CN114657113A

CN114657113A - 一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用

Info

Publication number: CN114657113A
Application number: CN202210493541.7A
Authority: CN
Inventors: 马樱芳; 唐雪明; 蒋素梅; 李学文
Original assignee: Guiyi Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Guiyi Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，公开了一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用。本发明用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达系统分泌表达全能核酸酶，不仅避免了毕赤酵母的长周期、高成本的缺陷，同时也实现了目的蛋白的可溶性表达，避免复杂的包涵体复性步骤。本发明使用阴离子交换层析‑凝胶过滤层析两步纯化，可获得高纯度的目的蛋白，纯度约95％，且对核酸具有很好的降解能力。本发明纯化的全能核酸酶不含His标签，可进一步降低全能核酸酶对含His标签的待纯样品的污染，提高样品的纯度。

Description

一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用。

背景技术

全能核酸酶，也称广谱核酸酶，是一种来源于粘质沙雷氏菌(SerratiaMarcescen)的非特异性核酸内切酶，可在非常宽泛的条件下、切割链内任意核苷酸，将核酸(含单链、双链、线状、环状、天然或变性等多种形式的DNA和RNA)完全消化成2～5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸。全能核酸酶常用于重组蛋白、病毒疫苗等生物制品中去除核酸，以及有效降低细胞、组织、微生物等蛋白裂解液样品的粘度等。具体如：在ELISA、二维电泳和免疫印迹分析中，全能核酸酶可有效提高分辨率和回收率；在大规模的层析纯化时，避免由于大量的核酸吸附在层析介质上降低蛋白质的有效载量从而降低纯化得率等。

在重组蛋白纯化过程中，全能核酸酶可有效去除核酸干扰，提高后续蛋白纯化或功能研究。目前，市场上全能核酸酶的主要来源大多为毕赤酵母或大肠杆菌异源表达。对于毕赤酵母的分泌表达，限于其发酵诱导周期较长，生产成本相对较高；对于大肠杆菌原核表达系统表达的，容易形成包涵体，而包涵体复性及纯化工艺复杂，酶活损失也较大；且部分市售产品，带有His标签，对于待纯化目标蛋白也带有His的样品且纯度要求高的蛋白样品纯化，则需要不带His标签的重组全能核酸酶。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明对全能核酸酶进行密码子优化，采用大肠杆菌分泌表达系统，经渗透压法提取周质空间表达的不带His标签的全能核酸酶，纯化获得全能核酸酶。

本发明的第一个目的是提供了一种表达全能核酸酶的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌BL21(DE3)plysS为宿主，异源表达全能核酸酶。

进一步地，所述的全能核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，编码所述的全能核酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的全能核酸酶的表达载体为pET系列载体。

进一步地，所述的表达载体为pET22b载体。

本发明的第二个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

S1、将全能核酸酶的编码基因构建至pET系列表达载体上，得到重组表达载体；

S2、将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)plysS宿主中，筛选得到所述的重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种采用所述的重组菌发酵生产全能核酸酶的方法，包括如下步骤：将所述重组菌的种子液接种至LB培养基中在35～38℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.1～1.5mM的IPTG，在28～32℃诱导2～6h，得到含有全能核酸酶的发酵液。

进一步地，所述的方法还包括所述的全能核酸酶提取纯化的步骤：

S01、将得到的含有全能核酸酶的发酵液离心收集菌体；

S02、采用渗透压休克法提取菌体的周质蛋白粗提液，并采用膜过滤法过滤所述的周质蛋白粗提液；

S03、采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析对周质蛋白粗提液进行纯化，得到所述的全能核酸酶。

进一步地，所述的渗透压休克法是向所述的菌体中加入4～6倍的高渗溶液搅拌后离心收集菌体，再加入4～6倍的低渗溶液，搅拌后离心取上清。

本发明的第四个目的是提供所述的重组菌在蛋白纯化中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1)本发明用大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达系统分泌表达全能核酸酶，不仅避免了毕赤酵母的长周期、高成本的缺陷，同时也实现了目的蛋白的可溶性表达，避免复杂的包涵体复性步骤。

