CN110592045A

CN110592045A - 一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(r,s)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

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Publication number: CN110592045A
Application number: CN201910766521.0A
Authority: CN
Inventors: 章银军; 陈昌盛; 郑建永; 吴石金
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-08-20
Also published as: CN110592045B

Abstract

本发明提供了一种立体选择性重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及其拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯的应用；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)‑吲哚啉‑2‑甲酸乙酯，生成(S)‑吲哚啉‑2‑甲酸，转化率达45％左右，产物光学纯度都在96％以上。

Description

一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种立体选择性酯酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。

(二)背景技术

(S)-吲哚啉-2-甲酸及其某些化合物是目前实验及临床阶段的许多新药中间体。如法国Servier公司发明的心血管治疗药培哚普利，用于治疗原发性高血压与心力衰竭，作用时间长，副作用小，耐受性好，市场前景良好。这些具有心血管疾病治疗功效的活性组中，普遍含有(S)-吲哚啉-2-甲酸或其加氢产物的特征结构。

目前，文献报道的合成(S)-吲哚啉-2-甲酸主要是用具有旋光性的起始原料合成、手性助剂合成法、化学试剂拆分法。如浙江大学的钱超以L-苯丙氨酸为“手性源”，经硝化、溴化、分子内环合制备得到了6-硝基-(S)-吲哚啉-2-甲酸，该产物可通过硝基还原、重氮化和去重氮基反应制备得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。其路线如下：

Vincent等以吲哚-2-甲酸为原料，经酯化、锡/氯化氢还原得外消旋吲哚啉-2-甲酸乙酯，再用(R)-α-苯乙胺为拆分试剂对其进行拆分，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。化学合成或拆分法均存在步骤繁多，污染严重或者拆分试剂价格昂贵的缺点。采用酶法制备是趋势，具有成本低，低排放的优势。

De Vries等的专利报道了以邻卤(氯或溴)苯甲醛为原料，与醋酐缩合，所得的肉桂酸衍生物用苯丙氨酸氨解酶(从Rhodosporidium toruloides ATCC 10788中获得)氨解得到光学纯的邻卤-L-苯丙氨酸，然后再经环合反应得到光学纯的(S)-吲哚啉-2-甲酸。

韩国SK公司专利报道使用外消旋的吲哚啉-2-甲酸甲酯作为底物，以商品化的Savinase作为催化剂水解，特异性水解(R)-吲哚啉-2-甲酸甲酯，再将不水解的(S)-吲哚啉-2-甲酸甲酯进一步水解，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸e.e.值达99％，收率47％。

对于拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用奠定良好的基础。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性酯酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用，解决了用野生菌B8W22制备(S)-吲哚啉-2-甲酸过程中的ee.值达不到93％以上的技术难题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种立体选择性重组酯酶，所述重组酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

MET Pro Leu Asp Pro His Ile Gln Ile Phe Leu Asn Gln Tyr Asn Glu METPro Arg Pro Ser Leu Glu Asp Val Thr Pro Pro Gln Leu Arg Glu MET Glu Lys METSer Leu Thr Pro

Ser Lys Glu Ala Val Lys Lys Val Tyr Asn Lys Glu Ile Gln Leu Asn GluArg Thr Leu Thr Ile Arg Val Tyr Glu Pro Glu Gly Thr Gly Pro Phe Pro Ala LeuVal Tyr Tyr His Gly Gly Gly Trp Val Leu Gly Ser Leu Asp Thr His Asp Ser IleCys Arg Ser Tyr Ala Asn Glu Thr Asn Cys Ile Val Val Ser Val Asp Tyr Arg LeuAla Pro Glu Asp Lys Phe Pro Ala Ala Val Asn Asp Ala Tyr Asp Ala Leu Asp TrpIle Ala Ala His Ala Ser Gln Leu Asn Ile Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Gly GlyAsp Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Ala Val Val Ser Ile Leu Ala Lys Gln Arg GlnGly Pro Ser Ile Val His Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ser Val Gly Phe Lys Asn GlnHis Pro Ala Ser MET Lys Glu Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Leu Ser Lys Asp Leu METAsp Trp Phe Arg Leu Gln Tyr Leu Asn Asn Lys

Glu Glu Glu Gln His Pro Tyr Asn Ala Pro Val Leu Leu Glu Asp Leu SerSer Leu Pro Ser Ala Thr Ile Leu Thr Ala Gln Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Ser GlyLys Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Asn His Gly Val Pro Val Thr Tyr Glu Asn TyrGlu Thr MET Ile His Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe Val Pro Leu Ala Gln GlnAla Ile Asn Lys Ser Ala Ala Gln Leu Arg Gln Val Phe Asp Ser Ile

