwersalnych starterów zlokalizowanych w wektorze.
Analizy komputerowe: analizy komputerowe uzyskanych sekwencji DNA przeprowadzano za pomocą programów Genetics Computer Group (Deverenx i wsp., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984), a przeszukiwanie podobieństw w bazach danych przeprowadzano za pomocą Internetu na stronie National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) przy zastosowaniu algorytmów BLASTX oraz BLASTP (Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) oraz Gish i wsp., Nature Genet. 3: 266-722 (1993)).
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΪΝ.ST25 WYKAZ SEKWENCJI <110> New England Biolabs, inc.
Morgan, Richard D.
Bhatia, Tanya Davis, Theodore Lovasco, Lindsay <120> Rekombinowane endonukleazy restrykyjne typu II, Mmei i inne pokrewne endonukleazy oraz sposoby ich wytwarzania <130> NEB-207-PIN <140>
<141>
<150> US 60/395,431 <151> 2002-07-12 <150> PCT/US03/31570 <151> 2003-07-10 <160> 50 <170> Patent w wersji 3.2 <210> 1 <211> 6010 <212> DNA <213> Methylophilus methylotrophus <220>
<221> cecha inna <222> (800)..(800) <223> n to a, c, g, lub t <400> 1
gaattccaga | taggtagtcc | tttggtactt | ccatcccaac | cagtgtcacg | ttccgcgcca | 60 |
aaccaatcgg | ttaaagtgta | agaaagtctt | gcactgaagt | agctgtagga | caaaccgaag | 120 |
ttaacctctg | tggtatccca | gcgaccacct | ttaggtgttt | gacggaagcc | tgctgcgtca | 180 |
cctgccaagt | tatatttctt | ccatgaacca | cctgggtaca | ggtagctgat | caaaccagca | 240 |
gtccaaccca | agccttcaat | agcaggaata | gttccgttat | acccaccata | aatatcaatt | 300 |
tcggcagttg | catcagggaa | ggtatttggt | gtcacgtttg | aaccccatgc | accgacataa | 360 |
aagccgctgt | catgagtaat | atcaataccg | ccttgaacgg | caggtttgtg | ccagttttgt | 420 |
gaaataccac | gagcatagta | atctgaaaca | aatccaacgt | ttgcagtagc | agcccaggct | 480 |
gatttttctt | ctttagcctc | ttcagctgcg | tatgaaactt | gggcaaaaga | taatgtgctt | 540 |
aacactgctg | tgagcaatat | agattgacgc | attatgagtc | ctctctctgt | gaaatctttg | 600 |
attaagttgt | tgtaaacgag | aatgaaacaa | caaccacaaa | gcaaagcacg | tgccaaacta | 660 |
taaataacat | tataatcaat | tatttaaaat | atatttataa | tctaaaatat | taaattaatt | 720 |
atttaataaa | ctgtttttta | ttgatttaac | tctaaaacat | atgggtgcaa | ccaccctttt | 780 |
tactcactga | taatgctaan | atagccaaca | aaggagcctt | caccatgctg | atttcaaatg | 840 |
aaaaaattca | ggaattatct | ttaaaaatca | aacaactaat | cgaatcaagc | cccatttcag | 900 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 | ||||||
agctaaataa | caacttgcat | gcactaattc agggcgcact | caccaaaatg | gaacttgttt | 960 | |
cgcgtgaaga | attcgatatc | caatctgcat | tattagcgcg | cacgcaagag | caattaaaac | 1020 |
gtcttgaaga | aaaaatcagc | cagcttgaag | aagggcaggc | atccagaaag | taaaaattaa | 1080 |
tttacaattg | ttagcattcc | attattgagg | agtgcgctat | gagtctggcg | gtgttataca | 1140 |
gtcgcgcgtt | aagcggcatg | gaggcgccag | aagtggtggt | agaagtccac | ttggcgaatg | 1200 |
gactacccag | ctttaccatt | gttgaaacat | attgaaactt | taagccttag | cattttttca | 1260 |
aatatacaaa | tgccccaagc | tggtgcatta | agaagaatgt | aacaactccc | tgcagactag | 1320 |
gaataacttc | atgatttaac | gaacatccct | gagtttcaaa | gtcgaatctt | ctcgtgttgc | 1380 |
aaatttctac | agcttccttt | ctgaccctct | tgcaccaaat | tgcactatgg | cgctaataaa | 1440 |
tcttctgcta | tccaataatg | tccaactaac | cctttatgga | ctcttaaaaa | agatttaata | 1500 |
aatgattaag | atgaattcaa | ggaatttgat | gcctggaaat | atggcaaaag | caaaaaggca | 1560 |
gcccagtgct | gacttttttg | ttttaacatt | ggcccatata | tccaatttca | aataatttaa | 1620 |
aaattatcgg | gagctaatct | gtggctttaa | gctggaacga | gataagaaga | aaagctattg | 1680 |
agttttctaa | aagatgggaa | gacgcctcag | atgaaaacag | tcaagccaaa | ccctttttaa | 1740 |
tagatttttt | cgaagttttt | ggaataacta | ataagagagt | tgcaacattt | gagcatgctg | 1800 |
tgaaaaagtt | cgccaaggcc | cataaggaac | aatctcgagg | attcgtagat | ttgttttggc | 1860 |
ctggcattct | tcttattgaa | atgaaaagca | gaggtaaaga | cctcgacaaa | gcgtatgacc | 1920 |
aggcacttga | ttacttttct | ggcattgcag | aaagagactt | acccagatac | gttttagttt | 1980 |
gcgacttcca | gcgtttcaga | ttaacagacc | taataacaaa | agagtcagtt | gaatttcttt | 2040 |
taaaggactt | ataccaaaat | gtgaggtctt | ttggttttat | agctggttat | caaactcaag | 2100 |
taatcaagcc | acaagaccct | attaatatta | aggcggctga | acggatgggt | aagcttcatg | 2160 |
acaccctgaa | gttggttgga | tatgagggac | acgctttaga | actttatcta | gtgcgtttac | 2220 |
ttttttgctt | attcgcagaa | gacacaacta | tttttgagaa | aagtttattc | caagaatata | 2280 |
tcgagacaaa | gacgctagag | gacggcagtg | accttgcaca | tcatatcaat | acactttttt | 2340 |
atgttctcaa | taccccagaa | caaaaaagat | taaagaatct | agacgaacac | cttgctgcat | 2400 |
ttccatatat | caatggaaaa | cttttcgagg | agccacttcc | gccagctcag | tttgataaag | 2460 |
caatgagaga | ggcattgctt | gacttgtgct | cattagattg | gagcaggatt | tcaccagcaa | 2520 |
tatttggaag | tttattccaa | agcattatgg | atgctaaaaa | gagaagaaat | cttggggcac | 2580 |
actacaccag | cgaagcaaat | attctcaagt | taatcaagcc | attgtttctt | gacgagctct | 2640 |
gggtagagtt | cgagaaagtt | aaaaataata | aaaataaatt | actagcgttc | cacaaaaaac | 2700 |
taagaggact | tacatttttc | gaccctgcat | gcggttgcgg | aaattttctt | gtaatcacat | 2760 |
accgagaact | aagactttta | gaaattgaag | tgttaagagg | attgcataga | ggtggtcaac | 2820 |
aagttttgga | tattgagcat | cttattcaga | ttaacgtaga | ccagtttttt | ggtatcgaaa | 2880 |
tagaggagtt | tcccgcacag | attgctcagg | ttgctctctg | gcttacagac | caccaaatga | 2940 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 | ||||||
atatgaaaat | ttcagatgag | tttggaaact actttgcccg | tatcccacta | aaatctactc | 3000 | |
ctcacatttt | gaatgctaat | gctttacaga | ttgattggaa | cgatgtttta | gaggctaaaa | 3060 |
aatgttgctt | catattagga | aatcctccat | ttgttggtaa | aagtaaacaa | acaccgggac | 3120 |
aaaaagcgga | tttactatct | gtttttggaa | atcttaaatc | cgcttcagac | ttagacctag | 3180 |
ttgctgcttg | gtatcccaaa | gcagcacatt | acattcaaac | aaatgcaaac | atacgctgtg | 3240 |
catttgtctc | aacgaatagt | attactcaag | gtgagcaagt | atcgttgctt | tggccgcttc | 3300 |
tgctctcatt | aggcataaaa | ataaactttg | ctcacagaac | tttcagctgg | acaaatgagg | 3360 |
cgtcaggagt | agcggcggtt | cactgcgtaa | ttatcggatt | tgggttgaag | gattcagatg | 3420 |
aaaaaataat | ctatgagtat | gaaagtatta | atggagaacc | attagctatt | aaggcaaaaa | 3480 |
atattaatcc | atatttgaga | gacggggtgg | atgtgattgc | ctgcaagcgt | cagcagccaa | 3540 |
tctcaaaatt | accaagcatg | cgttatggca | acaaaccaac | agatgatgga | aatttcctat | 3600 |
ttactgacga | agaaaaaaac | caatttatta | caaatgagcc | atcttccgaa | aaatacttca | 3660 |
gacggtttgt | gggcggggat | gagttcataa | acaatacaag | tcgatggtgt | ttatggcttg | 3720 |
acggtgctga | catttcagaa | atacgagcga | tgcctttggt | cttggctagg | ataaaaaaag | 3780 |
tccaagaatt | cagattaaaa | agctcggcca | aaccaactcg | acaaagtgct | tcgacaccaa | 3840 |
tgaagttctt | ttatatatct | cagccggata | cggactatct | gttgatacct | gaaacatcat | 3900 |
ctgaaaacag | acaatttatt | ccaattggtt | ttgttgatag | aaatgtcatt | tcaagtaacg | 3960 |
caacgtatca | tattcctagt | gctgaacctt | tgatatttgg | cctgctttca | tcgaccatgc | 4020 |
acaactgctg | gatgagaaat | gtaggaggaa | ggttagaaag | tcgttataga | tattctgcca | 4080 |
gcctggttta | caacacgttt | ccatggattc | aacccaacga | aaaacaatcg | aaagcgatag | 4140 |
aagaagctgc | atttgcgatt | ttaaaagcta | gaagcaatta | tccaaacgaa | agtttagctg | 4200 |
gtttatacga | cccaaaaaca | atgcctagtg | agcttcttaa | agcacatcaa | aaacttgata | 4260 |
aggctgtgga | ttctgtctat | ggatttaaag | gaccaaacac | agaaattgct | cgaatagctt | 4320 |
ttttgtttga | aacataccaa | aagatgactt | cactcttacc | accagaaaaa | gaaattaaga | 4380 |
aatctaaggg | caaaaattaa | ttaatgtatt | taacattaaa | ccaccctgat | ttatttcgaa | 4440 |
tagttcaaat | gcttccatgt | ggactaatcg | ccttcaatca | tattaaaaaa | ccgacgctag | 4500 |
taataaaaac | ttccaaagag | gccatattaa | ccgccaaaat | taatcgtgaa | tttaaaatat | 4560 |
atctttatca | aaccacatcg | gcttgtgttc | tagtaagtgc | attttttgac | gattctgata | 4620 |
gtccactatt | cattacaaca | ccaattgttc | gagatgacca | acactcctta | gacttgttaa | 4680 |
gatttttaat | caacaatgat | tttacgattt | gcttctttga | tgaactgaac | cgagaatttc | 4740 |
tttccgttaa | cgcaactggt | aatttagtct | ctatctttga | gagcattcac | ttgatgccac | 4800 |
tgccgagccc | agaggaagcc | cacaatgcat | tgaatgaagc | ggaattttgg | ttcagtttac | 4860 |
gctcagctgc | tgatgatgaa | tcatctatcc | aggtttcttt | attggataat | ctatttcctg | 4920 |
acgattttgt | aatttatgac | ctatcctcaa | acaaaaacga | tatgacatca | ttggttagag | 4980 |
PL 208 400 B1
aaactaaacc | aggatactat | NEB caggaagcag | -207-PIN.ST25 atattgcaaa gttactaaca | agagctttta | 5040 | |
gtttggaaag | catttatcag | aatccagtga | aaacaagcga | ttcaaaagag | ttggcagacg | 5100 |
ttgtggtatt | cggccaaaag | gaaattttaa | taattcaagc | taaagatagt | gaaaacaatc | 5160 |
agaaacaagt | tttagaggtt | tcgttagaca | agaaatgcgc | aaagtcttca | aagaaacttt | 5220 |
ctgaagcttt | ggcacaactc | accgacacta | tcttaacaat | atccaataca | ccaatagttg | 5280 |
atgttcgggt | tggtaagaaa | aaatgcactc | tgaactttga | gggaaagcag | cttattggta | 5340 |
tcgtcgttgt | taaagagctt | tttaatgata | tttacgataa | atacagtcaa | aaagtttttg | 5400 |
agcatgtaga | gttgtctaaa | gcacccattg | tcttctttga | ctatccagaa | tttgcaagaa | 5460 |
tgacatttca | ttgtaattct | gaggaattat | tactttatgc | tttgcatagg | atatttagtt | 5520 |
ctgcaataga | aaatggaatg | tataaacgat | tgagatttac | tcaacctatc | ataactgatg | 5580 |
gtcatgacag | ctacttcagg | atacaaaaca | ggccccattc | tgatgaggcc | tatttaattt | 5640 |
gcacagagga | tgaaatgaag | ctctcaaata | agtttaaaga | ctaaatttat | attttcctca | 5700 |
gtatcttaaa | aacaatattc | attaaattgg | aaagcccgca | atgattgttg | cagtatcaat | 5760 |
gcgggcatca | gtatccagct | cttgcaatac | acggaagtat | caagaagcga | atcaggattc | 5820 |
taaccatacc | tttttaattg | caacaatcta | atttccataa | catgtgtagc | tacatcgaaa | 5880 |
aaaagacctc | gaagaggttg | caagagcgtc | cagctcgcgg | catcaaaaga | ccctagtctt | 5940 |
ttgacaaggg | ggagccaaaa | aactgaggtg | gaggagcttg | ccgacgaagc | caggaagccc | 6000 |
cagcgtccgg 6010 <210> 2 <211> 919 <212> PRT <213> Methylophilus methylotrophus
<400> 2 Met Ala Leu 1 | Ser | Trp 5 | Asn | Glu | Ile | Arg | Arg 10 | Lys | Ala | Ile | Glu | Phe 15 | Ser |
Lys Arg Trp | Glu | Asp | Ala | Ser | Asp | Glu | Asn | Ser | Gln | Ala | Lys | Pro | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||
Leu ile Asp | Phe | Phe | Glu | Val | Phe | Gly | Ile | Thr | Asn | Lys | Arg | Val | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||
Thr Phe Glu | His | Ala | Val | Lys | Lys | Phe | Ala | Lys | Ala | Hi s | Lys | Glu | Gln |
50 | 55 | 60 | |||||||||||
Ser Arg Gly | Phe | val | Asp | Leu | Phe | T rp | Pro | Gly | Ile | Leu | Leu | Ile | Glu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||
Met Lys ser | Arg | Gly | Lys | Asp | Leu | Asp | Lys | Ala | Tyr | Asp | Gln | Al a | Leu |
85 | 90 | 95 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp | Tyr Phe | Ser 100 | Gly | Ile Ala Glu Arg Asp Leu 105 | Pro | Arg | Tyr 110 | val | Leu | ||||||
val | cys | Asp | Phe | Gin | Arg | Phe | Arg | Leu | Thr | Asp | Leu | Ile | Thr | Lys | Glu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | val | Glu | Phe | Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Tyr | Gin | Asn | val | Arg | ser | phe |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Phe | Ile | Ala | Gly | Tyr | Gin | Thr | Gin | val | Ile | Lys | Pro | Gin | Asp | Pro |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ile | Asn | Ile | Lys | Ala | Ala | Glu | Arg | Met | Gly | Lys | Leu | Hi s | Asp | Thr | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Lys | Leu | val | Gly | Tyr | Glu | Gly | His | Ala | Leu | Glu | Leu | Tyr | Leu | Val | Arg |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Leu | Leu | Phe | cys | Leu | Phe | Ala | Glu | Asp | Thr | Thr | Ile | Phe | Glu | Lys | Ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Leu | Phe | Gin | Glu | Tyr | Ile | Glu | Thr | Lys | Thr | Leu | Glu | ASP | Gly | Ser | Asp |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Ala | His | Hi s | ile | Asn | Thr | Leu | phe | Tyr | val | Leu | Asn | Thr | Pro | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Lys | Arg | Leu | Lys | Asn | Leu | Asp | Glu | His | Leu | Ala | Ala | Phe | Pro | Tyr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ile | Asn | Gly | Lys | Leu | Phe | Glu | Glu | Pro | Leu | Pro | Pro | Ala | Gin | Phe | Asp |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Lys | Al a | Met | Arg | Glu | Al a | Leu | Leu | Asp | Leu | cys | Ser | Leu | Asp | Trp | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Arg | Ile | Ser | Pro | Al a | Ile | Phe | Gly | Ser | Leu | Phe | Gin | Ser | Ile | Met | Asp |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ala | Lys | Lys | Arg | Arg | Asn | Leu | Gly | Ala | His | Tyr | Thr | Ser | Glu | Ala | Asn |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ile | Leu | Lys | Leu | Ile | Lys | Pro | Leu | Phe | Leu | Asp | Glu | Leu | Trp | Val | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Phe | Glu | Lys | val | Lys | Asn | Asn | Lys | Asn | Lys | Leu | Leu | Al a | Phe | His | Lys |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Lys | Leu | Arg | Gly | Leu | Thr | Phe | Phe | ASP | Pro | Al a | cys | Gly | cys | Gly | Asn |
355 | 360 | 365 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Phe Leu 370 | val | ile | Thr Tyr Arg Glu 375 | Leu | Arg Leu | Leu 380 | Glu | Ile | Glu | Val | |||||
Leu | Arg | Gly | Leu | His | Arg | Gly | Gly | Gin | Gin | val | Leu | Asp | Ile | Glu | His |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Ile | Gin | ile | Asn | val | Asp | Gin | Phe | Phe | Gly | ile | Glu | Ile | Glu | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Phe | Pro | Ala | Gin | Ile | Ala | Gin | Val | Ala | Leu | Trp | Leu | Thr | Asp | His | Gin |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Met | Asn | Met | Lys | Ile | Ser | Asp | Glu | Phe | Gly | Asn | Tyr | Phe | Ala | Arg | ile |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Pro | Leu | Lys | Ser | Thr | Pro | Hi s | Ile | Leu | Asn | Al a | Asn | Ala | Leu | Gin | Ile |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Asp | Trp | Asn | Asp | Val | Leu | Glu | Ala | Lys | Lys | cys | cys | Phe | Ile | Leu | Gly |
455 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Asn | Pro | pro | Phe | val | Gly | Lys | ser | Lys | Gin | Thr | pro | Gly | Gin | Lys | Al a |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Asp | Leu | Leu | ser | val | Phe | Gly | Asn | Leu | Lys | Ser | Ala | Ser | Asp | Leu | Asp |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Leu | val | Ala | Ala | Trp | Tyr | pro | Lys | Ala | Ala | His | Tyr | ile | Gin | Thr | Asn |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Ala | Asn | Ile | Arg | cys | Ala | Phe | Val | Ser | Thr | Asn | Ser | ile | Thr | Gin | Gly |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Glu | Gin | Val | Ser | Leu | Leu | Trp | Pro | Leu | Leu | Leu | Ser | Leu | Gly | Ile | Lys |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ile | Asn | Phe | Al a | His | Arg | Thr | Phe | Ser | Trp | Thr | Asn | Glu | Ala | Ser | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Val | Ala | Ala | val | His | Cys | Val | Ile | Ile | Gly | Phe | Gly | Leu | Lys | Asp | Ser |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asp | Glu | Lys | ile | Ile | Tyr | Glu | Tyr | Glu | Ser | Ile | Asn | Gly | Glu | Pro | Leu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Ala | Ile | Lys | Al a | Lys | Asn | Ile | Asn | Pro | Tyr | Leu | Arg | Asp | Gly | Val | Asp |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