2)本发明表达的目的蛋白为原始蛋白序列，完全与天然蛋白一致。

3)本发明使用阴离子交换层析-凝胶过滤层析两步纯化，可获得高纯度的目的蛋白，纯度约95％，且对核酸具有很好的降解能力。

4)本发明纯化的全能核酸酶不含His标签，可进一步降低全能核酸酶对含His标签的待纯样品的污染，提高样品的纯度。

上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1、E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc转化子菌落PCR验证，M：DL5000 Marker；+：阳性对照，模板为质粒pET22b-Nuc；泳道1-4分别表示1-4#转化子；

图2、E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc诱导表达破碎液SDS-PAGE检测，M：PremixedProtein Marker；1：BL21(DE3)/pET22b；2：BL21(DE3)/pET22b-Nuc破碎上清；3：BL21(DE3)/pET22b-Nuc破碎沉淀；

图3、不同诱导条件下重组工程菌的SDS-PAGE；

图4、重组工程菌E.coli BL21(DE3)plysS/pET22b-Nuc不同诱导剂浓度下的SDS-PAGE；

图5、纯化后NuC的SDS-PAGE检测，M：Premixed Protein Marker；NuC：纯化后的全能核酸酶；

图6、全能核酸酶NuC对核酸的降解活性验证。

具体实施方式

本发明公开了表达全能核酸酶的重组菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

全能核酸酶野生型基因序列：Genbank:M19495.1，来源于一种粘质沙雷氏菌(S.marcescens)，基因编码区全长801bp，其中1-63bp为信号肽部分，64-801bp为全能核酸酶的成熟区，即成熟区长度为738bp，具体序列如下(SEQ ID NO.1)：

ATGCGCTTTAACAACAAGATGTTGGCCTTGGCCGCCCTGCTGTTCGCCGCGCAGGCGTCGGCCGACACGCTCGAATCCATCGACAACTGCGCGGTCGGCTGCCCGACCGGCGGCAGCAGCAACGTGTCTATCGTGCGCCATGCTTATACGTTGAACAACAACAGCACCACCAAGTTCGCCAACTGGGTGGCCTATCACATCACCAAAGACACGCCGGCCAGCGGCAAGACGCGCAACTGGAAAACCGATCCGGCTCTCAATCCGGCGGACACTCTGGCGCCCGCCGATTACACCGGTGCCAACGCCGCGCTGAAGGTCGATCGCGGTCATCAGGCGCCGCTGGCCTCGCTGGCGGGCGTTTCCGACTGGGAATCGTTGAACTACCTGTCCAACATCACGCCGCAAAAGTCCGATCTGAACCAGGGCGCCTGGGCTCGGCTGGAAGATCAGGAACGCAAGCTGATCGATCGCGCCGATATCTCCTCGGTCTATACCGTGACCGGGCCGCTGTATGAGCGCGATATGGGCAAACTGCCGGGCACCCAGAAAGCGCACACCATCCCCAGCGCCTACTGGAAGGTAATTTTCATCAACAACAGCCCGGCGGTGAACCACTATGCCGCCTTCCTGTTCGACCAGAACACGCCGAAGGGCGCCGATTTCTGCCAATTCCGCGTGACGGTGGACGAGATCGAGAAACGCACCGGCCTGATCATCTGGGCCGGTCTGCCGGACGACGTGCAGGCTTCGCTGAAGAGCAAACCGGGCGTTCTGCCGGAGTTGATGGGCTGCAAAAACTGA