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述立体选择性重组酯酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

ATGCCGTTAG ATCCGCATAT TCAAATATTT CTAAATCAAT ATAATGAAAT GCCCCGTCCT

TCTTTAGAGG ACGTCACCCC CCCGCAGCTT AGAGAAATGG AAAAGATGTC TTTAACTCCT

TCCAAAGAAG CAGTTAAAAA AGTATATAAT AAAGAAATCC AATTAAATGA ACGCACGCTC

ACTATACGAG TGTATGAACC TGAAGGAACA GGGCCATTTC CCGCTCTTGT TTATTATCAC

GGAGGAGGCT GGGTATTAGG AAGCTTAGAT ACTCATGACT CCATATGCAG ATCGTATGCA

AATGAAACAA ACTGTATTGT AGTGTCTGTT GATTACCGCC TTGCTCCTGA AGATAAATTT

CCCGCTGCGG TGAACGATGC CTATGACGCC TTGGATTGGA TTGCAGCTCA TGCGTCTCAA

TTAAATATCG ATTCAAACAA AATTGCCGTC GGGGGCGACA GTGCCGGTGG TAACCTTGCT

GCGGTTGTAA GTATTTTAGC AAAACAAAGA CAAGGTCCAT CCATTGTTCA TCAGCTGCTT

ATTTATCCAT CTGTAGGATT TAAAAATCAG CACCCTGCAT CTATGAAAGA AAATGGCGAA

GGATATCTTC TTTCAAAAGA TCTTATGGAT TGGTTTCGCC TTCAATACTT AAATAATAAA

GAAGAAGAAC AGCATCCCTA TAACGCTCCG GTATTACTAG AAGACCTATC GAGCCTACCG

AGCGCTACCA TTCTTACAGC ACAGTACGAC CCTCTAAGAG ATAGCGGAAA AGACTACGCG

GACGCATTAA AAAATCACGG TGTTCCCGTC ACCTACGAAA ATTATGAAAC AATGATTCAC

GGGTTTTTAG GGTTTCATGA ATTTGTCCCA CTTGCTCAGC AGGCGATCAA TAAAAGCGCA

GCTCAACTGC GTCAAGTATT TGACTCCATT

本发明立体选择性重组酯酶基因由如下方法得到：从芽孢杆菌B8W22(Bacillusaryabhattai)中分离纯化得到该立体选择性酯酶基因，MALDI-TOF蛋白质普鉴定为羧酸酯酶tr|D5DRW2|D5DRW2BACMQ，在NCBI上检索编码该蛋白的基因序列，获得相似度最高的同源基因序列，设计引物pET-28a-nco1-F(5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGATGCCGTTAGATCCGCATATTC-3’)、引物pET-28a-xho1-R(5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATGGAGTCAAATACTT

GACGCAG-3’)。利用PCR技术，以来源于芽孢杆菌B8W22(Bacillusaryabhattai)的基因组DNA为模板克隆酯酶基因片段。将该片段连接到pET-28a载体上获得克隆载体pET-28a-BaCE并将其转化于大肠杆菌DH5α中。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为930bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述立体选择性酯酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及含有所述重组酯酶编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明还涉及所述立体选择性重组酯酶编码基因在制备立体选择性重组酯酶中的应用，具体的，所述的应用为：构建含有所述立体选择性重组酯酶基因的重组载体pET-28a-BaCE，将所述重组载体转化至大肠杆菌BL21中，获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BaCE。重组大肠杆菌经诱导培养，培养液经离心分离得到含有立体选择性酯酶的菌体细胞。菌体细胞超声波破碎后，离心去除细胞碎片，所得的上清液通过Ni-NTA金属螯合亲和层析分离纯化，得到重组酯酶纯酶。

本发明立体选择性酯酶活力测定方法为：反应体系3mL：2.8mL 50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)和0.1mL 30mmol/L对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的乙腈溶液混合后，于30℃恒温水浴保温5min。之后加入0.1mL的酶液，并立即计时。反应时间为3min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的酶液作对照。

在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

本发明还涉及所述的立体选择性重组酯酶在催化拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用，所述应用以含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、冻干菌体或湿菌体悬液破碎上清提取的纯酶为催化剂，以(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物，以pH7.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-40℃，150-200rpm(优选30℃、180-200rpm)条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)-吲哚啉-2-甲酸。所述底物加入终浓度为10～50g/L缓冲液(优选20～30g/L)，催化剂质量用量以缓冲液体积计为0.01～20g/L，其中湿菌体加入量5～20g/L缓冲液(优选10～15g/L)，干菌体加入量为1～3g/L缓冲液，纯酶加入量为0.01-0.06g/L缓冲液。