val | ile | Ala | cys | Lys | Arg | Gin | Gin | Pro | Ile | ser | Lys | Leu | pro | Ser | Met |
625 | 630 | 635 | 640 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Arg Tyr Gly Asn | Lys 645 | Pro | Thr | Asp Asp | Gly Asn 650 | Phe | Leu | Phe | Thr 655 | Asp | |||||
Glu | Glu | Lys | Asn | Gin | Phe | ile | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | Ser | Glu | Lys | Tyr |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Phe | Arg | Arg | Phe | Val | Gly | Gly | Asp | Glu | Phe | ile | Asn | Asn | Thr | Ser | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Trp | cys | Leu | Trp | Leu | Asp | Gly | Ala | Asp | Ile | Ser | Glu | Ile | Arg | Ala | Met |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Pro | Leu | Val | Leu | Ala | Arg | ile | Lys | Lys | Val | Gin | Glu | Phe | Arg | Leu | Lys |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
ser | Ser | Ala | Lys | pro | Thr | Arg | Gin | Ser | Al a | Ser | Thr | Pro | Met | Lys | Phe |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Phe | Tyr | Ile | Ser | Gin | Pro | Asp | Thr | Asp | Tyr | Leu | Leu | Ile | Pro | Glu | Thr |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Ser | Ser | Glu | Asn | Arg | Gin | Phe | Ile | Pro | ile | Gly | Phe | val | Asp | Arg | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
val | Ile | Ser | ser | Asn | Ala | Thr | Tyr | His | ile | Pro | ser | Ala | Glu | Pro | Leu |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ile | Phe | Gly | Leu | Leu | Ser | Ser | Thr | Met | His | Asn | Cys | Trp | Met | Arg | Asn |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
val | Gly | Gly | Arg | Leu | Glu | Ser | Arg | Tyr | Arg | Tyr | Ser | Ala | Ser | Leu | val |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Tyr | Asn | Thr | Phe | Pro | Trp | Ile | Gin | Pro | Asn | Glu | Lys | Gin | Ser | Lys | Ala |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ile | Glu | Glu | Ala | Al a | Phe | Ala | ile | Leu | Lys | Ala | Arg | Ser | Asn | Tyr | Pro |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Asn | Glu | Ser | Leu | Al a | Gly | Leu | Tyr | Asp | Pro | Lys | Thr | Met | Pro | Ser | Glu |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Leu | Leu | Lys | Ala | His | Gin | Lys | Leu | Asp | Lys | Ala | val | Asp | Ser | Val | Tyr |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Gly | Phe | Lys | Gly | Pro | Asn | Thr | Glu | Ile | Ala | Arg | Ile | Ala | Phe | Leu | Phe |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Glu | Thr | Tyr | Gin | Lys | Met | Thr | Ser | Leu | Leu | Pro | Pro | Glu | Lys | Glu | Ile |
900 | 905 | 910 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Lys Lys Ser Lys Gly Lys Asn 915 <210> 3 <211> 932 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|28373198|ref|NP_783835.1
<400> 3 Met Pro Thr 1 | Arg | Gin 5 | Gin | Al a | Al a | Arg | Glu 10 | Phe | val | Lys | Thr | τ rp 15 | Ser |
Ser Asp Lys | Lys | Gly | Arg | Glu | Asp | Ala | Asp | Arg | Gin | Thr | Phe | Trp | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||
Asp Leu Leu | Gin | Arg | val | Tyr | Gly | Ile | Asp | Asn | Tyr | Tyr | Asp | Tyr | Ile |
35 | 40 | 45 | |||||||||||
Thr Tyr Glu | Lys | Asp | val | Gin | val | Lys | Al a | Asp | Gly | Lys | Val | Thr | Thr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||
Arg Arg ile | Asp | Gly | Tyr | ile | Pro | Ser | Thr | Lys | Ile | Met | val | Glu | Met |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||
Lys Gly Lys | Asn | Ile | Lys | Asp | Leu | Ser | Lys | Pro | Ile | Thr | Gin | Ser | Gly |
85 | 90 | 95 | |||||||||||
Gly Asp Glu | Leu | Thr | Pro | Phe | Glu | Gin | Al a | Lys | Arg | Tyr | Ala | Asn | Phe |
100 | 105 | 110 | |||||||||||
Leu Pro Asn | Ser | Glu | Gin | Pro | Arg | Trp | Ile | Leu | val | Ser | Asn | Phe | Asn |
115 | 120 | 125 | |||||||||||
Glu ile Asp | ile | His | Asp | Met | Glu | Arg | Pro | Leu | Asp | Glu | Pro | Lys | val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||
ile Lys Leu | Glu | Asp | Leu | Pro | Lys | Lys | val | Lys | Ser | Leu | Glu | Phe | Met |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||
Val Asp Ala | Asn | Gin | Gin | Gin | val | ile | Asp | Glu | Lys | Gin | Leu | Ser | val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||
Asp Ala Gly | Asn | Leu | val | Ala | Lys | ile | Tyr | Asn | Glu | Leu | Thr | Asn | Ala |
180 | 185 | 190 | |||||||||||
Tyr Ala Ala | Gly | Arg | Gly | Ile | Asp | Val | Asn | Glu | Pro | Arg | ile | Gin | Arg |
195 | 200 | 205 | |||||||||||
Ser Leu Asn | Met | Leu | ile | Val | Arg | Leu | Val | Phe | Leu | Leu | Tyr | Ala | Asp |
210 | 215 | 220 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp 225 | Ser Asn | Leu Phe Gly 230 | Lys Glu Asp Ile | Phe Gin Ala 235 | Phe | Ile | Glu 240 | ||||||||
Arg | Arg | Glu | Pro | Arg | Asp | Ile | Arg | Arg | Asp | Leu | Ser | Glu | Leu | Phe | Lys |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Val | Leu | Asp | Gin | Pro | Glu | Glu | Gin | Arg | Asp | Pro | Tyr | Leu | Asp | Asp | Glu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Asn | Gin | Phe | Ala | Tyr | Val | Asn | Gly | Gly | Met | Phe | Ser | Asp | Glu | Asn |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
val | Ile | Ile | Pro | Gin | Phe | Thr | Asp | Glu | Leu | Lys | Arg | Leu | Ile | val | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Asp | Ala | Gly | Arg | Gly | Phe | Asp | Trp | Ser | Gly | Ile | Ser | Pro | Thr | Ile | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gly | Ala | val | Phe | Glu | Ser | Thr | Leu | Asn | Pro | Glu | Thr | Arg | Arg | Ser | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gly | Met | His | Tyr | Thr | Ser | Ile | Glu | Asn | Ile | Hi s | Lys | Val | Ile | Asp | Pro |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Leu | Phe | Leu | Asn | Asp | Leu | His | Asp | Glu | Phe | Asp | Lys | Ile | Gin | Asn | Met |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | Asn | Arg | Arg | Gin | Arg | Val | Thr | Arg | Ala | Lys | Ala | Phe | Arg | Asp | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Gly | Lys | Leu | Lys | Phe | Phe | Asp | Pro | Ala | Cys | Gly | Ser | Gly | Asn | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Thr | Glu | Thr | Tyr | Leu | Ser | Leu | Arg | Lys | Met | Glu | Asn | Glu | Cys | Leu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Arg | Ile | Ile | Val | Gly | Asn | Gin | Gly | Ala | Leu | Al a | Leu | Thr | Asp | Glu | Ser |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Pro | Lys | Val | Lys | Ile | Gin | Asn | Phe | Tyr | Gly | ile | Glu | Ile | Asn | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Phe | Ala | Val | Ser | Val | Al a | Arg | Thr | Ala | Met | Trp | ile | Ala | Glu | Ser | Gin |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Met | T rp | Glu | Gin | Thr | Lys | Asp | Ile | Thr | Phe | Ala | Asn | Lys | Asp | Phe | Leu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | Leu | Asp | Ser | Asn | Asp | Ser | Ile | Tyr | Glu | Gly | Asn | Ala | Leu | Arg | Met |
485 | 490 | 495 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp Trp Asn Asp ile | val | Lys | Pro Tyr Glu 505 | Leu | Asp | Tyr | Ile 510 | Met | Gly | ||||||
500 | |||||||||||||||
Asn | Pro | pro | Phe | val | Gly | Tyr | Ser | Leu | Gln | Thr | Lys | Glu | Gln | Lys | Gln |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Asp | Ile | Lys | Gln | Glu | Phe | Phe | Lys | Tyr | Thr | Asp | Lys | Tyr | Gly | Lys | Phe |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Asp | Tyr | Val | Ser | Gly | T rp | Tyr | Ile | Lys | Gly | Ala | Lys | Tyr | Ile | Gl n | Asn |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Thr | Ile | Lys | Val | Gly | Phe | val | Ser | Thr | Asp | Ser | ile | Ile | Gln | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Glu | Gln | Ala | Pro | Glu | Ile | Trp | Lys | val | Leu | Phe | Asn | Asp | Phe | Hi s | Ile |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Phe | Ile | Asn | Tyr | Gly | Tyr | Arg | Ser | Phe | Glu | Trp | Asn | Asn | Glu | Ala | Ala |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Asn | Lys | Ala | Lys | val | Asp | Val | Val | Ile | val | Gly | Phe | Ser | Thr | Lys | Glu |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Asp | Lys | Asn | Pro | Thr | Ile | Tyr | Asp | Glu | Gln | Lys | Ile | Ile | Ser | Ala | Lys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
His | Ile | Asn | Gln | Tyr | Met | Tyr | Asp | Ser | Asp | Asn | Ile | Phe | Ile | Asp | Thr |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Thr | Arg | Lys | Tyr | Ile | Glu | Ala | Met | Pro | Lys | Met | Lys | Thr | Gly | Asn | Arg |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
pro | Ala | Asp | Gly | Gly | Al a | Leu | Ile | Leu | Ser | Pro | Lys | Glu | Ala | Lys | Glu |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Leu | val | Asn | Glu | Glu | pro | Gln | Ser | Lys | Gln | Phe | Ile | Lys | Lys | Leu | Thr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Gly | ser | Lys | Glu | Phe | ile | Thr | Gly | Lys | Tyr | Arg | Tyr | cys | Leu | Trp | Leu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
val | Asn | val | Thr | Pro | Lys | Gln | Leu | Arg | ser | Met | Pro | Leu | val | Leu | Lys |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | val | Glu | Gln | Cys | Lys | Glu | Asn | Arg | Leu | ser | Gly | Ala | Pro | ASp | Arg |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gln | Lys | Leu | Ala | Ala | Thr | Pro | His | Leu | Phe | Arg | Glu | Gln | Met | Asn | Pro |
755 | 760 | 765 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp Asn Tyr | Met | ile val | Pro Leu 775 | Val | Thr | Gly | cys 780 | Arg | Arg | Lys | Tyr | ||||
770 | |||||||||||||||
Val | Pro | Phe | Gly | Tyr | Leu | Gly | Asn | Asp | ile | ile | Pro | Thr | Asn | Leu | Ala |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Thr | Ile | ile | Pro | Glu | Al a | Asp | His | Tyr | Ala | Phe | Gly | val | Leu | Glu | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ile | Val | Hi s | Met | Al a | Trp | Met | Arg | val | Val | Ala | Gly | Arg | Lys | Gly | Thr |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ser | Tyr | Arg | Tyr | Ser | Lys | Asn | Leu | val | Tyr | Thr | Asn | Phe | Pro | Trp | Pro |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
val | val | ASP | ile | Asn | Gin | Lys | Glu | Lys | ile | Thr | Ile | Thr | Ala | Gin | Asp |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Ile | Leu | Asn | Ala | Arg | Asn | Leu | Tyr | Pro | Asp | Ser | Ser | Leu | Ala | Asp | Leu |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Tyr | Asp | Pro | Leu | Thr | Met | Pro | Ile | Glu | Leu | Arg | Lys | Ala | His | Glu | Ala |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Asn | Asp | Lys | Ala | Val | Leu | Lys | Al a | Tyr | Gly | Leu | Lys | Pro | Ser | Ala | Thr |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Glu | pro | Glu | ile | val | Gin | Hi s | Leu | Phe | Lys | Met | Tyr | Glu | Lys | Leu | Thr |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Lys | Lys | Asp | T rp |
930 <210> 4 <211> 354 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> | GenBank | Nr gi|27450519|gb|AA014619.1|AF465251_62 |
<400> | 4 | |
Val Leu | Phe Asn | Asp Phe His Ile Phe Ile Asn Tyr Gly Tyr Arg Ser |
1 | 5 10 15 | |
Phe Glu | Trp Asn | Asn Glu Ala Ala Asn Lys Ala Lys val Asp val val |
20 | 25 30 | |
Ile Val | Gly Phe | Ser Thr Lys Glu Asp Lys Asn Pro Thr Ile Tyr Asp |
35 | 40 45 |
PL 208 400 B1
NEB-207-PIN.ST25
Ser Ser Asn Ile Ser His Cys | Lys Asn Ile | Asn | Gly 60 | Tyr | Leu | Phe | Asp | ||||||||
50 | 55 | ||||||||||||||
Gly | Asn | Asn | ile | Phe | Val | Thr | Asn | Arg | Pro | Ala | Pro | Leu | Ser | Asn | val |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
pro | Arg | Met | His | Asn | Gly | cys | Lys | Leu | Leu | ASP | Gly | Gly | Phe | Tyr | Thr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Thr | Ser | Gin | Glu | Arg | Lys | Glu | Ala | Ile | Ser | Lys | Asp | Pro | Tyr | Al a |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asp | Lys | Phe | ile | Arg | Pro | Tyr | Leu | Gly | Ala | Lys | Asn | Phe | ile | Hi s | Gly |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Thr | Ala | Arg | Tyr | cys | ile | Trp | Leu | Lys | Asp | Al a | Asn | pro | Lys | Asp | Ile |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
His | Gin | Ser | Pro | Phe | ile | Leu | Asp | Arg | Ile | Asn | Lys | Val | Al a | Glu | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Arg | Ser | Gin | Gin | Lys | Ser | Lys | Asp | Thr | Gin | Lys | Tyr | Ala | Lys | Arg | Pro |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Met | Leu | Pro | Thr | Arg | Leu | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Hi s | Asp | Glu | Hi s | Thr | Asp |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Met | Leu | Ile | val | Pro | Al a | Thr | ser | ser | Gin | Arg | Arg | Glu | Tyr | Leu | Pro |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ile | Gly | Tyr | val | Ser | Glu | Lys | Asn | ile | val | Ser | Tyr | Ser | Leu | Met | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ile | Pro | Asn | Ala | Ser | Asn | Phe | Asn | Phe | Gly | Ile | Leu | Glu | Ser | Lys | Val |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
His | Tyr | Ile | Trp | Leu | Lys | Asn | Phe | cys | Gly | Arg | Leu | Lys | Ser | ASP | Tyr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Arg | Tyr | Ser | Asn | Thr | Ile | Ile | Tyr | Asn | Asn | Phe | Pro | Trp | Pro | Thr | val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gly | Asp | Lys | Gin | Glu | Gin | Asn | Ile | Ser | Glu | Thr | Ala | Gin | Gly | Ile | Leu |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asn | Thr | Arg | Lys | Leu | Tyr | Pro | Asp | Ser | ser | Leu | Ala | ASP | Leu | Tyr | Asp |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Pro | Leu | Thr | Met | Pro | val | Glu | Leu | Arg | Lys | Ala | Hi s | Glu | Ala | Asn | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 |
PL 208 400 B1
NEB-207-PIN.ST25 | ||||||||||||
Lys | Al a | val | Leu | Lys | Ala | Tyr | Gly | Leu ser pro Lys | Ala | Thr | Glu | Gin |
325 | 330 | 335 | ||||||||||
Glu | Ile | Val | Glu | His | Leu | Phe | Lys | Met Tyr Glu Lys | Leu | Thr | Lys | Gly |
340 345 350
Glu Arg <210> 5 <211> 919 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> M. methylotrophus aminokwas <400> 5
Met Ala Leu ser Trp | Asn | Glu | Ile Arg Arg Lys Ala 10 | Ile | Glu | Phe 15 | Ser | ||||||||
1 | 5 | ||||||||||||||