成熟区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：245aa

DTLESIDNCAVGCPTGGSSNVSIVRHAYTLNNNSTTKFANWVAYHITKDTPASGKTRNWKTDPALNPADTLAPADYTGANAALKVDRGHQAPLASLAGVSDWESLNYLSNITPQKSDLNQGAWARLEDQERKLIDRADISSVYTVTGPLYERDMGKLPGTQKAHTIPSAYWKVIFINNSPAVNHYAAFLFDQNTPKGADFCQFRVTVDEIEKRTGLIIWAGLPDDVQASLKSKPGVLPELMGCKN

将该基因在原核系统大肠杆菌中进行异源表达，故对上述原始序列(成熟区，长度738bp)按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，优化后的序列如下：其GC含量由61.2％降低至54.2％，优化后序列如下(SEQ ID NO.3)：

GATACCCTGGAAAGCATTGATAACTGCGCGGTGGGCTGCCCGACCGGCGGCAGCAGCAATGTTAGCATTGTTCGCCATGCGTATACCCTGAACAACAACAGCACCACCAAATTTGCGAACTGGGTGGCGTATCATATTACCAAAGATACCCCGGCGAGCGGCAAAACCCGCAACTGGAAAACCGATCCGGCGCTGAACCCGGCGGATACCTTAGCGCCTGCGGATTATACCGGTGCGAATGCGGCGTTAAAAGTGGATCGCGGCCATCAGGCGCCTCTGGCGAGCTTAGCGGGTGTTAGCGATTGGGAAAGCCTGAATTATCTGAGCAACATTACCCCGCAGAAAAGCGATCTGAACCAGGGCGCGTGGGCGCGTTTAGAAGATCAAGAACGTAAACTGATTGATCGCGCGGATATTAGCAGCGTGTATACCGTGACCGGCCCGCTGTATGAACGCGATATGGGCAAACTGCCGGGCACCCAGAAAGCGCATACCATTCCGAGCGCGTATTGGAAAGTGATTTTTATTAACAACAGCCCGGCGGTGAACCATTATGCGGCGTTTCTGTTTGATCAGAACACCCCGAAAGGCGCGGATTTTTGCCAGTTTCGCGTGACCGTGGATGAAATTGAAAAACGCACCGGCCTGATTATTTGGGCGGGCCTGCCTGATGATGTGCAGGCGAGCTTAAAAAGCAAACCGGGCGTGCTGCCGGAACTGATGGGCTGTAAAAACTGA

重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc的构建及验证

密码子优化后全能核酸酶Nuc经酶切位点NcoI(5’)、XhoI(3’)构建于pET22b载体上，由华大基因合成。表达后蛋白分子量约为28kDa，C端不带His标签。

将pET22b-Nuc重组质粒经42℃热激转化法转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，于37℃恒温培养箱中过夜培养。次日随机挑取E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc单菌落进行菌落PCR验证，扩增引物为通用引物T7、T7ter，具体序列如下：

T7(SEQ ID NO.4)：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

T7ter(SEQ ID NO.5)：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

1)菌落PCR扩增体系：20μL体系(见如下表1)。

表1菌落PCR扩增体系

2)PCR扩增程序：98℃、10s；55℃、5s；72℃、5s；共30循环

3)扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，由图1可知挑选的4个转化子均为阳性。

实施例2：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc的诱导表达

以E.coli BL21(DE3)/pET22b作为对照菌株，挑选2#转化子为实验组进行实验，具体如下：

(1)将E.coli BL21(DE3)/pET22b和E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc于100μg/mL的Amp抗性平板上活化：37℃过夜培养。

(2)挑选单菌落接种到10mL LB液体培养基(Amp)中，37℃、200rpm培养过夜。

(3)次日，按2％接种量转接到另一瓶10mL液体LB培养基(Amp)中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG，调整温度至30℃诱导4h。

(4)取2mL诱导液，8000rpm、离心2min，生理盐水清洗两次，再加入2mL生理盐水重悬菌体。

(5)超声波破碎：超声功率25％，超2s、停2s，共处理10min。

对上述超声破碎菌液进行蛋白胶检测，结果如图2所示，结果表明：该诱导条件下的全能核酸酶的表达量较高，且主要存在于沉淀中。可见，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc在该条件下主要形成包涵体。