本发明所述反应液分离纯化方法为：拆分反应结束后，用正己烷萃取未完全反应的底物，充分振荡，12000rpm离心15min，取下层水相加NaOH至pH 10.0，充分振荡，12000rpm离心15min，取上清，用盐酸(优选4M的盐酸)调节至2.0后，减压过滤，获得滤液和滤渣，滤渣为产品(S)-吲哚啉-2-甲酸。

本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的重组大肠杆菌接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养12-16h，获得种子液；再以体积浓度2％的接种量将种子液接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体。

本发明纯酶按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，250W超声波破碎，超声2s，间隔6s，有效超声时间10min，在4℃下12000rpm离心15min，获得上清液；按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取上清液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用10mM咪唑水溶液、40mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、250mM咪唑水溶液洗脱，收集100mM咪唑水溶液的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量)脱盐浓缩，收集截留液，冻干，获得重组酯酶纯酶。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于芽孢杆菌B8W22(Bacillus aryabhattai)的立体选择性酯酶基因，该酯酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组酯酶；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂催化拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯，可以生成(S)-吲哚啉-2-甲酸，转化率达44.39％，产物光学纯度都在96％以上。

(四)附图说明

图1为PCR扩增酯酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1为利用引物pET-28a-nco1-F和引物pET-28a-xho1-R扩增得到的酯酶基因片段；M为Trans 2K Plus DNA Marker。

图2为构建的重组质粒pET-28a-BaCE。

图3为PCR扩增鉴定阳性重组子的琼脂糖凝胶电泳图；M为DNA分子量标准；泳道1至2为PCR扩增的目的DNA片段。

图4为重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BaCE催化外消旋底物吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)吲哚啉-2-甲酸的液相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：重组酯酶BaCE

芽孢杆菌B8W22(Bacillus aryabhattai)，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO:M 2017751，保藏日期2017年11月30日，已在先前申请专利(申请号：2019101300148)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。

1、用核酸提取试剂盒提取芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017751的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物pET-28a-noc1-F(5’-TAAGAAGGAGATATACCATGGATGCCGTTAGATCCGCATATTC-3’)、引物pET-28a-xho1-R(5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAATGGAGTCAAAT

ACTTGACGCAG-3’)的作用下进行PCR扩增。

PCR反应体系各组分加入量(总体积20μL):

引物pET-28a-nco1-F和引物pET-28a-xho1-R各0.3μL，基因组DNA 1μL，primesTARMax Premix(2×)聚合酶10μL，加水补至20μL。

PCR反应条件为：预变性98℃，3min，然后进入温度循环98℃，10s；58℃，10s；72℃，25s；共30个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。取5μL PCR反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果表明为单一条带，扩增片段大小约为930bp，如图1所示。

2、载体线性化：用限制性核酸内切酶Nco1和Xho1将质粒pET-28a进行双酶切。

双酶切体系反应体系各组分加入量(总体积20μL):

Buffer 2μL，质粒10μL，Nco1和Xho1各1μL，加水补至20μL，37℃孵育1小时，用DNA液体快速回收试剂盒纯化。

3、将步骤1扩增片段和步骤2酶切质粒pET-28a，用一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行连接，得到重组质粒pET-28a-BaCE，构建示意图如图2所示。

4、取10μL重组质粒pET-28a-BaCE转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，加入1000μLLB培养基(不添加抗性)，37℃，200rpm摇菌1h。5000rpm离心5min，弃900μL上清，用剩余培养基将菌重悬，涂布于含100μg/ml卡那霉素的LB平板上，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果见图3。由图3可知，在930bp左右的位置具有单一条带，表明所挑选的菌株为阳性重组子，即为含有胞内表达重组质粒pET-28a-BaCE的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BaCE。获得的阳性重组子经培养后，提取质粒，送样测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经步骤1扩增到的核苷酸序列长度为930bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2:重组酯酶BaCE菌体细胞

根据实施例1获得的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BaCE接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养12-16h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀ 0.6，再向LB液体培养基加入终浓度为0.2mM的IPTG，22℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体，即为含有重组酯酶的菌体细胞。