Lys | Arg | Trp | Glu | ASp | Ala | ser | Asp | Glu | Asn | ser | Gin | Ala | Lys | Pro | Phe |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Ile | Asp | Phe | Phe | Glu | Val | Phe | Gly | Ile | Thr | Asn | Lys | Arg | Val | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Thr | Phe | Glu | Hi s | Al a | Val | Lys | Lys | Phe | Ala | Lys | Ala | Hi s | Lys | Glu | Gin |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ser | Arg | Gly | Phe | val | Asp | Leu | Phe | Trp | Pro | Gly | Ile | Leu | Leu | Ile | Glu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Met | Lys | Ser | Arg | Gly | Lys | Asp | Leu | Asp | Lys | Ala | Tyr | Asp | Gin | Ala | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asp | Tyr | Phe | Ser | Gly | ile | Ala | Glu | Arg | Asp | Leu | Pro | Arg | Tyr | val | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
val | cys | Asp | Phe | Gin | Arg | Phe | Arg | Leu | Thr | Asp | Leu | Ile | Thr | Lys | Glu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Val | Glu | Phe | Leu | Leu | Lys | Asp | Leu | Tyr | Gin | Asn | val | Arg | Ser | Phe |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Phe | Ile | Ala | Gly | Tyr | Gin | Thr | Gin | Val | Ile | Lys | Pro | Gin | Asp | Pro |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
ile | Asn | ile | Lys | Al a | Ala | Glu | Arg | Met | Gly | Lys | Leu | His | Asp | Thr | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Lys | Leu | val | Gly | Tyr | Glu | Gly | His | Ala | Leu | Glu | Leu | Tyr | Leu | Val | Arg |
180 | 185 | 190 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Leu | Leu Phe Cys 195 | Leu | Phe Ala Glu 200 | Asp Thr Thr | ile | Phe 205 | Glu | Lys | Ser | ||||||
Leu | Phe | Gin | Glu | Tyr | Ile | Glu | Thr | Lys | Thr | Leu | Glu | Asp | Gly | Ser | Asp |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Ala | Hi s | Hi s | ile | Asn | Thr | Leu | Phe | Tyr | val | Leu | Asn | Thr | Pro | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Lys | Arg | Leu | Lys | Asn | Leu | Asp | Glu | His | Leu | Al a | Ala | Phe | pro | Tyr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
ile | Asn | Gly | Lys | Leu | Phe | Glu | Glu | Pro | Leu | Pro | Pro | Ala | Gin | Phe | Asp |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Lys | Ala | Met | Arg | Glu | Ala | Leu | Leu | Asp | Leu | cys | ser | Leu | ASp | Trp | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Arg | Ile | Ser | Pro | Ala | Ile | Phe | Gly | Ser | Leu | Phe | Gin | ser | Ile | Met | Asp |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ala | Lys | Lys | Arg | Arg | Asn | Leu | Gly | Al a | His | Tyr | Thr | Ser | Glu | Ala | Asn |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ile | Leu | Lys | Leu | Ile | Lys | Pro | Leu | Phe | Leu | Asp | Glu | Leu | Trp | val | Glu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Phe | Glu | Lys | val | Lys | Asn | Asn | Lys | Asn | Lys | Leu | Leu | Ala | Phe | His | Lys |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Lys | Leu | Arg | Gly | Leu | Thr | Phe | Phe | Asp | Pro | Ala | cys | Gly | Cys | Gly | Asn |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Phe | Leu | Val | Ile | Thr | Tyr | Arg | Glu | Leu | Arg | Leu | Leu | Glu | Ile | Glu | val |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Arg | Gly | Leu | His | Arg | Gly | Gly | Gin | Gin | Val | Leu | Asp | Ile | Glu | His |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Ile | Gin | Ile | Asn | val | Asp | Gin | Phe | Phe | Gly | Ile | Glu | Ile | Glu | Glu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Phe | Pro | Ala | Gin | Ile | Al a | Gin | Val | Ala | Leu | Trp | Leu | Thr | Asp | Hi s | Gin |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Met | Asn | Met | Lys | Ile | ser | Asp | Glu | Phe | Gly | Asn | Tyr | Phe | Al a | Arg | Ile |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Pro | Leu | Lys | Ser | Thr | Pro | Hi s | ile | Leu | Asn | Ala | Asn | Ala | Leu | Gin | Ile |
450 455 460
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
ASP 465 | Trp Asn | Asp val | Leu Glu 470 | Ala | Lys | Lys Cys Cys Phe ile Leu Gly | |||||||||
475 | 480 | ||||||||||||||
Asn | Pro | Pro | Phe | val | Gly | Lys | Ser | Lys | Gin | Thr | Pro | Gly | Gin | Lys | Ala |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Asp | Leu | Leu | Ser | Val | Phe | Gly | Asn | Leu | Lys | Ser | Ala | Ser | Asp | Leu | Asp |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Leu | val | Ala | Ala | Trp | Tyr | Pro | Lys | Al a | Ala | Hi s | Tyr | Ile | Gl n | Thr | Asn |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Al a | Asn | ile | Arg | cys | Al a | Phe | val | Ser | Thr | Asn | Ser | ile | Thr | Gin | Gly |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Glu | Gin | Val | Ser | Leu | Leu | T rp | Pro | Leu | Leu | Leu | Ser | Leu | Gly | Ile | Lys |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
ile | Asn | Phe | Ala | His | Arg | Thr | Phe | ser | Trp | Thr | Asn | Glu | Al a | Ser | Gly |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
val | Ala | Ala | val | His | cys | val | ile | Ile | Gly | Phe | Gly | Leu | Lys | ASP | Ser |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Asp | Glu | Lys | Ile | Ile | Tyr | Glu | Tyr | Glu | Ser | ile | Asn | Gly | Glu | Pro | Leu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Ala | Ile | Lys | Ala | Lys | Asn | ile | Asn | Pro | Tyr | Leu | Arg | Asp | Gly | val | Asp |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
val | Ile | Al a | cys | Lys | Arg | Gin | Gin | pro | ile | Ser | Lys | Leu | Pro | Ser | Met |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Arg | Tyr | Gly | Asn | Lys | Pro | Thr | Asp | Asp | Gly | Asn | phe | Leu | Phe | Thr | ASP |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Glu | Glu | Lys | Asn | Gin | Phe | Ile | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | Ser | Glu | Lys | Tyr |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Phe | Arg | Arg | Phe | Val | Gly | Gly | Asp | Glu | Phe | Ile | Asn | Asn | Thr | Ser | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Trp | cys | Leu | Trp | Leu | Asp | Gly | Ala | Asp | Ile | Ser | Glu | Ile | Arg | Ala | Met |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Pro | Leu | val | Leu | Ala | Arg | Ile | Lys | Lys | val | Gin | Glu | Phe | Arg | Leu | Lys |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Ser | Ser | Ala | Lys | Pro | Thr | Arg | Gin | Ser | Ala | Ser | Thr | Pro | Met | Lys | Phe |
725 | 730 | 735 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Phe Tyr | ile Ser 740 | Gin | Pro | Asp | Thr Asp 745 | Tyr | Leu | Leu | Ile | Pro 750 | Glu | Thr | |||
Ser | Ser | Glu | Asn | Arg | Gin | Phe | Ile | pro | ile | Gly | Phe | val | ASp | Arg | Asn |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
val | ile | ser | Ser | Asn | Ala | Thr | Tyr | His | ile | Pro | Ser | Ala | Glu | Pro | Leu |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ile | Phe | Gly | Leu | Leu | Ser | Ser | Thr | Met | His | Asn | cys | Trp | Met | Arg | Asn |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
val | Gly | Gly | Arg | Leu | Glu | Ser | Arg | Tyr | Arg | Tyr | Ser | Al a | Ser | Leu | val |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Tyr | Asn | Thr | Phe | Pro | Trp | ile | Gin | Pro | Asn | Glu | Lys | Gin | Ser | Lys | Ala |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ile | Glu | Glu | Ala | Al a | Phe | Ala | Ile | Leu | Lys | Ala | Arg | Ser | Asn | Tyr | Pro |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Asn | Glu | Ser | Leu | Ala | Gly | Leu | Tyr | Asp | Pro | Lys | Thr | Met | Pro | Ser | Glu |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Leu | Leu | Lys | Ala | His | Gin | Lys | Leu | Asp | Lys | Ala | val | Asp | ser | val | Tyr |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Gly | Phe | Lys | Gly | Pro | Asn | Thr | Glu | ile | Ala | Arg | Ile | Ala | Phe | Leu | Phe |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Glu | Thr | Tyr | Gin | Lys | Met | Thr | Ser | Leu | Leu | Pro | Pro | Glu | Lys | Glu | Ile |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Lys | Lys | ser | Lys | Gly | Lys | Asn |
915 <210> 6 <211> 936 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|15794682jref|ΝΡ_284504.1 <400> 6
Met 1 | Lys | Thr | Leu | Leu 5 | Gin | Leu | Gin | Thr | Ala 10 | Ala | Gin | Asn | Phe | Ala 15 | Ala |
Tyr | Tyr | Lys | Asp | Gin | Thr | Asp | Glu | Arg | Arg | Glu | Lys | Asp | Thr | Phe | Asn |
25 30
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Glu Phe Phe | Ala | ile | Phe Gly ile 40 | Asp Arg | Lys | Asn | Val 45 | Al a | Hi s | Phe | |||||
35 | |||||||||||||||
Glu | Tyr | Pro | val | Lys | Asp | Pro | Al a | Asp | Asn | Thr | Gln | Phe | Val | Asp | ile |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Phe | Trp | Glu | Gly | ile | Phe | Leu | Ala | Glu | Hi s | Lys | Ser | Al a | Asn | Lys | Asn |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Thr | Lys | Ala | Lys | Glu | Gln | Ala | Glu | Arg | Tyr | Leu | Gln | Glu | Ile | Gly |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Arg | Thr | Lys | Pro | ser | Ala | Leu | Pro | Glu | Tyr | Tyr | Ala | Val | Ser | Asp | Phe |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ala | Hi s | Phe | Hi s | Leu | Tyr | Arg | Arg | Val | Pro | Glu | Glu | Gly | Ala | Glu | Asn |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gln | Trp | Gln | Phe | pro | Leu | Glu | Glu | Leu | Pro | Glu | Tyr | Ile | Thr | Arg | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
val | Phe | Asp | Phe | Met | Phe | Gly | Ile | Glu | Ala | Lys | val | Arg | Gln | Ile | Gln |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Glu | Glu | Ala | Asn | ile | Gln | Ala | Al a | Ala | Thr | ile | Gly | Arg | Leu | His | Asp |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ala | Leu | Lys | Glu | Glu | Gly | Ile | Tyr | Glu | Glu | Hi s | Glu | Leu | Arg | Leu | Phe |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ile | Thr | Arg | Leu | Leu | Phe | Leu | Phe | Phe | Ala | Asp | Asp | Ser | Ala | val | Phe |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | Arg | Asn | Tyr | Leu | Phe | Gln | Asp | Phe | Leu | Glu | Asn | Cys | Lys | Glu | Ala |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asp | Thr | Leu | Gly | Asp | Lys | Leu | Asn | Gln | Leu | Phe | Glu | Phe | Leu | Asn | Thr |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Pro | Asp | Gln | Lys | Arg | Ser | Lys | Thr | Gln | Ser | Glu | Lys | Phe | Lys | Gly | Phe |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Glu | Tyr | Val | Asn | Gly | Gly | Leu | Phe | Lys | Glu | Arg | Leu | Arg | Thr | Phe | Asp |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Thr | Ala | Lys | Gln | Hi s | Arg | Al a | Leu | Ile | Asp | cys | Gly | Asn | Phe | Asp |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Trp | Arg | Asn | ile | Ser | Pro | Glu | ile | Phe | Gly | Thr | Leu | Phe | Gln | Ser | val |
290 | 295 | 300 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Met | Asp | Ala | Gin | Glu | Arg | Arg | Glu | Ala | Gly | Ala | His | Tyr | Thr | Glu | Ala |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ala | Asn | Ile | Asp | Lys | val | ile | Asn | Gly | Leu | Phe | Leu | Glu | Asn | Leu | Arg |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Glu | Phe | Glu | Ala | Val | Lys | Ala | Leu | Lys | Arg | Asp | Lys | Ala | Lys | Lys |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Leu | Ala | Ala | Phe | Tyr | Gin | Lys | Ile | Gin | Asn | Leu | Gin | Phe | Leu | Asp | Pro |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Al a | cys | Gly | cys | Gly | Asn | Phe | Leu | ile | val | Al a | Tyr | Asp | Arg | ile | Arg |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ala | Leu | Glu | Asp | Asp | Ile | Ile | Ala | Glu | Ala | Leu | Lys | Asp | Lys | Ala | Asp |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Gly | Leu | Phe | Asp | Ser | Pro | Ser | val | Gin | cys | Arg | Leu | Lys | Gin | Phe | Hi s |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Gly | Ile | Glu | ile | Asp | Glu | Phe | Ala | val | Leu | ile | Ala | Arg | Thr | Ala | Met |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Trp | Leu | Lys | Asn | Hi s | Gin | cys | Asn | Ile | Arg | Thr | Gin | ile | Arg | Phe | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gly | Glu | Val | Ala | cys | Hi s | Thr | Leu | Pro | Leu | Glu | Asp | Ala | Ala | Glu | Ile |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ile | His | Ala | Asn | Ser | Leu | Arg | Thr | Pro | Trp | Gin | Ala | Ala | Asp | Tyr | ile |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Phe | Gly | Asn | Pro | Pro | Phe | Ile | Gly | Ser | Thr | Tyr | Gin | Thr | Lys | Glu | Gin |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Lys | Asn | Asp | Leu | Glu | Ser | Ile | Cys | Gly | His | ile | Lys | Gly | Tyr | Gly | Leu |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Leu | Asp | Tyr | val | cys | Asn | Trp | Tyr | val | Lys | Ala | Ala | Gly | Ile | Met | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gin | Hi s | Pro | Gin | val | Gin | Thr | Ala | Phe | Val | Ser | Thr | Asn | Ser | ile | Cys |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gin | Gly | Gin | Gin | Val | Glu | Ile | Leu | Trp | Gly | Ser | Leu | Leu | Asn | Gin | Gly |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ile | Glu | ile | His | Phe | Al a | Hi s | Arg | Thr | phe | Gin | Trp | Thr | Ser | Gin | Ala |
565 | 570 | 575 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Ala | Gly | Lys | Ala 580 | Ala | val | Hi s | cys |
Pro | Pro | Met 595 | Pro | Ser | Glu | Lys | Thr 600 |
Gly | Glu 610 | Pro | Glu | Lys | Hi s | Al a 615 | val |
Asp 625 | Ala | pro | Asp | Leu | ile 630 | Ile | Ala |
Glu | Pro | Asp | Met | val 645 | Asn | Gly | Ser |
Ile | Leu | Ser | Thr 660 | Ala | Glu | Lys | Asp |
Ala | Glu | Gin 675 | Tyr | Ile | Arg | Pro | Phe 680 |
Gly | Lys 690 | Thr | Arg | Trp | cys | Leu 695 | Trp |
Arg 705 | Asn | Hi s | Asp | Leu | Lys 710 | Gin | Met |
Ala | val | Lys | Thr | Met 725 | Arg | Glu | Al a |
Asp | Ala | Ala | Thr 740 | Pro | Trp | Leu | Phe |
Gly | Asn | Tyr 755 | Leu | ile | ile | Pro | ser 760 |
Ile | Pro 770 | Ile | Gly | Tyr | Leu | Ser 775 | Phe |
Phe 785 | Ile | Leu | Pro | Asn | Ala 790 | Thr | Leu |
Thr | Met | His | Asn | Ala 805 | Phe | Met | Arg |
Asp | Tyr | Arg | Tyr 820 | ser | Asn | Thr | val |
Glu | Ser | Cys | Arg | Leu | Pro | Ser | Glu |
835 840
Ile | Val | Gly | Phe | Arg 590 | Gin | Lys |
Tyr | Asp | Tyr | Pro 605 | Asp | Ile | Lys |
Asn | Ile | Asn 620 | pro | Tyr | Leu | ile |
Arg | Ser 635 | Arg | Pro | ile | Hi s | cys 640 |
Pro 650 | Thr | Glu | Gly | Gly | Asn 655 | Leu |
Leu | Ile | Ala | Ala | Glu 670 | Pro | Leu |
Gly | Ala | Asp | Glu 685 | Phe | Leu | Asn |
Hi s | Gly | Val 700 | Ser | Asp | Val | Lys |
Gin | val 715 | Gin | Ala | Arg | Ile | Gin 720 |
Ser 730 | Asp | Lys | Gin | Thr | Gin 735 | Lys |
Lys | ile | Arg | Gin | pro 750 | Ser | Asp |
ser | ser | Glu | Ser 765 | Arg | Arg | Phe |
Thr | Val | val 780 | Ser | Asn | Leu | Ala |
Hi s | Phe 795 | Gly | ile | Leu | Ser | Ser 800 |
val 810 | Ala | Gly | Arg | Leu | Lys 815 | Ser |
Tyr | Asn | Asn | Phe | Pro 830 | Phe | Pro |