实施例3：诱导条件优化

包涵体的复性程序复杂，且经复性后的蛋白活性损失较大。为了减少包涵体的形成，分别对诱导剂IPTG浓度(设置0.01mM、0.05mM和0.1mM三个浓度)及诱导温度(分别25℃和30℃)两个条件进行优化，按照实施例2中所述的步骤诱导表达。诱导表达结束后，经SDS-PAGE检测包涵体形成情况，结果如图3和表2所示。

表2E.coli BL21(DE3)/pET22b-Nuc不同诱导条件下蛋白表达量及包涵体情况

注：“--”表示未表达目的蛋白或目的蛋白表达量为0；“-”表示未形成包涵体；“+”表示有少量包涵体形成或表达量较低；“++”表示大量包涵体形成或表达量较高

结合SDS-PAGE结果及表2情况可知，相同诱导剂浓度，25℃条件下目的蛋白表达量相对较低，形成的包涵体较少。同一诱导温度下，随着诱导剂浓度升高，目的蛋白表达量表现为升高，表达的蛋白来不及正确折叠，形成包涵体。综合摇瓶实验结果，选择25℃、0.05mMIPTG或30℃、0.01mM IPTG诱导均可，结合实际发酵情况，从降低生产成本的角度出发，选择30℃、0.01mM IPTG诱导表达更合适，但仍会产生包涵体。

实施例4：重组菌E.coli BL21(DE3)plysS/pET22b-Nuc构建及表达

E.coli BL21(DE3)plysS是包含pLysS质粒的表达宿主菌，该宿主达到稳定期时溶菌酶表达水平较高，目的蛋白表达水平降低，可有效缓解目的蛋白对宿主的影响，进而缓解蛋白对宿主的毒性。虽然通过降低温度或诱导剂浓度可减少包涵体的量，但为了进一步提高可溶性蛋白的量，选择用E.coli BL21(DE3)plysS为表达宿主进行诱导表达。

活化菌株E.coli DH5α/pET22b-Nuc，挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养，离心收集菌体后采用上海捷瑞质粒提取试剂盒提取重组质粒pET22b-Nuc，检测浓度及纯度。采用42℃热激法将质粒转化至E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中，经后培养，将转化液涂布于Amp(终浓度100μg/mL)和Cm(终浓度34μg/mL)双抗LB平板，37℃过夜培养。

待转化子长出后，菌落PCR验证，扩增体系及程序同实施例1中所述。挑选阳性转化子接种，培养条件参照实施例2，分别用0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM四个不同浓度的IPTG进行诱导表达，30℃诱导4h后超声波破碎，破碎液澄清，未产生沉淀，可见4个浓度诱导下均未形成包涵体。经SDS-PAGE检测表达情况，结果如图4。由图4可知，诱导温度为30℃时，0.5mMIPTG诱导即可表达大量的目的蛋白NuC，且不形成包涵体。

实施例5：全能核酸酶NuC的纯化

纯化所需溶液配制：

1)细胞洗涤液：10mM Tris，pH8.0，50mM NaCl

2)高渗溶液：50mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，20％蔗糖

3)低渗溶液：5mM MgSO₄

4)阴离子交换平衡液：20mM PB，25mM NaCl，pH7.41，5.25ms/cm

5)阴离子交换洗脱液：20mM PB，500mM NaCl，pH7.42

6)分子筛平衡液：20mM Tris，pH7.5，50mM NaCl，1mM MgCl2

7)透析储存液：20mM Tris，pH7.5，50mM NaCl，1mM MgCl2，50％甘油

纯化工艺：包括前处理、阴离子交换和分子筛凝胶纯化等步骤，具体如下：

1、前处理：

1)细胞洗涤：诱导表达后，于9000rpm离心10min，弃上清收集菌体。加入菌体重量5倍体积的细胞洗涤液洗涤菌体，弃净上清并称重。

2)渗透压休克法提取周质NuC粗提液：菌体加入5倍体积的高渗溶液(含1mMPMSF)，室温搅拌10min，离心收集菌体；再加入5倍体积冰浴的低渗溶液，搅拌10min，离心取上清，0.45μm滤膜过滤，即获得周质蛋白粗提液。