实施例3：

实施例2中获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a-BaCE湿菌体1g，用20ml、50mM的pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，然后进行超声破碎(超声功率为250W，超声2s，间隔6s，有效超声时间10min)，破碎悬浮液在4℃下12000rpm离心10min，尽量弃尽细胞碎片，取上清液，即得蛋白粗酶液。按照Ni-NTA金属螯合亲和层析使用说明，取蛋白粗酶液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用含50mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、150mM咪唑水溶液、200mM咪唑的水溶液洗脱杂蛋白和目的蛋白。收集用含100mM咪唑水溶液洗脱后的流出液，超滤膜(10kDa截留分子量，可截留分子量>10kDa的蛋白(含目的蛋白)，而水溶液及低分子量的溶质则允许透过膜)脱盐浓缩，收集截留液(即为纯酶液)，然后于-20℃低温保藏，获得重组酯酶纯酶0.03g。

酯酶水解硝基苯酚乙酸酯的活力测定方法为：2.8mL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和0.1mL 30mmol/L对硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)的乙腈溶液混合后，于30℃恒温水浴保温5min，之后加入0.1mL的纯酶液，并立即计时。反应时间为3min，反应结束后立即加入1mL无水乙醇终止反应，并立即在波长为405nm下测定吸光值。同样的反应条件下，以灭活的纯酶液作对照，在上述测定条件下，以每分钟水解底物产生lμmol的对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

该纯酶基于对硝基苯酚丁酸酯的水解反应，测得其水解对硝基苯酚丁酸酯的活力为0.57U/mg。而宿主菌大肠杆菌BL21(阴性对照)按照相同方法检测其水解对硝基苯酚乙酸酯活力仅为0.01U/mg。重组基因工程菌酯酶的水解活力是阴性对照的57倍，表明该酯酶基因在大肠杆菌BL21中成功实现过量表达。

实施例4：拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸

将实施例2中获得的湿菌体2g在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。在1mL反应体系中，取0.01g冻干菌体，加入1mL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化30min。反应结束后，反应液用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，对底物及其转化产物进行液相色谱分析。结果如图4所示，(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e._p 96.27％，产率44.49％。同等条件下，芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017751的e.e._p只有93％，表明该酯酶基因在大肠杆菌BL21中成功表达，且对于(S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯选择性优于野生菌。

液相色谱分析条件：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱大赛璐AD-H；流动相正己烷：异丙醇＝5：1(体积比)，流速1ml/min，柱压457psi，柱温30℃；进样量10μL。

实施例5：拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸

将实施例2中获得的湿菌体2g在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。在1mL反应体系中，取0.01g冻干菌体，加入1mL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入终浓度50g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化30min。反应结束后，反应液用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，对底物及其转化产物进行液相色谱分析(同实施例4)。(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e._p 96.05％，产率43.75％。

实施例6：拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸

将实施例2中获得的湿菌体2g在-17℃冷冻干燥24h，获得冻干菌体0.2g。在1mL反应体系中，取0.02g冻干菌体，加入1mL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化30min。反应结束后，反应液用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，对底物及其转化产物进行液相色谱分析(同实施例4)。(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e._p 96.88％，产率46.15％。

实施例7：拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸

在1mL反应体系中，加0.02mg实施例3中获得的重组酯酶纯酶，加入1mL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化30min。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析(同实施例4)。结果显示(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e._p 96.55％，产率44.39％。

实施例8：拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸

在1mL反应体系中，加0.04mg实施例3中获得的重组酯酶纯酶，加入1mL pH7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液，充分振荡混匀，再加入终浓度25g/L外消旋(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯作为底物，在30℃、180r/min下，转化30min。反应结束后，用4M稀盐酸调pH至2，再加入2mL乙酸乙酯萃取，取有机层，用真空旋转蒸发仪旋干，然后加入1mL的流动相溶解，除水后制成液相检测样品，对底物及其转化产物进行液相色谱分析(同实施例4)。结果显示(S)-吲哚啉-2-甲酸的对映体过量值e.e._p 97.16％，产率46.39％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组酯酶、基因、工程菌及拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Pro Leu Asp Pro His Ile Gln Ile Phe Leu Asn Gln Tyr Asn Glu

1 5 10 15

Met Pro Arg Pro Ser Leu Glu Asp Val Thr Pro Pro Gln Leu Arg Glu

20 25 30

Met Glu Lys Met Ser Leu Thr Pro Ser Lys Glu Ala Val Lys Lys Val

35 40 45

Tyr Asn Lys Glu Ile Gln Leu Asn Glu Arg Thr Leu Thr Ile Arg Val

50 55 60

Tyr Glu Pro Glu Gly Thr Gly Pro Phe Pro Ala Leu Val Tyr Tyr His

65 70 75 80

Gly Gly Gly Trp Val Leu Gly Ser Leu Asp Thr His Asp Ser Ile Cys

85 90 95

Arg Ser Tyr Ala Asn Glu Thr Asn Cys Ile Val Val Ser Val Asp Tyr

100 105 110

Arg Leu Ala Pro Glu Asp Lys Phe Pro Ala Ala Val Asn Asp Ala Tyr

115 120 125

Asp Ala Leu Asp Trp Ile Ala Ala His Ala Ser Gln Leu Asn Ile Asp

130 135 140

Ser Asn Lys Ile Ala Val Gly Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala

145 150 155 160

Ala Val Val Ser Ile Leu Ala Lys Gln Arg Gln Gly Pro Ser Ile Val

165 170 175

His Gln Leu Leu Ile Tyr Pro Ser Val Gly Phe Lys Asn Gln His Pro

180 185 190

Ala Ser Met Lys Glu Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Leu Ser Lys Asp Leu

195 200 205

Met Asp Trp Phe Arg Leu Gln Tyr Leu Asn Asn Lys Glu Glu Glu Gln

210 215 220

His Pro Tyr Asn Ala Pro Val Leu Leu Glu Asp Leu Ser Ser Leu Pro

225 230 235 240

Ser Ala Thr Ile Leu Thr Ala Gln Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Ser Gly

245 250 255

Lys Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Asn His Gly Val Pro Val Thr Tyr

260 265 270

Glu Asn Tyr Glu Thr Met Ile His Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe

275 280 285

Val Pro Leu Ala Gln Gln Ala Ile Asn Lys Ser Ala Ala Gln Leu Arg

290 295 300

Gln Val Phe Asp Ser Ile

305 310

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgccgttag atccgcatat tcaaatattt ctaaatcaat ataatgaaat gccccgtcct 60

tctttagagg acgtcacccc cccgcagctt agagaaatgg aaaagatgtc tttaactcct 120

tccaaagaag cagttaaaaa agtatataat aaagaaatcc aattaaatga acgcacgctc 180

actatacgag tgtatgaacc tgaaggaaca gggccatttc ccgctcttgt ttattatcac 240

ggaggaggct gggtattagg aagcttagat actcatgact ccatatgcag atcgtatgca 300

aatgaaacaa actgtattgt agtgtctgtt gattaccgcc ttgctcctga agataaattt 360

cccgctgcgg tgaacgatgc ctatgacgcc ttggattgga ttgcagctca tgcgtctcaa 420

ttaaatatcg attcaaacaa aattgccgtc gggggcgaca gtgccggtgg taaccttgct 480

gcggttgtaa gtattttagc aaaacaaaga caaggtccat ccattgttca tcagctgctt 540

atttatccat ctgtaggatt taaaaatcag caccctgcat ctatgaaaga aaatggcgaa 600

ggatatcttc tttcaaaaga tcttatggat tggtttcgcc ttcaatactt aaataataaa 660

gaagaagaac agcatcccta taacgctccg gtattactag aagacctatc gagcctaccg 720

agcgctacca ttcttacagc acagtacgac cctctaagag atagcggaaa agactacgcg 780

gacgcattaa aaaatcacgg tgttcccgtc acctacgaaa attatgaaac aatgattcac 840

gggtttttag ggtttcatga atttgtccca cttgctcagc aggcgatcaa taaaagcgca 900

gctcaactgc gtcaagtatt tgactccatt 930

Claims

1.一种立体选择性重组酯酶，其特征在于所述重组酯酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述立体选择性重组酯酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述立体选择性重组酯酶编码基因在制备立体选择性重组酯酶中的应用。

6.一种权利要求1所述立体选择性重组酯酶在催化拆分(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、冻干菌体或湿菌体提取的纯酶为催化剂，以(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物，以pH6.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-40℃，150-200rpm条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液分离纯化，得到(S)-吲哚啉-2-甲酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂质量用量以缓冲液体积计为0.01～20g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为10～50g/L。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌接种至含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，在37℃下培养12-16h，获得种子液；再以体积浓度2％的接种量将种子液接种到新鲜的含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4-0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃下诱导培养10-12h，然后在4℃下8000rpm离心10min，收集湿菌体。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含立体选择性重组酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬，250W超声波破碎，超声2s，间隔6s，有效超声时间10min，在4℃下12000rpm离心15min，获得上清液；采用Ni-NTA金属螯合亲和层析，取上清液上样至预平衡Ni²⁺柱中，再依次用10mM咪唑水溶液、40mM咪唑水溶液、100mM咪唑水溶液、250mM咪唑水溶液洗脱，收集100mM咪唑水溶液的流出液，超滤膜脱盐浓缩，收集截留液，冻干，获得重组酯酶纯酶。