Asp | Arg | Pro | Asp | Pro | Leu | Arg |
845
PL 208 400 B1
Ala Ala Val 850 | Glu | Ala | NEB-207-PIN.ST25 | Gly | Gin | ||||||||||
Ala | Ala 855 | Gin | Thr | val | Leu | Asp 860 | Ala Arg | ||||||||
Tyr | Arg | Arg | Glu | Ala | Gin | Glu | Ala | Gly | Leu | Pro | Glu | Pro | Thr | Leu | Ala |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Glu | Leu | Tyr | Ala | pro | ASp | Ala | Gly | Tyr | Thr | Ala | Leu | Asp | Lys | Ala | Hi s |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Thr | Leu | Asp | Lys | Al a | Val | Asp | Lys | Al a | Tyr | Gly | Tyr | Lys | Thr | Gly |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Lys | Asn | Thr | ASP | ASP | Glu | Ala | Glu | Arg | val | Ala | Phe | Leu | Phe | Glu | Leu |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Tyr | Arg | Lys | Ala | Ala | Ala | ile | Al a | ||||||||
930 | 935 |
<210> 7 <211> 879 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|16077744|ref|ΝΡ_388558.1 <400> 7
Met Ala 1 | Leu | Ile | Asp 5 | Leu Glu Asp Lys Ile Ala Glu Ile Val 10 | Asn 15 | Arg | |||||||||
Glu | Asp | His | Ser | Asp | Phe | Leu | Tyr | Glu | Leu | Leu | Gly | val | Tyr | ASP | val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Arg | Ala | Thr | Ile | Thr | Arg | Leu | Lys | Lys | Gly | Asn | Gin | Asn | Leu | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Lys | Arg | val | Gly | Glu | Val | His | Leu | Lys | Asn | Lys | Val | Trp | Phe | Lys | Glu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Lys | Lys | Gly | Lys | Leu | Phe | Asp | Ala | Leu | Ile | ASP | Ile | Glu | Gin | Gin |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
val | Glu | Tyr | Leu | Ser | Ala | Lys | Pro | Arg | Tyr | Leu | Leu | Val | Thr | Asp | Tyr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asp | Gly | val | Leu | Al a | Lys | Asp | Thr | Lys | Thr | Leu | Glu | Ala | Leu | Asp | val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Lys | Phe | Glu | Glu | Leu | Pro | Gin | Tyr | Phe | Asp | Phe | Phe | Leu | Ala | Trp | Lys |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gly | Ile | Glu | Lys | val | Glu | Phe | Glu | Lys | Glu | Asn | Pro | Ala | Asp | Ile | Lys |
130 | 135 | 140 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Ala 145 | Ala Glu | Arg | Phe | Ala 150 | Arg | Ile | Tyr Asp val 155 | Leu | Arg | Lys | Glu | Asn 160 | |||
Asn | Ile | Ile | Glu | Thr | Asn | Arg | Gly | Leu | Asp | Leu | Phe | Leu | Ile | Arg | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Phe | cys | Phe | Phe | Ala | Glu | Asp | Thr | Asp | ile | Phe | Lys | Arg | Asn | Ser |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Phe | Thr | Asn | Leu | Ile | Lys | Thr | Leu | Thr | Glu | Glu | Asp | Gly | Ser | Asn | Leu |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asn | Lys | Leu | Phe | Ala | Asp | Leu | Phe | Ile | Val | Leu | Asp | Lys | Asn | Glu | Arg |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asp | Asp | Val | Pro | Ser | Tyr | Leu | Lys | Glu | Phe | Pro | Tyr | val | Asn | Gly | Gin |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Phe | Thr | Glu | Pro | His | Thr | Glu | Leu | Glu | Phe | Ser | Al a | Lys | Ser | Arg |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Lys | Leu | Ile | Ile | Glu | cys | Gly | Glu | Leu | Leu | Asn | Trp | Ala | Lys | Ile | Asn |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Pro | Asp | Ile | Phe | Gly | Ser | Met | ile | Gin | Ala | val | Ala | Ser | Glu | Glu | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Arg | ser | Tyr | Leu | Gly | Met | His | Tyr | Thr | Ser | val | Pro | Asn | Ile | Met | Lys |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Val | Ile | Lys | Pro | Leu | Phe | Leu | Asp | Lys | Leu | Asn | Gin | Ser | Phe | Leu | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ala | Tyr | ASp | Asp | Tyr | Thr | Lys | Leu | Glu | Asn | Leu | Leu | Thr | Arg | Ile | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Lys | Ile | Lys | Phe | Phe | Asp | Pro | Ala | cys | Gly | Ser | Gly | Asn | Phe | Leu | ile |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
ile | Thr | Tyr | Lys | Glu | Leu | Arg | Arg | Met | Glu | Ile | Asn | Ile | Ile | Lys | Arg |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Leu | Gin | Glu | Leu | Leu | Gly | Glu | Tyr | Leu | Tyr | val | Pro | ser | val | Thr | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ser | Gin | Phe | Tyr | Gly | Ile | Glu | Ile | Glu | Asp | Phe | Ala | Hi s | Asp | val | Ala |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Lys | Leu | Ser | Leu | Trp | Ile | Ala | Glu | His | Gin | Met | Asn | Glu | Glu | Leu | Lys |
405 410 415
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asn Glu | val | His 420 | Asn | Al a | Val | Arg | Pro 425 | Thr | Leu | Pro | Leu | Hi s 430 | Thr | Ala | |
Gly | Asp | Ile | Arg | cys | Ala | Asn | Ala | Ile | Arg | val | Glu | Trp | Thr | Glu | Val |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
cys | Pro | Ala | Gin | Gly | Ser | Glu | Glu | Val | Tyr | Val | Phe | Gly | Asn | Pro | Pro |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Gly | Ser | Lys | Lys | Gin | Asn | Lys | Glu | His | Lys | Ser | Asp | Met | Leu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ser | Ile | Phe | Gly | Lys | val | Lys | Asn | Gly | Lys | Met | Leu | Asp | Tyr | Ile | Ser |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Ala | Trp | Phe | Tyr | Phe | Gly | Ala | Lys | Tyr | Ala | Ser | Thr | Thr | Asn | Ala | Lys |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Val | Al a | Phe | Val | Ser | Thr | Asn | Ser | Val | Thr | Gin | Gly | Glu | Gin | Val | Ser |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
ile | Leu | Trp | Asn | Glu | Leu | Phe | Lys | Phe | Gly | Ile | Gin | Ile | Asn | Phe | Al a |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Ser | Phe | Lys | Trp | Ala | Asn | Asn | Ala | Lys | Asn | Asn | Ala | Ala | val |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
ile | val | val | ile | val | Gly | phe | Gly | pro | Leu | ASP | Thr | Lys | val | Asn | Lys |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Phe | val | Asp | Glu | Thr | Lys | Lys | Leu | val | ser | Asn | Ile | ser | Pro |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Tyr | Leu | Thr | Asp | Gly | Glu | Asn | Ile | Leu | val | ser | ser | Arg | Thr | Lys | Pro |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
ile | ser | Asp | Leu | Pro | Lys | Leu | Hi s | Phe | Gly | Asn | Met | pro | Asn | ASp | Gly |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Gly | Gly | Leu | Leu | Phe | Thr | Ile | Thr | Glu | Tyr | Thr | Asp | Ala | Ile | Asn | Lys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Tyr | Pro | Glu | Leu | val | Pro | Tyr | Phe | Lys | Lys | Phe | Ile | Gly | Ser | Val | Glu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Phe | Ile | Asn | Gly | Gly | Leu | Arg | Tyr | cys | Leu | T rp | Leu | Asn | Glu | Al a | Lys |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Tyr | Glu | Lys | Ile | Lys | Ser | Asn | Pro | Leu | Ile | Gin | Glu | Arg | Ile | Ser | Ile |
675 | 680 | 685 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
ser | Lys 690 | Asn His | Arg | Glu | Lys 695 | ser Thr Asp | Lys | Gly 700 | Thr | Asn | Lys | Leu | |||
Ala | Leu | Thr | Pro | Trp | Lys | Phe | Arg | Asp | Thr | Hi s | Glu | Thr | Thr | Asn | Tyr |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Ser | ile | val | Val | Pro | Ser | val | Ser | Ser | Glu | Α5Π | Arg | Phe | Tyr | ile | pro |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Met | Gly | Leu | Ala | Gly | Ala | Asp | Thr | ile | Leu | Ser | Asn | Leu | Ile | Tyr | Val |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
ile | Tyr | Asp | Ala | Glu | Ile | Tyr | Leu | Leu | Gly | ile | Leu | Met | Ser | Arg | Met |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Hi s | Met | Thr | T rp | val | Lys | Ala | Val | Ala | Gly | Arg | Leu | Lys | Thr | Asp | Tyr |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Arg | Tyr | Ser | Ala | Gly | Leu | cys | Tyr | Asn | Thr | Phe | Pro | Ile | Pro | Glu | Leu |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Ser | Thr | Arg | Arg | Lys | Asn | Glu | Ile | Glu | Glu | Ala | ile | Leu | Glu | Ile | Leu |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Asp | Leu | Arg | Glu | Glu | Gln | Gly | Gly | Thr | Leu | Ala | Glu | Leu | Tyr | Asn | Pro |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ser | Thr | Met | Pro | Ile | Glu | Leu | Lys | val | Ala | Hi s | Glu | Lys | Leu | Asp | Gly |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Ile | Val | Glu | Arg | Ala | Tyr | Arg | Gln | Lys | Gln | Phe | Glu | Ser | Asp | Glu | Glu |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Arg | Leu | Glu | val | Leu | Leu | Lys | Leu | Tyr | Gln | Glu | Met | Thr | Glu | Arg | |
865 | 870 | 875 |
<210> 8 <211> 952 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|9945797|gb|AAG03371.1 <400> 8
Met | val | Met | Ala | Pro | Thr | Thr | Val | Phe | Asp | Arg | Ala | Thr | ile | Arg | Hi s |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Asn | Leu | Thr | Glu | Phe | Lys | Leu | Arg | Trp | Leu | Asp | Arg | Ile | Lys | Gln | Trp |
25 30
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Glu | Ala Glu Asn Arg 35 | Pro Ala Thr Glu Ser Ser His Asp Gin | Gin | Phe | |||||||||||
40 | 45 | ||||||||||||||
Trp | Gly | Asp | Leu | Leu | Asp | cys | Phe | Gly | Val | Asn | Ala | Arg | Asp | Leu | Tyr |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Leu | Tyr | Gin | Arg | Ser | Ala | Lys | Arg | Ala | Ser | Thr | Gly | Arg | Thr | Gly | Lys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ile | Asp | Met | Phe | Met | Pro | Gly | Lys | val | ile | Gly | Glu | Ala | Lys | ser | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gly | val | Pro | Leu | Asp | Asp | Ala | Tyr | Ala | Gin | Ala | Leu | Asp | Tyr | Leu | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gly | Gly | Thr | Ile | Ala | Asn | Ser | His | Met | Pro | Al a | Tyr | Val | Val | cys | Ser |
115 | 120 | 12 5 | |||||||||||||
Asn | Phe | Glu | Thr | Leu | Arg | val | Thr | Arg | Leu | Asn | Arg | Thr | Tyr | Val | Gly |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Asp | Ser | Ala | Asp | Trp | Asp | Ile | Thr | Phe | Pro | Leu | Ala | Glu | Ile | Asp | Glu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Hi s | Ile | Glu | Gin | Leu | Al a | Phe | Leu | Ala | Asp | Tyr | Glu | Thr | Ser | Al a | Tyr |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Arg | Glu | Glu | Glu | Lys | Al a | ser | Leu | Glu | Ala | ser | Arg | Leu | Met | val | Glu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Leu | Phe | Arg | Ala | Met | Asn | Gly | Asp | Asp | Val | Asp | Glu | Ala | Val | Gly | Asp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asp | Ala | Pro | Thr | Thr | Pro | Glu | Glu | Glu | Asp | Glu | Arg | val | Met | Arg | Thr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ser | Ile | Tyr | Leu | Thr | Arg | Ile | Leu | Phe | Leu | Leu | Phe | Gly | Asp | Asp | Ala |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Leu | Trp | Asp | Thr | Pro | His | Leu | Phe | Ala | Asp | Phe | Val | Arg | Asn | Glu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Thr | Pro | Glu | Ser | Leu | Gly | Pro | Gin | Leu | Asn | Glu | Leu | Phe | Ser | Val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Leu | Asn | Thr | Al a | Pro | Glu | Lys | Arg | Pro | Lys | Arg | Leu | Pro | Ser | Thr | Leu |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Al a | Lys | Phe | Pro | Tyr | val | Asn | Gly | Ala | Leu | Phe | Al a | Glu | Pro | Leu | Al a |
290 | 295 | 300 |
PL 208 400 B1
Ser 305 | Glu Tyr | Phe | NEB-207-PIN.ST25 | cys 320 | |||||||||||
Asp | Tyr 310 | Gin Met | Arg | Glu | Al a 315 | Leu | Leu | Ala | Al a | ||||||
Asp | Phe | Asp | Trp | Ser | Thr | ile | ASp | val | ser | val | Phe | Gly | Ser | Leu | Phe |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Gin | Leu | Val | Lys | Ser | Lys | Glu | Ala | Arg | Arg | Ser | Asp | Gly | Glu | Hi s | Tyr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Thr | Ser | Lys | Ala | Asn | ile | Met | Lys | Thr | Ile | Gly | Pro | Leu | Phe | Leu | Asp |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Glu | Leu | Arg | Ala | Glu | Ala | Asp | Lys | Leu | Val | Ser | Ser | Pro | Ser | Thr | Ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
val | Ala | Al a | Leu | Glu | Arg | Phe | Arg | Asp | Ser | Leu | Ser | Glu | Leu | val | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ala | Asp | Met | Ala | cys | Gly | Ser | Gly | Asn | Phe | Leu | Leu | Leu | Al a | Tyr | Arg |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Glu | Leu | Arg | Arg | Ile | Glu | Thr | Asp | Ile | Ile | val | Ala | ile | Arg | Gin | Arg |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Arg | Gly | Glu | Thr | Gly | Met | Ser | Leu | Asn | Ile | Glu | Trp | Glu | Gin | Lys | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ser | Ile | Gly | Gin | Phe | Tyr | Gly | Ile | Glu | Leu | Asn | Trp | Trp | Pro | Ala | Lys |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ile | Ala | Glu | Thr | Ala | Met | Phe | Leu | Val | Asp | His | Gin | Ala | Asn | Lys | Glu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Leu | Ala | Asn | Ala | val | Gly | Arg | Pro | Pro | Glu | Arg | Leu | Pro | ile | Lys | Ile |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Thr | Al a | His | Ile | Val | Hi s | Gly | Asn | Ala | Leu | Gin | Leu | Asp | Trp | Ala | Asp |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ile | Leu | ser | Al a | ser | Ala | Ala | Lys | Thr | Tyr | ile | Phe | Gly | Asn | pro | pro |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Phe | Leu | Gly | His | Ala | Thr | Arg | Thr | Al a | Glu | Gin | Ala | Gin | Glu | Leu | Arg |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Asp | Leu | Trp | Gly | Thr | Lys | Asp | Ile | Ser | Arg | Leu | Asp | Tyr | val | Thr | Gly |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Trp | Hi s | Al a | Lys | cys | Leu | Asp | Phe | Phe | Lys | Ser | Arg | Glu | Gly | Arg | Phe |
565 | 570 | 575 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Ala Phe val | Thr 580 | Thr | Asn | ser ile Thr 585 | Gin Gly | Asp | Gin | val 590 | Pro | Arg | |||||