3)加入5M NaCl调节周质蛋白粗提液的电导率至5.2±0.5ms/cm，调节pH 7.4±0.1，0.45μm滤膜过滤。

2、阴离子交换：

1)阴离子柱Diamond Q平衡：用平衡液平衡处理20CV；

2)上样：上样环进行上样，流速0.5mL/min；

3)清洗：用阴离子交换平衡液清洗20CV，流速1mL/min至电导达基线；

4)洗脱：洗脱液按0-100％B梯度洗脱目的蛋白NuC，分步收集洗脱液，0.5-1mL/管。

5)SDS-PAGE胶分析各组分收集液。

3、凝胶过滤层析：

1)平衡：Superdex 75Increase凝胶过滤层析柱用分子筛平衡液平衡20CV；

2)上样：每次上样环上样0.5-1ml；

3)平衡液洗脱：流速1mL/min，分步收集洗脱峰。

4)透析保存：将凝胶过滤层析蛋白透析保存于储存液中，进行SDS-PAGE电泳分析(图5)，纯度可达95％以上。

实施例6：全能核酸酶NuC对核酸的降解活性验证

分别以不同质粒DNA和dsRNA为样本，测试纯化后的全能核酸酶NuC活性，反应体系见表3：

表3全能核酸酶NuC降解核酸反应体系

反应条件：37℃水浴30min，加入2μL 50mM EDTA终止反应。

终止反应后，取5μL样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，由图6电泳图可知，纯化获得的全能核酸酶对质粒DNA和dsRNA样品均有良好的降解作用。

实施例7：NuC与商品化带His标签的全能核酸酶对含His标签的待纯样品的纯度影响

本发明纯化的Nuc不含His标签，以市场上的带His标签的全能核酸酶为对照(产品编号D7126，https://www.beyotime.com/product/D7126-500KU.htm)，对比其在纯化重组有机磷降解酶opdA(含His标签)中的区别。opdA在大肠杆菌中表达形成包涵体，在纯化前的包涵体复性处理过程中，分别加入等量的商品化NuC和本发明获得的NuC，37℃消化处理破壁后的核酸以降低菌体粘度。前处理后进行Ni柱亲和层析，洗脱收集opdA，对收集的样品分析其全能核酸酶的保留情况。检测收集的opdA样品，本发明纯化的NuC处理组中未检出NuC活性，市售的含有His标签的NuC处理组含有弱NuC活性。同时，相比市售NuC，本发明Nuc消化后的opdA纯度可提高5.62％(相对含量)。可见，本发明获得的NuC可有效提高含His标签待纯蛋白样品的纯度。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 硅羿科技（上海）有限公司

<120> 一种表达全能核酸酶的重组菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgcgcttta acaacaagat gttggccttg gccgccctgc tgttcgccgc gcaggcgtcg 60