Leu | Phe | Gly | Pro | Ile | Phe | Lys | Ala | Gly | Trp | Arg | ile | Arg | Phe | Ala | His |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Arg | Thr | Phe | Al a | Trp | Asp | ser | Glu | Al a | Pro | Gly | Lys | Ala | Ala | val | Hi s |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Cys | Val | Ile | Val | Gly | Phe | ASP | Lys | Glu | Ser | Gin | Pro | Arg | Pro | Arg | Leu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Trp | Asp | Tyr | Pro | Asp | val | Lys | Gly | Glu | Pro | val | Ser | val | Glu | val | Gly |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Gin | Ser | Ile | Asn | Ala | Tyr | Leu | val | Asp | Gly | Pro | Asn | val | Leu | Val | Asp |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Lys | Ser | Arg | His | Pro | Ile | Ser | Ser | Glu | Ile | Ser | Pro | Ala | Thr | Phe | Gly |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Asn | Met | Ala | Arg | Asp | Gly | Gly | Asn | Leu | Leu | Val | Glu | Val | Asp | Glu | Tyr |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Asp | Glu | val | Met | Ser | Asp | Pro | val | Ala | Ala | Lys | Tyr | val | Arg | Pro | Phe |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Arg | Gly | Ser | Arg | Glu | Leu | Met | Asn | Gly | Leu | Asp | Arg | Trp | Cys | Leu | Trp |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Val | Asp | val | Ala | Pro | Ser | Asp | Ile | Ala | Gin | Ser | Pro | Val | Leu | Lys |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Lys | Arg | Leu | Glu | Ala | val | Lys | Ser | Phe | Arg | Ala | Asp | Ser | Lys | Al a | Ala |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Ser | Thr | Arg | Lys | Met | Al a | Glu | Thr | Pro | His | Leu | Phe | Gly | Gin | Arg | Ser |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Gin | Pro | Asp | Thr | Asp | Tyr | Leu | Cys | Leu | Pro | Lys | Val | Val | Ser | Glu | Arg |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Arg | Ser | Tyr | Phe | Thr | Val | Gin | Arg | Tyr | Pro | Ser | Asn | val | Ile | Ala | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Asp | Leu | val | Phe | Hi s | Al a | Gin | Asp | Pro | Asp | Gly | Leu | Met | Phe | Ala | Leu |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ala | Ser | Ser | Ser | Met | Phe | Ile | Thr | Trp | Gin | Lys | Ser | Ile | Gly | Gly | Arg |
835 | 840 | 845 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Leu | Lys ser Asp Leu 850 | Arg | Phe 855 | Ala | Asn | Thr | Leu | Thr 860 | Trp | Asn | Thr | Phe | |||
Pro | val | Pro | Glu | Leu | ASp | Glu | Lys | Thr | Arg | Gin | Arg | ile | Ile | Lys | Ala |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Gly | Lys | Lys | Val | Leu | Asp | Ala | Arg | Al a | Leu | Hi s | Pro | Gl u | Arg | ser | Leu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Glu | His | Tyr | Asn | Pro | Leu | Ala | Met | Ala | Pro | Glu | Leu | Ile | Lys | Al a |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Hi s | Asp | Ala | Leu | Asp | Arg | Glu | Val | Asp | Lys | Ala | Phe | Gly | Ala | Pro | Arg |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Lys | Leu | Thr | Thr | Val | Arg | Gin | Arg | Gin | Glu | Leu | Leu | Phe | Al a | Asn | Tyr |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Glu | Lys | Leu | Ile | Ser | Hi s | Gin | Pro |
945 950 <210> 9 <211> 168 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank I | ίγ gi | |23451826|gb|AAN32874.1 |
<400> 9 | ||
Pro Ala Asp Glu | Arg | ser Gin Met Asp Ala Gly Gly Lys Pro val Glu |
1 | 5 | 10 15 |
Gly Gly Asn Leu | Leu | Phe Ala Glu Glu Glu Lys Gin Arg Leu val Glu |
20 | 25 30 | |
Gly Asn val Asp | val | val Lys Phe Leu Lys Arg Val Tyr Gly Ala Ser |
35 | 40 45 | |
Glu Tyr Ile Arg | Gly | Glu val Arg Phe Cys Leu Trp ile Ser Asp Ser |
50 | 55 60 | |
Gin Glu Gin Glu | Al a | Lys Ser Asn Ser Asp Ile Asn Cys Lys Leu Asn |
65 | 70 75 80 | |
Ala Val Ala Ala | Phe | Arg Leu Lys Ser Pro Lys Ala Ala Thr Lys Lys |
85 | 90 95 | |
Gly Ala Ala Trp | Pro | His Lys Phe Glu Glu Val Lys Gin Ile Gly Asn |
100 | 105 110 | |
Glu val val Thr | Ile | Val Pro Lys val Ser Ser Glu Ser Arg Glu Tyr |
115 | 120 125 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Leu | Pro | val | Gly | Leu | Leu | Pro | Arg | Gly | Ser | Ile | Val | Thr | ASp | Leu | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Phe | Al a | Leu | Tyr | Asp | Al a | Pro | Leu | τ rp | Asn | Met | Al a | Leu | ile | Al a | Ser |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Arg | Leu | Hi s | Leu | Val | Trp | ile | Gly |
165 <210> 10 <211> 909 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gb|23110638|gb|ZP00096791.1 <400> 10
Met Asn 1 | Pro | val | Glu 5 | Ile | Glu | Glu | Ala | Val 10 | Ser Asp Leu Ala | Arg 15 | Al a | ||||
Pro | Tyr | Asp | Ala | Ser | Glu | Phe | Pro | Phe | Gin | Phe | Leu | Ala | Al a | Phe | Gly |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asn | Lys | Gin | Thr | Thr | Leu | Gin | Arg | Leu | Arg | Ala | Gly | Asn | Ser | Asn | Gin |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ser | ASP | Leu | Pro | Gly | Al a | val | Leu | Gin | Arg | Asn | His | Ile | Hi s | ile | Ala |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Thr | cys | Asp | Ala | Gly | Asn | val | Asp | Arg | Thr | Leu | Ala | Ala | Leu | Arg | Lys |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ser | Pro | Lys | Thr | Ala | Ser | Gin | Lys | Ala | Arg | Phe | ile | Leu | Al a | Thr | Asp |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gly | val | Al a | Phe | Gin | Ala | Glu | ASp | Met | Ala | Ser | Gly | Glu | Thr | val | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
cys | Asn | Tyr | Ala | Ala | Phe | Pro | Asp | Lys | Phe | Ala | Phe | Phe | Leu | pro | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ala | Gly | Ile | Thr | Thr | Val | Gin | Gin | ile | Arg | Glu | Ser | Ser | Phe | Asp | ile |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Lys | Ala | Thr | Gly | Arg | Leu | Asn | Lys | Leu | Tyr | val | Glu | Leu | Leu | Lys | ASp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Asn | Pro | Asp | Trp | Al a | Ser | Arg | Ser | Glu | Asp | Met | Asn | Hi s | Phe | Met | Ala |
165 | 170 | 175 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Arg | Leu ile Phe cys Phe 180 | Phe Ala Glu Asp Thr 185 | Asp ile | Phe 190 | val | Gly | |||||||||
Glu | Gly | Leu | Phe | Ser | Arg | Thr | val | Glu | Thr | Met | Ser | Ala | Arg | Asp | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ser | Asp | Thr | Hi s | Met | Val | Ile | Ala | Glu | Ile | Phe | Arg | Ala | Met | ASP | Thr |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | Leu | Ala | Asp | Arg | Al a | Ala | Ala | Gly | ile | Lys | Ser | Trp | Al a | Asp | val |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Phe | Pro | Tyr | val | Asn | Gly | Gln | Leu | Phe | Ser | Gly | Ser | Thr | Glu | Cys | Pro |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Arg | Phe | Ser | Lys | Ile | Ala | Arg | Ser | Tyr | Leu | Leu | Hi s | Ile | Gly | Ser | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Asp | Trp | Gln | Lys | Ile | Asn | Pro | Asp | Ile | Phe | Gly | ser | Met | Ile | Gln | Ala |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
val | Ala | Asp | Asp | Glu | Glu | Arg | Gly | Ala | Leu | Gly | Met | His | Tyr | Thr | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Val | Pro | Asn | He | Leu | Lys | Val | Leu | Asn | Pro | Leu | Phe | Leu | Asp | Asp | Leu |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Arg | Ala | Lys | Leu | Glu | Glu | Ala | Gly | Asp | Asn | Ser | Arg | Lys | Leu | Leu | Asn |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Leu | Arg | Asn | Arg | Met | Ala | Lys | Ile | Arg | Val | Phe | Asp | Pro | Ala | Cys | Gly |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ser | Gly | Asn | Phe | Leu | Val | Ile | Al a | Tyr | Lys | Gln | Met | Arg | Glu | Leu | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ala | Glu | Ile | Asn | Arg | Arg | Arg | Gly | Glu | Ala | Asp | Arg | Arg | Ser | Asp | ile |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Pro | Leu | Thr | Asn | Phe | Arg | Gly | Ile | Glu | Leu | Arg | Asn | Phe | Pro | Ala | Glu |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ile | Ala | Arg | Leu | Ala | Leu | Ile | Ile | Al a | Glu | Tyr | Gln | Cys | Asp | val | Leu |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Tyr | Arg | Gly | Gln | Lys | Glu | Ala | Leu | Ala | Glu | Phe | Leu | pro | Leu | Asp | Ser |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Gln | Asn | Trp | Ile | Thr | cys | Gly | Asn | Al a | Leu | Arg | Leu | Asp | Trp | Leu | Ser |
435 | 440 | 445 |
PL 208 400 B1
Ile Cys 450 | Pro Pro | NEB-207-PIN.ST25 | Leu | ||||||||||||
Thr | Gly | Thr 455 | Ala | val | Lys | Leu Gin Ala 460 | Asn | Asp | |||||||
phe | Glu | Met | pro | Leu | Asp | Gin | Al a | Glu | Ile | Asp | Phe | Glu | Asn | Glu | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gly | Glu | Thr | Tyr | Ile | Cys | Gly | Asn | Pro | Pro | Tyr | Leu | Gly | Ala | Lys | Lys |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Lys | Ser | Ser | Asp | Gin | Ile | Glu | Asp | Met | Lys | Arg | val | Gly | Leu | Asp | Lys |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ala | Gin | Leu | Leu | Asp | Tyr | Val | Ser | Al a | Phe | ile | val | Arg | Gly | Leu | Pro |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Leu | val | Ala | Gin | Gin | Arg | Cys | Asp | Met | Ala | Leu | Val | Ser | Thr | Ser | Ser |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ile | cys | Gin | Gly | Glu | Gin | val | Ser | Leu | ile | Trp | Pro | Arg | Ile | Leu | Lys |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ser | Ala | Asn | val | Lys | Phe | Al a | Tyr | Arg | Pro | Phe | Arg | Trp | Ser | Asn | Ser |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ala | Ala | Asn | Asn | Ala | Gly | val | Tyr | cys | Thr | Ile | Ile | Gly | Leu | Thr | Gly |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Ser | Glu | val | Ser | Asn | Lys | Lys | Leu | Phe | Gly | Glu | Gly | Ser | Val | val | Glu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Cys | Ser | Ser | ile | Ala | Pro | Tyr | Leu | Val | Pro | Gly | Pro | Glu | Ile | Ile | Cys |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Ala | Pro | Arg | Gin | Ser | Ser | Ile | Ser | Gly | Phe | Ala | Arg | Met | val | Met | Gly |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
ser | Asn | Pro | val | Asp | Gly | Lys | Arg | Leu | Ile | Phe | Glu | Gin | Asp | Glu | Lys |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Glu | Ser | Val | val | Ala | Ala | Asp | Pro | Arg | Ser | Glu | Arg | Phe | Phe | Lys | Arg |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Gly | Thr | Gin | Glu | Leu | val | Asn | Gly | val | Asp | Arg | Trp | Cys | Leu |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Trp | Ile | Asn | Asp | Asp | Gin | Val | Asp | Asp | Ala | Lys | Ala | Ile | Ala | Glu | ile |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Ala | Lys | val | Leu | Glu | Ser | Cys | Arg | Ser | Tyr | Arg | Gin | Gly | Ala | Gly | Arg |
705 710 715 720
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp | Ala Gin | Lys | Ala Ala Asn Arg Pro His | Ser | Phe Cys | Tyr | Arg 735 | Thr | |||||||
725 | 730 | ||||||||||||||
Phe | Gin | Glu | Asn | Ile | Gly | ile | His | Val | Gly | Leu | Thr | Ile | Gly | Asn | Gly |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Ser | Hi s | val | Pro | Al a | Asp | Leu | Lys | Ser | Ser | Gly | Phe | val | Ser | Ser |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Hi s | Thr | Al a | Tyr | Met | Ile | Tyr | Gly | Trp | His | Pro | Val | Glu | Phe | Ala | Leu |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Leu | Asn | Ser | Arg | Leu | Met | Leu | val | Trp | Thr | Glu | Thr | val | Gly | Gly | Arg |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Leu | Gly | Asn | Gly | Met | Arg | Phe | Ser | Asn | Thr | Ile | Val | Tyr | Asn | Thr | Phe |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Pro | val | Pro | Ser | Leu | Thr | Asp | Gin | Asn | Lys | Ala | Asp | Leu | Thr | Arg | cys |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Ala | Glu | Asp | ile | Leu | Leu | Al a | Arg | Glu | Ser | His | Phe | Pro | Al a | Thr | ile |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Ala | Asp | Leu | Tyr | Asp | Pro | Glu | Thr | Met | Pro | Glu | Ser | Leu | Arg | Ala | Ala |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Hi s | Asp | Arg | Asn | Asp | Glu | val | Leu | Glu | Arg | Ile | Tyr | Ile | Gly | Arg | Arg |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Phe | Arg | Asn | Asp | Thr | Glu | Arg | Leu | Glu | Lys | Leu | Phe | Glu | Leu | Tyr | Thr |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Lys | Met | Thr | Gly | Gly | Arg | Ser | Ser | Glu | Gly | Gly | Ala | Ala |
900 905 <210> 11 <211> 1048 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> | GenBank | Nr g- | i|20803963|emb|CAD31540. | 1 |
<400> | 11 | |||
Met ser | Leu Gly | Ala | Ala Gly Leu Thr Pro ile | Thr Pro Ala Ala Phe |
1 | 5 | 10 | 15 | |
Ile Lys | Lys Trp | Arg | Lys ser Glu Leu Gly Glu | Arg Gin Ala Ala Gin |
20 | 25 | 30 | ||
Glu His | Phe Leu | Asp | Ile Cys Ser Leu Val Gly | His Pro Ser Pro Ser |
35 | 40 | 45 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
ASP Glu ASP Pro 50 | Thr | Gly | Ala Phe Phe Ala Phe Glu | Lys | Gly | Ala | Asn | ||||||||
55 | 60 | ||||||||||||||
Lys | Leu | Gly | Gly | Gly | Lys | Gly | Phe | Ala | Asp | Val | Trp | Lys | Lys | Gly | Hi s |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Phe | Al a | Trp | Glu | Tyr | Lys | Arg | Lys | Lys | Gly | Asn | Leu | Asp | Glu | Ala | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Gin | Leu | Met | Arg | Tyr | Ala | Pro | Al a | Leu | Leu | Ser | Pro | Pro | Leu | His |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ile | Val | cys | Asp | ile | Glu | Arg | Leu | Arg | Ile | His | Thr | Al a | Trp | Thr | Asn |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Thr | val | Pro | ser | Thr | Tyr | val | Ile | Thr | Leu | Asp | Asp | Leu | Ala | Glu | pro |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ser | Ala | Arg | Glu | Met | Leu | His | Asn | val | Phe | Phe | Ser | Pro | Glu | Lys | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Arg | Pro | Thr | Arg | Thr | Arg | Ala | Ala | val | Thr | Lys | Glu | Ala | Ala | Asp | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Phe | ser | Al a | ile | Ala | Leu | Arg | val | Gin | Gly | Arg | Gly | Thr | Pro | Asp | Glu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ile | Ala | His | Phe | Val | Asn | Gin | Leu | val | Phe | cys | Phe | Phe | Ala | Gin | ser |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
val | ser | Leu | Leu | pro | Asp | Gly | Leu | Phe | Thr | Lys | Leu | Leu | Lys | Arg | ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Ala | Arg | Ala | Pro | Glu | Arg | Ala | Met | Ser | Tyr | Leu | Asp | Lys | Leu | Phe | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ala | Met | Glu | Arg | Gly | Gly | Glu | Phe | Asp | Leu | Thr | ASp | ile | Thr | Trp | Phe |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Asn | Gly | Gly | Leu | Phe | Asp | Gly | Arg | Arg | Ala | Leu | Arg | Leu | Asp | Asp | Gly |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Asp | Ile | Gly | Leu | Leu | Val | Ala | Ala | Asp | Ser | Leu | Asp | Trp | Gly | Leu | Ile |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asp | Pro | Thr | Ile | Phe | Gly | Thr | Leu | Phe | Glu | Arg | Phe | Leu | Asp | Pro | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Lys | Arg | Ala | Gin | Ile | Gly | Al a | His | Tyr | Thr | Asp | Pro | Glu | Lys | ile | Met |
305 | 310 | 315 | 320 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Arg Leu
Gin Ala
Pro Met
Ala Glu 370
Leu Asp 385
Gly val
Gly Met ile Glu
Ile Gly 450
Ile Pro 465 val Arg
Leu Leu
Pro Glu
Leu Met 530 val Tyr 545
Val Glu
Gly Leu val Asp
Arg Arg 340
Arg Arg 355 val Arg
Pro Ala
Lys Asp
Pro Ala 420
Ile Asn 435
Asp Ile
Ile Leu
Gin Ala
Ala Ala 500
Ala Glu 515
Arg Gin
Asp Gly
Lys Ser val Thr 580
Pro val 325
Glu Ile
Gin Gin
Ser Arg
Cys Gly 390
Ile Glu 405
Gin Leu
Met Met
Gin Trp
Arg Lys 470
Gin Asp 485
Leu Gin
Phe ile
Ala Leu
Arg val 550
Arg Ala 565
Thr Asn ile Leu Arg Pro Leu Arg 330
Gin Glu val Glu Leu Leu Asn Gly 345
Ser Arg Arg Met Lys Arg 360
Phe Thr Glu Arg Leu Arg 375 380
Ser Gly Asn Phe Leu Tyr 395
His Arg Ala Asn Leu Asp 410
Pro Leu Val Gly Pro Glu 425
Ala Ala 440
Glu Leu
Ala Arg
Gin Ile 455
Leu Asp
Val Asp
Pro Val val Gly 520
Gly Asp 535
Ser Arg
Ala Val ser ile
Lys Asn
Ala Ile
Thr Ala 490
Ser Glu 505
Asn Pro
Pro Thr
Gly Ile 460
Glu Arg 475
Arg Asp
Asp Ala
Pro Phe val Asp 540
Glu Ala
Asp Leu 555
Ala Ala 570
Asp Arg
Arg Gly 585
Gly Ala
Asn Arg 350
Glu Glu 365
Lys Leu
Leu Ala
Cys Glu
Ile Leu 430
Thr Thr 445
Arg Ser
Arg Asp
Ala Gin
Glu Ala 510 val Gly 525
Arg Leu val cys
Thr Arg
Asn Arg 590
Trp Glu 335
Lys Pro
Ala Ala
Arg ile
Leu Gin 400
Met Leu 415
Arg Gly
Ile Trp
Lys Ser
Ala Leu 480
Gly Asp 495
Glu Trp val Arg
Phe Asp
Tyr Trp 560
Arg val 575
Arg val
PL 208 400 B1
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Pro 865 | Ala | val | Arg Tyr | Glu 870 | Lys | Asp Ser Arg Ala Ile Ala Ile 875 | Ser | Lys 880 | |||||||
Al a | Al a | Lys | Arg | Leu | Asp | Asp | Ile | Arg | Asn | Ala | Trp | Leu | Asn | Pro | Ser |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Asp | Leu | val | Gin | Ile | Lys | Pro | Glu | Val | Val | Pro | Gly | Tyr | Pro | Asp | Arg |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Ile | Leu | Pro | Lys | Asp | ile | Ala | Ser | Asp | Ala | Ile | Leu | Arg | Asp | Arg | Thr |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Leu | Thr | Asn | Leu | Tyr | Asn | Arg | Arg | Pro | Gin | Trp | Leu | Val | Asp | Al a | His |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Ser | ASp | Leu | Asp | Ala | Al a | val | Ala | Gly | Ala | Tyr | Gly | Trp | Pro | Al a | Asp |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
Ile | ser | Glu | Asp | Glu | Al a | Leu | Ala | Asn | Leu | Leu | Glu | Leu | Asn | Leu | Ala |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Arg | Glu | Al a | Phe | Asn | Glu | Hi s | Al a | Lys | Ser | Gly | Leu | Lys | Thr | Arg | Lys |
980 | 985 | 990 |
Pro Arg Arg Arg Pro Thr Pro Glu Glu Val Arg Arg Ala Pro Gin Mel 995 1000 1005
Lys Leu Pro ile Ala Gly Gly Arg Lys Ser Val val Gly Pro Gin 1010 1015 1020
Gin Leu Thr Thr Lys Asp Arg Glu Asn Gin Pro Thr Ser Ala Glu 1025 1030 1035
Arg Pro Arg Asn Thr Lys Arg Arg Thr Ser 1040 1045 <210> 12 <211> 959 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|16125079|ref|np_419643.1 <400> 12
Asp Leu Cys Arg Met Leu Glu val Pro Thr Pro Ala Glu Asp Asp Pro 15 10 15
Leu Gly Glu Arg Tyr Cys Phe Glu Arg Gly Ala Ala Lys Thr Gly Gly 20 25 30
PL 208 400 B1
NEB-207-ΡΙΝ.ST25
Gly Asp Gly 35 | Trp | Ala Asp val | Trp Arg Lys Gly Cys 40 | Phe 45 | Gly | Trp | Glu | ||||||||
Tyr | Lys | Gly | Lys | Hi s | Lys | Asn | Leu | Asp | Al a | Al a | Leu | Arg | Gin | Leu | Gin |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ala | Tyr | Al a | Leu | Asp | Leu | Gin | Asn | pro | pro | Tyr | Leu | Val | val | Ser | Asp |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Met | Glu | Arg | Ile | ile | val | His | Thr | Asn | Trp | Thr | Asn | Thr | ile | ser | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | ile | Glu | Phe | Thr | Leu | Asp | Asp | Leu | Hi s | Glu | pro | Glu | Lys | Leu | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Met | Leu | Arg | Gin | Val | Phe | Asp | Gly | ser | Asp | ser | Leu | Lys | pro | Lys | ile |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Ser | Pro | Gin | Glu | Leu | Thr | Ala | Lys | Val | Ala | Gin | Arg | Phe | Gly | Asp | Leu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Arg | Arg | Leu | Gin | Glu | Arg | Gly | His | His | Pro | Arg | Asp | Val | Al a | His |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Phe | Leu | Asn | Arg | Val | val | Phe | cys | Met | Phe | Ala | Glu | Asp | Al a | Lys | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Pro | Glu | Gly | Leu | Phe | Thr | Arg | Leu | Thr | Arg | Ser | Met | Gin | Met | Arg |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Pro | Pro | Ala | Glu | Al a | Al a | Pro | Gin | Phe | Asp | Ala | Leu | Phe | Ala | Met | Met |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | Al a | Gly | Gly | Met | Phe | Gly | Ala | Asp | Ile | Val | Hi s | Trp | Phe | Asn | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Gly | Leu | Phe | Asp | Glu | Lys | Pro | Al a | Leu | Pro | Leu | Glu | Arg | Ala | Asp | Ile |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Lys | Leu | ile | His | Asp | Thr | Al a | Ala | Glu | Hi s | Asp | Trp | Ser | Asp | Leu | Asp |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Pro | Ser | val | Phe | Gly | Asn | Met | Phe | Glu | Glu | Al a | Leu | Lys | Al a | Thr | Arg |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Glu | Arg | Ala | Ala | Leu | Gly | Ala | Hi s | Tyr | Thr | Asp | Arg | Glu | Lys | Ile | Leu |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Lys | Ile | Ile | Asp | Pro | val | Ile | Thr | Trp | Pro | Leu | Met | Al a | Gin | Trp | Glu |
290 | 295 | 300 |
PL 208 400 B1
Thr 305 | Ala Leu | Ala Glu | NEB-207-PIN.ST25 | Ala 320 | |||||||||||
Ile Arg Ala Ala Leu Asp | Ala | Arg | Ala | Al a | |||||||||||
310 | 315 | ||||||||||||||
Glu | Al a | Glu | Arg | Lys | Ala | val | Leu | Glu | Ala | Ala | Ala | Glu | Ala | Met | Arg |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Asp | Pro | Val | Lys | Al a | Lys | Ala | Gly | Glu | Ala | Ala | Arg | Arg | Lys | Thr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Leu | Thr | Ala | Ile | Ala | Lys | Arg | Ser | ASp | Ala | Ala | Leu | Gly | Gin | Ala | Lys |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Arg | Leu | Glu | Ala | Phe | Leu | Ser | Arg | Leu | Ala | Ala | Phe | Arg | Val | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Asp | Pro | Al a | cys | Gly | Ser | Gly | Asn | Phe | Leu | Tyr | Val | Al a | Leu | Hi s | Ala |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Leu | Lys | Asp | ile | Glu | Arg | Arg | Ala | Leu | Val | Asp | Ala | Glu | Arg | Leu | Gly |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Leu | Glu | val | Pro | Thr | Pro | Arg | Val | Gly | Leu | Al a | cys | val | Arg | Gly | Ile |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Glu | Ile | Glu | Glu | Tyr | Ala | Ala | Glu | Leu | Ala | Arg | val | Thr | Leu | Trp | Ile |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gly | Asp | Leu | Gin | Trp | His | Ala | Lys | Asn | Asn | Tyr | Arg | Gly | Phe | Ala | Glu |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Pro | Ile | Leu | Ser | Ser | Leu | Asp | Gin | Ile | Glu | Cys | Arg | Asp | Ala | Leu | Leu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Asn | Ala | Asp | Gly | Thr | Glu | Ala | Gin | Trp | Pro | Ala | val | Asp | val | ile | Val |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Gly | Asn | Pro | Pro | Phe | Leu | Gly | Ser | Lys | Arg | Leu | Arg | Asp | Gly | Leu | Gly |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Asn | Asp | Tyr | val | Glu | Arg | Leu | Phe | ser | Thr | Tyr | Arg | Gly | Lys | val | Pro |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Ala | Glu | Al a | Asp | Phe | val | Al a | Tyr | Trp | Ile | Ala | Lys | Ala | Trp | Glu | Leu |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
val | Gin | Ala | Gin | Gin | Gly | Arg | Arg | Al a | Gly | Leu | val | Thr | Thr | Asn | ser |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Val | Arg | Gly | Gly | Al a | Ser | Arg | Lys | Val | Leu | ASP | Pro | Ile | Ala | Asp | Ala |
565 570 575
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Gly | Ala Leu Met 580 | Glu | Ala Trp Ala Asp 585 | Glu | Pro Trp | Ala | Leu 590 | Glu | Gly | ||||||
Al a | Al a | val | Arg | val | Ser | Met | Phe | Gly | Phe | Gly | Asp | Gly | Phe | Ala | Glu |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Arg | Arg | Leu | Glu | Gly | Arg | Lys | Al a | Glu | His | Leu | His | Ser | Asp | Phe | Arg |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Gly | Ala | Ser | Thr | Asp | val | Thr | Lys | Ala | Leu | Arg | Leu | Lys | Glu | Asn | Ala |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Ser | Ile | Al a | Phe | Met | Gly | Asp | Thr | Lys | Gly | Gly | Ala | Phe | Asp | val | ser |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Gly | Glu | Ile | Ala | Arg | Glu | Trp | Leu | Arg | Leu | Pro | Leu | Asn | Pro | Asn | Gly |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Arg | Pro | Asn | Ser | Asp | Val | Leu | Lys | Pro | Trp | Arg | Asn | Ala | Met | Asp | Met |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Thr | Arg | Arg | ser | ser | Asp | Lys | Trp | Ile | Ile | Asp | Phe | Gly | Trp | Thr | Met |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Ser | Glu | Al a | Asp | Al a | Ala | Leu | phe | Glu | Thr | pro | Phe | Arg | His | val | Leu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Leu | His | val | Lys | Pro | Glu | Arg | Asp | Arg | Asn | Asn | Arg | Glu | Met | Tyr | Arg |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Leu | Asn | Trp | T rp | Lys | Hi s | val | Glu | Pro | Arg | Gin | Gly | Leu | Met | Lys | Arg |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
val | pro | Ala | Leu | Ser | Arg | Leu | Leu | Val | Thr | Pro | Glu | val | Ser | Lys | Hi s |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Arg | Leu | Phe | ile | Trp | Leu | Asp | Ala | Arg | Val | Leu | Pro | Asp | Hi s | Lys | Leu |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Gin | val | Val | Thr | Leu | Asp | Asp | Asp | cys | Ser | Phe | Gly | val | Leu | His | Ser |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Arg | Phe | Hi s | Glu | Val | Trp | Ala | Leu | Ala | Ala | Gly | Ser | Trp | His | Gly | Ser |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Gly | Asn | Asp | Pro | Arg | Tyr | Thr | ile | Ser | Thr | Thr | Phe | Glu | Thr | Phe | Pro |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Phe | Pro | Glu | Gly | Leu | Thr | Pro | Asn | Ile | Al a | Ala | Val | Asp | Tyr | Glu | Gly |
835 | 840 | 845 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp Pro | Arg | Ala Gln | Al a | Ile Ala Ala Ala Ala Ala | Glu | Leu Asn Arg | |||||||||
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Leu | Arg | Glu | Al a | Trp | Leu | Asn | Pro | Pro | Asp | Leu | Val | Arg | Ile | Glu | Pro |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Glu | val | val | Pro | Gly | Tyr | Pro | Asp | Arg | val | Leu | Pro | Val | Ser | Pro | Glu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Gly | Ala | Glu | Leu | Lys | Lys | Arg | Thr | Leu | Thr | Asn | Leu | Tyr | Asn | Gln |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Arg | Pro | Ala | T rp | Leu | Asp | Met | Al a | Hi s | Gln | Arg | Leu | Asp | Ala | Ala | Val |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Ala | Ala | Ala | Tyr | Gly | Trp | Pro | Asp | Gly | Leu | Thr | Asp | Asp | Glu | Ile | Leu |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Glu | Arg | Leu | Phe | Ala | Leu | Asn | Gln | Glu | Arg | Ala | Al a | Ala | Gly | Arg | |
945 | 950 | 955 |
<210> 13 <211> 909 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> GenBank Nr gi|15807788|ref|ΝΡ_285443.1 <400> 13
Met Hi s 1 | Pro | Gln | Glu 5 | Phe Ala Asp Thr Trp 10 | Ser Arg | Arg | Ala | Leu 15 | Lys | ||||||
Ala | Thr | Glu | Arg | Asp | Ser | Tyr | Val | Gln | Hi s | Trp | Leu | Asp | Leu | Cys | Gln |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Leu | His | Hi s | Glu | Al a | Pro | Gly | Ala | Asp | Pro | Asp | Tyr | Lys | Phe | Glu |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Arg | Arg | val | Thr | Lys | Val | Gly | Thr | Lys | Asp | Lys | Gly | Phe | Ala | Asp | val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Phe | Lys | Lys | Ala | Hi s | Phe | Ile | Thr | Glu | Tyr | Lys | Arg | Pro | Gly | Ser | Asp |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Gly | Ala | Al a | Leu | Gln | Gln | Al a | Thr | Leu | Tyr | Ser | Arg | Asp | Leu | Gly |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asn | Pro | Pro | Leu | Leu | Leu | Thr | Ser | Asp | Phe | Gln | Arg | ile | Glu | Ile | Asn |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Thr | Ala | Phe | Thr | Gly | Thr | Ser | Pro | Lys | Ser | Tyr | Leu | ile | Thr | Leu | Asp |
115 | 120 | 125 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Asp ile Ala | Glu Asn | Arg | Val 135 | val | Gly Gly Asn | Asp 140 | val | Pro | Ala | Leu | |||||
130 | |||||||||||||||
Gin | ile | Leu | His | ser | Ala | Leu | Hi s | Gin | Pro | Tyr | Asp | Leu | Asp | Pro | Arg |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Phe | Arg | Glu | Arg | Ile | Thr | Thr | Asp | Ala | Thr | Arg | Gl n | Val | Gly | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Val | Ala | Arg | Arg | Leu | Gly | Glu | Arg | Glu | Gly | Arg | Thr | Arg | Al a | Ala | His |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Met | Met | Met | Arg | Val | Val | Phe | Al a | Leu | Phe | Ala | Glu | Asp | Thr | Gly | Met |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Leu | Glu | Arg | Gly | Ile | Val | Thr | Arg | Leu | Leu | Glu | Arg | Al a | Arg | Al a | Pro |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Pro | Gly | Glu | Asp | Gin | Leu | Tyr | Phe | Gin | Asp | Leu | Phe | Gly | Ala | Met | Lys |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Glu | Phe | Trp | Gly | Thr | Asp | Ile | Arg | Hi s | Phe | Asn | Gly | Gly |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Leu | Phe | Asp | Ser | Glu | Asp | Al a | Leu | Al a | Leu | Thr | Ser | Glu | Asp | Ala | Al a |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ala | Leu | Ile | Ile | Al a | Ala | Lys | Leu | Asp | Trp | Ser | Glu | val | Glu | Pro | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ile | Phe | Gly | Thr | Leu | Phe | Glu | Asn | Ser | Leu | Asp | val | Asp | Thr | Arg | ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Arg | Arg | Gly | Ala | His | Tyr | Thr | Ser | val | Asn | Asp | Ile | Glu | Arg | Ile | val |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asp | Arg | val | val | Met | Glu | pro | Leu | Trp | Ala | Glu | Trp | Asp | Ala | Leu | Arg |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Leu | ser | Leu | pro | Glu | Leu | Lys | Lys | Asn | val | Arg | Leu | Glu | Arg | Leu | Phe |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ala | phe | Gin | Asp | Arg | Leu | Thr | Al a | Val | Arg | Ile | Leu | Asp | Pro | Al a | cys |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Gly | ser | Gly | Asn | Phe | Leu | Phe | Val | Al a | Leu | Lys | Lys | Leu | Leu | Asp | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Glu | Tyr | Gin | val | Arg | Met | Al a | Ala | Val | Met | Asn | Asp | Ile | Gly | Glu | Phe |