gccgacacgc tcgaatccat cgacaactgc gcggtcggct gcccgaccgg cggcagcagc 120

aacgtgtcta tcgtgcgcca tgcttatacg ttgaacaaca acagcaccac caagttcgcc 180

aactgggtgg cctatcacat caccaaagac acgccggcca gcggcaagac gcgcaactgg 240

aaaaccgatc cggctctcaa tccggcggac actctggcgc ccgccgatta caccggtgcc 300

aacgccgcgc tgaaggtcga tcgcggtcat caggcgccgc tggcctcgct ggcgggcgtt 360

tccgactggg aatcgttgaa ctacctgtcc aacatcacgc cgcaaaagtc cgatctgaac 420

cagggcgcct gggctcggct ggaagatcag gaacgcaagc tgatcgatcg cgccgatatc 480

tcctcggtct ataccgtgac cgggccgctg tatgagcgcg atatgggcaa actgccgggc 540

acccagaaag cgcacaccat ccccagcgcc tactggaagg taattttcat caacaacagc 600

ccggcggtga accactatgc cgccttcctg ttcgaccaga acacgccgaa gggcgccgat 660

ttctgccaat tccgcgtgac ggtggacgag atcgagaaac gcaccggcct gatcatctgg 720

gccggtctgc cggacgacgt gcaggcttcg ctgaagagca aaccgggcgt tctgccggag 780

ttgatgggct gcaaaaactg a 801

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val Gly Cys Pro Thr Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala Tyr Thr Leu Asn Asn

20 25 30

Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala Tyr His Ile Thr Lys

35 40 45

Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp Lys Thr Asp Pro Ala

50 55 60

Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Thr Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala Pro Leu Ala Ser Leu

85 90 95

Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr Leu Ser Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp Ala Arg Leu Glu Asp

115 120 125

Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile Ser Ser Val Tyr Thr

130 135 140

Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly Lys Leu Pro Gly Thr

145 150 155 160

Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp Lys Val Ile Phe Ile

165 170 175

Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala Phe Leu Phe Asp Gln

180 185 190

Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe Arg Val Thr Val Asp

195 200 205

Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Asp

210 215 220

Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly Val Leu Pro Glu Leu

225 230 235 240

Met Gly Cys Lys Asn

245

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gataccctgg aaagcattga taactgcgcg gtgggctgcc cgaccggcgg cagcagcaat 60

gttagcattg ttcgccatgc gtataccctg aacaacaaca gcaccaccaa atttgcgaac 120

tgggtggcgt atcatattac caaagatacc ccggcgagcg gcaaaacccg caactggaaa 180

accgatccgg cgctgaaccc ggcggatacc ttagcgcctg cggattatac cggtgcgaat 240

gcggcgttaa aagtggatcg cggccatcag gcgcctctgg cgagcttagc gggtgttagc 300

gattgggaaa gcctgaatta tctgagcaac attaccccgc agaaaagcga tctgaaccag 360

ggcgcgtggg cgcgtttaga agatcaagaa cgtaaactga ttgatcgcgc ggatattagc 420

agcgtgtata ccgtgaccgg cccgctgtat gaacgcgata tgggcaaact gccgggcacc 480

cagaaagcgc ataccattcc gagcgcgtat tggaaagtga tttttattaa caacagcccg 540

gcggtgaacc attatgcggc gtttctgttt gatcagaaca ccccgaaagg cgcggatttt 600

tgccagtttc gcgtgaccgt ggatgaaatt gaaaaacgca ccggcctgat tatttgggcg 660

ggcctgcctg atgatgtgca ggcgagctta aaaagcaaac cgggcgtgct gccggaactg 720

atgggctgta aaaactga 738

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

taatacgact cactataggg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims

1.一种表达全能核酸酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌BL21(DE3)plysS为宿主，异源表达全能核酸酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的全能核酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，编码所述的全能核酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的全能核酸酶的表达载体为pET系列载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的表达载体为pET22b载体。

6.一种权利要求1～5任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S2、将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS宿主中，筛选得到所述的重组菌。

7.一种采用权利要求1～5任一项所述的重组菌发酵生产全能核酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述重组菌的种子液接种至LB培养基中在35～38℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.1～1.5mM的IPTG，在28～32℃诱导2～6h，得到含有全能核酸酶的发酵液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括所述的全能核酸酶提取纯化的步骤：

S01、将得到的含有全能核酸酶的发酵液离心收集菌体；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的渗透压休克法是向所述的菌体中加入4～6倍的高渗溶液搅拌后离心收集菌体，再加入4～6倍的低渗溶液，搅拌后离心取上清。

10.一种权利要求1～5任一项所述的重组菌在蛋白纯化中的应用。