385 | 390 | 395 | 400 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Glu Met | Pro | Pro | Leu val 405 | Hi s | pro | Gin Gin 410 | Met | Leu Gly ile Glu 415 | ile | ||||||
Glu | Thr | Phe | Al a | His | Glu | Leu | Al a | Ser | Ile | Thr | Leu | Trp | Met | Gly | Tyr |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Phe | Gin | Trp | Lys | Arg | Ala | His | Gly | Gly | His | Trp | Glu | Thr | pro | Ile | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Gin | Arg | Leu | Asp | Asn | Ile | Gin | Asn | Arg | Asp | Ala | Leu | Leu | Asn | Pro | Asp |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Gly | Thr | Glu | Ala | Thr | Trp | Pro | Arg | Ala | Asp | Phe | ile | val | Gly | Asn | pro |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | Phe | Leu | Gly | Asp | Lys | Met | Met | Arg | ser | Gin | Leu | Gly | Glu | Ala | Tyr |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Thr | Thr | Gin | Leu | Arg | Glu | Thr | phe | Lys | Asp | Arg | Leu | Pro | Gly | Gin | Ser |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Asp | Leu | val | Cys | Tyr | Trp | Pro | Glu | Lys | Ala | Arg | Ala | Leu | Ile | Glu | Ala |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gly | Val | Thr | Thr | Arg | Al a | Gly | Phe | val | Thr | Thr | Asn | Ser | Ile | Arg | Gly |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Gly | Lys | Asn | Arg | val | val | Leu | Glu | Arg | ile | Lys | Al a | Thr | Gly | Asp | Leu |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Phe | Met | Ala | Trp | Pro | Asp | Glu | Pro | Trp | Gin | Gin | Asn | Gly | Ala | Ala | Val |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Arg | val | ser | Leu | Phe | Gly | Phe | ASP | Asn | Gly | Thr | Glu | Thr | Leu | Arg | Thr |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Leu | Asn | Asp | Gly | His | val | Gly | val | Ile | Asn | Ala | Asp | Leu | Asn | Ala | Gly |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Thr | Asp | val | Lys | Gin | Ala | Gin | Lys | Leu | pro | Glu | Asn | Ala | Gly | val | Ser |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Phe | Ile | Gly | Thr | Gin | Lys | Gly | Gly | Al a | Phe | Asp | Ile | Pro | Gly | Asp | Leu |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Ala | Arg | ser | Trp | Leu | Ser | Val | Pro | Asn | Pro | Asp | Arg | Val | Ser | Asn | Ala |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Asp | val | Leu | Lys | Pro | Trp | val | Asn | Gly | Met | Asp | Leu | Thr | Arg | Arg | Pro |
660 | 665 | 670 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Ser | Gly Arg 675 | Trp | ile ile Asp Phe 680 | Ala Gin | Met | Asp | Glu 685 | Gly | Glu | Al a | |||||
Arg | Gin | Tyr | Leu | Gin | Pro | Met | Ala | Tyr | Val | Glu | Gin | Lys | Ile | Arg | Pro |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Glu | Arg | Ala | Thr | Asn | Ser | Asp | Arg | Pro | ser | Arg | Glu | Arg | Trp | Trp | Leu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
His | Gl n | Arg | Ser | Arg | Pro | Glu | Leu | Arg | Glu | Ala | Thr | Ile | Glu | Leu | Asp |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Arg | Phe | Ile | Gly | Ile | Pro | Arg | Val | Ala | Lys | His | Leu | Leu | Pro | val | Trp |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Leu | Pro | Glu | Gly | Thr | Leu | pro | Asp | Ser | Gin | val | val | val | Ile | Ala | Arg |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Asp | Asp | Asp | Phe | Ile | Phe | Gly | Val | Leu | Ala | Ser | Thr | Ile | His | Arg | Ser |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Trp | Ala | Arg | Met | Gin | Gly | Thr | Tyr | Met | Gly | Val | Gly | Asn | Asp | Leu | Arg |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Tyr | Thr | Pro | Ser | Thr | cys | Phe | Glu | Thr | Phe | Pro | Val | Pro | Ala | Pro | Thr |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Asp | Glu | Gin | Arg | Ala | Glu | Ile | Glu | Lys | Trp | Ala | Lys | Tyr | ile | val | Gin |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Leu | Arg | Glu | Hi s | Leu | Leu | Asn | Gin | Asp | Ala | Lys | Gly | Thr | Leu | Thr | Gly |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Ile | Tyr | Asn | Gin | Leu | Glu | Lys | Leu | Arg | Asn | Ser | Pro | Asp | Al a | Al a | Hi s |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Pro | val | Ser | Al a | Leu | Ala | Thr | Al a | Hi s | Asp | Lys | Leu | Asp | Gin | Al a | Val |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Ala | Thr | Ala | Tyr | Gly | Trp | Glu | τ rp | Pro | Leu | Asn | Glu | Asp | Gin | val | Leu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Glu | Arg | Leu | Leu | Al a | Leu | Asn | Leu | Glu | Arg | cys | Pro | Ala | |||
900 | 905 |
<210> | 14 |
<211> | 955 |
<212> | PRT |
<213> | ni eznane |
<220> |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <223> GenBank Nr gi|15807258|ref|NP_295988.1 <220>
<221> cecha inna <222> (920)..(920) <223> Xaa może byc naturalnie występującym aminokwasem <400> 14
Met 1 | Pro Gin Thr | Glu 5 | Thr Ala Gin | Arg Met Glu 10 | Asp | Phe | Val | Ala 15 | Tyr | ||||||
Trp | Arg | Thr | Leu | Lys | Gly | ASp | Glu | Lys | Gly | Glu | Ser | Gin | val | Phe | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asp | Arg | Leu | Phe | Gin | Ala | Phe | Gly | Hi s | Ala | Gly | Tyr | Lys | Glu | Ala | Gly |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ala | Glu | Leu | Glu | Tyr | Arg | val | Ala | Lys | Gin | Gly | Gly | Gly | Lys | Lys | Phe |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Al a | Asp | Leu | Leu | Trp | Arg | pro | Arg | val | Leu | ile | Glu | Met | Lys | Lys | Arg |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gly | Glu | Lys | Leu | Ala | Asn | Hi s | Tyr | Gin | Gin | Ala | Phe | Asp | Tyr | Trp | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Lys | Leu | val | Pro | ASP | Arg | Pro | Arg | Tyr | Ala | val | Leu | cys | Asn | Phe | Asp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Glu | Leu | Trp | val | Tyr | Asp | Phe | Asn | Gin | Gin | Leu | Asp | Glu | Pro | Met | Asp |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | Leu | Arg | ile | Glu | Glu | Leu | Pro | Glu | Arg | Tyr | Thr | Val | Leu | Asn | Phe |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Met | phe | Glu | Gin | Glu | Arg | Al a | Pro | Leu | Phe | Gly | Asn | Asn | Arg | Val | Asp |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
val | Thr | Arg | Glu | Ala | Al a | Asp | Ser | Val | Ala | Lys | val | Leu | Asn | Ser | val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ile | Ala | Arg | Gly | Glu | Asp | Arg | Ala | Arg | Ala | Gin | Arg | Phe | Leu | Leu | Gin |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Cys | val | Met | Ala | Met | Phe | Ala | Glu | Asp | Phe | Glu | Leu | ile | Pro | Arg | Gly |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Phe | Phe | Thr | Glu | Leu | Ala | Asp | Asp | Ala | Arg | Al a | Gly | Arg | Gly | ser | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Asp | Leu | Phe | Gly | Gly | Leu | Phe | Arg | Gin | Met | Asn | Thr | Ser | Glu | Arg |
225 | 230 | 235 | 240 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Ala | Arg | Gly | Gly | Arg | Phe | Al a | Pro | Ile | Pro | Tyr | Phe | Asn | Gly | Gly | Leu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Phe | Arg | Ala | val | Asp | Pro | Ile | Glu | Leu | Asn | Arg | Asp | Glu | Leu | Tyr | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Leu | Hi s | Lys | Al a | Ala | Leu | Glu | Asn | Asn | Trp | Ala | Arg | Ile | Gin | Pro | Gin |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
ile | Phe | Gly | val | Leu | Phe | Gin | Ser | Ser | Met | Asp | Lys | Lys | Glu | Gin | His |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Al a | Lys | Gly | Ala | Hi s | Tyr | Thr | Ser | Glu | Ala | Asp | Ile | Met | Arg | val | val |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Pro | Thr | Ile | val | Thr | Pro | Phe | Gin | Arg | Gin | Ile | Glu | Al a | Ala | Thr |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Thr | Gin | Lys | Glu | Leu | Arg | Ala | Ile | Leu | Asp | Glu | Leu | Ala | ser | Phe | Gin |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
val | Leu | Asp | Pro | Ala | Cys | Gly | Ser | Gly | Asn | Phe | Leu | Tyr | val | Al a | Tyr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Arg | Glu | Leu | Arg | Arg | Leu | Glu | Ala | Arg | Ala | Leu | Leu | Arg | Leu | Arg | Asp |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Leu | Ser | Ala | Pro | Gly | Thr | Ala | Leu | Pro | Pro | Ala | Arg | Val | Ser | Ile | Arg |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Gin | Met | Hi s | Gly | Leu | Glu | Tyr | Asp | Pro | Phe | Gly | Val | Glu | Leu | Ala | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
val | Thr | Leu | Thr | Leu | Al a | Lys | Glu | Leu | Ala | Ile | Arg | Glu | Met | His | Asp |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Leu | Leu | Gly | Asn | Thr | Gly | Leu | Asp | Phe | Asp | Gin | Pro | Leu | Pro | Leu | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Asn | Leu | Asp | Asp | Arg | Ile | val | Gin | Gly | Asp | Ala | Leu | Phe | Thr | Pro | Trp |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Pro | Arg | Val | Asp | Ala | Ile | Val | Gly | Asn | Pro | Pro | Phe | Gin | Ser | Lys | Asn |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Lys | Leu | Gin | Arg | Glu | Met | Gly | Ala | Ala | Tyr | val | Lys | Lys | Leu | Arg | Ala |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Hi s | Tyr | Pro | Asp | val | Pro | Gly | Arg | Ala | Asp | Tyr | cys | val | Tyr | Trp | Ile |
500 | 505 | 510 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Arg Lys | Ala 515 | His Asp | Gln | Leu | Gly Ser Gly 520 | Gln | Arg | Ala 525 | Gly | Leu | Val | ||||
Gly | Thr | Asn | Thr | ile | Arg | Gln | Asn | Asp | ser | Arg | val | Gly | Gly | Leu | Asp |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Tyr | val | val | Gln | Hi s | Gly | Gly | Thr | ile | Thr | Asp | Ala | val | Gly | Thr | Gln |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
val | Trp | Ser | Gly | Asp | Ala | Al a | val | His | val | Ser | ile | Val | Asn | Trp | val |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Lys | Gly | Pro | Al a | Glu | Gly | pro | Lys | Hi s | Leu | Al a | Trp | Gln | val | Gly | Asp |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Hi s | Arg | Thr | Ser | Pro | Trp | Gln | ser | Thr | Glu | Leu | Pro | val | ile | Asn | Ser |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Ala | Leu | ser | Al a | Gly | Thr | Asp | val | Thr | Gln | Ala | Gln | Lys | Leu | Arg | val |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Asn | Met | Asn | Ser | Gly | Al a | cys | Tyr | Gln | Gly | Gln | Thr | His | Gly | Hi s | Lys |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Gly | Phe | Leu | Leu | Asp | Gly | Leu | Glu | Ala | Gly | Gln | Met | Leu | Ser | Al a | Glu |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Arg | Lys | Asn | Ala | Glu | Val | Ile | phe | Pro | Tyr | Leu | Thr | Gly | Asp | Glu | Leu |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Leu | Arg | Thr | Ser | Pro | Pro | His | Pro | Thr | Arg | Tyr | Val | Ile | Asp | phe | Gln |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Pro | Arg | Asp | Val | phe | Gly | Al a | Arg | Ala | Tyr | Lys | Leu | Pro | Phe | Al a | Arg |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Ile | Glu | Arg | Glu | val | Leu | Pro | Thr | Arg | Gln | Ala | Ala | Ala | Ala | Glu | Glu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Glu | Al a | Arg | Asn | Ala | Glu | Val | Leu | Ala | Al a | Asn | Pro | Lys | Ala | Lys | Thr |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Asn | Lys | Hi s | Hi s | Arg | Asn | Phe | Leu | Asn | Gln | Trp | Trp | Ala | Leu | Ser | Tyr |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Gly | Arg | Ser | Glu | Met | Ile | Glu | Lys | Ile | Ser | Ser | Leu | Ser | Arg | Tyr | Ile |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Val | cys | Ser | Arg | Val | Thr | Lys | Arg | Gln | Val | Phe | Glu | Phe | Leu | Asp | Asn |
770 | 775 | 780 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Gly ile Arg Pro 785 | ser | Asp Gly Leu Gin 790 | Ile | Phe Ala 795 | Phe | Glu | Asp | Asp 800 | |||||||
Tyr | Ser | Phe | Gly | Val | Ile | Gin | Ser | Ser | val | Hi s | Trp | Gin | Trp | Leu | Ile |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Ala | Arg | Gly | Gly | Thr | Leu | Thr | Ala | Arg | Leu | Met | Tyr | Thr | Ser | ASP | Thr |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
val | phe | Asp | Thr | Phe | Pro | Trp | Pro | Asp | Pro | Thr | Leu | Ala | Gin | Val | Arg |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Ala | Val | Ala | Ala | Ala | Al a | Val | Lys | Leu | Arg | Glu | Leu | Arg | Asn | Lys | val |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
Met | Arg | Glu | Gin | Gly | Trp | Ser | Leu | Arg | Asp | Leu | Tyr | Arg | Thr | Leu | Asp |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Met | Pro | Gly | Lys | Asn | Pro | Leu | Arg | Asp | Ala | Gin | Glu | Arg | Leu | Asp | Al a |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | val | Ser | Ala | Al a | Tyr | Gly | Leu | Pro | Ala | Gly | Ala | Asp | Met | Leu | Asp |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Phe | Leu | Leu | Ala | Leu | Asn | Ala | xaa | val | Ala | Al a | Ala | Glu | Ala | Arg | Gly |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Al a | Ala | val | Thr | Gly | Pro | Gly | Leu | pro | Ala | Gly | Leu | Asn | Thr | Al a | Asp |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Phe | val | Thr | Ala | Asp | Al a | val | Arg | pro | Leu | Gly | |||||
945 | 950 | 955 |
<210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> pierwszych 14 reszt końca aminowego Mmei <400> 15
Ala Leu Ser Trp Asn Glu ile Arg Arg Lys Ala ile Glu Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> pierwszych 29 reszt peptydu 25kD
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
<220> <221> <222> <223> | cecha inna ¢20)..(20) X = Xaa (każdy | ami nokwas) |
<220> <221> <222> <223> | cecha inna (21)..(21) X = xaa (każdy | ami nokwas) |
<220> <221> <222> <223> | cecha inna ¢23)..(23) x = xaa (każdy | ami nokwas) |
<22O> <221> <222> <223> | cecha inna ¢25)..(25) x = xaa (każdy | ami nokwas) |
<400> | 16 |
Met Lys ile ser Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala Arg Ile Pro Leu 15 10 15
Lys ser Thr xaa xaa ile xaa Glu xaa Asn Ala Leu Gin 20 25
<210> | 17 | |
<211> | 40 | |
<212> | PRT | |
<213> | ni eznane | |
<220> | ||
<223> | pierwszych 40 | i reszt aminokwasowych uzyskanych z fragmentu 14 kD |
<220> | ||
<221> | cecha inna | |
<222> | (36)..(36) | |
<223> | X=Xaa (każdy | ami nokwas) |
<400> | 17 | |
Met Asp Ala Lys Lys | Arg Arg Asn Leu Gly Ala His Tyr Thr Ser Glu |
10 15
Ala Asn ile Leu Lys Leu ile Lys Pro Leu Leu Leu Asp Glu Leu Trp 20 25 30
Val Val Phe Xaa Lys Val Lys Asn 35 40 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> pierwszych 25 reszt peptydu 7,5 kD <400> 18
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
Met Lys Ser Arg Gly Lys Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Asp Gin Ala Leu 15 10 15
Asp Tyr Phe Ser Gly Ile Ala Glu Arg 20 25 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> starter fragmentu 25 kD <400> 19
Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala
1 | 5 ' |
<210> | 20 |
<211> | 20 |
<212> | DNA |
<213> | nieznane |
<220> | |
<223> | starter lewy |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢3)..(3) |
<223> | R = A lub G |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢6)..(6) |
<223> | γ = τ lub c |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢9)..(9) |
<223> | n to a, c, g, |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢12)..(12) |
<223> | γ = τ lub c |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (15)..(15) |
<223> | Y = T lub C |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (18) . . (18) |
<223> | γ = τ lub c |
<400> | 20 |
garttyggna aytayttygc | |
<210> | 21 |
<211> | 20 |
PL 208 400 B1
NEB-207-PIN.ST25 <212> DNA <213> nieznane <220>
<223> starter prawy <220>
<221> cecha inna <222> (3)..(3) <223> R = A lub G <220>
<221> cecha inna <222> (6)..(6) <223> R = A lub G <22Ο>
<221> cecha inna <222> (9)..(9) <223> η to a, c, g, lub t <220>
<221> | cecha | i nna |
<222> | (12).. | (12) |
<223> | R = A | lub G |
<220> | ||
<221> | cecha | i nna |
<222> | (15).. | .(15) |
<223> | Y = T | lub C |
<220> | ||
<221> | cecha | i nna |
<222> | (18) . . | .(18) |
<223> | R = A | 1 ub G |
<400> | 21 |
aartarttnc craaytcrtc 20 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> starter fragmentu 14 kD <400> 22
Met Asp Ala Lys Lys Arg
1 | 5 |
<210> <211> <212> <213> | 23 17 DNA ni eznany |
<220> <223> | starter lewy |
<220> <221> <222> <223> | cecha inna (6)..(6) Y = T lub C |
PL 208 400 B1
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (9)..(9) |
<223> | η to a, c, g, |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (12)..(12) |
<223> | R = A lub G |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢15)..(15) |
<223> | R = A lub G |
<400> | 23 |
atggaygcna araarcg | |
<210> | 24 |
<211> | 17 |
<212> | DNA |
<213> | nieznany |
<220> | |
<223> | starter prawy |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (6).. (6) |
<223> | γ = τ lub c |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (9) · (9) |
<223> | n to a, c, g, |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | ¢12)..(12) |
<223> | R = A lub G |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (15)..(15) |
<223> | R = A lub G |
<400> | 24 |
atggaygcna araarag | |
<210> | 25 |
<211> | 20 |
<212> | DNA |
<213> | ni eznany |
<220> | |
<223> | starter prawy |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (3)..(3) |
<223> | n to a, c, g, |
<220> | |
<221> | cecha inna |
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <222> (6)..(6) <223> Υ = Τ lub C <220>
<221> cecha inna <222> (9)..(9) <223> Υ = Τ lub C <220>
<221> cecha inna <222> (12)..(12) <223> η to a, c, g, or t <220>
<221> cecha inna <222> (15)..(15) <223> R = A lub G <400> 25 cgncgyttyt tngcrtccat 20 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> starter fragmentu 7.5 kD <400> 26
Asp Lys Ala Tyr Asp Gin Ala
1 | 5 |
<210> | 27 |
<211> | 20 |
<212> | DNA |
<213> | ni eznany |
<220> | |
<223> | starter lewy |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (3)..(3) |
<223> | Y = T lub C |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (6)..(6) |
<223> | R = A lub G |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (9)..(9) |
<223> | n to a, c, g |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (11) dl) |
<223> | Y = T lub C |
<220> | |
<221> | cecha inna |
<222> | (14) .. (14) |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <223> Υ = Τ lub C <220>
<221> cecha inna <222> (17)..(17) <223> R = A lub G <400> 27 gayaargcnt aygaycargc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter prawy <220>
<221> cecha inna <222> (3)..(3) <223> Υ = Τ lub C <220>
<221> cecha inna <222> (6)..(6) <223> R = A lub G <220>
<221> cecha inna <222> (9)..(9)
<223> | R = A lub G | |
<22Ο> | ||
<221> | cecha | i nna |
<222> | (12) . . | (12) |
<223> | η to a | L, C, i |
<220> | ||
<221> | cecha | inna |
<222> | (15).. | (15) |
<223> | Υ = Τ | lub C |
<220> | ||
<221> | cecha | i nna |
<222> | (18).. | (18) |
<223> | R = A | lub G |
<400> | 28 |
gcytgrtcrt angcyttrtc 20 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter ΙΡ 1 <400> 29 gttggatccc gcacagattg ctcagg 26 <210> 30 <211> 30
PL 208 400 B1
<212> | DNA |
<213> | nieznany |
<220> | |
<223> | starter ip 2 |
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <400> 30 gttggatcct acgttaatct gaataagatg 30 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 3 <400> 31 gttggatcct gttaatctga aacgctgg 28 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 4 <400> 32 gttggatcct tataccaaaa tgtgaggtc 29 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 5 <400> 33 ttcagaaata cgagcgatgc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 6 <400> 34 gtcaagccat aaacaccatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 7 | |
<400> 35 gagggtcaga aaggaagctg | 20 |
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25
<210> | 36 |
<211> | 20 |
<212> | DNA |
<213> | nieznany |
<220> | |
<223> | starter IP 8 |
<400> 36 gtccaactaa ccctttatgg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 9 <400> 37 ttcctagtgc tgaacctttg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 10 <400> 38 gttgcgttac ttgaaatgac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter IP 11 <400> 39 ccaaaatgga acttgtttcg 20
<210> | 40 |
<211> | 20 |
<212> | DNA |
<213> | ni eznany |
<22O> | |
<223> | starter IP 12 |
<400> | 40 |
gtgagtgcgc cctgaattag | |
<210> | 41 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | nieznany |
<220> |
PL 208 400 B1 <223> starter sl
NEB-207-PIN.ST25 <400> 41 gcttcatttc atcctctgtg c <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter S2 <400> 42 taaccgccaa aattaatcgt g 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> starter S3 <400>
<400> 43 ccactattca ttacaacacc <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> 20 nukleotydów, które pasują do sekwencji dna m. methyltrophus <400> 44 gttctgcagt taaggataac atatggcttt aagctggaac gag 43 <210> 45 <211> 37 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> 22 nukleotydów, które pasują do sekwencji DNA M. methylotrophus <400> 45 gttggatccg tcgacattaa ttaatttttg cccttag <210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> oligonukleotyd 1 <400> 46 gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg 48 <210> 47 <211> 48
PL 208 400 B1
ΝΕΒ-207-ΡΙΝ.ST25 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> oligonukleotyd 2 <400> 47 caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac 48 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> oligonukleotyd 3 <220>
<221> cecha inna <222> (15)..(15) <223> A = 6-metyloadenina <400> 48 gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg 48 <210> 49 <211> 48 <212> DNA <213> nieznany <220>
<223> oligonukleotyd 4 <220>
<221> cecha inna <222> (38)..(38) <223> A = 6-metyloadenina <400> 49 caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac 48 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> nieznane <220>
<223> fragment pojedycznego wewnętrznego trawienia CnBr <400> 50
Gly Arg Gly Arg Gly val Gly val
Claims (4)
1. Wyizolowany segment DNA kodujący Mmel, restrykcyjna endonukleaza-metylaza, znamienny tym, że wyizolowany DNA uzyskuje się z plazmidu pTBMmel o numerze dostępowym ATCC PTA-4521.
2. Rekombinowany wektor, do którego wprowadzono segment DNA kodujący Mmel, endonukleaza-metylaza, jak zdefiniowano w zastrz. 1.
3. Komórka gospodarza transformowana wektorem, jak zdefiniowano w zastrz. 2.
4. Sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej Mmel oraz metylazy Mmel, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem zdefiniowanym w zastrz. 2 w warunkach odpowiednich do ekspresji wspomnianej endonukleazy i metylazy.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39543102P | 2002-07-12 | 2002-07-12 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL374263A1 PL374263A1 (pl) | 2005-10-03 |
PL208400B1 true PL208400B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=30115870
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL374263A PL208400B1 (pl) | 2002-07-12 | 2003-07-10 | Wyizolowany segment DNA kodujący MmeI restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej MmeI oraz metylazy MmeI |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7115407B2 (pl) |
EP (2) | EP2228442A1 (pl) |
CN (2) | CN100591765C (pl) |
AU (1) | AU2003253865A1 (pl) |
DE (1) | DE60332739D1 (pl) |
PL (1) | PL208400B1 (pl) |
WO (1) | WO2004007670A2 (pl) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7186538B2 (en) | 2003-07-10 | 2007-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Type II restriction endonuclease, CstMI, obtainable from Corynebacterium striatum M82B and a process for producing the same |
US7932029B1 (en) * | 2006-01-04 | 2011-04-26 | Si Lok | Methods for nucleic acid mapping and identification of fine-structural-variations in nucleic acids and utilities |
WO2008083065A2 (en) * | 2006-12-27 | 2008-07-10 | New England Biolabs, Inc. | A recombinant type ii restriction endonuclease, nmeaiii, and a process for producing the same |
US8620589B2 (en) * | 2007-06-20 | 2013-12-31 | New England Biolabs, Inc. | Synthetic binding proteins |
EP2158556A2 (en) | 2007-06-20 | 2010-03-03 | New England Biolabs, Inc. | Rational design of binding proteins that recognize desired specific squences |
US8372619B2 (en) * | 2007-07-12 | 2013-02-12 | New England Biolabs, Inc. | High fidelity restriction endonucleases |
US8741570B2 (en) * | 2008-02-06 | 2014-06-03 | Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen | Thermo-optical characterisation of nucleic acid molecules |
CN102264900A (zh) | 2008-12-23 | 2011-11-30 | 新英格兰生物实验室公司 | 用于切割修饰的dna的组合物、方法和相关用途 |
DE102018107585B3 (de) * | 2018-03-29 | 2019-03-28 | Universität Rostock | Vorrichtung zur Herstellung von 3D-gedruckten Wirkstofffreisetzungssystemen mit Wirkstoffdepots, sowie Verfahren zur Herstellung von 3D-gedruckten Wirkstofffreisetzungssystemen |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0066994A3 (en) * | 1981-06-04 | 1984-02-01 | Imperial Chemical Industries Plc | Production and use of genetically-modified microorganisms |
US5200333A (en) * | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
US6383770B1 (en) | 1997-09-02 | 2002-05-07 | New England Biolabs, Inc. | Method for screening restriction endonucleases |
US6413758B1 (en) * | 2000-10-20 | 2002-07-02 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of Bpml restriction endonuclease in E. coli |
US7186538B2 (en) | 2003-07-10 | 2007-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Type II restriction endonuclease, CstMI, obtainable from Corynebacterium striatum M82B and a process for producing the same |
-
2003
- 2003-07-10 DE DE60332739T patent/DE60332739D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 EP EP10005419A patent/EP2228442A1/en not_active Withdrawn
- 2003-07-10 PL PL374263A patent/PL208400B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2003-07-10 CN CN03816564A patent/CN100591765C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-10 WO PCT/US2003/021570 patent/WO2004007670A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-07-10 US US10/616,624 patent/US7115407B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-10 EP EP03764434A patent/EP1539945B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-10 AU AU2003253865A patent/AU2003253865A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-10 CN CN200910174075A patent/CN101693898A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1539945A2 (en) | 2005-06-15 |
EP1539945A4 (en) | 2006-01-04 |
EP1539945B1 (en) | 2010-05-26 |
EP2228442A1 (en) | 2010-09-15 |
US7115407B2 (en) | 2006-10-03 |
US20040091911A1 (en) | 2004-05-13 |
WO2004007670A2 (en) | 2004-01-22 |
DE60332739D1 (de) | 2010-07-08 |
WO2004007670A3 (en) | 2004-03-25 |
CN1668740A (zh) | 2005-09-14 |
AU2003253865A8 (en) | 2004-02-02 |
PL374263A1 (pl) | 2005-10-03 |
AU2003253865A1 (en) | 2004-02-02 |
CN101693898A (zh) | 2010-04-14 |
CN100591765C (zh) | 2010-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0869174B1 (en) | Method for cloning and producing the SpeI restriction endonuclease | |
PL208400B1 (pl) | Wyizolowany segment DNA kodujący MmeI restrykcyjna endonukleaza-metylaza, rekombinowany wektor, komórka gospodarza transformowana wektorem i sposób wytwarzania rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej MmeI oraz metylazy MmeI | |
US5371006A (en) | Isolated DNA encoding the NotI restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
EP0871715A1 (en) | A METHOD FOR DIRECT CLONING OF NUCLEASE GENES IN $i(E. COLI) | |
JP5210530B2 (ja) | RrhJ1I制限・修飾酵素およびその遺伝子 | |
EP0931835B1 (en) | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease | |
US7186538B2 (en) | Type II restriction endonuclease, CstMI, obtainable from Corynebacterium striatum M82B and a process for producing the same | |
US6238904B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HpyCH4III, obtainable from Helicobacter pylori CH4 and a process for producing the same | |
JPH0698779A (ja) | NaeI制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼをクローン化し産生する方法 | |
JPH06205683A (ja) | SphI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離DNA及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 | |
JPH1057082A (ja) | 大腸菌中で制限エンドヌクレアーゼSapIをクローニング及び産生する方法 | |
US6893854B2 (en) | Nuclease | |
US5516678A (en) | Method for producing the SSPI restriction endonuclease and methylase | |
WO2001021776A1 (en) | A NOVEL TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE, HpyCH4V, OBTAINABLE FROM HELICOBACTER PYLORI CH4 AND A PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
US5849558A (en) | Discovery of and method for cloning and producing the PspGI restriction endonuclease | |
US6238901B1 (en) | Type II restriction endonuclease, HPY 188 III, obtainable from Helicobacter pylori J188 and a process for producing the same | |
US5366882A (en) | Method for producing the BGLI restriction endonuclease and methylase | |
US5731185A (en) | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
EP1298212B1 (en) | Method for cloning and expression of BsmBI restriction endonuclease and BsmBI methylase in E. coli and purification of BsmBI endonuclease | |
US5824529A (en) | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease | |
JP5626263B2 (ja) | RrhJ1I修飾酵素およびその遺伝子 | |
WO2001018186A1 (en) | A NOVEL TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE, Hpy188I, OBTAINABLE FROM HELICOBACTER PYLORI J188 AND A PROCESS FOR PRODUCING THE SAME | |
WO2001021638A1 (en) | A type ii restriction endonuclease from helicobacter pylori ch4 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RECP | Rectifications of patent specification | ||
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20130710 |